Capítulo 4
Identificação de bactérias de origem ambiental
Welington Luiz de Araújo
Júlia Kuklinsky-Sobral
Introdução
A utilização dos recursos genéticos, incluindo isolados microbianos coletados desde 1993, é orientada pelo Convention of Biological Diversity (CBD), que foi ratificado por mais de 180 países. Essa convenção deu o direito de soberania ao país de origem dos recursos e objetiva que, em caso de exploração comercial, o país detentor da diversidade obtenha os seus direitos de exploração. Entretanto, é sabido que para ocorrer uma correta utilização desses recursos, é necessário que a biodiversidade seja conhecida e mantida em coleções para que possa ser utilizada por grupos de pesquisa com especial interesse em determinadas áreas. Atualmente, grande parte das amostras microbianas conhecidas está depositada em coleções de cultura internacionais como o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) da Alemanha, Bacteria Collection – Laboratorium voor Microbiologie (BCCM) na Bélgica, Japan Collection of Microrganisms (JCM) do Japão e American Type Culture Collection (ATCC) nos Estados Unidos. Além disso, estas coleções também são as maiores responsáveis pela identificação e classificação bacteriana, incluindo os isolados obtidos com potencial biotecnológico.
A taxonomia é a ciência que lida com a classificação (= criação de novos taxa), identificação (= alocação de isolados dentro de espécies conhecidas) e nomenclatura de seres vivos. A taxonomia bacteriana foi criada para permitir o desenvolvimento de um sistema estável, previsível e altamente informativo que contribui para o avanço de vários ramos da ciência, como a biotecnologia, ecologia, epidemiologia, evolução, genômica, medicina e a microbiologia. No início, a taxonomia bacteriana foi baseada somente em características bioquímicas e morfológicas (HOLT et al., 1994), resultando na formação de grupos taxonômicos polifiléticos sem relação filogenética. Entretanto, a partir de 1970, a utilização da taxonomia polifásica, incluindo análises de DNA como a hibridização de DNA-DNA (COLWELL, 1970), produziu grupos taxonômicos monofiléticos que foram posteriormente posicionados no espaço filogenético com o auxílio de sequências do 16S rDNA. Atualmente, a estrutura da taxonomia de bactérias é baseada na filogenia do gene 16S rDNA (LUDWIG; KLENK, 2001), sendo a descrição de novas espécies publicada no International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM), que é o jornal oficial para caracterizações taxonômicas, descrições de novos taxa e reclassificação de procariotos.
Um dos principais problemas na taxonomia de procariotos, em geral, é a identificação de linhagens em nível de espécie por meio de testes fenotípicos e de sequências de 16S rDNA, pois as características fenotípicas e de sequências das espécies são muito semelhantes. Nesse caso, o critério decisivo para identificação de espécies ainda é a similaridade obtida em ensaios de hibridização de DNA entre genomas de dois organismos (STACKEBRANDT et al., 2002). Outro problema enfrentado para a identificação e classificação de bactérias por meio de análises fenotípicas é o fato de que muitas espécies ainda não descritas não são cultivadas nas condições empregadas para o crescimento microbiano, dificultando dessa forma a sua caracterização.
Identificação de bactérias
Métodos tradicionais – série bioquímica
A identificação e classificação clássica de bactérias são baseadas, principalmente, nas características bioquímicas de cada espécie. Dessa forma, para se determinar essas características, os isolados bacterianos devem ser cultivados puros, isto é, de culturas que são obtidas a partir de uma única célula ou de uma única colônia isolada. A temperatura de incubação correta é muito importante para se obter resultados adequados. Como regra, testes devem ser feitos sob temperatura ótima de crescimento, variando, no caso de isolados ambientais, entre 20 °C e 30 °C, dependendo das condições de isolamento utilizadas.
O oxigênio é essencial na caracterização de bactérias; além disso, para obter resultados reproduzíveis, o tempo de incubação é de grande importância. Em um estágio de multiplicação suficiente, deve-se obter no meio líquido uma turbidez ou precipitação, ou um bom crescimento superficial no meio sólido. O tempo padrão de incubação é específico para cada teste, e assim um período de incubação mais curto do que o prescrito é geralmente suficiente, especialmente se o teste for positivo.
Um ponto essencial na identificação é o controle de qualidade. Todos os meios de cultura e reagentes devem ser testados com culturas apropriadas ou linhagem-tipo antes de serem colocados no uso rotineiro. Linhagem-tipo é uma linhagem que foi designada como padrão representativo de uma dada espécie. Todas as outras linhagens incluídas como pertencentes à mesma espécie devem ser comparadas com a linhagem-tipo. É importante considerar que toda identificação bacteriana deve começar com separação dos grupos em gram-positivo ou gram-negativo (Tabela 1). Para isso, utiliza-se a coloração de gram ou o teste com hidróxido de potássio (KOH). Após isso, as bactérias gram-negativas devem ser submetidas ao teste de O/F (oxidação e fermentação de glicose). Nesse ponto, bactérias fermentadoras devem ser submetidas a testes específicos de fermentação de açúcares, enquanto as não fermentadoras devem ser submetidas a outros testes bioquímicos. Para maiores detalhes a respeito dos testes necessários, deve-se consultar o Manual de Bergey’s (HOLT et al., 1994). As bactérias gram-negativas fermentadoras mais frequentemente isoladas em associação com plantas pertencem aos gêneros Enterobacter, Erwinia, Klebsiela e Pantoea, enquanto as bactérias gram-negativas não fermentadoras pertencem aos gêneros Burkholderia, Pseudomonas, Ralstonia e Xanthomonas.
Tabela 1. Testes preliminares e específicos que podem ser utilizados na identificação de bactérias. |
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Característica |
Requerimento mínimo para identificação |
Teste específico |
Morfológica |
• Coloração de gram • Teste com KOH • Forma e arranjo • Motilidade |
• Posição e números de flagelos • Cápsulas e inclusões |
Crescimento |
• Pigmentação |
• Colônia em meio sólido • Forma, consistência, superfície, elevação, borda, odor • Colônia em meio líquido, depósito, turbidez |
Fisiológica |
• Requerimento de oxigênio • Temperatura ótima de crescimento |
• Tolerância a temperatura, pH • Fatores de crescimento • Inibição por antibióticos • Meios seletivos, NaCl |
Bioquímica |
• Utilização de glicose • Fermentativo • OxidativaInerte • Catalase • Oxidase |
• Produção de ácido a partir açúcares • Redução de nitrato • Denitrificação • Voges Proskauer • Vermelho de metila • Descarboxilase de arginina lisina, ornitina, gelatina, esculina, Tween 80 • Hidrólise de amido • Utilização de citrato – malonato • Hidrólise de amido • Produtos de fermentação • Hemólise |
Fonte: adaptado de Araújo et al. (2002). |
Para bactérias gram-positivas, devem ser avaliadas a forma das células (cocos ou bastonetes) e a presença de endósporos. Normalmente, tem sido observado que isolados com endósporos e células na forma de bastonete pertencem ao gênero Bacillus, embora outros gêneros como Paenibacillus, Brevibacillus (aeróbio) e Clostridium (anaeróbio restrito) possam também ser isolados.
Sistemas automatizados para identificação bioquímica – kits
Para facilitar os trabalhos de caracterização de bactérias, inúmeros kits comerciais foram desenvolvidos, tornando essa análise rápida e barata. Apesar da variedade de kits disponíveis no mercado, o seu uso tem sido restrito, pois muitos são direcionados para propósitos específicos, principalmente na identificação de grupos de bactérias de importância médica. Nesse contexto, é importante notar que o meio ambiente contém uma variedade maior de taxa do que a encontrada nos laboratórios clínicos. Essencialmente, dois tipos de kits comerciais foram desenvolvidos: aqueles que visam a respostas bioquímicas dos microrganismos e aqueles baseados em reações sorológicas:
• Sistemas API: suspensões de células são adicionadas nas cavidades plásticas e incubadas por 24 horas. Alguns testes requerem adição de reagentes. Os resultados são analisados e registrados por códigos num perfil de registros. Há também serviços de computação para identificação. Podem ser usados os testes API 20E (enterobacteria, gram-negativos não fermentadores), API20S (estreptococos) e Apia (anaeróbios).
• Rapid E: semelhante ao API 20E, porém com 21 reações e incubação por 4 horas.
• Enterotubos: são usados para identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae. É um tubo plástico contendo substrato. Após a remoção da tampa do tubo plástico, inoculam-se as bactérias, através de alça inoculadora já acoplada ao tubo, ao longo dos compartimentos. Os tubos são fechados e incubados a 37 °C por 18 a 24 horas. Alguns testes necessitam de adição de reagentes.
• Oxi-Ferm: este sistema permite a identificação de organismos gram-negativos não fermentadores. O sistema Oxi-Ferm é semelhante ao enterotubo, porém oito meios são usados no tubo para a identificação.
• Sistema Micro ID: é usado para identificação de Enterobacteriaceae, utilizando substratos incorporados em tiras de papel. O sistema Micro ID é baseado nos resultados de 15 testes bioquímicos que podem ser analisados em menos de 4 horas. Os resultados são interpretados com o auxílio de um manual de códigos.
• Sistema Minitek II: permite a identificação de Enterobacteriaceae, gram-negativos não fermentadores (21 reações), cocos gram-positivos (20 reações), Neisseria spp. (4 reações de caracterização). Consiste em discos de papel impregnados com substratos desidratados, nos quais uma suspensão celular é adicionada para a determinação de reações características. O período de incubação é variável, dependendo do organismo em teste. Resultados são interpretados utilizando-se uma tabela de cores.
• Minitek Anaerobe II: esse teste é semelhante ao Minitek II, são 20 reações de caracterização com incubação em condições anaeróbicas. Computadores facilitam e auxiliam na identificação de microrganismos. Os dados obtidos de um microrganismo desconhecido podem ser rapidamente comparados com o banco de dados contendo as informações sobre as características de um taxon definido. É possível usar tabelas de diagnósticos em conjunto com computador. As tabelas são incorporadas na memória do computador, sendo os resultados de organismos desconhecidos comparados com cada uma das possibilidades, e a correlação mais alta é dada como uma identificação. Os sistemas de identificação computadorizados têm sido desenvolvidos para avaliar a probabilidade estatística de identificação de microrganismos. Tal tipo de sistema de identificação muitas vezes envolve o desenvolvimento e o uso de matrizes de probabilidade, que são compilações de frequência de ocorrência das características de um microrganismo desconhecido dentro de um grupo taxonômico.
• RapIDNH: esse sistema identifica Neisseria, Haemophilus e Moraxella spp. Suspensões celulares são inoculadas nas cavidades com substratos e incubadas. Após a incubação, os reagentes são adicionados. Os resultados são analisados e comparados com padrões do manual ou por meio de serviços de computador.
• Biolog Nutritional System: as placas do sistema Biolog testa a habilidade de uma bactéria em utilizar (oxidar) 95 diferentes fontes de carbono pré-selecionadas. A identificação da bactéria dá-se por uma combinação de propriedades metabólicas dos isolados com a base de dados dos padrões. Os testes GN MicroPlates são para gram-negativas, enquanto os GP MicroPlate são para gram-positivas. Uma suspensão de bactérias (150 mL) em 0,85% de solução salina é dispensada em cada uma das cavidades da placa e incubadas por 18 a 24 horas, entre 33 °C e 35 °C. Os resultados podem ser analisados visualmente ou por meio de um leitor de placas (590 nm) e, posteriormente, comparados com uma base de dados.
• Vitek: este sistema é rápido e muito usado nas indústrias. O material é inoculado nas cavidades por um multipipetador. Um módulo computadorizado faz a leitura, e a identificação é feita após 8 horas de incubação. O sistema serve para a caracterização de anaeróbios (ANI), Bacillus spp. (Bacillus Biochemical Card), gram-negativos (Gram-negative identification card- GNI) e gram-positivos (Gram-positive identification card- GPI).
Estratégias e técnicas modernas de identificação de bactérias
Tipagem molecular
A taxonomia polifásica integra dados fenotípicos, quimiotaxonômicos, moleculares e genômicos com o objetivo de representar a biodiversidade nos seus diferentes níveis, isto é, de linhagem a suprafamílias. Nesse contexto, várias técnicas genômicas baseadas em padrões de banda ou códigos de barra, como o Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (Ardra), Repetitive Extragenic Palindromic (rep-PCR) e ribotipagem, podem ser utilizadas (DIJKSHOORN et al., 2001). Embora exista um grande número de técnicas que revelam polimorfismo de DNA é importante considerar o tipo de organismo a ser avaliado.
A técnica de RAPD utiliza iniciadores ou primers curtos e aleatórios que se anelam em diferentes locais no DNA genômico, gerando novos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (WELSH; MCCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990). O teste RAPD é extremamente útil para estudos de filogenia e caracterização de indivíduos, estudos da comunidade microbiana de ambientes aquáticos, além de bactérias endofíticas (ARAÚJO et al., 2001; FRANKLIN et al., 1999; LOUWS et al., 1999). O Ardra consiste na amplificação e posterior digestão do rDNA com enzimas de restrição. Esse método é baseado no princípio de que os sítios de restrição no rDNA são conservados de acordo com padrões filogenéticos. Dessa forma, pode ser utilizado o 16S rDNA para o estudo de grupos heterogêneos, ou a região espaçadora entre o 16S e o 23S rDNA para o estudo de grupos muito similares (ELSAS et al., 1998; HEYNDRICKX et al., 1996; RANJARD et al., 2000). O rep-PCR é baseado em famílias de sequências repetitivas de DNA presentes no genoma de bactérias que têm sido utilizadas na caracterização e subdivisão de espécies bacterianas em nível intraespecífico. Entre essas famílias podem-se citar as sequências repetitivas extragênicas palindrômicas (REP) de 35 pb a 40 pb, consensuais intergênicas repetitivas enterobacterianas (Eric) de 124 pb a 127 pb, e os elementos BOX de 154 pb. Os elementos BOX podem estar envolvidos na ligação da DNA girase e terminação da replicação do DNA. A utilização de rep-PCR para caracterização de bactérias e estudos de diversidade genética tem se mostrado uma ferramenta útil (VINUESA et al., 1998). Portanto, pode-se observar que essas técnicas citadas auxiliam tanto na identificação quanto em estudos de diversidade microbiana.
O AFLP também se caracteriza como uma técnica de tipagem molecular, pois combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição com as vantagens da PCR. Estudos independentes mostraram uma alta correlação entre a similaridade de padrões de AFLP e de hibridização de DNA-DNA para diversos grupos taxonômicos modelo, incluindo Aeromonas (HUYS et al., 1996), Agrobacterium (MOUGEL et al., 2001), Bradyrhyzobium (WILLEMS et al., 2001), Burkholderia (COENYE et al., 2000), Vibrios (THOMPSON et al., 2004) e Xanthomonas (RADEMAKER et al., 2000). Por esse motivo, sugeriu-se que AFLP poderia ser uma alternativa para as hibridizações de DNA (STACKEBRANDT et al., 2002; THOMPSON et al., 2004). Apesar de a técnica de AFLP ser rápida, altamente discriminatória, e os resultados poderem ser acumulados em bases de dados locais, a comparação de padrões de AFLP gerados em diferentes laboratórios é muito difícil, comprometendo tremendamente a criação de bancos de dados públicos para a identificação de procariotos.
A não portabilidade de dados fenotípicos, por exemplo, perfis de ácidos graxos e de proteínas, e dados moleculares, por exemplo, AFLP, resulta na concentração do conhecimento taxonômico sobre diferentes grupos de procariotos em poucos laboratórios internacionais de referência. Essa tendência leva a uma maior demora na catalogação da biodiversidade global, uma vez que taxonomistas de várias partes do mundo usam diferentes ferramentas para estudarem os mesmos grupos taxonômicos.
Identificação molecular sem o cultivo microbiano
A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana e, em especial, para a identificação de microrganismos de amostras ambientais. Dados derivados de estudos comparativos apontam para o fato de que apenas uma pequena fração dos microrganismos na natureza (entre 0,1% e 1%, dependendo do habitat) é cultivada por meio do emprego de métodos microbiológicos convencionais (AMANN et al., 1995).
Nesse contexto, técnicas moleculares baseadas no gene do 16S rRNA têm sido utilizadas para a avaliação de comunidades microbianas não cultiváveis (AMANN et al., 1995). Dentre essas técnicas, e em especial para o estudo de populações microbianas complexas, o Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) identifica diferenças baseadas no comportamento desnaturante da dupla fita de DNA. Nesse caso, o ambiente desnaturante é criado pela combinação uniforme da temperatura de corrida, variando entre 50 oC e 65 oC, e um gradiente desnaturante linear de ureia e formamida (HEUER; SMALLA, 1997). O DGGE tem recebido especial atenção por ter sido utilizado com sucesso em diversos habitats naturais e na detecção de variações na comunidade microbiana decorrente da presença de poluentes e planta hospedeira. Dessa forma, essa técnica se mostra eficiente na identificação de bactérias não cultiváveis de diferentes amostras ambientais.
Outra técnica utilizada para a identificação de microrganismos de amostras ambientais é a hibridização de DNA das amostras com sondas de rRNA complementares ao microrganismo alvo. Existem dois diferentes tipos de hibridização utilizados em estudos de taxonomia microbiana: hibridização slot-blot e hibridização fluorescente in situ (Fish). A hibridização slot-blot requer a extração de ácidos nucleicos, imobilização deles em membranas e hibridização com sondas (rRNA) radioativas ou não radioativas. Na técnica de Fish, os ácidos nucleicos alvos são detectados diretamente nas células. Para acontecer a detecção in situ, as células devem ser permeabilizadas para possibilitar o acesso das sondas ao interior celular (AMANN et al., 1995). Uma das características positivas do Fish é que as células ficam intactas e podem ser utilizadas para outros estudos.
O desenvolvimento da biologia molecular está proporcionando o surgimento de novas técnicas que auxiliem a identificação de microrganismos. Dentre as mais recentes, pode-se citar a Metagenômica e Microarranjos de DNA (DNA chips ou microarray). Metagenômica, também conhecida como genômica ambiental, é a análise do genoma de microrganismos por extração direta do DNA de uma amostra, amplificação de genes específicos (para a identificação é utilizado o gene 16S rRNA), clonagem dos fragmentos amplificados em vetores (plasmídeos) e posterior sequenciamento dos clones (HANDELSMAN, 2004). A tecnologia de microarranjos de DNA permite uma oportunidade única para uma múltipla detecção de ácidos nucleicos (SMALL et al., 2001). Os microarranjos são, em princípio e prática, extensões de métodos baseados em hibridizações que têm sido utilizados por décadas para identificar e quantificar ácidos nucleicos em amostras biológicas (EISEN; BROWN, 1999; SOUTHERN et al., 1999). Entretanto, a tecnologia de microarranjos envolve a integração de áreas da ciência, como biologia molecular, genética, bioinformática, bioquímica, engenharia de materiais, robótica e outros (HELLER, 2002). Essa técnica permite que a expressão de milhares de genes seja avaliada simultaneamente, trazendo novas perspectivas para o entendimento da expressão e regulação de genes (CHAUSSABEL; SHER, 2002), detecção de microrganismos no ambiente (KOIZUMI et al., 2002; PEPLIES et al., 2003; SMALL et al., 2001), tipagem de bactérias (GARAIZAR et al., 2002), comparação genômica entre isolados bacterianos (NUNES et al., 2003), identificação de genes específicos (CALL et al., 2003; DONG et al., 2001) e estudos filogenéticos.
MLST – biodiversidade e evolução
O uso de Multi Locus Sequence Typing (MLST) tem ampliado a visão sobre a biodiversidade e evolução de bactérias. Essa técnica se originou da eletroforese de enzimas, amplamente usada por biologistas de populações (CAUGANT, 2001). A metodologia moderna consiste no sequenciamento e análise de fragmentos de 5 a 7 genes, conservados geralmente em housekeeping, espaçados ao longo do genoma bacteriano com pelo menos 100 Kb de distância ou do outro (MAIDEN et al., 1998). A grande vantagem dessa técnica é que a diferença entre linhagens é indexada diretamente nas sequências de DNA. Como esses genes evoluem muito lentamente, tornam-se ideais para estudos de longo termo de epidemiologia e identificação. Além disso, sequências gênicas, diferentemente de padrões de bandas, como AFLP, rep-PCR, podem ser acumuladas em bases de dados de domínio público e comparadas com facilidade.
Dados de MLST podem ser utilizados para calcular a contribuição de mutação e recombinação na evolução de complexos clonais dentro de uma dada espécie de bactérias (FEIL et al., 2003). É importante ressaltar que MLST tem sido empregado apenas na tipagem de alguns poucos patógenos humanos, como Bacillus cereus, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e V. cholerae. Pouco ainda é conhecido sobre o uso da metodologia de MLST para a diferenciação de espécies, gêneros e famílias no domínio Bacteria.
O estudo da filogenia e evolução de procariotos tem melhorado consideravelmente com a inclusão de novas metodologias baseadas na genômica, do conteúdo e ordem de genes, de sequências concatenadas (WOLF et al., 2002), superárvores (DAUBIN et al., 2001) e análises de distâncias evolucionárias entre genes ortológos (WOLF et al., 2002). Análises evolutivas em nível de espécie, que incluem a delineação de genótipos ancestrais, complexos clonais e da taxa de recombinação entre linhagens, têm sido aprimoradas pelo uso dos algorítimos Burst e Splits tree decomposition (FEIL; SPRATT, 2001; FEIL et al., 2003). Aplicando esses novos princípios, Cohan (2002) reflete que as espécies bacterianas atualmente delineadas são, na verdade, equivalentes a gêneros. Realmente, a definição atual de espécie bacteriana é pragmática. Atualmente, essa definição compreende grupos de isolados genomicamente coerentes, que compartilham elevado grau de similaridade em diversas características independentes. Apesar de intensa crítica (LAN; REEVES, 2000, 2001; SMITH et al., 2000), a hibridização de DNA-DNA ainda é a técnica melhor descrita para a definição de espécies em Bacteriologia. Linhagens da mesma espécie apresentam, sob condições controladas de ensaios, pelo menos 70% de hibridização entre seus genomas, conforme definido pelo Comitê Internacional de Sistemática Bacteriana (STACKEBRANDT et al., 2002). Tem sido sugerido que novas metodologias devem ser desenvolvidas para suplantar as limitações da hibridização DNA-DNA, rDNA 16S, características fenotípicas e fingerprints. Nesse contexto, o Multi Locus Sequence Analysis (MLSA) poderia ser uma alternativa, visto que diversos pesquisadores têm sugerido que a definição de espécie seja baseada em sequências de genes (LA SCOLA et al., 2003). Entretanto, não há um consenso sobre o conceito de espécie em bactérias, mas diferentes modelos evolutivos baseados na seleção natural e na transferência horizontal de genes têm sido propostos.
Taxonomia eletrônica
A proposta da taxonomia eletrônica vem causando muito debate por parte de diversos taxonomistas (BISBY et al., 2002; SMITH, 2004), mas sem dúvida ela produzirá um sistema de catalogação de espécies mais rápido, eficiente, transparente, barato e acessível para toda a comunidade científica por meio de bases de dados disponíveis via Internet. Dados de marcadores moleculares poderiam ser facilmente disponibilizados em bases de dados públicas, necessitando apenas de trabalho de atualização, por meio da inclusão de sequências de novas espécies e a manutenção e atualização dos dados, com o intuito de evitar erros e/ou falta de informação sobre as espécies. Obviamente, as bases de dados de marcadores moleculares, com exceção às sequências de genes, ainda precisam ser produzidas para a maioria das espécies conhecidas; mas, estando montadas, possibilitarão que descrições taxonômicas sejam feitas com maior rapidez e objetividade, resultando em um rápido desenvolvimento da taxonomia e exploração da biodiversidade.
Existem várias iniciativas para o desenvolvimento de websites dedicadas à taxonomia e de descrições eletrônicas de novas espécies. Species 2000 deseja enumerar todas as espécies de organismos vivos no planeta em uma base de dados eletrônica que sirva de portal de entrada para estudos sobre biodiversidade. Até o presente já foram listadas 500 mil espécies (PEPLOW, 2005). Enquanto que o Global Biodiversity Information Facility (GBIF) pretende globalizar todo o conhecimento atual sobre biodiversidade pela internet.
Finalmente, a escolha de um método adequado para identificar um microrganismo deve ser feita de acordo com a natureza da investigação, o conhecimento profissional, a habilidade do pesquisador ou da equipe técnica e a disponibilidade do laboratório. Além disso, o conhecimento sobre o procedimento de consulta à literatura correlata é fundamental para o êxito na identificação segura de um microrganismo.
Protocolos
Caracterização morfológica
Determinação da forma da célula
Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:
a) As lâminas são coradas com safranina por 1 minuto.
b) Elas são lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.
As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. Nessa análise, é possível observar a forma das células (cocos ou bastonetes), bem como outras estruturas como filamentos ou arranjos em cachos.
Coloração de gram
Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:
a) As lâminas são coradas com cristal violeta por 1 minuto.
b) Elas são lavadas cuidadosamente com solução de lugol forte.
c) As lâminas são cobertas com lugol forte por 1 minuto.
d) Elas são lavadas com solução descorante por 1 minuto e posteriormente com água.
e) As lâminas são coradas com safranina por 1 minuto.
f) Elas são lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.
As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. As células das bactérias gram-positivas mantêm a coloração violeta por causa da retenção dos corantes iniciais, enquanto as bactérias gram-negativas apresentam coloração rosa-avermelhada, por causa da coloração de contraste com safranina. Células velhas podem resultar em falso gram-negativo.
Coloração de Wirtz (coloração de esporos)
Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:
a) As lâminas são coradas com verde malaquita por 15 minutos.
b) Lavadas cuidadosamente com água corrente.
c) As lâminas são coradas com safranina por 30 segundos.
d) Lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.
As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. Os esporos apresentam coloração verde enquanto que as células vegetativas apresentam coloração rosa-avermelhada, por causa da coloração de contraste com safranina.
Identificação bioquímica
EPM (ácido e gás de glicose, urease, H2S, L-triptofano desaminase)
Com auxílio de uma alça de ponta reta (agulha), as bactérias devem ser inoculadas por meio de picada profunda no meio EPM e incubadas a 28 °C por 24 horas. A formação de bolhas indica a produção de gás a partir da glicose; a passagem da cor do meio de verde para amarelo, na base do tubo, indica que houve produção de ácido a partir da glicose; porém, quando houver produção de H2S nesse mesmo local, ocorre a formação de pigmentos pretos. A coloração verde escura na superfície do meio indica a produção de L-triptofano desaminase, e a produção de urease é verificada quando a cor do meio passa de verde para azul.
Mili (motilidade, indol – lisina)
As culturas bacterianas devem ser inoculadas com o auxílio de uma alça de ponta reta no interior do tubo contendo o meio Mili, e incubadas a 28 °C por 24 horas. Após o crescimento bacteriano, é realizada a leitura do teste: a presença de zonas túrbidas ao redor da picada indica motilidade positiva, quando a cor do meio passa de roxo-violeta para amarelo indica lisina descarboxilase negativa, enquanto que a produção de indol a partir de triptofano é verificada colocando de 3 a 5 gotas do reagente de Kovacs. Nesse caso, o teste é considerado positivo quando ocorre a formação de um anel vermelho (anel indólico).
Utilização de citrato
A bactéria deve ser inoculada por meio de estrias na superfície do meio citrato de Simmmons e incubada a 28 °C. O crescimento bacteriano e a alteração da coloração do meio devem ser examinados diariamente durante 7 dias. O resultado positivo é caracterizado pela passagem da cor do meio de verde para azul.
Utilização de diferentes fontes de carbono
No momento do uso deve ser adicionada a fonte de carbono desejada (D-glicose, D-frutose, D-galactose, D-manose, L-arabinose, D-xilose, L-ramnose, celobiose, D-lactose, D-melibiose, sacarose, Trealose, rafinose, D-melizitose, dextrana, inulina, D-manitol, meso-inositol, Adonitol, xilitol e salicina), em solução estoque esterilizada a 20% em água, numa concentração final em meio básico para açúcares de 1%. Após a formulação do meio de cultura, 5,0 mL deste meio são distribuídos em tubos de ensaio esterilizados. Após a inoculação da bactéria de interesse, o tubo deve ser incubado a 28 °C por 7 dias. O resultado positivo é caracterizado pela passagem da cor meio de verde para amarela por causa da acidificação do meio e queda do pH.
Teste de oxidação e fermentação da glicose (O/F glicose)
A bactéria de interesse deve ser inoculada com picada profunda em dois tubos contendo o meio para teste de O/F . Sobre a superfície de um dos tubos devem ser colocados 3,0 mL de óleo mineral esterilizado, e ambos os tubos devem ser incubados a 28 °C por 72 horas. A mudança da cor do meio de verde para amarela nos dois tubos indica a fermentação da glicose (F), mas se essa alteração ocorrer apenas na superfície do tubo sem óleo indica oxidação da glicose (O). Entretanto, se houver crescimento bacteriano, e o meio passar de verde para azul, não ocorreu utilização da glicose, mas o pH aumentou em virtude de produtos do metabolismo proteico.
Hidrólise do amido
Os isolados bacterianos devem ser inoculados em placas de petri contendo o meio de amido e incubados a 28 °C por 48 horas. Após o crescimento, essas colônias devem ser cobertas com solução de lugol. O resultado positivo é caracterizado por um halo incolor ao redor da colônia bacteriana.
Hidrólise da gelatina
O meio de gelatina deve ser deixado a 4 °C durante 2 horas para solidificar. O inóculo deve ser por picada profunda com auxílio de uma alça de ponta reta. O tubo deve ser incubado a 28 °C durante 30 dias. Para observações diárias, os tubos inoculados juntamente com um tubo controle (sem inóculo) devem ser colocados a 4 °C por 1 hora antes da análise. A manutenção do estado líquido do meio após essa inoculação a 4 °C indica a hidrólise da gelatina.
Crescimento em diferentes temperaturas
As bactérias devem ser inoculadas em meio NA ou outro de crescimento específico e incubadas em diferentes temperaturas (4 °C, 10 °C, 20 °C, 28 °C, 32 °C, 37 °C, 45 °C e 55 °C) durante 7 dias para verificar o crescimento.
Crescimento em NaCI 5%
Para este teste, deve ser utilizado o meio NA ou outro de melhor taxa de crescimento, acrescido de NaCI na concentração de 5%. Após o inóculo, as placas devem ser incubadas a 28 °C por 72 horas para se observar o crescimento bacteriano.
Crescimento em diferentes pHs
Para esta análise, pode ser utilizado o meio LB ou outro de interesse. O pH do meio deve ser ajustado ao nível desejado. Após a inoculação da bactéria de interesse, o tubo deve ser incubado a 28 oC por 72 horas para se verificar o crescimento bacteriano.
Catalase
Com auxílio de um palito de madeira, deve ser cortada uma amostra de colônia bacteriana e colocada sobre uma gota de H2O2 (3%). O resultado positivo é caracterizado pelo desprendimento de gás imediatamente ou após cinco minutos.
Oxidase
Sobre um papel de filtro impregnado com 2 a 3 gotas de dimetil-ρ-fenilenediamina (1%), devem ser colocadas amostras de colônia bacteriana. O resultado positivo é determinado pelo aparecimento de coloração violeta sobre o papel em 10 segundos.
Produção de indol
As bactérias devem ser semeadas em caldo para determinação da produção de indol e incubadas a 28 oC por 48 horas. Após o crescimento, devem ser adicionadas 4 gotas do reagente de Kovacs, e um halo vermelho na fase alcoólica indica presença de indol.
Redução de nitrato a nitrito
As bactérias devem ser inoculadas em meio com nitrato e incubadas a 28 oC por 48 horas. Após o crescimento, devem ser adicionadas 2 gotas da solução A e 2 gotas da solução B dos reagentes para o teste de nitrato. O resultado positivo é caracterizado pelo aparecimento de uma coloração vermelha intensa na superfície do meio.
Reação de Voges-Proskauer
Com auxílio de uma alça de platina, as bactérias devem ser inoculadas em tubos contendo o meio VP e incubadas a 28 oC por 72 horas. A leitura da reação deve ser feita alcalinizando o meio com 2 a 3 gotas de KOH (40%) e posteriormente adicionando de 3 a 5 gotas de solução de α-naftol. O teste positivo é caracterizado pela presença de halo vermelho, alguns segundos após a adição do reagente. Esse halo se forma a partir da superfície de contato com o O2 por causa da oxidação da acetoína.
Meios de cultura utilizados para o estudo de bactérias
Meio TSA (Tryptone Soy Agar) 10%
Triptona: 1,5 g
Peptona de soja: 0,5 g
NaCl: 1,5 g
Ágar: 15,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 7,3
Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio TSA pronto (Merck, Difco Oxoid) na concentração de 4 g L-1 (10%), acrescido de 1,5% de ágar.
Meio TSB (Tryptone Soy Broth) 5%
Caseína de digestão pancreática: 0,85 g
Digestão papaínica de soja: 0,15 g
NaCl: 0,25 g
Na2HPO4: 0,125 g
Glicose: 0,125 g
Ágar: 15,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 7,3
Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio TSB pronto (Merck, Difco ou Oxoid) na concentração de 1,5 g L-1 (5%), acrescido de 1,5% de ágar.
Meio LB – Luria Bertani
Triptona: 10,0 g
Extrato de levedura: 5,0 g
NaCl: 10,0 g
Ágar bacteriológico (Difco): 15,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 7,0
Meio nutriente ágar (NA)
Extrato de carne: 3,0 g
Peptona: 5,0 g
Ágar: 15,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 6,8
Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio NA pronto (Difco) na concentração de 23 g L-1 .
Meio para oxidação/fermentação de glicose (O/F)
Peptona: 2,0 g
NaCl: 5,0 g
KH2 PO4: 0,30 g
Azul de bromotimol (1% em água): 0,8 mL
Ágar: 3,0 g
Completar o volume com água destilada para: 900 mL
O meio deve ser autoclavado (1 atm) por 20 minutos a 120 °C, e posteriormente devem-se acrescentar 100 mL de solução de glicose (10%). O meio deve ser distribuído em tubos de ensaio (10 mL tubo-1).
Meio para detecção de indol
Extrato de carne: 3,0 g
Triptona: 10,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 6,8
Meio para redução de nitrato
Extrato de carne: 3,0 g
Peptona: 5,0 g
KNO3: 1,0 g
Ágar: 12,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 6,8
Meio EPM (TOLEDO et al., 1982)
Solução base: A
Extrato de carne: 2,0 g
Triptona: 10,0 g
NaCl: 5,0 g
NaH2 PO4 . 5 H2 O: 2,0 g
L-triptofano: 1,0 g
Azul de bromotimol (sol. 1%): 0,8 mL
Ágar: 11,0 g
Água destilada 1.000 mL
Após solubilização dos componentes, o pH deve ser ajustado para 7,4 e deve-se acrescentar o ágar. O meio de cultura deve ser autoclavado a 120 oC durante 20 minutos.
Solução base B
Citrato de ferro amoniacal: 2,35 g
Na2S2O3 . 5 H2O: 2,35 g
Glicose: 11,76 g
Ureia: 47,06 g
Água destilada: 100 mL
Os compostos devem ser homogeneizados e aquecidos em banho-maria a 65 °C por 1 hora, agitando constantemente até completa dissolução.
Preparo final
Solução A: 982,5 mL
Solução B: 17,5 mL
Após misturar duas soluções, 4 mL do meio de cultura deve ser distribuído assepticamente em tubos e inclinados para solidificação.
Meio de gelatina
Extrato de carne: 3,0 g
Peptona: 5,0 g
Gelatina: 12,0 g
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 6,8
Meio para reação de Voges-Proskauer (VP)
Peptona: 5,0 g
K2HPO4: 5,0 g
Solução de glicose 5%: 100 mL
Completar o volume com água destilada para: 900 mL
pH: 7,5
A peptona e o K2HPO4 devem ser dissolvidos, distribuídos em tubos com 1,35 mL do meio e autoclavados. Posteriormente, devem ser adicionados 150 µL da solução de glicose já esterilizada em cada tubo.
Meio para fermentação de açúcares
Peptona: 10,0 g
NaCl: 5,0 g
Azul de bromotimol (1%): 2 mL
Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL
pH: 7,2
Soluções utilizadas na identificação de microrganismos
Solução de cristal violeta
Solução A
Cristal violeta: 2 g
Etanol 95%: 20 mL
Solução B
Oxalato de amônia: 0,8 g
Água destilada: 80 mL
Solução final
As soluções A e B devem ser misturadas e deixadas em repouso por 48 horas. Após esse período, a solução deve ser filtrada em papel e armazenada à temperatura ambiente.
Solução de iodo forte (lugol)
Iodo: 10 g
Iodeto de potássio: 6 g
Água destilada: 20 mL
Etanol 95% – completar para: 100 mL
O iodo e o iodeto de potássio devem ser triturados e dissolvidos em 20 mL de água, e o volume completado para 100 mL com etanol 95%.
Solução de safranina (0,025%)
Safranina: 12,5 µg
Etanol: 50 mL
Água destilada: 50 mL
No momento do uso, diluir 1:10 em água destilada.
Solução de verde malaquita
Verde malaquita: 0,01 mg
Água destilada: 200 mL
Solução descorante
Solução de iodo forte: 3 mL
Acetona: 97 mL
Reagente para o teste do nitrato
Solução A
Ácido sulfanílico: 160 µL
Ácido acético 5N: 20 mL
Solução B
α-naftilamina: 100 µL
Ácido acético 5N: 20 mL
Reagente de Kovacs
ρ-dimetilaminobenzaldeído: 0,005 mg
Álcool amílico: 75,0 mL
HCl concentrado: 25,0 mL
O ρ-dimetilaminobenzaldeído deve ser solubilizado no álcool em banho-maria entre 50 °C e 55 °C e em seguida deve ser adicionado o ácido. O reagente deve ser armazenado em frasco escuro a 4 °C.
Solução de α-naftol
α-naftol: 0,01 mg
Etanol: 200 mL
Solução de azul de bromotimol
Azul de bromotimol: 1,0 mg
Etanol: 50 mL
Água destilada: 50 mL
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