Capítulo 6
Estratégias de seleção e uso de substâncias químicas antimicrobianas para o controle de contaminantes na cultura de tecidos de plantas
Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Frederico Henrique da Silva Costa
Introdução
É inegável o avanço da biotecnologia nas últimas décadas. E, à medida que se intensifica seu uso e aplicações nas mais diversas áreas, a impressão que temos é que, a cada problema surgido, a pesquisa científica se encarrega de achar soluções, anos antes muitas vezes inimagináveis. Na área vegetal, a biotecnologia avança a passos largos, e há muito deixou de ser novidade. Muito embora algumas áreas, como a engenharia genética, ainda sejam um tema relativamente recente, há pelo menos um século pesquisadores desenvolvem e aperfeiçoam técnicas de manipulação vegetal in vitro e, mais recentemente, a propagação clonal em larga escala. Particularmente nesse último caso, a otimização de protocolos, aliada ao desenvolvimento de ferramentas mais práticas para a multiplicação de espécies, como o uso de biorreatores, proporcionou avanços consideráveis quanto ao aspecto da multiplicação de materiais-elite.
Mas, apesar disso, há pelo menos uma área na cultura de tecidos de plantas que, apesar de sua extrema importância, avançou muito pouco: a das contaminações. Por isso, é quase unanimidade entre os profissionais da área que o problema das contaminações constitui-se como a principal causa da perda de materiais in vitro. Nesse sentido, medidas, como uma adequada esterilização dos equipamentos, dos meios de cultura e do material vegetal inicial, associadas a um ambiente asséptico e de prevenção daqueles que manipulam o material, são indispensáveis para a diminuição desse problema (LEIFERT; WOODWARD, 1998; LONG et al., 1988; PEREIRA et al., 2003). No entanto, na maioria das vezes, esses cuidados básicos nem sempre são suficientes para evitar os problemas de contaminação; assim, outras medidas de controle dos contaminantes, normalmente por meio do uso de substâncias antimicrobianas, são necessárias.
De modo geral, as contaminações são mais comuns na fase de estabelecimento dos cultivos. Nessa fase, a ocorrência de microrganismos no cultivo pode ser em virtude de variados fatores, como a deficiente esterilização superficial dos explantes, dos meios de cultura e das vidrarias, ou ainda pela presença de microrganismos que habitam o interior dos tecidos da planta durante o desenvolvimento vegetal, usualmente denominados de endofíticos (LEIFERT et al., 1989; REED et al., 1998). De fato, é possível que todos os vegetais apresentem microrganismos em seus tecidos. Entretanto, apesar de ainda se saber muito pouco sobre a relação de microrganismos endofíticos com as plantas, além da identidade, diversidade e níveis populacionais, para a cultura de tecidos de plantas este tipo de contaminante é considerado o mais problemático, pois pode não se desenvolver no período inicial de cultivo, permanecendo latente nos tecidos das plantas em meio de cultura, vindo a se desenvolver somente após um determinado período de tempo, quando as condições do meio de cultura ou do ambiente tornam-se favoráveis para seu crescimento (PEREIRA et al., 2003). Assim, basta que um único explante esteja contaminado para que a disseminação aconteça nos estágios mais avançados de multiplicação do material vegetal, com o agravante de alguns desses microrganismos poderem ser resistentes às rápidas imersões em álcool e às temperaturas atingidas durante a flambagem dos instrumentos. Outro fator a se considerar nesse caso refere-se ao estado físico do meio de cultura. Normalmente, a multiplicação de cultivos em meio líquido, sob agitação, cria condições favoráveis para o desenvolvimento desses microrganismos endógenos, tornando-se um fator limitante para o crescimento dos explantes em meios com essa consistência (PEREIRA; FORTES, 2003).
As contaminações comprometem o crescimento e desenvolvimento dos explantes, pois, normalmente, competem com as plantas pelos nutrientes e vitaminas do meio de cultura, afetando o normal desenvolvimento destes, podendo levá-los, inclusive, a morte. Essa deterioração dos explantes está relacionada com a produção de metabólitos fitotóxicos, tais como os ácidos láctico e acético, cianeto, além de certos reguladores de crescimento e antibióticos (BAKKER; SCHIPPERS, 1987; KLOEPPER et al., 1989; LEIFERT et al., 1991; STANIER et al., 1987; YEPES; ALDWINCKLE, 1994).
Na prática, a diferença básica entre as fontes de contaminações está no fato de que fungos e leveduras podem ser mais facilmente percebidos no meio de cultura após poucos dias de cultivo, o que, de certo modo, facilita a eliminação de material contaminado. Já no caso das bactérias, por serem muitas vezes de difícil visualização, nem sempre a presença é evidenciada no início do cultivo e, dessa forma, podem ser disseminadas facilmente de um material para outro durante as etapas de multiplicação. Do ponto de vista prático, a melhor medida a ser tomada no caso de contaminação de cultivos é o descarte e a autoclavagem do material contaminado, ou em alguns casos, a convivência com o organismo contaminante por meio da aclimatização imediata do material em casa de vegetação. No entanto, a eliminação de material vegetal nem sempre é possível, e o número de plantas é insuficiente para a aclimatização: dessa forma, tratamentos curativos são recomendados (LEIFERT et al., 1989).
Nesse sentido, as estratégias empregadas rotineiramente para contornar essas limitações incluem desde a desinfestação superficial dos explantes com produtos à base de cloro até a adição de substâncias antifúngicas e antibacterianas no meio de cultura. No entanto, na maioria das vezes a desinfestação superficial é ineficaz para atenuar ou eliminar a ocorrência de contaminantes do explante. Assim, a seleção in vitro de tipos e concentrações de substâncias químicas antimicrobianas é necessária.
Estratégias de controle de bactérias por agentes químicos: testes de seleção de antibióticos e avaliação da fitotoxicidade aos cultivos
Para o controle das contaminações bacterianas, normalmente utilizam-se substâncias antibióticas que são incorporadas ao meio de cultura ou usadas diretamente sobre os explantes contaminados. Mesmo que se utilizem antibióticos bactericidas de amplo espectro e não tóxico às plantas in vitro, o controle bacteriano na cultura de tecidos é problemático. Na maioria dos trabalhos, a frequência de descontaminação não é total, pois, de alguma forma, os tecidos vegetais podem interferir no controle, seja destoxificando essas substâncias ou servindo como hábitat para os contaminantes que se translocam pelos tecidos das plantas. Dessa forma, é comum que as concentrações de antibióticos devam ser mais elevadas quando estes são adicionados ao meio juntamente com o cultivo. Nesse caso, o problema refere-se à toxicidade que essas substâncias podem causar aos explantes.
Uma das alternativas para se evitar o efeito tóxico dos antibióticos sobre os explantes é reduzir ao máximo o tempo do tratamento dos explantes com o agente antimicrobiano. No entanto, a não utilização de concentrações elevadas por períodos prolongados muitas vezes causam efeitos apenas bacteriostáticos ao invés de bactericidas, constituindo-se como uma ação paliativa frente ao principal objetivo que é a eliminação por completo do organismo contaminante. Os antibióticos bacteriostáticos induzem bloqueios reversíveis da síntese proteica dos microrganismos, fato que impede temporariamente a multiplicação normal das bactérias, mas não impede posteriormente a retomada do crescimento bacteriano, uma vez que o meio esteja livre dessas substâncias. As tetraciclinas, as sulfonamidas e o cloranfenicol são exemplos clássicos de bacteriostáticos. Por outro lado, substâncias bactericidas podem inibir a síntese proteica dos microrganismos ou destruir a membrana citoplasmática provocando lesões profundas e irreversíveis nas células bacterianas. Dessa forma, ao longo do tempo, verifica-se uma redução no número de microrganismos que será tanto menor quanto maior for a concentração do antibiótico. Os beta-lactâmicos, como as penicilinas e as cefalosporinas, e os aminoglicosídicos, como a gentamicina, são exemplos típicos de bactericidas.
O sucesso do trabalho com antibióticos somente pode ser obtido após o isolamento, a identificação e realização de testes de sensibilidade das bactérias aos antibióticos, além de avaliações quanto à toxidez dessas substâncias ao cultivo. Ressalte-se que em razão da fitotoxicidade e do alto custo do tratamento, os antibióticos devem ser utilizados apenas para contaminantes específicos das culturas, pois somente as bactérias que estiverem dentro do espectro de ação de cada antibiótico serão controladas (LEIFERT et al., 1991; PEREIRA et al., 2003; TENG; NICHOLSON, 1997).
Provas para determinar a sensibilidade dos isolados bacterianos a antibióticos
A suscetibilidade de bactérias isoladas a partir de cultivos in vitro pode ser avaliada por diversas técnicas. Contudo, pela praticidade e economicidade, as provas de sensibilidade por difusão com disco (antibiograma) e de determinação da concentração bactericida mínima inibitória (CBMI) são as mais recomendadas. Na verdade, ambos os testes referem-se à determinação da resistência ou suscetibilidade de uma bactéria a um ou mais antibióticos. No entanto, como normalmente na cultura de tecidos de plantas os testes são feitos utilizando-se discos de papel impregnados com concentrações fixas do antibiótico, é necessário que se realize, complementariamente a este teste, a determinação da CBMI como forma de se precisar, a partir de gradientes, a mais baixa concentração do antibiótico capaz de inibir ou eliminar uma população bacteriana. Além disso, ao final da seleção dos antibióticos, é de fundamental importância que se realizem testes visando verificar a toxicidade do antibiótico sobre o material vegetal em estudo.
Antibiograma
Uma vez isoladas e purificadas (ver capítulo 3), suspensões bacterianas a serem utilizadas nos testes são usualmente preparadas, colhendo-se um inóculo da cultura pura e transferindo-o para Erlenmeyer com 50 mL de meio caldo nutritivo (mesma formulação do meio ágar nutritivo, excluindo-se o solidificante ágar), o qual será incubado por 18 a 24 horas de 30 °C a 35 °C em agitação a 360 rpm. A partir de então, uma alíquota de 100 µL do agente microbiano, crescido anteriormente em meio de cultura, é espalhado sobre a superfície do meio de cultura ágar nutritivo (AN) ou Mueller – Hinton de consistência semissólida, contido em placas de Petri. Em seguida, discos de papel impregnados com os antibióticos que se quer testar são colocados, assepticamente, sobre o meio, sendo as placas então incubadas invertidas e no escuro à 30 °C–35 °C. Cada disco pode ser considerado como uma unidade de observação. Nesse ensaio, são normalmente testados diversos tipos de antibióticos, justamente para avaliar a maior ou menor suscetibilidade dos isolados a esses produtos. A sensibilidade dos isolados bacterianos aos antibióticos-teste é avaliada após 24 horas de incubação, determinando-se o tamanho do halo de inibição (Figura 1). Dessa forma, são considerados mais suscetíveis ao antibiótico os isolados que apresentarem a formação de um halo de inibição. Quanto maior o halo formado, maior será a suscetibilidade do isolado ao antibiótico, sendo este um tipo de agente indicado para as etapas seguintes do controle microbiano in vitro. Num estudo com bactérias endofíticas contaminantes na cultura da batata, Pereira et al. (2003) verificaram que entre doze antibióticos testados, seis apresentaram algum tipo de controle, e, destes, os que proporcionaram os melhores resultados para a inibição do crescimento bacteriano foram a ampicilina, o cloranfenicol, a estreptomicina e a tetraciclina em concentrações que variaram de 32 mg L-1 a 256 mg L-1 (Tabela 1).

Figura 1. Espécies de Pseudomonas isoladas de plantas de batata mostrando resistência (A) e suscetibilidade (B e C) a antibióticos.
Foto: Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Tabela 1. Sensibilidade a antibióticos de isolados bacterianos contaminantes de batata durante a propagação in vitro. |
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Antibiótico |
Isolado |
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Concentração (mcg mL-1) |
B2 |
B3 |
B4A |
B4B |
B7A |
B7B |
B8A |
B8B |
|
Amicacina |
30,0 |
13,0 s |
4,0 r |
3,5 r |
2,5 r |
10,7 s |
0 r |
7,5 r |
7,2 r |
Ampicilina |
10,0 |
5,5 r |
9,5 s |
10,0 s |
10,2 s |
10,7 s |
0 r |
0 r |
0 r |
Cefoxina |
30,0 |
4,2 r |
4,0 r |
3,5 r |
3,7 r |
8,5 s |
0 r |
1,0 r |
0 r |
Cefalotina |
30,0 |
5,0 r |
9,2 s |
9,2 s |
12,7 s |
9,5 s |
0 r |
0,5 r |
0 r |
Cloranfenicol |
30,0 |
5,2 r |
9,2 s |
7,2 r |
7,5 r |
7,5 r |
1,0 r |
14,0 s |
3,7 r |
Eritromicina |
15,0 |
8,5 s |
10,5 s |
10,0 s |
9,7 s |
4,7 r |
0 r |
10,0 s |
3,2 r |
Estreptomicina |
10,0 |
13,2 s |
4,5 r |
3,2 r |
3,2 r |
8,5 s |
0 r |
0 r |
0 r |
Novobiocin |
5,0 |
11,2 s |
7,2 r |
6,0 r |
8,2 s |
6,2 r |
0 r |
7,0 r |
3,0 r |
Penicilina |
10,0 |
3,2 r |
6,5 r |
7,2 r |
9,2 s |
4,7 r |
0 r |
0 r |
0 r |
Rifampicina |
5,0 |
9,2 s |
12,5 s |
11,5 s |
9,7 s |
5,2 r |
0,25 r |
6,5 r |
5,0 r |
Tetraciclina |
30,0 |
16,0 s |
9,2 s |
8,2 s |
8,2 s |
14,2 s |
1,2 r |
13,7 s |
7,7 r |
Vancomicina |
30,0 |
10,0 s |
4,7 r |
5,2 r |
5,7 r |
9,5 s |
0,7 r |
5,2 r |
3,7 r |
Sensibilidade dos isolados: r - resistente (halo < 8,0 mm); s - suscetível (halo ≥ 8,0 mm). |
Determinação da concentração bactericida mínima inibitória
Neste tipo de teste, é importante primeiramente que se ajuste o número de células bacterianas viáveis, entre 30 UFC mL-1 e 300 UFC mL-1, capazes de se reproduzir para que os resultados do teste sejam confiáveis, uma vez que em cada alíquota é possível que existam milhões de células bacterianas, nem todas viáveis. Uma das formas mais simples de se determinar o número de células viáveis (Unidade Formadora de Colônia – UFC) envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana cultivadas em meio líquido, sua inoculação superficial em meio sólido e posterior contagem do número de colônias crescidas, num determinado período de tempo, não devendo ultrapassar 24 horas para cada etapa. Para se alcançar o número ideal de células viáveis formadoras de colônias, é necessário que se façam diluições seriadas, de 10-1 a 10-8, das amostras em solução salina (0,85% NaCl) estéril, geralmente em triplicata para evitar possíveis erros como o de mais de uma célula bacteriana originar uma única colônia.
A determinação da concentração bactericida mínima inibitória (Minimal Bactericidal Concentration – MBC) consiste em se determinar a mais baixa concentração de antibiótico capaz de eliminar um contaminante. O método é realizado por meio de diluições seriadas do agente microbiano em caldo AN e na presença do isolado bacteriano em estudo. Geralmente, 11 tubos de ensaios com caldo AN são preparados em duplicata e esterilizados por autoclavagem (15 minutos sob 121 °C e 1,5 atm de pressão). Em câmara de fluxo laminar, as soluções dos antibióticos em teste são esterilizadas por filtração (Millipore, 0,22 µm) e adicionadas individualmente ao meio de cultura de forma a se obter uma diluição seriada de 1/2 a 1/1.024, correspondendo a concentrações que variam de 2,0 mg L-1 a 1.024 mg L-1 do produto testado. O meio do 11º tubo é usado como padrão, sem a adição de antibiótico. Em seguida, cada tubo de ensaio é inoculado com 100 µL da suspensão bacteriana (de 30 UFC mL-1 a 300 UFC mL-1) e incubados a 30 °C–35 °C no escuro. As bactérias testadas são crescidas por 24 horas sob agitação (360 rpm) em Erlenmeyers com 50 mL de caldo nutritivo.
A avaliação da turvação do meio de cultura é feita diariamente por um período de até 96 horas. Para confirmação dos resultados, as diluições não turvadas dos agentes-teste também são plaqueadas em meio AN semissólido, utilizando para tanto 3 repetições (placas de Petri), sendo a avaliação do crescimento feita até 72 horas de incubação. Os antibióticos empregados nesse teste são aqueles que mostrarem seletividade aos isolados, de acordo com os resultados obtidos no antibiograma (Tabela 2).
Tabela 2. Concentração bactericida mínima inibitória (CBMI) dos antibióticos ampicilina (Amp), cloranfenicol (Cloran), eritromicina (Erit), estreptomicina (Estrep), rifampicina (Rifamp) e tetraciclina (Tetrac) para diferentes estirpes bacterianas isoladas de batata sob micropropagação. |
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CBMI (mg |
Ampicilina |
Cloran- |
Eritro- |
Estrep- |
Rifampicina |
Tetraciclina |
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B2 |
B3 |
B4A |
B4B |
B7A |
B7B |
B8A |
B8B |
B3 |
B8A |
B2 |
B7A |
B3 |
B4A |
B4B |
B7B |
B8B |
B2 |
B4A |
B4B |
B7A |
B7B |
B8A |
B8B |
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0 |
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2 |
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4 |
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8 |
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16 |
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32 |
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64 |
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128 |
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256 |
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512 |
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1.024 |
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+ crescimento; - ausência de crescimento. B2: Enterobacteraceae; B3, B4A e B4B: Corynebacterium sp.; B7A: Enterobacteraceae; B7B: Acetobacteraceae; B8A: Xanthomonas sp.; B8B: Pseudomonas sp. Fonte: adaptado de Pereira et al. (2003). |
Avaliação da toxicidade de antibióticos no desenvolvimento in vitro de plantas
Assim como descrito anteriormente, para o controle microbiano in vitro não basta somente que os antibióticos sejam efetivos contra as bactérias contaminantes. Eles também devem ser atóxicos aos cultivos de maneira a permitir o normal desenvolvimento das plantas, uma vez fazendo parte do meio de cultura. Para tanto, experimentos de fitotoxicidade devem ser realizados na presença de um ou mais antibióticos no meio de cultura, antibióticos efetivos e selecionados nas provas de determinação da CBMI. Para tanto, recomenda-se que os ensaios devam utilizar concentrações acima e abaixo das concentrações obtidas nos testes da CBMI e um tratamento-testemunha para controle.
Antes de serem incorporados ao meio de cultura, os antibióticos a serem testados devem ser esterilizados a frio, por filtração, e adicionados ao meio de cultura quando este estiver em processo de resfriamento (de 40 °C a 50 °C). Após alguns dias de cultivo deve-se fazer a determinação da fitotoxicidade dos antibióticos em razão da sobrevivência e possíveis alterações morfológicas dos materiais em cultivo. Pereira et al. (2003) avaliou a fitotoxicidade dos antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina em 7 concentrações dos referidos antibióticos (0 mg L-1, 32 mg L-1, 64 mg L-1, 128 mg L-1, 256 mg L-1, 512 mg L-1 e 1.024 mg L-1) em meio líquido e semissólido durante a multiplicação de batata e verificou que a adição de ampicilina no meio de cultura até a concentração de 1.024 mg L-1 não afetou o desenvolvimento das plantas in vitro. No entanto, concluiu que a estreptomicina apresentou efeito fitotóxico mais pronunciado quando presente em meio de cultura líquido, e que os antibióticos tetraciclina e cloranfenicol não devem ser adicionados ao meio de cultura por períodos prolongados por causarem severos danos ao desenvolvimento in vitro do cultivo, mesmo em baixas concentrações (Figura 2).

Figura 2. Altura de brotações e taxa de multiplicação de batata em função de diferentes concentrações de antibióticos em meios de cultura de consistência semissólida e líquida, após 21 dias de cultivo.
Fonte: Pereira et al. (2003).
Estratégias de controle de fungos e leveduras por agentes químicos: testes de seleção de fungicidas e avaliação da fitotoxicidade aos cultivos
A adoção por métodos de seleção de tipos e concentrações de fungicidas visando ao controle de contaminações é ainda mais incipiente na área de cultura de tecidos de plantas que a de antibióticos. O que se observa é que as pesquisas reportadas até o presente momento utilizam em sua maioria o fungicida benomyl para o controle de contaminantes (HALDEMAN et al., 1987; SANTANA et al., 2003), havendo poucas informações acerca de outros compostos. Contudo, nos últimos anos, o interesse por novos produtos e de amplo espectro de ação tem sido evidente, visando não apenas ao controle de contaminação, mas também aos efeitos benéficos da utilização desses compostos no crescimento e desenvolvimento das plantas in vitro (COLOMBO et al., 2004; NAGY et al., 2005; ODA et al., 2003; WATT et al., 1996).
Assim como para os antibióticos, um fungicida para ser usado nas diferentes fases do cultivo in vitro deve satisfazer a alguns requisitos, como ser tóxico ao fungo alvo e não ao explante em uso, mesmo em concentrações altas; ser estável e de fácil obtenção; oferecer menor risco ao operador; ter boa solubilidade; não ser afetado pelo pH e pelo meio de cultivo; possuir amplo espectro de ação; ser passível de combinação; apresentar chances reduzidas de resistência; e ser de baixo custo (SANTANA et al., 2003). Satisfeitas algumas dessas considerações, procede-se à realização da seleção de fungicidas in vitro. Para tanto, utiliza-se de métodos rápidos e práticos, também conhecidos por bioensaios, nos quais se avaliam os diferentes princípios ativos para cada fungo em questão, suas concentrações adequadas, e, por fim, verificam-se os efeitos dessas concentrações sobre os explantes in vitro.
Dentre os fungicidas já utilizados em culturas in vitro, tem-se o benomyl (SANTANA et al., 2003), miconazole (TYNAN et al., 1993), chlorothalonil (COLOMBO et al., 2004; ODA et al., 2003), azoxystrobin, cabendazime, fededazole e imazil (SHIELDS et al., 1984); (SALGADO et al., 2001; SATO et al., 2004). No entanto, tem-se verificado efeitos fitotóxicos da utilização de alguns desses fungicidas em alguns casos, o que enfatiza a importância de estudos acerca de concentrações ótimas a cada cultura em estudo. Segundo George (1993), a ocorrência da toxidez de plantas a determinadas substâncias químicas depende geralmente de cada espécie e do tipo de explante em cultivo.
Um antimicrobiano sintético que tem sido bastante utilizado em cultura de células e tecidos vegetais é o Plant Preservative Mixture (PPM™), um biocida de largo espectro de ação, estável quando autoclavado e que pode ser aplicado para prevenir ou reduzir efetivamente a contaminação microbiana em cultivos in vitro. Acrescenta-se o fato de que, quando adicionado em concentrações adequadas, não prejudica a germinação in vitro de sementes, proliferação e regeneração de calos. Atua impedindo a germinação de ambos esporos de bactérias e fungos, por destruir as células destes, e, em altas concentrações, pode eliminar contaminações endógenas dos explantes.
No caso de leveduras, George (1993) reporta a utilização do chlotrinazole em cultura de meristema de macieira, além de outros como o iminooctodine, ampfotericin B e nystatin, sendo estes dois últimos atóxicos quando usados para cultivo in vitro dessa espécie. Estudo recente realizado por Nagy et al. (2005) recomendou os seguintes fungicidas para o controle da levedura Rhodotorula slooffiae em cultura de tecidos de macieira: ProClinw 300, mancozeb, thiabendazole, nitrato de prata e mancozeb + zoxamid.
Na Tabela 3 estão relacionados alguns fungos cuja ocorrência em cultivos in vitro já foi reportada pela pesquisa em cultura de tecidos de plantas.
Tabela 3. Contaminantes fúngicos reportados pela pesquisa durante o cultivo in vitro de algumas espécies de plantas. |
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Fungo |
Espécie vegetal |
Referência |
Alternaria tenuis Dendrophoma sp. Dothiorella sp. Collectotrichum sp. |
Meristemas de Camellia sinensis e C. japonica |
Haldeman et al. (1987) |
Actinomycete |
Macieira |
Hennerty et al. (1988) |
Fusarium oxysporum f. sp. cubense |
Meristemas de banana (cv. Maçã) |
Carneiro et al. (2000) |
Cladosporium sp. Alternaria sp. Aspergillus sp. Curvularia sp. Drechslera sp. Fusarium sp. Helminthosporium sp. Rhizopus sp. |
Explantes nodais de Psidium guajava L. |
Ramírez et al. (2000) |
Alternaria tenius Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Fusarium culmorum |
Sementes de Telfaria occidentalis e Hibiscus cannabinus |
Odutayo et al. (2004) |
Etapas do processo de seleção de fungicidas in vitro
Obtenção do isolado
De modo geral, os isolados são obtidos de material naturalmente infectado, podendo ser de folhas, ramos e raízes. Para tanto, porções do tecido infectado são cortadas, desinfestadas superficialmente, divididas em fragmentos menores e plaqueadas em meio de cultura adequado a cada espécie de fungo. Em geral, os meios mais utilizados para cultura de fungos são o Batata Dextrose Ágar (BDA), Yeast Potato Dextrose (YEPD) e Malt Extract Agar (MEA). No caso específico da cultura de tecidos vegetais, o isolamento pode ser proveniente de contaminações ocorrentes ao longo do processo de estabelecimento e fases subsequentes do cultivo in vitro, como reportado por Shields et al. (1984), Ramírez-Villalobos et al. (2000) e Santana et al. (2003).
Depois de feito o plaqueamento, as placas são incubadas em câmara de crescimento à temperatura e ao fotoperíodo adequados até o surgimento da estrutura reprodutiva do fungo, cujo tempo irá depender da sua taxa de crescimento. Em seguida, procedem-se as repicagens e a transferência para o meio novo visando obter a cultura pura do isolado, para então dar prosseguimento às etapas de caracterização e identificação.
Ramírez et al. (2000), com o objetivo de isolar e identificar fungos contaminantes durante o estabelecimento in vitro de segmentos nodais de Psidium guajava L., realizaram inicialmente a coleta e desinfestação superficial dos explantes pela imersão em 8 g L-1 de benomyl + 300 mg L-1 de rifampicina por 30 minutos, seguido de 1 minuto em álcool 70% e 15 minutos em hipoclorito comercial a 50%, sendo finalmente o material vegetal submetido à tríplice lavagem em água destilada e autoclavada. Decorrido esse processo, os segmentos foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10 mL de meio de MS autoclavado, suplementado com vitaminas, 20 g L-1 de sacarose e solidificado com 7 g L-1 de ágar. As culturas foram mantidas sob obscuridade e 25 ºC. Passados 5 dias do estabelecimento in vitro, o crescimento dos fungos foi detectado, sendo estes cultivados em meio BDA adicionado de ácido láctico a 25% para obtenção da cultura pura dos fungos. Posteriormente, lâminas foram preparadas contendo cada isolado corado com azul de algodão até os testes de identificação. Metodologia semelhante foi empregada com sucesso por Odutayo et al. (2004) para isolamento e posterior identificação de fungos contaminantes em cultura de tecidos de Hibiscus cannabinus e Telfaria occidentalis.
Caracterização e identificação dos isolados
Esta etapa é fundamental para que se obtenha êxito durante a seleção dos tipos e concentrações de fungicidas mais adequados para o controle. A caracterização morfológica das estruturas reprodutivas de cada fungo é geralmente feita com auxílio de microscópio óptico, e a identificação dos gêneros realizada mediante o uso de chaves taxonômicas e por meio de consulta na literatura micológica especializada (BARNETT; HUNTER, 1972).
Fungos contaminantes durante o estabelecimento in vitro de segmentos nodais de Psidium guajava L. foram identificados por Ramírez et al. (2000). Por meio dessa metodologia, os seguintes gêneros de fungos contaminantes foram identificados: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium e Rhizopus. Destes, os fungos Cladosporium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp. e Curvularia sp. representaram 87,5% do total, sendo o gênero Cladosporium sp. o de maior ocorrência (36,25%). Já os gêneros Drechslera sp., Fusarium sp., Helminthosporium sp. e Rhizopus sp. representaram 2,5%. Utilizando os mesmos procedimentos, Odutayo et al. (2004) caracterizaram e identificaram os fungos Alternaria tenius, Aspergilus niger, Aspergilus fumigatus e Fusarium culmorum em cultura de tecidos das espécies Hibiscus cannabinus e Telfaria occidentalis.
Bioensaios para avaliação e seleção de fungicidas
A maioria das pesquisas sobre a seleção in vitro de fungicidas em cultura de tecidos vegetais adotam como metodologia a introdução direta de concentrações de fungicidas nos meios de cultivo contendo os explantes infectados (HALDEMAN et al., 1987; SANTANA et al., 2003), havendo ainda aquelas que inicialmente identificam o agente contaminante, realizam testes de micotoxicidade, para em seguida avaliar os efeitos sobre os explantes. Contudo, embora não exista na literatura um método padrão para o caso da cultura de tecidos vegetais, existem outras metodologias de seleção de fungicidas in vitro descritas pela pesquisa científica, as quais serão abordadas a seguir.
Método baseado na adição de compostos químicos diretamente no meio de cultura
Este método tem sido aplicado por alguns trabalhos na área de cultura de tecidos, apresentando, inclusive, bons resultados. Seus riscos estão relacionados a problemas de fitotoxidez aos explantes e perda de material vegetal, o que, no caso, pode limitar seu uso.
O método consiste na avaliação de diferentes concentrações, geralmente em mg L-1 ou g L-1 do ingrediente ativo do produto ou de sua formulação comercial, as quais são introduzidas ao meio de cultivo por meio de filtragem a frio em membrana milipore, antes ou após o processo de autoclavagem, o que irá depender da sensibilidade do ingrediente ativo em se degradar ou perder sua atividade nesse processo, visto que no caso do benomyl há relatos de degradação (HALDEMAN et al., 1987). Os fungicidas são, em geral, dissolvidos em água destilada e autoclavada ou mesmo em solventes como o Dimethylsulfoxide (DMSO) ou acetona. Em seguida, explantes são cultivados nas referidas concentrações do fungicida até que se possa observar o aparecimento ou não dos contaminantes. Além das observações dos contaminantes, costumam-se fazer inspeções acerca da ocorrência de anormalidades nos explantes, tipo necrose, oxidação e morte dos tecidos. Caso não haja contaminantes e as culturas se apresentem normais, procedem-se as sucessivas repicagens em meio fresco.
Santana et al. (2003) utilizaram a incorporação de fungicidas e antibióticos no meio de cultivo de segmentos foliares de Annona cauliflora, A. bahiensis e A. glabra visando à obtenção de culturas assépticas. Assim, verificaram que a adição ao meio WPM de 1 g L-1 do fungicida comercial benlate 500 possibilitou a total eliminação dos fungos contaminantes.
Imersão dos explantes em soluções contendo os fungicidas e posterior cultivo em meio de cultura
Inicialmente, as soluções contendo as concentrações requeridas dos fungicidas são preparadas, pela diluição em água ou algum tipo de solvente, filtradas ou autoclavadas, e então adicionadas ao meio de cultura, geralmente líquido, já autoclavado e apresentando temperatura de aproximadamente 45 ºC. Decorrido esse processo, os explantes são submetidos aos tratamentos por período determinado, geralmente sob rotação (shakers) e na presença de luz. Posteriormente, os explantes tratados e não tratados, testemunha ou controle, são transferidos para meio de cultura sólido, específico a cada espécie e explantes, ou mesmo cultivados sob ágar nutriente. Em seguida, os meios de cultura com os explantes são mantidos sob condições de temperatura e luminosidade controladas até as avaliações de ocorrência de contaminantes e possíveis respostas fitotóxicas dos explantes. Alguns autores costumam repetir os primeiros resultados durante novos cultivos e por períodos mais longos de tempo de cultivo, visto que algumas vezes aparecem contaminações latentes, o que aumenta a confiabilidade dos resultados.
Haldeman et al. (1987) utilizaram essa metodologia para controle de contaminações fúngicas e bacterianas em cultura de brotos meristemáticos de Camellia sinensis e C. japonica, combinando o fungicida benomyl (Benomyl) e o antibiótico rifampicina. De acordo com os resultados, a adição de 1 g L-1 a 4 g L-1 de benomyl associado a 10 mg L-1 de rifampicina controlou eficientemente (de 85% a 95%) os contaminantes, não tendo sido observados efeitos fitotóxicos dos tratamentos ao cultivo.
Empregando metodologia similar, Kritzinger et al. (1998) obtiveram bons resultados para a descontaminação de rizomas de Zantedeschia aethiopica. Para isso, realizaram um pré-tratamento dos rizomas numa mistura dos fungicidas comerciais Captana e Mancozeb, ambos a 5 g L-1, sob rotação e condições de escuro, em diferentes intervalos de tempo. Em seguida, os rizomas foram submetidos a desinfestação padrão e cultivados em meio de MS. Verificou-se cerca de 65% de descontaminação pelo tratamento de 24 horas de exposição à mistura.
Métodos baseados na inibição do crescimento micelial e conidial
1) Método empregado por Tynan et al. (1993): com o objetivo de avaliar a efetividade do biocida Miconazole (micotoxicidade) sobre 23 fungos associados à cultura de tecidos vegetais, os autores utilizaram-se de 40 omycetes, 11 deuteromycetes, 4 ascomycetes e 4 contaminantes comuns no ar encontrados em um laboratório de cultura de tecidos vegetais. Inicialmente, os fungos foram cultivados em meio constituído de extrato de batata 20% (w/v), 1% (w/v) de sacarose e 1,5% (w/v) de ágar bacteriológico, acrescido de 0 mg L-1, 5 mg L-1, 10 mg L-1, 15 mg L-1 e 20 mg L-1 do fungicida miconazole, dissolvido em dimethyl sulfoxide (DMSO) (40 mg mL-1) e adicionado ao meio de cultura após autoclavagem. Em seguida, os tratamentos foram distribuídos em placas de petri. Para cada concentração de miconazole, foram distribuídos no meio de cultivo 4 discos de 7 mm de diâmetro de cada colônia fúngica por placa de Petri. Depois disso, as culturas foram incubadas a 20 °C sob lâmpadas fluorescentes e 16 horas de luz. A resposta ao miconazole foi determinada por meio da medição do diâmetro do crescimento das hifas após 2 a 6 dias, dependendo da taxa de crescimento de cada fungo. Já o crescimento relativo (RG) para cada concentração de mionazole foi calculado pela seguinte expressão: RG = 100 (Wf - Wi)/Wi, em que Wi e Wf correspondiam às medidas iniciais e finais do crescimento das hifas.
2) Método proposto por Kimura et al. (2001): baseia-se na introdução de fungicidas no meio de cultura fundente, no qual se realizam medições do diâmetro do crescimento micelial, geralmente em dois sentidos, perpendiculares entre si. Em seguida, por meio de uma análise de regressão, obtém-se o ED50, concentração do ingrediente ativo capaz de inibir 50% do crescimento micelial do isolado, e a concentração mínima inibitória (CMI) dos fungicidas. A partir de então, realiza-se outro bioensaio de incorporação de fungicidas para avaliar a sensibilidade de conídios a fungicidas, adotando-se para isso o teste de diluição de fungicidas em água destilada mais a suspensão conidial (conídios mL-1) e a testemunha (apenas água destilada e suspensão conidial). Para avaliar a inibição da germinação, determina-se a porcentagem de conídios germinados, com base em 100 conídios avaliados. Por fim, avalia-se a erradicação do micélio, empregando-se, para isso, o teste de contato micelial com a calda antifungicida. Para tanto, desenvolve-se o crescimento micelial em meio de cultura, e, em seguida, submete-se o novo micélio desenvolvido na fina camada (película) do meio ao tratamento com determinada quantidade dos fungicidas, preparada em água destilada esterilizada. Depois de determinado tempo, descarta-se a suspensão do fungicida e retiram-se 5 discos de 7 mm de diâmetro da película micelial, os quais devem ser transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura apropriado. Posteriormente, conta-se o número de colônias originadas a partir dos discos de película micelial tratados.
3) Método proposto por Nogueira et al. (2002): inicialmente prepara-se uma suspensão de esporos, de concentração definida, por exemplo, 2x104 conídios mL-1, sob câmara de Neubauer (hemocitômetro) a partir de isolados monospóricos (cultura pura) do fungo a ser estudado, previamente obtidos de material infectado. Em seguida, com o auxílio de uma micropipeta, retira-se uma alíquota da suspensão de esporos (15 μL) e a transfere para cavidades de lâminas escavadas contendo uma quantidade pré-determinada da solução dos fungicidas (15 μL) a serem avaliados. Há também necessidade de se utilizar uma testemunha (padrão de germinação) constituída de um meio de cultura determinado, por exemplo, meio Kirchoff composto de 10% de sacarose, 1% de asparagina, 0,25% de sulfato de magnésio e 1% de fosfato monobásico de potássio (NAGURAJAN; SARASWATHI, 1971). Ao término dessa fase, procede a transferência das lâminas escavadas assepticamente para câmaras úmidas, por exemplo, placas de Petri de 15 cm contendo duas folhas de papel de filtro esterilizadas e umedecidas com água destilada e esterilizada, mantendo-as em câmara de crescimento no escuro e com temperatura controlada (25±1 °C). Decorrido o tempo de incubação, paralisa-se o processo de germinação com o uso de substâncias específicas, como o lactofenol + azul-de-amam, e em seguida fazem-se as observações das lâminas sob microscópio óptico para contagem e determinação do percentual de conídios germinados e do número total de conídios vivos.
4) Método proposto por Fischer (2003): este método consiste na diluição em série dos fungicidas e ajuste dos mesmos para concentrações de 0, 1, 10, 100 e 1.000 ppm de ingrediente ativo, os quais são em seguida adicionados ao meio de cultura fundente (45 ºC–50 ºC), com 20 mL vertido em cada placa de petri de 90 mm de diâmetro. Depois de resfriado o meio de cultura, um disco de 5 mm de diâmetro da colônia fúngica já purificada é transferido para placas de Petri. Em seguida, as culturas são mantidas sob condições ideais ao crescimento do fungo, por determinado período. A eficiência dos produtos é verificada pela aferição perpendicular dos diâmetros das colônias em milímetros, determinando-se assim a porcentagem de inibição (%I) dos referidos tratamentos em relação à testemunha, utilizando para isso a seguinte fórmula: (%I) = (DTest – Dtrat)/DTest x 100, onde DTest e DTrat são os diâmetros da testemunha e dos tratamentos.
Bioensaios para avaliação de fitotoxicidade dos fungicidas aos explantes
De maneira geral, as metodologias utilizadas para avaliação da fitotoxicidade se baseiam na incorporação ao meio de cultura de concentrações de fungicidas pré-definidas nos ensaios de micotoxicidade. No entanto, poucas são as publicações que descrevem a prevenção da contaminação utilizando fungicidas no meio nutritivo e os possíveis efeitos dessas substâncias sobre o desenvolvimento das plantas in vitro (SHIELDS et al., 1984). Acrescenta-se ainda que, das pesquisas já realizadas e reportadas até o presente momento, as informações são de modo geral insuficientes acerca dos reais mecanismos que controlam os efeitos dos fungicidas nos explantes in vitro.
Oda et al. (2003), avaliando o efeito tóxico de substâncias fungicidas e germicidas sobre o crescimento vegetativo e enraizamento de plantas da orquídea Oncidium varicosum, observaram que a adição do fungicida azoxystrobin em todas as concentrações avaliadas assim como também a introdução de alta dose de benomyl (0,8 g L-1) apresentaram efeitos letais para as plantas. Ainda segundo esses autores, na medida em que se aumentou a dosagem fungicida de benomyl, houve redução do número de raízes e do comprimento da maior raiz. Efeitos negativos do uso de fungicidas in vitro também foram relatados por Watt et al. (1996) que constataram que tanto o fungicida benomyl (0,5 g L-1 e 1,0 g L-1) quanto o chlorothalonil (0,25 g L-1 e 0,5 g L-1), quando adicionados ao meio de cultura, foram prejudiciais ao cultivo de Eucalyptus grandis, afetando de maneira significativa a sobrevivência dos explantes, além de inibir por completo a multiplicação e regeneração das plantas.
Já Niedz e Bausher (2002) obtiveram sucesso nos estabelecidos in vitro de brotos de Citrus sinensis oriundos de plantas da casa de vegetação (95% de descontaminação) pela adiação ao meio de cultura de 5 mL L-1 de PPM. Embora a adição de 20 mL L-1 de PPM tenha promovido maior controle dos índices de contaminação, os níveis de fitotoxidez foram severos aos explantes. Em outro experimento, esses autores verificaram que, apesar de a redução dos níveis de contaminação ter sido cerca de 2/3 com a exposição dos explantes a uma solução contendo 10 mL L-1 ou 20 mL L-1 de PPM, esse método causou elevada fitotoxidez sobre o crescimento de brotos. Com o objetivo de controlar a contaminação no estabelecimento in vitro de gemas apicais e laterais de Celtis sp., Sato et al. (2001) observaram que a adição de benomyl ao meio de cultivo, em concentrações de 100 mg L-1, 200 mg L-1, 300 mg L-1, 400 mg L-1 e 500 mg L-1, inibiu totalmente o desenvolvimento dos fungos, assim como também não apresentou fitotoxidez às gemas.
Leveduras em cultivos in vitro: metodologia para identificação e obtenção de culturas assépticas
Embora a contaminação por leveduras seja um problema importante na cultura de tecidos de plantas (LEIFERT et al., 1990), poucas são as pesquisas visando identificar as espécies causadoras da contaminação e, muito menos ainda, o desenvolvimento de métodos preventivos ou curativos. Nesse contexto, vários compostos têm sido descritos por sua atividade antimicótica contra uma ampla diversidade de fungos, muitos dos quais são potencialmente usados na eliminação de leveduras em cultura de tecidos (NAGY et al., 2005). Ressalta-se, entretanto, que de modo geral as plantas são mais sensíveis a efeitos fitotóxicos sob condições in vitro do que in vivo.
Em estudo recente, Nagy et al. (2005) identificaram, durante as etapas de micropropagação de macieira cv. Pinova, uma bactéria de vida livre de pigmentação rosa. Observações preliminares, baseadas em análises microscópicas, também sugeriram a presença de leveduras. Além disso, vários tratamentos de esterilização superficial dos explantes colocados em cultivo não possibilitaram a eliminação dos contaminantes. Assim, os autores realizaram um estudo para identificar e reverter essa limitação no cultivo in vitro da cv. Pinova de macieira. Para isso, utilizaram a seguinte metodologia abaixo descrita.
Material vegetal e fungicidas utilizados – Os explantes consistiram em brotos da cv. Pinova de macieira, obtidos de gemas axilares e brotos em ativo crescimento. Inicialmente, os brotos foram desinfestados superficialmente, e os meristemas excisados e inoculados em meio de cultura. Após 4 dias do estabelecimento, os meristemas livres de contaminações foram transferidos para meio fresco. No entanto, visando confirmar a eficiência do processo de desinfestação, os explantes foram colocados sobre meio BDA e avaliados quanto ao crescimento de microrganismos após incubação a 28 ºC por 7 dias. Contudo, com o objetivo de verificar a eficiência de compostos químicos sobre as possíveis contaminações e esclarecer sobre a ocorrência de leveduras, os seguintes produtos foram empregados: mancozeb, myclobutanil e mancozeb + zoxamid, triforine, benomyl, ProClinw 300 e PPM.
Obtenção dos isolados – Leveduras foram isoladas de brotos visivelmente contaminados, coletando pequenos segmentos caulinares (1 mm3) da parte basal dos brotos, que foram em seguida triturados em água destilada. Todos os isolamentos foram feitos pelo plaqueamento dos tecidos triturados sobre meio BDA, pH 5,6, contendo 100 mg L-1 de chloramphenicol e incubados a 25 ºC por 6 a 7 dias. Dezesseis colônias de leveduras individuais foram selecionadas ao acaso e subcultivadas por três vezes sobre meio BDA. Posteriormente, os isolados foram armazenados a -70 ºC em glicerol 15%. Culturas foram riscadas sobre meio BDA, incubadas por 3 a 4 dias a 25 ºC, e então transferidas para meio fresco de BDA e incubadas por 2 dias.
Caracterização das leveduras – A identificação foi realizada por meio de características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas de acordo com metodologia padrão empregada em taxonomia de leveduras (YARROW, 1998). O tipo de cepa de Rhodotorula glutinis PYCC 4177 (CBS 20) foi incluído em todas as observações como uma referência. Análises moleculares foram também conduzidas segundo protocolo de Sampaio et al. (2001) e usando os primers ITS5 (50 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) e LR6 (50 CGC CAG TTC TGC TTA CC).
Tratamento com fungicidas – A sensitividade das leveduras aos fungicidas foi determinada pelo crescimento dos isolados sobre meio de ágar de milho e MS, suplementado com os diferentes fungicidas. O ágar de milho (Difco) foi acrescido de 2% de glicose e 0,05% de ácido 2-morpholinoethanesulfonic (MES). Ambos os meios tiveram seu pH ajustado para 5,6 antes da autoclavagem. As soluções estoques de muitos dos fungicidas empregados foram preparadas em água destilada e rapidamente vertidas nas placas. Os fungicidas thiabendazole e miconazole foram dissolvidos em dimethyl sulfoxide (DMSO), e a concentração final de DMSO no meio foi 1%. Os fungicidas foram adicionados aos meios de cultivo após a autoclavagem, e quando estes apresentavam uma temperatura de 45 ºC. Após vertido nas placas, cerca de 15 μL da suspensão contendo as leveduras, aproximadamente 108 células mL-1, foi adicionada, e as culturas incubadas a 25 ºC por 14 dias.
Concentração mínima inibitória (MIC) – Foi determinada pela introdução de baixas concentrações dos fungicidas testados, nas quais não se observou o crescimento das leveduras após 14 dias. Já a concentração mínima fitotóxica (MPC) dos referidos fungicidas foi determinada em meio de MS usando valores determinados da MIC. Para isso, brotos jovens, de 10 mm a 15 mm de comprimento, foram incubados por 1 a 2 horas em solução contendo os fungicidas e então transferidos para meio de MS sólido contendo as mesmas concentrações dos fungicidas. A fitotoxicidade foi determinada visualmente pela observação de necroses, escurecimento, cloroses e variações morfológicas. Crescimento de leveduras nos tecidos cultivados foi observado por 14 dias. Em seguida, os explantes que não apresentavam contaminação visível foram removidos, transferidos para tubos de ensaio individuais contendo meio batata, acrescido de 2% de glicose, e incubados por um período adicional de 7 dias para determinar a presença de leveduras.
A prevenção e a descontaminação de tecidos de macieira foram conseguidas com sucesso pelo uso de mancozeb (15 mg L-1). Visando aumentar a eficiência na eliminação das leveduras dos tecidos, foram avaliadas diferentes combinações dos fungicidas, o que resultou em alta eficácia. Para isso, os autores imergiram brotos contaminados por 1 a 2 horas em meio líquido contendo metade da concentração dos sais de MS desprovido de açúcar e adicionado de 588 μM de nitrato de prata. Após o tratamento, os brotos foram cultivados em meio semissólido de MS contendo mancozeb (15 mg L-1) e thiabendazole (40 mg L-1). Após 14 dias do cultivo, 9 dos 30 brotos tratados apresentaram contaminação, sendo que os melhores fungicidas no controle da levedura Rhodotorula slooffiae, sem causar fitotoxicidade, foram o ProClinw 300®, mancozeb, thiabendazole e mancozeb + zoxamid.
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