Capítulo 3
Detecção, isolamento e preservação de microrganismos contaminantes da cultura de células, tecidos e órgãos de plantas
Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Flavio Alterthum
Introdução
Numerosos gêneros de microrganismos têm sido encontrados vivendo associados epifítica ou endofiticamente a tecidos e órgãos de plantas. Especialmente os de origem endofítica, ou seja, que vivem internamente nas mais diversas partes das plantas, podem escapar do efeito das substâncias desinfestantes utilizadas antes do estabelecimento in vitro dos propágulos vegetativos, introduzindo-se ao meio de cultura junto com o explante inicial. Algumas espécies apresentam a capacidade de se expressarem em meio de cultivo de plantas logo nos primeiros dias de cultivo. Outras, porém, permanecem latentes no interior dos tecidos permanecendo protegidas dos agentes químicos. Por meio de mecanismos de permanência no interior dos tecidos, podem se propagar com o material vegetal durante os subcultivos, permanecendo latentes por longos períodos de tempo, em virtude de inibições ocasionadas por fatores como concentrações de certos sais e pH do meio, resíduos de substâncias desinfetantes utilizadas nos explantes e compostos antimicrobianos no meio de cultura.
Na maioria das vezes, a contaminação em um cultivo in vitro não é por causa de uma única espécie contaminante. Assim, é possível que o uso isolado de uma substância antimicrobiana, sem a relativa comprovação de sua eficiência em relação ao agente contaminante, não promova a eliminação por completo dos contaminantes presentes no cultivo. Por isso, um número considerável de autores combina duas ou mais substâncias, seja para aumentar as chances controle do total de microrganismos crescidos no meio de cultura ou para tornar essas substâncias mais efetivas no controle de uma determinada espécie contaminante (GILBERT et al., 1991; YEPES; ALDWINCKLE, 1994).
Mas mesmo que se faça a combinação de antimicrobianos, a adição destes no meio de cultura não é garantia de êxito no controle dos contaminantes por não se conhecer o tipo de contaminante e por não se saber a efetividade dessas substâncias junto ao contaminante aparente no meio de cultura. Portanto, além de ineficaz, o tratamento também pode se tornar caro pelo elevado preço desse tipo de substância. Além disso, assim como no tratamento de doenças, a identificação do patógeno é de fundamental importância para a seleção de substâncias de controle.
Boa parte dos antibióticos atualmente encontrados no mercado apresentam amplo espectro de ação, sendo eficazes tanto para espécies do grupo das gram-negativas como das gram-positivas. No entanto, para quem trabalha na cultura de tecidos, o detalhe da fitotoxicidade não pode ser esquecido, uma vez que os antibióticos normalmente usados na cultura de tecidos são os mesmos recomendados para a cura de doenças em plantas e seres humanos. Isso significa dizer que determinados tipos e concentrações de antibióticos quando adicionados ao meio de cultura podem ser tóxicos ao cultivo e, dessa forma, causar a perda do material vegetal (PEREIRA et al., 2003). Chama-se a atenção também para o fato de que o conhecimento e a interação dos microrganismos com o habitat e a descoberta de substâncias para seu controle são baseados em estudos com culturas puras.
Estratégias para a detecção inicial de contaminantes
Durante o ciclo vegetativo, os vários processos resultantes do desenvolvimento de um vegetal são importantes portas de entrada de microrganismos. É assim que acontece com a maioria das espécies causadoras de doenças de plantas, os saprófitos e os endofíticos encontrados nas plantas. Assim, basta que uma planta seja estabelecida em solo não desinfetado e sob condições externas para qualquer tipo de abertura favorecer a entrada de microrganismos, quer seja por aberturas naturais, como estômatos, lenticelas e flores ou pela expansão de raízes, quer seja por ferimentos causados mecanicamente ou por insetos e animais.
Diferente de muitos tipos de fungos, normalmente bactérias só são capazes de penetrar num vegetal por aberturas, uma vez que não são capazes de romper as camadas iniciais de células da planta. E, nesse contexto, a penetração causada por ferimentos é normalmente até mais importante que a penetração por aberturas naturais. Isso se deve ao fato de que logo após o ferimento há liberação de exsudados na parte ferida que podem servir como substâncias atrativas ao microrganismo em questão. Além disso, esse tipo de abertura proporciona o contato direto e mais profundo do microrganismo com as células e espaços intercelulares do hospedeiro, facilitando sua penetração e consequente translocação pela planta. E como é praticamente impossível se cultivar plantas em condições totalmente assépticas, a não ser sob condições in vitro, pode-se afirmar que todos os vegetais possuem uma importante flora microbiana no interior de seus tecidos.
Mas se ainda estamos longe de elucidarmos a importância e a relação desses microrganismos endógenos com a fisiologia e o desenvolvimento das plantas, sabidamente se reconhece que eles são as grandes causas de perdas de material em laboratórios de micropropagação, especialmente na etapa de estabelecimento do material. Para tanto, sua detecção prévia é altamente necessária para que se evite a multiplicação de materiais contaminados.
De modo geral, não há dificuldades para a detecção prévia de microrganismos num vegetal ou parte dele. As estratégias limitam-se a observar a presença dessa flora endofítica diretamente nos tecidos da planta por meio da microscopia ou então pela sua detecção por meio do crescimento de microrganismos em meios de cultura nutritivos enriquecidos. Apesar de raramente ser utilizada na cultura de tecidos para fins de visualização de contaminação, a técnica de detecção ou visualização por microscopia é a mais precisa quando se deseja observar a localização dos microrganismos nas diversas partes da planta, por exemplo, os espaços intra e intercelulares e o interior de tecidos vascularizados. Embora a detecção por microscopia nos proporcione importantes informações sobre a localização dos microrganismos na planta, na cultura de tecidos é uma técnica muito pouco utilizada. A grande maioria dos trabalhos de pesquisa visando à detecção de microrganismo é realizada cultivando tecidos ou órgãos de plantas em meios de cultura enriquecidos.
De maneira geral, qualquer meio de cultura que promova um eficiente crescimento microbiano pode ser utilizado para a detecção da flora microbiana presente nos tecidos das plantas. Em razão do elevado número de meios disponíveis e da complexidade na composição destes, uma vez que para muitas espécies já foram determinados meios específicos, torna-se difícil listar um meio de cultura ideal para o cultivo desses microrganismos in vitro. Além disso, normalmente não se sabe o tipo de contaminante na amostra, o que sugere a utilização de meios enriquecidos visando proporcionar o aparecimento do maior número possível de espécies nas placas.
Nesse aspecto, deve-se atentar para o fato de que determinadas formulações, pelas altas concentrações de nutrientes minerais, podem causar seletividade no crescimento microbiano, uma vez que muitos requerem condições e meios especiais para sustentar seu crescimento. Acrescente-se a isso o fato de que determinados grupos de microrganismos produzem substâncias que, em baixas concentrações, são antagônicas ao crescimento de outros grupos taxonomicamente afins. Este é o caso de algumas estirpes bacterianas que produzem bacteriocinas, consideradas por definição como substâncias com efeito antibiótico.E, em se tratando de ecologia microbiana, assume-se que esses grupos apresentam vantagem adicional em termos de sobrevivência e competição sobre aquelas incapazes de sintetizar tais substâncias.
Não bastasse a seletividade ocasionada pelas condições nutricionais dos meios e antagônicas dos microrganismos, sabe-se que os diferentes grupos de microrganismos apresentam crescimento mais ou menos lento que outros levando, muitas vezes, a erros de interpretação sobre a presença ou não de contaminantes no material em estudo. Portanto, propiciar condições ótimas de crescimento, especialmente relacionadas às condições nutricionais e físicas do meio, é aspecto importante que deve ser observado no estudo.
Como sabemos, os nutrientes para o crescimento microbiano são fornecidos por meios de cultura, e, assim como para qualquer tipo de organismo vivo, todas as células necessitam de uma fonte de carbono e energia e de diferentes tipos de sais inorgânicos (N, P, K, Fe, etc.) para seu crescimento. Os meios de cultura destinados ao cultivo de plantas, além de conter nutrientes minerais essenciais para o crescimento das plantas, contêm altas concentrações de sacarose e outros nutrientes orgânicos (vitaminas e aminoácidos) que garantem o crescimento das plantas sob condições in vitro. A sacarose é adicionada ao meio para a geração de esqueletos de carbono e produção de energia, visto que a fotossíntese das plantas é inferior ou quase inexistente nessas condições, quando comparada à das plantas sob condições naturais.
Se por um lado a sacarose constitui componente essencial para as plantas, sua adição combinada a outros componentes orgânicos torna o meio de cultura também como um excelente substrato para o crescimento de fungos, leveduras e bactérias (Tabela 1). E é por isso que apesar de não serem específicos para o crescimento microbiano, mesmo em meios de cultura como o de Murashige e Skoog (1962), amplamente usado para o cultivo de plantas in vitro, observa-se o aparecimento de contaminantes fúngicos e bacterianos.
Tabela 1. Composição iônica de macro e micronutrientes de dois meios de cultura utilizados para o cultivo de plantas e fungos. |
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Nutriente |
Elemento |
Meio de Murashige & Skoog (1962): cultivo de plantas |
Meio de Vogel (1966): crescimento de fungos |
Macronutrientes (mM) |
|||
Nitrato |
NO-3 |
39,40 |
16,85 |
Amônio |
NH4 |
20,61 |
8,13 |
Potássio |
K+ |
20,04 |
10,56 |
Cloreto |
Cl- |
5,98 |
0,57 |
Cálcio |
Ca2+ |
2,99 |
0,33 |
Magnésio |
Mg2+ |
1,50 |
0,34 |
Sulfato |
SO3-4 |
1,50 |
1,32 |
Fosfato |
PO3-4 |
1,24 |
26,18 |
Micronutrientes (µM) |
|||
Ferro |
Fe |
337,54 |
12,75 |
Boro |
B |
100,25 |
0,79 |
Manganês |
Mn |
99,97 |
22,40 |
Zinco |
Zn |
29,90 |
18,28 |
Molibdênio |
Mo |
1,03 |
0,21 |
Cobre |
Cu |
0,10 |
0,1 |
Sacarose |
87,60 |
– |
|
Glucose |
– |
55,00 |
|
Nutrientes orgânicos (µM) |
|||
Glicina |
25,40 |
– |
|
Inositol |
555,00 |
– |
|
Tiamina |
0,30 |
0,19 |
|
Ácido nicotínico |
4,06 |
– |
|
Piridoxina |
2,43 |
– |
|
Fonte: adaptado de Leifert et al. (1994). |
Rotineiramente, os meios de cultura mais utilizados para o isolamento de fungos e bactérias contaminantes têm sido o Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e o Ágar Nutriente (AN), respectivamente. Mas diversos outros meios ou formulações, como o 523 (KADO; HESKETT, 1970), Triptic Soy Agar (TSA 10%), Triptic Soy Broth (TSB 5%), ou mesmo formulações mais pobres como o ágar-água, podem ser utilizados para o isolamento e crescimento fúngico e bacteriano. O uso de dois ou mais meios de cultura visando aperfeiçoar o crescimento e obter o maior número de isolados possíveis é uma prática recomendável para se evitar que a comunidade associada ao hospedeiro seja subestimada. Essa estratégia foi utilizada por Oliveira et al. (2000) que utilizaram três diferentes tipos de meio de cultura indicadores para a detecção inicial de contaminantes no estabelecimento in vitro de gemas apicais de bananeira. Embora não tenham observado diferenças quanto ao tipo de meio utilizado, os autores relataram a dificuldade de visualização das colônias crescidas e relacionaram esse problema à translucidez dos meios, especialmente para o tipo de solidificante utilizado.
Dependendo do tipo de microrganismos que se quer detectar, normalmente o meio para fungos e bactérias apresenta uma pequena variação de pH. Para fungos o pH do meio é ligeiramente ácido (pH de 5 a 6), enquanto que para bactérias tende a alcalinidade (pH entre 7,0 e 7,2). Assim, dependendo dos microrganismos, os meios de cultura devem ser ajustados dentro dessas faixa específicas de pH à temperatura ambiente antes de serem autoclavados. Dependendo ainda dos microrganismos que se quer isolar e estudar, o meio de cultura pode ser suplementado com substâncias antifúngicas (fungicidas) ou antibacterianas (bactericidas) adicionando-as ao meio depois da esterilização, a frio, enquanto o meio estiver em processo de resfriamento, com temperatura não superior a 50 °C.
Outro fator a ser observado refere-se à temperatura de incubação. Além de variar de acordo com os grupos microbianos a serem isolados, a temperatura de incubação está diretamente relacionada com as reações metabólicas e necessidades nutricionais dos microrganismos, influenciando, dessa forma, o crescimento microbiano in vitro. As faixas de crescimento microbiano são bastan-te amplas, podendo situarem-se entre 20 °C e 37 °C. No entanto, como normalmente não se conhece o tipo de contaminante presente no material vegetal, pode-se utilizar inicialmente a temperatura padrão de 28 °C, embora testes de crescimento em diferentes padrões de temperatura sejam altamente recomendados.
O tempo de incubação pode variar de um dia a várias semanas, uma vez que algumas espécies podem apresentar crescimento mais lento que outras. No entanto, recomenda-se que, uma vez sob cultivo, as avaliações de crescimento sejam feitas diariamente para evitar que o tempo excessivo de isolamento possa levar ao aparecimento de contaminantes externos aos pretendidos.
Métodos empregados para o isolamento de contaminantes
Como as bactérias apresentam pouca variação morfológica, é praticamente impossível identificá-las pelo exame direto no microscópio, como normalmente acontece com os fungos. Assim, é necessário que elas sejam devidamente isoladas e purificadas de forma a permitir sua identificação por um conjunto de características e técnicas que incluem a morfologia das colônias e as técnicas bioquímicas, as reações a tratamentos com corantes e as moleculares, que são especificadas no capítulo 4.
De modo geral, são poucos os métodos empregados para o isolamento de contaminantes. Especialmente na área de cultura de tecidos, o isolamento de microrganismos contaminantes pode ser feito de duas formas: direta ou indireta.
Isolamento de forma direta
A forma direta é a mais comumente utilizada nos trabalhos visando à identificação e ao controle de microrganismos contaminantes de plantas in vitro. A técnica consiste em isolar os microrganismos logo após a comprovação visual do crescimento do contaminante in vitro. Com o auxílio de uma alça de platina ou palito esterilizado, colhe-se uma amostra do material contaminante, inoculando-o em um meio de cultura enriquecido (ME), como o ágar nutriente (AN), sendo em seguida colocado para crescer em temperatura de 28 °C a 30 °C. Uma vez crescido, esse material poderá ser utilizado para a etapa seguinte, ou seja, de purificação das colônias bacterianas.
Forma indireta
A forma indireta é a mais aconselhável para estudos de prevenção e conhecimento de populações endógenas presentes nos tecidos da planta. É pouco utilizada na cultura de tecidos, pelo menos para o controle, mas trata-se de uma técnica amplamente utilizada por microbiologistas no estudo de populações endofíticas e suas relações com as plantas e o ambiente.
A técnica consiste em cultivar explantes de qualquer parte da planta (brotações, folhas, entrenós, raízes, etc.) em meio de cultura enriquecido para promover o crescimento dos microrganismos presentes no vegetal em estudo. Nesse sentido, dependendo do tipo que se quer isolar, o meio de cultura pode ser suplementado com substâncias antifúngicas e antibacterianas visando à seletividade do crescimento. Nessa etapa, é fundamental que se obtenha o máximo possível de amostras da comunidade interiorana da planta, que represente as diferentes populações e espécies presentes naquele hospedeiro.
O passo inicial para o isolamento desses tipos de microrganismos refere-se à coleta das amostras. Estas devem ser provenientes de plantas sadias, sem nenhum sintoma que denote a presença de doenças. Deve-se também levar em consideração que diferenças de clima (época do ano), região (locais diferentes de coleta), estágio de desenvolvimento da planta (juvenil e adulta), bem como o tipo de material a ser coletado (folhas, raízes, hastes, brotações) podem proporcionar o crescimento de diferentes espécies de microrganismos, já que estes podem estar localizados em locais específicos dentro de uma mesma planta.
Uma vez selecionadas as partes da planta a serem cultivadas, os materiais são levados para o laboratório onde são submetidos à desinfestação superficial visando à completa eliminação da comunidade epifítica ou saprófita no tecido que se quer cultivar, tomando-se o cuidado de manter íntegras as partes internas do vegetal. Apesar da ampla gama de produtos possíveis de serem utilizados nessa etapa (peróxido de hidrogênio, formaldeído, etc.), os protocolos mais citados são aqueles que usam álcool (70%), hipoclorito de sódio ou cálcio, seguidos de lavagens consecutivas em água destilada e esterilizada. Os tempos de imersão variam em função da consistência do material. Assim, tecidos foliares normalmente requerem menos tempo de contato com essas substâncias quando comparadas a brotações ou internódios. Outro importante fator a considerar refere-se aos enxágues com água esterilizada, cujo objetivo é eliminar o excesso das substâncias desinfestantes que pode tanto ferir o material em cultivo, como inibir o crescimento microbiano pela ação tóxica.
Técnicas empregadas para o isolamento de forma indireta
Em seguida ao processo de desinfestação, o próximo passo para o cultivo desses explantes visando ao conhecimento da flora microbiana presente no vegetal é o cultivo fracionado dos explantes ou do extrato desses tecidos em meio de cultura.
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Fracionamento dos explantes
A técnica por fracionamento dos explantes consiste em seccionar os explantes, colocando-os em contato com o meio de cultura. Cada explante é normalmente dividido em partes de 0,5 cm a 1 cm, tomando-se o cuidado de eliminar as extremidades no caso de hastes, brotações e internódios, e as bordas, no caso de folhas, que sofreram influência direta dos agentes desinfestantes. Após devidamente identificados e com o auxílio de uma pinça, os explantes são transferidos para placas de Petri com meio enriquecido onde permanecem incubados sob temperatura de 28 °C a 30 °C. O tempo de incubação será aquele necessário para que se visualize o crescimento dos microrganismos ao redor dos explantes em cultura, que, dependendo da espécie e do tipo, podem variar de algumas horas a semanas, embora o crescimento de fungos seja normalmente mais lento do que bactérias, e num prazo não superior a cinco dias uma importante flora microbiana deve ser observada. Essa técnica é a menos trabalhosa e a mais simples de ser executada, sendo indicada especialmente para o isolamento de espécies que colonizam os vasos condutores do hospedeiro.
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Maceração dos tecidos
Quando o objetivo do trabalho for a determinação total da flora microbiana, independentemente de sua localização no vegetal, é mais indicado que os tecidos previamente selecionados sejam macerados em água, solução salina ou meio de cultura líquido esterilizados, e que este seja inoculado sobre um meio de cultura semissólido capaz de promover o crescimento microbiano. Também nesse caso, a desinfestação prévia dos explantes a serem utilizados é de fundamental importância para que se evite a contaminação das amostras por microrganismos epifíticos ou saprófitas, que possivelmente seriam eliminados pela desinfestação externa do tecido em estudo.
Uma vez realizada a desinfestação, com o auxílio de cadinhos e maceradores (pistilos) e sob absoluta condições de assepsia, 1,5 g de tecido vegetal é macerado em 5 mL de solução, com o intuito de liberar células dos endófitos presentes nas amostras. Para melhorar a difusão dos microrganismos para a solução diluidora e aumentar, assim, as chances de isolamento de microrganismos de baixa frequência nos tecidos e de crescimento lento em meio artificial, aconselha-se que o material macerado fique em repouso ou suave agitação de 20 a 30 minutos.
Uma vez terminado esse tempo, realiza-se o semeio desse macerado sobre a superfície do meio de cultura semissólido contido em placas de Petri e espalhamento com o auxílio de alça de repicagem. O uso dessa técnica pode permitir o surgimento de colônias isoladas. Para tanto, é aconselhável que se realizem diluições seriadas da solução macerada a fim de promover um eficiente crescimento individual de colônias, facilitando, dessa forma, as primeiras observações sobre as características morfológicas (tamanho da colônia, cor, brilho, bordas, etc.) dos isolados, além de ser uma importante indicação da diversidade naquele material vegetal.
Purificação dos contaminantes
Uma vez isolados os contaminantes, o crescimento das colônias em meio de cultura enriquecido normalmente não ultrapassa cinco dias. A partir de então, com as colônias desenvolvidas, realiza-se a purificação deles, já que na maioria das vezes pode haver mais de uma espécie contaminante.
As colônias são purificadas, tendo como critério as características morfológicas e microscópicas distintas dos isolados. As colônias assim selecionadas sofrem purificação pela técnica de esgotamento por estrias, no mesmo meio em que são repicadas (AN), sendo incubadas nas mesmas condições iniciais para crescimento. O número de subcultivos (repicagens) é variável e deve ser feito até que se obtenham colônias puras, comprovadas por meio de observações em microscópio estereoscópio (lupa).
Após os subcultivos, as colônias isoladas podem ser repicadas para tubos de ensaio com 20 mL de meio em bisel e armazenadas por curtos períodos de tempo a 4 ºC.
Controle da contaminação por meio da indexação dos materiais propagativos nos subcultivos
Mesmo que aparentemente após alguns dias passados do estabelecimento de material vegetal in vitro não se observe contaminação visual, bactérias podem permanecer latentes no interior dos tecidos e não apresentar crescimento por alguns subcultivos. Por isso, para evitar que o trabalho de vários subcultivos seja prejudicado ou até mesmo perdido com o aparecimento de contaminantes, testes simples de indexação dos materiais em cada multiplicação são indicados. Além de ser um indicativo da eficiência ou não do protocolo de descontaminação, a indexação do material nos subcultivos é importante por poder indicar a fonte da contaminação, uma vez que o aparecimento de contaminantes durante o subcultivo pode ser um indicativo da manipulação do material pelos operadores.
Para a detecção dos contaminantes, recomenda-se que utilizem meios de cultura enriquecidos, nos quais são semeados ou cultivados amostras do material em estudo.
Método da semeadura
Partindo-se de material aparentemente asséptico e já estabelecido, a parte interna recém dividida do explante no subcultivo é suavemente tocada com uma alça de platina ou com a lâmina do bisturi. Em seguida, a alça ou a lâmina é cuidadosamente colocada em contato com a superfície do meio de cultura escolhido para o teste, promovendo, assim, a semeadura de possíveis contaminantes. É possível também que essa semeadura seja feita de forma direta, tocando com a superfície do explante recém cortado o meio de cultura enriquecido. Sinais de crescimento microbiano nesse meio após alguns dias da semeadura são um indicativo de que o material está contaminado, embora em meio de multiplicação esse aspecto possa não ser evidente.
Método do cultivo de partes do explante
A indexação das plantas durante os subcultivos por meio de partes do explante consiste em cultivar as extremidades dos explantes no momento em que estes são subcultivados para um novo meio de cultura, preferencialmente enriquecido. Esse método é mais confiável que o anterior pelo fato de que, havendo presença de contaminantes, estes se desenvolvem próximos ao explante, eliminando possíveis dúvidas sobre a origem da contaminação.
Além da utilização de meio semissólido, o cultivo de partes do explante também pode ser feito em meio líquido sob agitação, com a vantagem de se observar um crescimento mais rápido de eventuais contaminantes. No entanto, assim como para o método de semeadura, nessa consistência do meio não é possível se ter certeza da contaminação ter sido originada do explante ou da manipulação.
Testes para avaliar a possível fitopatogenicidade dos isolados
Apesar de muitos autores declararem que as espécies contaminantes in vitro são raramente fitopatogênicas, a distinção entre ser ou não fitopatogênico é difícil de ser feita, pois a colonização de plantas por microrganismos endofíticos pode ser semelhante, em muitos casos, às infecções latentes por fitopatógenos. Esse fato foi citado por Bashan et al. (1982) que verificaram que isolados de Xanthomonas foram capazes de se multiplicarem endofiticamente em folhas de pimenta até que, sob determinadas condições ambientais, causaram sintomas no hospedeiro. Dessa forma, alguns testes rápidos podem ser realizados visando determinar essa característica dos organismos isolados.
Um dos métodos mais simples e rotineiramente utilizados é o teste de hipersensibilidade. O estudo de reações de hipersensibilidade em plantas por alguns tipos de bactérias permite detectar a fitopatogenicidade dos isolados, sendo uma importante fonte de informação sobre os microrganismos isolados, uma vez que, em virtude da elevada diversidade de bactérias muitas vezes crescidas nas placas, algumas podem se mostrar patogênicas ou serem de origem saprófita, ou seja, não causarem sintomas nos tecidos das plantas, mas serem consideradas contaminantes dos meios de cultura. Embora seja uma prática bastante comum nos laboratórios de fitopatologia, alguns cuidados especiais devem ser levados em consideração na aplicação da técnica.
Como citado previamente, o teste destina-se a detectar reações de hipersensibilidade das plantas a microrganismos, desde que estes sejam incompatíveis com o hospedeiro. Em outras palavras, significa dizer que na prática deve-se ter o cuidado de utilizar como planta-teste uma espécie não hospedeira para evitar resultados negativos, quando estes são na verdade positivos. Mas mesmo que se utilizem plantas não hospedeiras, existem inúmeros relatos sobre reações alternadas de potenciais microrganismos patogênicos mesmo em plantas não hospedeiras, como nos casos relatados por Gomide e Romeiro (1992) e Romeiro et al. (1988), que verificaram que algumas espécies de Xanthomonas e Erwinia apresentavam reações de sensibilidade típicas, mas outras vezes comportavam-se como saprófitas, deixando de incitar qualquer tipo de sintoma visível nas plantas testadas. Além disso, é comum que determinadas espécies de plantas escolhidas para o teste apresentem resultados divergentes e nem sempre respondem de maneira hipersensível à inoculação de microrganismos fitopatogênicos. Esse é o caso de plantas de fumo que podem facilmente apresentar reações típicas de sensibilidade em detrimento a outras plantas que podem não apresentar esses sintomas, mesmo utilizando o mesmo isolado para os testes. Por isso a importância de se utilizar, quando possível, mais de uma espécie de planta, como fumo, feijão, café, pimentão, soja, etc., para confirmar os resultados do teste.
Procedimentos para a realização do teste
Apesar de ser simples e rotineiro, o teste de hipersensibilidade requer que alguns aspectos básicos sejam observados na sua realização: que se utilizem células bacterianas em concentrações adequadas (de 107 UFC mL-1 a 108 UFC mL-1), que estas estejam vivas, que sejam aplicadas sob condições ambientais adequadas, além de se usar uma planta não hospedeira.
Nesse teste, os isolados bacterianos a serem testados são colocados para se desenvolverem em meios de cultura por 18 a 48 horas, preferencialmente utilizando-os na fase exponencial de crescimento. Uma vez desenvolvido o cultivo, utilizando-se água estéril ou solução salina (5 mL em tubo de ensaio), prepara-se uma suspensão bacteriana, que com o auxílio de uma seringa sem agulha é infiltrada no espaço internerval da face inferior da folha, sob a epiderme. A infiltração deve ser realizada lentamente até que se observe uma área encharcada na folha em razão do encharcamento dos espaços intercelulares. Uma vez terminado o processo, a área infiltrada toma uma coloração verde escura, que desaparece dentro de 30 minutos. Nesse teste, pode-se fazer a infiltração de vários isolados numa mesma planta, desde que na inoculação se utilize uma folha por isolado, e a identificação seja feita com atenção.
Uma vez realizada a infiltração dos isolados, as plantas devem ser mantidas sob condições de temperatura que não ultrapasse a 30 ºC, pois temperaturas superiores podem induzir resultados falso-positivos. O resultado do teste é rápido e bastante informativo, pois em pouco tempo após a infiltração já é possível verificar os resultados. A reação é positiva quando a parte infiltrada se necrosa dentro de um prazo de 12 a 24 horas. Necrose, amarelecimento ou dessecamento que começarem a surgir após esse período não devem ser interpretados como sintomas de sensibilidade.
Preservação dos microrganismos
Uma vez isolado um microrganismo, é desejável e, às vezes, necessário conservá-lo em laboratório para identificação, estudo ou uso no futuro. São várias as técnicas empregadas, e a escolha dependerá do tipo (gênero, espécie, grupo, subgrupo, raça, cepa, etc.) e do número de microrganismos diferentes, do tamanho do laboratório de microbiologia, das disponibilidades material e humana, bem como dos recursos financeiros disponíveis e da qualificação dos técnicos, entre outros fatores (GHERNA, 1995; ISAAC; JENNINGS, 1995).
Subculturas periódicas
A técnica mais comum consiste em semear o microrganismo em meio de cultura sólido, distribuído em tubos e periodicamente transferi-lo para novo meio. O tempo decorrido de uma transferência para outra dependerá da resistência do microrganismo bem como da composição do meio de cultura. É conveniente que o metabolismo microbiano seja reduzido tanto quanto possível, pois nessas condições ele permanecerá viável por tempo mais prolongado. Para conseguir tal resultado, há vários recursos que poderão ser aplicados de acordo com o tipo de microrganismo. Um deles, o mais simples, consiste em conservar as culturas microbianas à temperatura de geladeira; há bactérias e fungos que permanecem viáveis durante semanas e até meses. Outra técnica consiste em recobrir a cultura, após seu crescimento, com uma camada de óleo mineral estéril, reduzindo dessa forma o suprimento de oxigênio e, consequentemente, o metabolismo microbiano.
Para evitar o ressecamento das culturas, recomenda-se usar tubos com rosca e, além disso, recobrir a tampa com parafilme ou parafina.
A conservação em meio de cultura sólido envolve um trabalho intenso e constante, principalmente quando o número de microrganismos na coleção é grande. Além disso, são necessários muita atenção e cuidados na transferência ou repiques para evitar contaminações, ou seja, a proliferação de microrganismos indesejáveis. Outro aspecto relevante nessa técnica de conservação é que alguns microrganismos podem sofrer mutações durante sua multiplicação e com isto ter suas características genéticas alteradas.
Congelamento (até -20 ºC)
Algumas espécies bacterianas e fúngicas podem ser conservadas a temperaturas que variam de 0 ºC a -20 ºC, por período de alguns meses até dois anos. Para períodos maiores, não deve ser usado esse método, pois no seu procedimento de resfriamento há perdas significativas da viabilidade.
Nesse método, prepara-se uma suspensão microbiana, adiciona-se um crioprotetor como o glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) e procede-se ao congelamento lento. Esse detalhe técnico é importante, pois congelamentos rápidos ou bruscos levam a formação de cristais de gelo intracelulares e consequentemente a perda de viabilidade. Considera-se satisfatório a diminuição de 1 ºC a cada dez minutos. Crioprotetor é uma substância que penetra com facilidade na célula, atóxica na concentração empregada, e que protege ou diminui a formação de cristais que poderiam romper a membrana.
Congelamento (até -70 ºC)
O congelamento a -70 ºC é melhor que o anterior a -20 ºC no aspecto do tempo de conservação. O procedimento é semelhante, ou seja, a suspensão é misturada a um crioprotetor, por exemplo, glicerol, na concentração de 1/1. Essa mistura é acondicionada em pequenos tubos estéreis e colocada em congelador a -70 ºC.
Alguns cuidados são essenciais: a) a suspensão microbiana deve conter de 108 a 109 microrganismos por mL; b) não congelar ou descongelar mais do que uma vez; c) se for descongelar, faça-o rapidamente, colocando o frasco em banho-maria; d) marcar os tubos ou frascos com tintas ou marcadores que não saiam a baixas temperaturas. Os rótulos normalmente não suportam temperaturas tão baixas.
Uma pequena variante desse método, mas muito útil, é preparar pérolas de vidro que serão embebidas na suspensão citada acima e colocadas em pequenos frascos. Quando houver necessidade de recuperar o microrganismo, basta retirar uma pérola de vidro e colocar num meio de cultura adequado ao crescimento.
Congelamento (até -196 ºC)
Temperaturas em torno de -196 ºC têm sido obtidas em nitrogênio líquido e se mostrado muito eficientes para preservar microrganismos. Assim como em outros procedimentos, cultiva-se o microrganismo em condições ideais de crescimento, e a seguir as culturas são centrifugadas. Às células distribuídas em frascos de plásticos com capacidade para 4 mL, adiciona-se um crioprotetor, e a seguir inicia-se o abaixamento da temperatura. Inicialmente é lento até atingir -40 ºC, e em seguida coloca-se o crioprotetor em nitrogênio líquido para atingir -196 ºC. A essa temperatura os microrganismos podem ser conservados por muitos anos, dependendo sempre do tipo de microrganismo.
A recuperação é feita pelo descongelamento rápido em banho-maria e adiciona-se meio de cultura adequado para o crescimento do microrganismo.
Secagem
A maior parte das culturas de microrganismos morrem se dessecadas. Algumas, porém, se forem esporuladas (bactérias e fungos), podem ser preservadas por anos a fio. Os esporos (bacterianos) já são formas de resistência em virtude de seu protoplasma menos hidratado e, quando colocados em ambientes mais secos, tendem a se tornar ainda mais resistentes. Deve-se, portanto, cultivar o microrganismo de forma a esporular antes de prepará-lo para a conservação.
Uma forma simples e econômica de armazenar esporos é secá-los em fitas ou discos de papel de filtro e armazená-los num tubo de ensaio. Cada vez que for necessário, remove-se uma fita ou disco com auxílio de uma pinça e inocula-se num meio de cultura adequado. É recomendado que seja colocado em torno de 108 esporos viáveis por fita ou disco.
Outra forma econômica de armazenar bactérias é adsorvê-las à superfície de pérolas de vidro previamente lavadas, secadas e esterilizadas. A estas pérolas, adiciona-se uma suspensão de 108 bactérias por mL. Deixa-se secar, removendo, se necessário, excessos de suspensão e a seguir são colocadas em tubos de ensaio hermeticamente fechados e mantidos em temperatura de geladeira.
Fungos são conservados misturando-os com areia ou solo previamente esterilizados. Em alguns casos são cultivados no próprio solo e aí preservados, e em outros são adicionados após seu crescimento.
Liofilização
Este é um dos melhores métodos de preservação de microrganismos, e o processo é conduzido em aparelhos chamados liofilizadores. Em linhas gerais, o método consiste em cultivar o microrganismo em ótimas condições de crescimento e centrifugar ao final da fase logarítmica (se for uma cultura líquida). Adicionar às células um crioprotetor previamente esterilizado irá protegê-las para a fase seguinte que é a de congelar os microrganismos a -70 ºC. Glicerol, DMSO, leite desnatado são alguns dos protetores mais empregados. A suspensão microbiana é acondicionada em frascos ou ampolas de vidro, congeladas e a seguir colocadas no liofilizador para a secagem das células por meio do processo da sublimação, ou seja, a água é retirada da fase sólida e transportada à fase gasosa sem passar pela fase líquida. Para tanto, as células são submetidas ao alto vácuo no liofilizador. Concluída essa etapa, os frascos ou ampolas de vidro são fechados ou selados. Após a liofilização, as culturas devem ser mantidas em ambientes secos e temperaturas de geladeira, ou melhor ainda em congelador, a -30 ºC.
Referências
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