Capítulo 10
Intercâmbio de germoplasma: marcos regulatórios, diagnóstico e medidas de erradicação e controle de pragas e contaminantes exóticos
Vera Lúcia de Almeida Marinho
Abi Soares dos Anjos Marques
Introdução
O Brasil é detentor de cerca de 20% da biodiversidade mundial. Entretanto, a maioria dos produtos que fazem parte da alimentação dos brasileiros, como o arroz, o feijão, o trigo e o milho, são de origem exótica. A introdução de germoplasma vegetal no País se caracteriza como um processo dinâmico, utilizado para a obtenção de variedades mais produtivas, resistentes a pragas e adaptadas às nossas condições climáticas. Isso permitiu que, nas últimas décadas, o País passasse da condição de importador para exportador de diversos produtos, como soja, milho, ervilha, noz-moscada, canela, pimenta-do-reino, forrageiras, espécies florestais, frutíferas e hortaliças. No entanto, a introdução não controlada de germoplasma vegetal pode facilitar a entrada de pragas no País (MARINHO et al., 2003).
No Brasil, são inúmeros os exemplos de introdução de pragas exóticas que provocaram e em alguns casos ainda provocam sérios danos à agricultura. Podemos citar o exemplo do caso da introdução do fungo Diaporthe phaseolorum (Cke. & Ell) Sacc. f. sp. meridionalis Morgan-Jones, agente causal do cancro-da-haste-da-soja. Esse fungo, identificado pela primeira vez em 1989, causou sérios danos à cultura da soja, com perdas estimadas em até 100%. Atualmente essa doença está parcialmente controlada graças ao desenvolvimento de variedades resistentes. O mesmo não aconteceu com o nematoide do cisto-da-soja, Heterodera glycines Ichinohe, introduzido no País em 1992, e que até hoje representa uma ameaça para a cultura da soja (MARINHO et al., 2003). Outro exemplo recente de praga exótica no Brasil é a do fungo Mycosphaerella fijiensis. Em 1998, uma severa epidemia de sigatoka-negra, causada por essa espécie de fungo, foi constatada em diversas cultivares de banana, no Estado do Amazonas. Essa doença é responsável por perdas de até 100% da cultura na ausência de medidas de controle (CORDEIRO et al., 1998).
Para assegurar um movimento seguro de plantas, a introdução de germoplasma vegetal deve-se basear numa regulamentação fitossanitária eficaz para minimizar o risco da introdução de pragas exóticas no País.
Legislação fitossanitária
A primeira lei relativa à quarentena de plantas foi promulgada na França em 1660, mas somente em 1881 o primeiro acordo internacional sobre fitossanidade foi firmado na Europa, com a finalidade de prevenir a introdução de Phylloxera vitifoliae (Hemíptera: Phylloxeridae) em videira. No Brasil, o início das atividades dos serviços oficiais fitossanitários data de 1909, quando foi criado o Serviço de Inspeção, de Estatística e de Defesa Agrícola, mas somente em 1934 o Regulamento de Defesa Sanitária Vegetal foi publicado no Diário Oficial - Decreto nº 24.114 de 12 de abril de 1934 (BRASIL, 1934). Esse regulamento ainda está em vigor nos dias de hoje e ampliou largamente as atribuições do serviço de inspeção sanitária.
Em maio de 1977, a Portaria Nº 224 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) autorizou a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen) a executar o intercâmbio e a quarentena de germoplasma vegetal destinado à pesquisa. Em 2002, o Laboratório de Quarentena Vegetal do Cenargen foi credenciado pelo Mapa como Estação Quarentenária nível 1, ou seja, “Estação quarentenária com capacidade de detectar e identificar pragas quarentenárias em nível de espécie e que dispõe de instalações adequadas e especialistas renomados nas áreas de virologia, acarologia, nematologia, micologia, bacteriologia, entomologia e plantas invasoras” (BRASIL, 1999).
No que se refere à exportação de vegetais para o comércio, as normas para processamento das importações de sementes e mudas estão estabelecidas na Instrução normativa n° 50 de 29 de dezembro de 2006 (BRASIL, 2006).
No âmbito internacional, o Brasil é signatário da Convenção Internacional de Proteção de Vegetais, realizada em 1951, em Roma, pela Food and Agriculture Organization (FAO), e atualizada em 1997 durante 29ª sessão da Convenção. Essa convenção estipula que os governos devem cooperar entre si por meio de organizações regionais de proteção dos vegetais. Para isso, os países se organizaram em grupos geograficamente próximos para conceber e colocar em prática medidas fitossanitárias de quarentena de plantas no que concerne ao comércio e à pesquisa. As primeiras organizações regionais criadas com esse objetivo foram a European and Mediterranean Plant Protection Organization (Eppo), formada pelos países da Comunidade Europeia, e a North American Plant Protection Organization (Nappo), cujos países membros são os Estados Unidos, o Canadá e o México.
Em 1989, o Brasil, a Argentina, o Paraguai e o Uruguai – países componentes do Mercosul – e o Chile constituíram o Comite de Sanidad Vegetal del Cono Sur (Cosave) com o objetivo de estabelecer regulamentos fitossanitários para o intercâmbio seguro de material vegetal entre esses países. Os acordos comerciais entre esses países e a Organização Mundial do Comércio (OMC) garantem a livre circulação de bens, mas exigem uma nova política fitossanitária baseada em uma análise precisa dos riscos de entrada de pragas e não na proibição geral da entrada de alguns produtos vegetais. O intercâmbio de produtos vegetais entre os países do Mercosul é submetido a regulamentações específicas aprovadas pelo Cosave.
Intercâmbio de germoplasma vegetal
A Embrapa coordena o Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuária (SNPA), que inclui as unidades da Embrapa, as Universidades e as empresas estaduais de pesquisa. Os pedidos de importação de germoplasma das unidades da Embrapa devem ser encaminhados diretamente ao Cenargen/Laboratório de Quarentena Vegetal (LQV), que toma as providências cabíveis junto a Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Mapa. Os requerimentos de importação de germoplasma dos demais órgãos de pesquisa deverão ser enviados diretamente à Superintendência Federal de Agricultura (SFA) do estado correspondente, que os encaminhará à SDA, e esta solicitará um parecer técnico do Cenargen antes de emitir a Permissão de Importação. Os procedimentos posteriores à chegada do germoplasma ao País cabem à DFA, e a quarentena é realizada pelo Cenargen ou por outro órgão de quarentena credenciado pelo Mapa.
Os pedidos de importação de organismos para controle biológico e outros afins, destinados à pesquisa das unidades da Embrapa, devem ser enviados à Embrapa Meio Ambiente que, por sua vez, os encaminhará à SDA /Mapa para obter a permissão de importação.
O Mapa é o órgão fiscalizador da introdução de vegetais junto às alfândegas de portos, aeroportos e correios. Cada estado possui um representante oficial do Mapa na SFA, juntamente com o Ministério da Fazenda (Alfândega da Receita Federal). Para a importação de produtos vegetais para pesquisa, a única exigência requerida do fornecedor do material é o Certificado Fitossanitário expedido pelo país exportador. Quando concedida a Permissão de Importação pela SDA, o Cenargen envia à instituição doadora o pedido de solicitação do material juntamente com a etiqueta de importação. O material, ao chegar ao aeroporto, porto ou correio, é inspecionado pela SFA, que examina as suas condições sanitárias e a documentação e prescreve a quarentena de pós-entrada em alguma instituição credenciada pelo Mapa (MARQUES; MARINHO, 2007).
Desde 1976, o Cenargen vem realizando o intercâmbio e a quarentena do germoplasma destinado à pesquisa, tendo sido intercambiados até novembro de 2007 um total de 526.680 acessos de germoplasma, 391.048 de importação, 58.927 de exportação e 76.705 acessos referentes ao trânsito interno.
As restrições impostas pelas leis brasileiras, quanto ao envio de material vegetal nativo, são em relação ao atendimento das solicitações recebidas dos nossos parceiros internacionais, diminuindo significativamente a quantidade de germoplasma exportado.
O trânsito interno do germoplasma atendeu principalmente a movimentação de material genético destinado à Colbase, aumentando a quantidade e diversidade de acessos armazenados.
Como exemplo, as Figuras 1, 2, 3 e 4 mostram o fluxo de germoplasma vegetal, países importadores e exportadores de germoplasma vegetal, quantidade de germoplasma intercambiado, assim como produtos mais importados e exportados pelo Brasil de 2004 a 2007.

Figura 1. Comparação entre importação e exportação de germoplasma vegetal realizada pelo Serviço de Intercâmbio de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 2. Intercâmbio de Germoplasma Vegetal. 2 A: países que mais receberam germoplasma enviado pelo Brasil (exportação); 2 B: países que mais enviaram germoplasma para o Brasil (introdução).
Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 3. Número de acessos de germoplasma vegetal intercambiado no período de 2004 a 2007.
Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 4. Principais produtos importados (4 A), exportados (4 B) e trânsito interno (4 C) pelo Serviço de Intercâmbio de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia no período de 2004 a 2007.
Fonte: Marinho et al. (2007).
Dentre as instituições internacionais que mais enviaram germoplasma para o Brasil destacam-se: o Centro Internacional para o Melhoramento de Milho e Trigo (Cimmyt), tanto da sua sede no México, quanto das unidades no Uruguai e Colômbia; o Centro Internacional para Agricultura Tropical (Ciat), na Colômbia; o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (Usda), o Centro Internacional da Batata (Cip) no Peru, o Instituto Internacional para a Pesquisa de Arroz (Irri) nas Filipinas e o Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (Csiro) na Austrália. No Brasil, as instituições que receberam maior quantidade de germoplasma do exterior foram: a Embrapa (várias Unidades), o Instituto Agronômico do Paraná (Iapar), a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S.A. (Epagri), a Universidade Estadual Paulista (Unesp) e a Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz (Esalq).
No Cenargen, todas as informações sobre o germoplasma recebido são conferidas pelo curador dos respectivos produtos e registradas no Sistema Brasileiro de Informação de Recursos Genéticos (Sibrargen).
Quarentena de germoplasma vegetal
A palavra quarentena é derivada do latim quadraginata que significa quarenta. Em italiano, essa palavra foi originalmente aplicada para o período de 40 dias de isolamento requerido para que um navio, incluindo seus passageiros e carga, permanecesse ancorado em um porto de chegada quando proveniente de um país onde ocorressem doenças epidêmicas. Provavelmente, a primeira quarentena foi imposta em Veneza, Itália, em 1374, quando viajantes suspeitos de ter contraído a peste bubônica foram banidos. Quarentena vegetal, literalmente, significa o isolamento de plantas por 40 dias, período de incubação para o aparecimento e detecção de sintomas de doenças. Na verdade, esse procedimento constitui apenas uma fração das diversas ações que são utilizadas em um programa de exclusão de organismos indesejáveis (KAHAN, 1989).
As medidas de quarentena aplicadas aos produtos vegetais podem ser de exclusão ou de erradicação. Em caso de exclusão, os riscos de entrada dos agentes patogênicos são minimizados pelo controle da sua ausência no material vegetal antes da importação. Ao contrário, a erradicação autoriza a aplicação de tratamentos térmicos, químicos, biológicos ou de limpeza por meio de cultura de tecido quando o vegetal já está dentro do país importador (KAHAN, 1989).
Por definição, uma praga quarentenária é um organismo de risco econômico potencial para a área posta em perigo e onde ainda não está presente, ou, se está, não se encontra amplamente distribuída e está oficialmente controlada. Considera-se praga quarentenária A1 aquelas não presentes no país, porém com características de serem potenciais causadoras de importantes danos econômicos se introduzidas. Pragas quarentenárias A2 são aquelas de importância econômica potencial, já presentes no País, porém não se encontram amplamente distribuídas e possuem programa oficial de controle.
Para decidir quais espécies são de importância quarentenária, para o país ou região, várias informações devem ser consideradas. É necessário avaliar o potencial das espécies exóticas em causar prejuízos no país em questão. Esse processo é o componente preliminar da Análise de Risco de Pragas (ARP).
Métodos de diagnósticos, erradicação e medidas de controle de pragas
O Laboratório de Quarentena da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia analisa todo o germoplasma vegetal que entra no País para pesquisa. Esse procedimento visa minimizar a possibilidade de entrada de numerosas pragas de importância quarentenária e econômica para o País.
A detecção de um agente patogênico, por exemplo, dentro do quadro de um procedimento de certificação ou de quarentena, exige prioritariamente que a sensibilidade da técnica adotada permita evidenciar uma infecção latente em plantas que não apresentam sintomas. A identificação requer a utilização de técnicas que apresentem níveis de especificidade suficientes para caracterizar o agente causal com uma precisão adaptada ao problema encontrado (MARINHO, 2001).
Os progressos na área de biologia permitiram o aparecimento de inúmeras técnicas possibilitando a caracterização de moléculas imunogênicas, em particular as proteínas ou as sequências de ácidos nucleicos. Esses métodos abrem novas perspectivas dentro do diagnóstico de fitopatógenos e apresentam desenvolvimentos constantes (MARINHO, 2001).
O Laboratório de Quarentena Vegetal conta com seis unidades de pesquisa especializadas: entomologia, acarologia, micologia, virologia, nematologia e bacteriologia. Cada unidade possui estrutura e metodologias próprias para detecção, identificação, caracterização e erradicação dessas pragas.
Unidades de acarologia e entomologia
Destina-se à detecção, identificação e erradicação de insetos e ácaros em todo germoplasma intercambiado.
O germoplasma vegetal é examinado diretamente no interior de armadilhas luminosas, utilizando-se refletor e/ou microscópio estereoscópio para a detecção de insetos e/ou ácaros, sempre procurando por ovos, formas imaturas e/ou adultos no material, ou vestígios – perfurações, excreções ou teias (OLIVEIRA et al., 1999).
Para detecção de espécies de ácaros, as sementes são mantidas em temperatura ambiente, peneiradas, e os resíduos depositados em placa de Petri. Essa placa é colocada dentro de outra maior contendo álcool 70% para evitar o escape dos ácaros. Os resíduos do peneiramento das sementes são examinados ao microscópio estereoscópio (NÁVIA et al., 1999).
Também são procuradas sementes contaminantes, ou seja, sementes de plantas invasoras, que não fazem parte do material vegetal solicitado.
Tratamento para controle e erradicação de insetos e ácaros
Semente: todo germoplasma importado, exportado ou em trânsito no país sob a forma de sementes é fumigado com fosfeto de alumínio a 56% (fosfina) por um período de 72 horas quando a umidade relativa está acima de 50% e a temperatura no local acima de 20 ºC. Em ambientes, com temperatura e umidade relativa abaixo desses valores, o período de exposição é de 96 horas. O tratamento é realizado dentro de tambores e em sala hermeticamente fechados, com as embalagens das sementes perfuradas com estilete para facilitar a penetração do gás.
Material de propagação vegetativa: estacas, bulbos, rizomas e outras formas de propagação vegetativa intercambiados são submetidos a tratamento químico que consiste na imersão do material, por 15 minutos, em calda contendo inseticida e acaricida (NÁVIA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 1999).
Unidade de micologia
Esta unidade destina-se à detecção, identificação e erradicação de fungos fitopatogênicos em germoplasma vegetal importado. Para tanto, utiliza várias metodologias de análise, de acordo com o tipo de material recebido. Na Figura 5, exemplo de interceptação de fungo exótico em germoplasma de batata, importado da França, introduzido no Brasil para melhoramento genético (MENDES et al., 2006).

Figura 5. Tubérculo de batata (Solanum tuberosum) infectado por Phoma exigua var. foveata, fungo exótico ao Brasil, mostrando sintomas externos e internos de podridão.
Fotos: Vera Marinho
As amostras de sementes ou de material de propagação vegetativa, ao chegar ao laboratório, são examinadas diretamente ao microscópio estereoscópio para a observação de sintomas de descoloração do tecido, lesões necróticas ou presença de estruturas fúngicas. Essas sementes e/ou os fragmentos de material de propagação vegetativa são distribuídos em placas de Petri contendo meio de batata-dextrose-ágar (BDA) ou outro meio de cultura específico, após terem sido desinfetadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 0,2% por 2 minutos e lavadas por 2 vezes em água destilada estéril. As placas são incubadas à temperatura de 25 °C a 28 °C, sob luz fluorescente contínua, por 7 a 8 dias (ISTA, 1976). Outra metodologia utilizada consiste em colocar as sementes em caixas plásticas do tipo gerbox contendo 2 folhas de papel de filtro umedecidas em solução de hipoclorito de sódio a 0,2% e incubadas em câmara com fotoperíodo de 12 horas de luz NUV (Near Ultra Violet) e 12 horas de escuro, durante 7 a 8 dias para esporulação. Após esse período, as sementes são examinadas ao microscópio estereoscópio para observação de estruturas fúngicas, isolamento e posterior identificação do fungo (ISTA, 1976).
Identificação de fungos fitopatogênicos
A identificação é realizada por meio de observações das características morfológicas e fisiológicas desses fungos ao microscópio estereoscópio e de luz. A confirmação da ocorrência no Brasil dos fungos identificados no germoplasma importado é feita por consulta ao livro Fungos em Plantas no Brasil (MENDES et al., 1998) e a revistas especializadas sobre o assunto.
Teste de patogenicidade em quarentenário
São realizados testes de patogenicidade para fungos patogênicos de ocorrência no Brasil ou exóticos com o objetivo de verificar o grau de virulência ou de danos causados na planta hospedeira. A técnica consiste em fazer uma suspensão de 104 a 106 esporos/mL do fungo cultivado em meio de cultura BDA ou V8. Em seguida, a suspensão de esporos é inoculada em plântulas da mesma espécie vegetal da qual o fungo foi isolado e mantidas em câmara úmida até o surgimento dos sintomas. Procede-se, então, o isolamento do fungo das lesões para confirmação da sua patogenicidade (MENDES; FERREIRA, 1994).
Tratamento para controle/erradicação de fungos em germoplasma vegetal
As sementes contaminadas com fungos exóticos ou que já são de ocorrência no País são tratadas quimicamente com fungicidas específicos de contato e/ou sistêmicos. Após o tratamento, a eficiência do mesmo é avaliada com a reanálise do material (ISTA, 1976). O material é enviado ao destinatário quando confirmada a erradicação da praga. Quando o tratamento químico não elimina a praga exótica, recomenda-se o emprego da técnica de cultura de tecidos. Nesse caso, a eficiência do método na erradicação do patógeno é de 100%.
Unidade de virologia
Destina-se à detecção, identificação e erradicação de vírus, viroides e fitoplasmas em germoplasma vegetal importado. De maneira geral, o diagnóstico da infecção viral em vegetais repousa sobre: a) detecção do agente patogênico por enxertia ou inoculação mecânica de plantas indicadoras (métodos biológicos); b) colocação em evidência de moléculas imunogênicas sintetizadas pelo agente patogênico (métodos imunológicos); c) revelação da sequência de ácidos nucleicos específicos ao genoma do agente patogênico (métodos moleculares) (MARINHO, 2001). Vários métodos são utilizados na detecção e identificação de vírus e viroides, dependendo do material recebido. Dos mais utilizados para o diagnóstico destacam-se os métodos que seguem.
Observação de sintomas em plântulas
As sementes são semeadas em caixas com solo esterilizado e mantidas em casa de vegetação para observação de sintomas típicos causados por vírus ou viroides (mosaico, deformação foliar, super brotamento, estrias, epinastia, clorose, etc.) em plântulas. Caso sejam observados alguns desses sintomas, procede-se a coleta de material para a execução de testes específicos (Figura 6).

Figura 6. Plantio em quarentenário para observação de sintomas em plântulas.
Foto: Vera Marinho
Inoculação mecânica em plantas hospedeiras
Folhas de plântulas apresentando sintoma são coletadas, trituradas em tampão fosfato (diluição 1/10) e o suco distribuído sobre as folhas das plantas indicadoras previamente pulverizadas com uma fina camada de carborundum. A inoculação é realizada com o dedo ou cotonete. Após a inoculação, as plantas são lavadas com água corrente para retirar o excesso de carborundum. Espera-se em torno de 7 dias para o aparecimento de lesões locais, e 14 dias para o aparecimento de sintomas sistêmicos.
Microscopia eletrônica (ME)
Duas técnicas são utilizadas para observar a presença de partículas de vírus em uma planta infectada. São elas:
(i) Leaf-dip (KITAJIMA, 1965) – Folhas mostrando sintomas de vírus são cortadas em pequenos pedaços e colocadas em uma gota de 1% de silicotungstato de sódio ou de acetato de uranila, ambas substâncias utilizadas para contraste em ME. Sobre a gota com o material triturado, coloca-se uma telinha de cobre, específica para ME, e deixa-se por 2 minutos. A telinha é retirada do líquido e, após remover o excesso de líquido da mesma, pode-se então examiná-la ao microscópio eletrônico.
(ii) Secções ultrafinas (KARNOVSKY, 1965) – Pedaços pequenos de tecido vegetal (folhas, caule, raízes, etc.), provenientes de plantas infectadas, são fixados em 2% de glutaraldeído/paraformaldeído em tampão cacodilato de sódio (0.02 M, pH 7,2) por uma noite. Após lavagem do material em tampão cacodilato, os fragmentos são pós-fixados em tetróxido de ósmio (1% em tampão cacodilato 0.05 M) por 2 horas. Em seguida, os fragmentos são lavados com água destilada e colocados em acetato de uranila (0,5% solução) por uma noite. Desidratam-se os fragmentos em acetona 50%, 70%, 90% (uma vez) e 100% (3 vezes). No passo seguinte, o material é colocado em uma mistura de resina/acetona (1:1) por 4 horas, e em resina pura por 1 noite. A polimerização é feita em um molde de silicone a 70 ºC por 72 horas. Secções ultrafinas (50 nm) são realizadas utilizando-se ultramicrótomo e coradas com acetato de uranila (3%) por 20 minutos e em citrato de chumbo por 10 minutos. As secções ultrafinas são montadas em telinha de cobre e observadas ao microscópio eletrônico (Figura 7).

Figura 7. Micrografias eletrônicas de partículas de vírus alongados e esféricos e de inclusões causadas por Potyvirus.
Fotos: Vera Marinho
DAS-Elisa (SALAZAR, 1982)
É o teste imunológico utilizado para a detecção e identificação do vírus associado aos sintomas observados. Coloca-se nos orifícios de uma placa de poliestireno, própria para o teste de Elisa, IgG específico (antissoro) para o vírus a ser testado. Incuba-se a placa por 3 horas a 37 °C. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, os orifícios são cobertos com as amostras a serem testadas (antígenos) e mantidas em geladeira (4 ºC) por 1 noite. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, os orifícios são cobertos com uma solução de conjugado (anticorpo + enzima), e as placas incubadas por 3 a 4 horas a 37 °C ou à temperatura ambiente por 5 horas. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, um substrato da enzima é adicionado em cada orifício, e a placa é deixada à temperatura ambiente. Depois de 1 hora, uma primeira leitura é realizada.
Polymerase Chain Reaction (PCR) e Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
São testes moleculares usados para aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico. Suspeitando-se, por meio dos sintomas nas plantas após plantio das sementes e levantamento bibliográfico, da praga que está infectando o material vegetal analisado, extrai-se DNA ou RNA total dessas plantas e utiliza-se esse ácido nucleico como modelo para a detecção, como é o caso da grande maioria dos vírus de plantas e dos viroides. A reação PCR deve ser precedida de uma transcrição inversa do RNA viral (RT) em DNA complementar (cDNA). O ciclo da reação PCR, compreendendo as etapas de desnaturação, hibridização e alongamento do DNA, é repetido de 30 a 60 vezes. Após o término da reação PCR, o produto de amplificação é revelado em gel de agarose 1%, corado com brometo de etidium e observado sob luz ultravioleta (HADIDI et al., 1993; HALPER; HILLMAN, 1996).
Métodos para erradicação de vírus e viroides
Não existe tratamento químico que erradique vírus e viroides em plantas infectadas. Para a erradicação de vírus, submete-se o material infectado à termoterapia e/ou cultura de meristema. No caso de infecção por viroides, a limpeza do material só poderia ser eficiente utilizando-se crioterapia seguida de cultura de meristema. Esse procedimento ainda não é utilizado em quarentena.
Unidade de nematologia
Destina-se à detecção, à identificação e à erradicação de nematoides fitoparasitas em germoplasma vegetal importado, sendo utilizadas várias metodologias dependendo do tipo de material recebido.
Descascamento manual
Para amostra com pequena quantidade de sementes, principalmente aquelas que apresentam glumas e glumelas, como Panicum ou sementes de arroz, as partes externas das sementes são separadas do embrião e do endosperma, colocadas em água, por no mínimo 2 horas, e examinadas ao microscópio estereos-cópico para detecção de nematoides e posterior identificação (TENENTE et al., 1994).
Trituração
As sementes podem ser trituradas diretamente ou após a pré-imersão em água destilada durante 16 a 18 horas. Em ambos os casos a trituração das sementes em liquidificador deve ser de 20 a 30 segundos. A quantidade de água deve cobrir as sementes antes de triturá-las. Essa técnica não é recomendada para todo tipo de sementes, pois sementes de leguminosas, após a trituração, não podem ficar imersas, devem ser imediatamente passadas por peneiras e lavadas em água corrente. Nesse caso, como há fermentação, os nematoides ficam paralisados ou morrem por falta de oxigenação, não sendo possível recuperá-los (ZUCKERMAN et al., 1990).
Peneiramento
Utiliza-se um conjunto de peneiras de porosidade diferentes, de acordo com o material a ser usado nas extrações (solo, raiz, ou sementes) e da espécie de nematoide a ser recuperado. As peneiras comumente utilizadas são de porosidade de 0,149 mm (100 mesh); 0,074 mm (200 mesh); 0,037 mm (400 mesh) e 0,027 mm (500 mesh). O material em extração é lavado sobre uma ou mais peneiras, com água corrente, e recolhido em um becker seguido da observação em microscópio estereoscópio (ZUCKERMAN et al., 1990). Esse método é usado em combinação com outras técnicas de extração – trituração, bandeja, funil de Baermann – para melhor visualização dos nematoides em microscópio.
Unidade de bacteriologia
Destina-se à detecção, à identificação e à erradicação de bactérias fitopatogênicas em germoplasma vegetal importado. As bactérias fitopatogênicas são procariotos capazes de causar doenças em plantas e podem ser divididas em fastidiosas e não fastidiosas. Geralmente, as bactérias fastidiosas são estudadas por meio de microscopia de transmissão ou de testes moleculares, já que não podem ser cultivadas facilmente. Nessa categoria estão incluídos espiroplasmas, fitoplasmas e liberobactérias limitados ao floema. Estão incluídas também as bactérias limitadas ao xilema, como Xylella fastidiosa, causadora da clorose-variegada-dos-citrus (CVC). As principais bactérias fitopatogênicas não fastidiosas pertencem a 11 espécies: Erwinia, Pantoea, Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Xanthomonas, Xylophilus, Agrobacterium, Clavibacter e Curtobacterium (BRADBURY, 1986; HOLT, 1993; LELLIOTT; STEAD, 1987; SCHAAD et al., 2001).
Estes patógenos podem estar associados a sementes, materiais de propagação vegetativa, restos de cultura, solos, nematoides e insetos. A análise oficial de materiais provenientes de países estrangeiros, num sistema de quarentena, visa detectar a presença de bacterioses ainda não registradas na região ou país onde os materiais são introduzidos (MARQUES et al., 1994).
As taxas de infecção bacteriana em lotes de sementes são frequentemente baixas, variando de menos de 0,01% a 1%, o que dificulta sua detecção (SAMSON et al., 1999). Essa detecção é realizada por diferentes técnicas: (i) isolamento e cultivo do patógeno in vitro; (ii) microscopia ótica e eletrônica; (iii) sorologia; (iv) inoculação em plantas suscetíveis; e (v) uso de técnicas moleculares. A identificação do organismo isolado utiliza igualmente essas técnicas, além de testes bioquímicos (SCHAAD et al., 2001). A análise bacteriológica de sementes é feita por amostragem por meio de dois métodos: o plaqueamento do lavado de grãos em meio de cultura geral ou semisseletivo, se disponível, seguido da repicagem e identificação das bactérias isoladas, do plantio das amostras em solo esterilizado e da observação das plantas, anotando-se a presença de sintomas (MARQUES et al., 1995).
Variações desse método visando à detecção mais eficiente de patógenos específicos também são utilizadas, como a germinação de sementes de arroz em papel toalha para detecção de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e pv. oryzicola (MEW; MISRA, 1994). Quando o germoplasma é introduzido na forma de estacas, bulbos, rizomas ou tubérculos, o material é plantado em quarentenário e observado quanto à presença de sintomas.
Todo material que apresentar sintomas de infecção bacteriológica é processado em laboratório visando ao isolamento do organismo patogênico em meio de cultura (GARDAN; LUISETTI, 1987). Quando há crescimento de colônias bacterianas, as mesmas são analisadas com respeito à sua morfologia, à fisiologia e aos caracteres nutricionais e de patogenicidade, visando à sua identificação, que pode ser complementada por testes imunológicos como Elisa, imunodifusão e imunofluorescência. Métodos moleculares, como reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização de sondas de ácidos nucleicos, estão sendo desenvolvidos e testados para serem complementados na rotina de inspeção (CROWTHER, 1995).
Referências
BRADBURY, J. F. Guide to plant pathogenic bacteria. London, UK: CAB International Micological Institute, 1986. 332 p.
BRASIL. Decreto n° 24.114, de abril de 1934. Aprova o regulamento de defesa sanitária vegetal. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 04 abr. 1934, seção 1, p. 8514.
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