Capítulo 9
Contaminações microbianas em biorreatores

João Batista Teixeira

Introdução

A contaminação bacteriana e fúngica constitui um problema sério em todos os tipos de cultivo in vitro, seja em cultivos em meio gelificado ou em meio líquido (GEORGE, 1993). Pode-se afirmar, a grosso modo, que existem três formas de contaminação que podem afetar o material em cultivo durante uma ou mais fases do processo de micropropagação: contaminação superficial, contaminação en­dofítica e contaminação de origem ambiental (GEORGE, 1993; LONG et al., 1988).

Contaminação superficial

Este tipo de contaminação refere-se àqueles microrganis­mos presentes na superfície do material vegetal a ser utilizado como fonte de explantes. Após a germinação no solo, durante o processo de desenvolvimento, fungos e bactérias vão se depositando na superfície da planta, o que representa um processo natural de colonização de novos nichos pelos microrganismos. Essa contaminação ocorre mais intensamente nas superfícies expostas, como haste caulinar, folhas, flores abertas, superfície da raiz, etc. Locais mais protegidos, como interior das gemas, das flores fechadas e dos frutos, tendem a estar livres de contaminantes.

Durante o processo de desinfestação visando ao estabeleci­mento de culturas in vitro, esses contaminantes são eliminados, desde que a solução desinfestante atinja todos os nichos onde possam estar presentes as bactérias, fungos e seus esporos. O completo molhamento da superfície dos órgãos vegetais pode ser conduzido com a adição de substâncias redutoras da tensão superficial da água e/ou pela exposição ao vácuo dos tecidos imersos em agentes desinfestantes, para eliminação de bolhas de ar, que são o principal problema durante esse processo.

Geralmente, o uso de fungicidas e antibióticos durante o processo de desinfestação não surte nenhum efeito e deve ser preterido em função de outros tratamentos ou cuidados mais eficazes. Um procedimento que tem apresentado excelentes resultados em nosso laboratório é o cultivo em casa de vegetação das plantas matrizes, sob alguns cuidados especiais. Por exemplo, a irrigação é conduzida exclusivamente na base da planta, evitando ao máximo o molhamento da folhagem e dos pontos de crescimento. Isto associado a uma adequada adubação e controle de pragas e doenças têm permitido um excelente resultado em termos de eficiência no estabelecimento dos explantes in vitro, no que diz respeito à ausência de contaminação. Da mesma forma, desaconselha-se o tratamento das matrizes com antibióticos e fungicidas, a não ser em casos específicos em que esse procedimento se justifique.

O cultivo das matrizes em casa de vegetação pode, entre­tanto, criar alguns problemas, principalmente no controle de algumas pragas como cochonilhas e ácaros, dependendo da espécie e da região de cultivo.

Contaminação endofítica

Além da contaminação superficial, que é constituída pelos mais diferentes tipos de bactérias e fungos, existe um outro tipo que é a contaminação endofítica (LEIFERT; WAITES, 1990). Como o próprio nome indica, este é um tipo de contaminação presente no interior da planta, quer seja nos feixes vasculares, floema e xilema, ou nos espaços intercelulares.

Existem vários grupos de microrganismos endofíticos, tais como os fungos, bactérias, micoplasmas, virus e viroides (GEORGE, 1993). Muitos desses microrganismos são patogênicos, enquanto outros não o são, podendo até mesmo apresentar efeitos benéficos à planta hospedeira (DOLE; WILKINS, 1988; GEORGE, 1993).

Os vírus, viroides e micoplasmas, embora possam representar problemas para o estabelecimento da cultura in vitro, são muito pouco estudados nesse tipo de culturas, e, em geral, apenas os vírus recebem uma atenção maior, já que podem interferir com maior frequência no crescimento da planta em condições de campo. Dessa forma, em condições in vitro, apenas os fungos e bactérias são considerados problemas prioritários em termos de contaminação.

Os sintomas causados pelos organismos patogênicos são mais facilmente identificados no momento da coleta do material vegetal, e assim é possível escolher os órgãos ou tecidos pouco afetados. Por outro lado, os organismos não patogênicos passam despercebidos e são de difícil eliminação visual no momento da coleta, só aparecendo mais tarde durante o cultivo in vitro. Felizmente, esse tipo de contaminação é menos comum e está associado a certos tipos de planta (DEBERGH; MAENE, 1984).

Tratamentos com antibióticos e fungicidas da planta matriz resulta em pouco ou nenhum benefício. Assim, tentativas de eli­minar a contaminação endofítica pode ser feita por meio da adição de antibióticos e fungicidas apropriados. Entretanto, vários autores (FALKINER, 1990; GEORGE, 1993) afirmam que raramente é possí­vel a limpeza completa pela adição de antibióticos e fungicidas de uma cultura contaminada. Além do mais, o uso dessas substâncias deve atender algumas condições, por exemplo, ter ação sistêmica e não afetar o crescimento do tecido. Falkiner (1990) listou, pelo menos, dez características que um antibiótico ou fungicida deve apresentar para poder ser utilizado in vitro com segurança.

Alguns órgãos vegetais, como as raízes, são mais contamina­dos do que outros, embora em alguns casos toda a planta possa estar tomada por microrganismos endofíticos. Em nosso laboratório, a presença de organismos endofíticos se restringiu a bactérias, embora se saiba que fungos possam igualmente estar presentes no tecido vegetal sem causar nenhum distúrbio metabólico que possa ser identificado visualmente, como a mudança de coloração dos tecidos.

Contaminação ambiental

Um terceiro tipo de contaminação é aquela derivada do ambiente. Em princípio, toda contaminação é de origem ambiental, mas preferimos denominar de contaminação ambiental apenas aquela contaminação proveniente do ambiente, seja durante a desinfestação, durante o cultivo ou durante os procedimentos de subcultivo e renovação do meio de cultura.

A recontaminação do explante é uma ameaça constante, e todo cuidado é pouco no sentido de minimizar a perda de culturas por esse motivo.

Todo o ambiente do laboratório está contaminado, com exce­ção do interior dos frascos onde estão as culturas e o ar da capela de fluxo laminar. Assim, a recontaminação constitui uma das maiores causas de perdas de culturas por contaminação principalmente do tipo bacteriana. A recontaminação fúngica é muito menos frequente e denota falta de experiência ou desleixo durante os procedimen­tos de subcultivo e transferência dos explantes para frascos novos.

Aspectos gerais da contaminação

O uso de meio líquido pode levar a uma maior perda de culturas por contaminação, uma vez que o ambiente nesse meio facilita a dispersão dos contaminantes, sejam eles fungos ou bactérias, ao passo que em meio gelificado o esporo de fungos ou bactérias pode se restringir a um ponto na superfície do meio, ser identificado, e a cultura salva pela transferência para meio novo.

A contaminação fúngica, seja de origem externa, endofítica ou ambiental, em geral é facilmente identificada após alguns dias de cultivo, já a contaminação bacteriana é mais sutil e demora de alguns dias a algumas semanas para poder ser identificada. A contaminação com leveduras não é facilmente detectável, a não ser pelo odor de substância fermentada que exala do meio de cultura contaminado (GEORGE, 1993). Há, igualmente, uma discreta mudança de turbidez do meio de cultura.

Como o meio de cultura utilizado para o explante vegetal muitas vezes não é adequado para o crescimento de algum grupo de bactérias, o crescimento destas fica restrito ao explante e é de difícil identificação visual ou, para o caso de meio líquido, cresce lentamente com mudança gradual na turbidez do meio de cultura. Assim, cuidados especiais devem ser tomados para identificar e eliminar essas culturas contaminadas (BRADBURY, 1988).

É muito comum conferir ao primeiro sinal de contaminação persistente o nome de contaminação endofítica. Muitas vezes, os problemas estão relacionados muito mais a procedimentos inadequados de desinfestação do que mesmo da presença de contaminantes de origem endofítica, a qual felizmente não é tão frequente e depende em grande parte do tipo de material vegetal e espécie de planta utilizada (DEBERGH; MAENE, 1984).

Quando se pretende eliminar as bactérias via adição de antibióticos, o meio de cultura deve, em geral, ser mais pobre, inclusive com um menor teor de sacarose e sem adição de caseína ou qualquer outra fonte de aminoácidos. Dessa forma, desfavorecendo o crescimento da bactéria, é possível melhorar a eficiência do antibiótico. Entretanto, de acordo com George (1993), a eliminação completa de contaminantes da cultura in vitro via tratamento com antibióticos é raramente bem sucedida.

Contaminação em biorreator

Com o desenvolvimento de equipamentos denominados biorreatores para cultivo de células, embriões e gemas utilizando meio líquido e frascos com volumes variando de meio litro a algu­mas dezenas de litros, um dos problemas que surgiram foi o da contaminação. O problema tornou-se mais evidenciado porque a perda de um tubo de ensaio ou um frasco tipo maionese de 250 mL resulta na perda de uma ou algumas mudas, já a perda de um frasco de biorreator pode ser de algumas dezenas ou mesmo centenas de mudas.

Um outro aspecto diz respeito ao tamanho e à manipulação dos frascos. Um tubo de ensaio ou um frasco tipo maionese de 250 mL é facilmente esterilizado em autoclave e manipulado com segurança no interior da capela de fluxo laminar. Bocas estreitas também contribuem para uma menor taxa de recontaminação das culturas. Já os frascos de biorreatores com alguns litros ou mesmo dezenas de litros são muito mais difíceis de serem esterilizados e manipulados na capela de fluxo laminar, o que pode, caso não se tomem os devidos cuidados, resultar num aumento expressivo da taxa de recontaminação.

Contaminação em biorreator de imersão temporária

Em princípio, não existe diferença entre a taxa de recontaminação em biorreator de imersão permanente ou temporária. Ambos os equipamentos são de manipulação relativamente difícil, o que, se não se tomarem os devidos cuidados, a recontaminação comprometerá todos os frascos.

Como trabalhamos no desenvolvimento de protótipos de bior­reator de imersão temporária visando à micropropagação, vamos nos ater mais especificamente a esse modelo de equipamento.

Foram desenvolvidos até o momento quatro protótipos de biorreator de imersão temporária como podem ser vistos pela Figura 1. Os modelos apresentam o mesmo fundamento básico, que pode ser resumido no uso de frascos gêmeos, conectados entre si, sendo um frasco para cultivo do explante e outro para o meio de cultura. A intervalos de tempo preestabelecidos, de acor­do com a programação dos temporizadores, o meio de cultura é automaticamente transferido de um frasco para outro, retornando em seguida para o frasco anterior de modo a estabelecer a imer­são do material em cultivo. Os protótipos A, B e C apresentam basicamente a mesma configuração, com a diferença de que, para o modelo C, a iluminação é feita de baixo para cima, além de constituir um modelo mais compacto. No entanto, o modelo D, um protótipo para uso em escala industrial, apresenta uma construção bem diferente, sendo constituído de uma estante com 5 prateleiras, sendo 8 pares de frascos em cada prateleira. Além do mais, o volume de cada frasco é de 5 L e faz uso de frascos descartáveis ao contrário dos frascos dos protótipos anteriores, nos quais se utilizam frascos de vidro autoclaváveis de, no máximo, 2 L.

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Figura 1. Protótipos de biorreatores desenvolvidos pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. A) Modelo de 4 pares de frascos; B) Modelo de 12 pares de frascos, com 3 unidades de controle independentes; C) Modelo de 4 pares de frascos, com iluminação de baixo para cima; D) Modelo industrial de 80 pares de frascos.

Fotos: João Batista Teixeira

Procedimentos no que se refere à contaminação e recontaminação

Para todos os protótipos, o meio de cultura é esterilizado via autoclavagem. Cuidados gerais devem ser tomados para a autoclavagem do meio de cultura. Inicialmente, estoques velhos de reagentes não devem ser usados, uma vez que podem conter esporos de bactérias que podem resistir à autoclavagem. Durante o processo de autoclavagem, deve-se cuidar para não superlotar o equipamento e impedir a circulação de vapor, o que pode criar bolsões de ar no interior da autoclave onde a temperatura não atingirá os 121 ºC necessários à esterilização. Além do mais, ao final do período de 20 minutos sob temperatura máxima, não se deve abrir demasiadamente a válvula de liberação de vapor da autoclave. Esse procedimento acelera o resfriamento e pode comprometer o processo de esterilização. Abertura parcial da válvula só pode ser feita em ambientes com temperaturas muito altas, acima de 30 ºC, de modo que a temperatura da autoclave decresça adequadamente evitando a degradação do meio de cultura por exposição prolongada a altas temperaturas.

Além do meio de cultura, são autoclavadas as mangueiras e filtros de ar, devidamente embalados em sacos plásticos de PVC antes de serem levados para a autoclave. Os frascos de 5 L do modelo D são esterilizados por radiação gama por empresas espe­cializadas e chegam ao laboratório embalados em sacos plásticos duplos, prontos para o uso.

Além desses cuidados, alguns procedimentos são utilizados para minimizar a contaminação e recontaminação dos explantes durante o cultivo nos frascos de biorreator, que podem ser resumi­dos nos seguintes: a) preparo do explante inicial e uso de caseína hidrolisada; b) procedimentos na capela de fluxo laminar; c) carac­terísticas do laboratório em termos de construção e limpeza.

Preparo do explante inicial e uso de caseína hidrolisada

Um dos cuidados básicos refere-se ao preparo do explante inicial a ser introduzido nos frascos do biorreator. Os procedimen­tos dependem da espécie em cultivo, mas, em geral, seguem os mesmos passos. O estoque inicial das culturas in vitro é subculti­vado para meio líquido em camada fina, de 0,5 cm a 1,5 cm, con­tendo de 250 mg L-1 a 500 mg L-1 de caseína. A presença de caseína é benéfica para o crescimento do explante, embora também o seja para os possíveis contaminantes, principalmente bactérias, que são mais frequentes nessa fase. Assim, o aparecimento da contaminação por turvamento do meio é mais rápida e mais intensa. Além do mais, a presença de caseína reduz a precipitação de alguns componentes do meio básico, muito comum após a autoclavagem, o que, às vezes, pode dificultar a identificação de mudança na turbidez do meio por causa de contaminantes. Em seguida, os frascos que apresentarem algum tipo de turvação do meio são eliminados. Dependendo da espécie, os explantes podem ficar nesse meio por até quatro semanas, tempo suficiente para que possíveis contaminantes possam crescer e alterar a coloração e transparência do meio.

Procedimentos na capela de fluxo laminar

Como não poderia deixar de ser, a manipulação em capela de fluxo laminar constitui a fase em que ocorre o maior índice de recontaminação. Isso não é exclusividade do uso de biorreatores, mas ocorre com qualquer espécie e qualquer tipo de frasco e meio de cultura.

No caso do biorreator, os frascos são montados e inoculados dentro da capela, o que requer duas pessoas para manipular o protótipo D. Para os outros protótipos, uma pessoa pode, satisfato­riamente e com segurança, manipular os frascos, seja para mon­tagem, inoculação ou troca do meio de cultura.

No momento da montagem, a chance de recontaminação é pequena, já que os frascos do modelo D encontram-se protegidos em sacos plásticos duplos, sendo o primeiro eliminado antes de ser conduzido para a capela e o segundo já no interior da capela, o que confere total segurança ao procedimento. Durante a inoculação, os frascos contendo os explantes são limpos externamente com álcool a 70% de modo a reduzir ao máximo poeira, fungos e esporos de bactérias.

O diâmetro da boca do frasco de 5 L do modelo D é de aproximadamente 4 cm, o que minimiza os riscos de recontamina­ção durante a inoculação e troca do meio de cultura. Além do mais, apenas um frasco é aberto em ambos os proce­dimentos, isto é, tanto na inoculação quanto na troca de meio.

Características do laboratório em termos de construção e limpeza

O laboratório de micropropagação deve ser devidamente planejado no que diz respeito a possíveis fontes de contaminação microbiológica. A proximidade de fontes de poeira e exposição a ventos fortes pode contribuir para uma indesejável taxa de recontaminação das culturas. Correntes de ar, seja de origem externa ou interna como a dos aparelhos de ar condicionado, comprometem o trabalho de assepsia e acarretam altas taxas de contaminação e recontaminação. Além disso, fonte de umidade interna pode propiciar o crescimento de fungos, cujos esporos vão se espalhar pelo laboratório. É desnecessário ressaltar que culturas descartadas e contaminadas devem ser imediatamente autoclavadas, e os frascos lavados e secados rapidamente.

O laboratório deve ter o mínimo de poeira em circulação, o que constitui fonte de contaminantes fúngicos principalmente. Muitas vezes, o uso de aparelhos insufladores de ar estéril é a melhor medida para reduzir o índice de recontaminação no laboratório. O piso e as paredes devem ser revestidas preferencialmente de cerâmica, de tal forma a permitir uma limpeza cuidadosa com a frequência necessária.

Da mesma forma, a circulação de pessoas no interior do laboratório deve se restringir ao pessoal absolutamente necessário à condução dos trabalhos. Deve-se limitar ao estritamente impres­cindível as visitas de terceiros. Mesmo assim, o visitante deve usar calçados adequados fornecidos pelo laboratório, além de um guarda-pó. Alguns locais como sala de transferência não devem, em hipótese alguma, receber visitas.

Uma das maiores ameaças a um laboratório de micropro­pagação é o que diz respeito à proliferação de àcaros, os quais penetram os frascos de cultivo, deixando rastros facilmente visíveis de contaminação, tanto fúngica quanto bacteriana (BLAKE, 1988). A população de ácaros no laboratório deve ser mantida ao mínimo possível, por meio de tratamentos com produtos à base de formol, formaldeído ou cloreto de benzalcônio. Acaricidas específicos só são utilizados em casos extremamente raros, já que são produtos altamente tóxicos. Todas as medidas devem ser tomadas para que a infestação de ácaros não saia fora de controle, caso contrário, todas as culturas devem ser autoclavadas, e a sala de cultura passar por um tratamento rigoroso, até mesmo com a aplicação de acaricidas específicos caso o tratamento convencional não seja suficiente.

Outros modelos de biorreator

Para outros modelos de biorreator (TEIXEIRA, 2002), os cuidados para prevenir a contaminação e recontaminação dos frascos basicamente são os mesmos, embora particularidades devam ser levadas em consideração dependendo do modelo de equipamento a ser utilizado.

Conclusões gerais

A contaminação no laboratório de micropropagação é uma ameaça constante e qualquer descuido poderá ser devastador. Por isso, devem-se utilizar procedimentos de assepsia adequados capazes de manter a taxa de recontaminação em níveis aceitáveis, nunca superiores a 5%. Além disso, é importante notar que:

• Contaminações frequentes com fungos, principalmente aqueles comuns de ambiente, denotam desleixo ou baixa qualificação profissional.

• A recontaminação em biorreatores pode ser maior, caso não se tomem os devidos cuidados.

• Há necessidade de se adotar uma metodologia de trabalho adequada ao uso de cada modelo de biorreator, sobretudo nas fases de preparo do inóculo e da manipulação em capela de fluxo laminar.

• A contaminação bacteriana requer um constante moni­toramento, e há necessidade de um aprofundamento do conhecimento de cada tipo de bactéria, sobretudo daquelas de crescimento lento ou quase imperceptível, mas que pode afetar a cultura ao longo de semanas ou mesmo meses.

• A recontaminação de culturas assépticas é um dos princi­pais fatores de perdas em laboratórios de micropropa­gação, o que ocorre por vários fatores, mas a principal causa advém da inadequada manipulação das culturas em capela de fluxo laminar.

• A taxa de contaminação tanto bacteriana quanto fúngica pode ser mantida em níveis satisfatórios, mesmo com o uso de biorreatores, desde que os procedimentos sejam adequados.

Referências

BLAKE, J. Mites and thrips as bacterial and fungal vector between plant tissue cultures. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 163-166, 1988.

BRADBURY, J. F. Identification of cultivable bacteria from plants and plant tissue cultures by use of simple classical methods. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 27-37, 1988.

DEBERGH, P.; MAENE, L. Pathological and physiological problems related to the in vitro culture of plants. Parasitica, [S.l.], v. 40, p. 69-75, 1984.

DOLE, J.; WILKINS, H. A graft-transmissible factor in Euphorbia pulcherrima causing permanente changes in branching and other morphological characteristics. Acta HortiCulture, Leuven, v. 226, p. 283-288, 1988.

FALKINER, F. R. The criteria for shoosing an antibiotic for control of bacteria in plant tissue culture. Newsletter: International Association of Plant Tissue Culture, Calgary, v. 60, p. 12-23, 1990.

GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture. 2nd ed. Edington: Excegetic, 1993. v. 1.

LEIFERT, C.; WAITES, W. M. Contaminants of plant tissue cultures. Newsletter: International Association of Plant Tissue Culture, Calgary, v. 60, p. 2-13, 1990.

LONG, R. D.; CURTIN, T. F.; CASSELLS, A. C. An investigation of the effects of bacterial contamination on potato nodal cultures. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 83-91, 1988.

TEIXEIRA, J. B. Biorreatores. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento, Uberlândia, v. 4, n. 24, p. 36-41, 2002.