Capítulo 1
Importância das contaminações e dos microrganismos endêmicos na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas
Marcio Gilberto Cardoso Costa
Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Wagner Campos Otoni
Introdução
Os termos contaminação microbiana da cultura de tecidos, contaminação da cultura in vitro, contaminação da cultura de tecidos, ou simplesmente contaminação, são rotineiramente utilizados nos trabalhos de micropropagação de plantas para designar, em laboratório, a presença de microrganismos em células, tecidos e órgãos ou numa coleção de plantas. Independentemente do tipo de associação que os diferentes grupos de microrganismos possam estar envolvidos, é procedimento de rotina descartar os frascos que apresentem alguma colônia visível a olho nu e que causem algum tipo de ameaça à cultura. Esse procedimento parte do princípio de que, em geral, os microrganismos nas plantas em fase de micropropagação são passíveis de patogenecidade, adotando-se, dessa forma, o princípio da erradicação parcial ou total da cultura como medida de controle, uma vez que contaminação pode ser definida como o ato de tornar-se infectado, pressupondo a ocorrência de uma doença contagiosa, causada por um agente biológico. No entanto, como já se sabe, a grande maioria dos microrganismos contaminantes na cultura de tecidos de plantas não promovem a morte de materiais estabelecidos in vitro diretamente por causarem doenças nas plantas. Mas sim, por geralmente competirem com as plantas pelos nutrientes do meio de cultura e por excretarem substâncias geralmente tóxicas aos cultivos no meio de cultura.
De fato, o estado normal das plantas é o de coexistir com uma ampla gama de microrganismos simbiontes ou não, presentes nos diversos órgãos das plantas, como folhas e raízes, cujos efeitos ou finalidades são objetos de aprofundadas pesquisas em áreas como a microbiologia. Para se ter ideia da complexidade do tema, estima-se que aproximadamente 90% das espécies vegetais apresentem algum tipo de associação simbiótica com microrganismos, como os rizóbios (associação de bactérias com plantas leguminosas), micorrizas (associação de fungos com plantas), rizobactérias (bactérias promotoras de crescimento de plantas – RPCPs) e as diazotróficas (bactérias fixadoras do nitrogênio atmosférico), de tal modo que muitos benefícios recíprocos foram desenvolvidos, como melhor crescimento, reprodução e resistência a estresses bióticos e abióticos pelas plantas, assim como um local de refúgio, nutrição e disseminação pelo lado dos microrganismos (SAIKKONEN et al., 2004; SELOSSE; LE TACON, 1998).
As contaminações microbianas e seus impactos na cultura de tecidos vegetais
Embora o entendimento sobre a identidade, fontes e epidemiologia dos diferentes contaminantes microbianos tenha avançado consideravelmente nos últimos anos, a detecção de contaminantes bacterianos latentes e a eliminação da contaminação fúngica e bacteriana de culturas estabelecidas in vitro permanecem à espera do desenvolvimento de melhores estratégias. Uma vez seguidos os procedimentos básicos padrões de desinfestação, a contaminação frequentemente origina-se da introdução em cultura de explantes contaminados com microrganismos endofíticos ou microrganismos resistentes ao processo de desinfestação. Esses incluem fungos, leveduras, bactérias, vírus e viroides, os quais podem tornar-se patogênicos (vitropats, microrganismos que podem injuriar as plantas in vitro, mas que normalmente não causam doença no habitat natural ou agrícola das plantas in vivo) (HERMAN, 1990a) ou latentes não patogênicos às plantas in vitro (CASSELLS, 1991, 1997, 2000a, 2001).
A contaminação é o principal problema que afeta os laboratórios de micropropagação comercial, que tem sido estimada na média de 10%, mas podendo resultar no completo insucesso do processo de produção (CASSELLS, 2001). Seguindo a rápida ascensão na produção de plantas micropropagadas nos anos de 1980, um constante declínio do número de laboratórios de micropropagação comercial tem sido observado a partir da década de 1990, provavelmente causado pela inabilidade dos laboratórios em reduzir as perdas por contaminação a níveis satisfatórios que permitam tanto um rendimento de produção preditivo como a obtenção de plantas micropropagadas de qualidade (LEIFERT; WOODWARD, 1998). A tendência geral desses laboratórios é desconsiderar a contaminação das culturas, a menos que esta passe a afetar visivelmente a produção. Essa abordagem pragmática é baseada em duas generalizações: (i) que é difícil descontaminar culturas no estágio 2 ou estágios posteriores, e (ii) que a maioria dos contaminantes, ao contrário dos vitropats, são organismos comuns ao ambiente e por isso não ameaçam a produção ou os seres humanos envolvidos na produção.
Perdas por contaminação de até 2% por subcultivo são usualmente admitidas como o nível máximo necessário para garantir o sucesso da produção. Esse nível não pode ser obtido sem a aplicação de práticas de garantia de qualidade e a introdução de estratégias de controle da produção, comuns em outros segmentos industriais afetados pela contaminação microbiana, como indústrias de processamento de alimentos e farmacêutica. Estratégias de garantia de qualidade/gerenciamento, como a Análise de Risco e Pontos Críticos de Controle (ARPCC), que será discutida mais adiante, podem ser facilmente aplicadas em laboratórios de cultura de tecidos. Em laboratórios de micropropagação que investiram no estabelecimento da ARPCC, os custos adicionais foram mais do que compensados pela redução das perdas e melhor qualidade das plantas (LEIFERT et al., 1994a).
O manejo de contaminantes na cultura in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais depende inicialmente do uso de plantas estoques livres de patógenos e da combinação de métodos de desinfestação e/ou cultura de meristemas para o estabelecimento de culturas livres de patógenos e contaminantes (CASSELLS, 2000a). Quando necessário, a termoterapia ou a quimioterapia podem ser aplicadas à planta doadora, embora a primeira seja menos comum no caso de tratamento de tecidos vegetais, que não os meristemas. Muitos antibióticos utilizados na cultura de tecidos vegetais têm sido selecionados sem o emprego dos procedimentos e testes de sensibilidade padrões (BARRETT; CASSELLS, 1994) e são biostáticos em vez de biocidas (CASSELLS, 1998; FALKINER, 1990; PEREIRA; FORTES, 2003). A atividade bacteriostática da maioria dos antibióticos reforça a necessidade de um método de detecção sensitivo para confirmar a ausência de contaminantes. Tem sido proposto que culturas fotoautotróficas podem ser usadas como uma estratégia para minimizar os efeitos da contaminação microbiana durante a micropropagação, visto que a disponibilidade de nutrientes para sustentar o crescimento dos microrganismos é menor do que em culturas heterotróficas (KOZAI et al., 1992; LONG, 1997). A transferência de culturas heterotróficas para culturas autotróficas também tem sido defendida como uma estratégia para recuperar culturas contaminadas (SAYEGH; LONG, 1997).
Identificação e fontes de contaminação em laboratórios de cultura de tecidos vegetais
A identificação dos contaminantes mais comuns nos laboratórios é uma tarefa relativamente simples de ser realizada. A maioria dos fungos e leveduras contaminantes pode ser facilmente visualizada pelo exame macroscópico dos tecidos vegetais infectados (DANBY et al., 1994). As características de esporo/micélio podem ser usadas para identificar o gênero de fungos/leveduras associado à fonte de contaminação específica (Tabela 1). Também é possível separar as leveduras das bactérias contaminantes por meio da avaliação macroscópica. Leveduras crescem vigorosamente e formam colônias esbranquiçadas ou vermelhas/rosas, produzindo um odor típico de levedura no frasco de cultura, enquanto que as bactérias usualmente apresentam um crescimento mais leve no meio de cultura ou, quando crescem mais vigorosamente, as colônias são de aparência fina e translúcida.
No entanto, poucas espécies de bactérias apresentam crescimento característico ou produzem sintomas típicos em cultura de tecidos vegetais, de modo que a separação dos diferentes gêneros não pode ser feita baseada apenas na morfologia de colônia. Dessa forma, os principais grupos/gêneros de contaminantes bacterianos podem ser identificados apenas empregando-se testes bacteriológicos, muitos desses na forma de kits comerciais que identificam as bactérias em nível de gênero ou espécie. A identificação em nível de gênero, que normalmente não requer o uso de kits caros, é frequentemente suficiente para identificar a fonte de contaminação bacteriana. Contaminantes indicadores, que identificam a fonte de contaminação de forma precisa, são descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Contaminantes indicando fontes de contaminação específicas. |
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Contaminante |
Fonte de contaminação provável |
Comentário |
Bactérias |
||
Gram-negativas Gram-positivas |
Desinfestação ineficiente dos explantes Práticas de laboratório inadequadas |
Frequentemente Pseudomonas e Enterobacteriaceae |
Cocobacilos gram-positivos (Staphylococcus epidermis) |
Deficiência de técnicas assépticas em: (i) subcultivo das plantas (ii) vertimento do meio de cultura |
Staphylococcus spp. são considerados parasitas obrigatórios de animais |
Bacillus spp. |
Esterilização deficiente do meio de cultura Esterilização ineficiente dos instrumentos usados para subcultivo |
Frequentemente Bacillus subtilis e B. pumilus B. circulans pode sobreviver em álcool 70% |
Fungos/leveduras |
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Diferentes tipos |
Sala de crescimento infestada por ácaros e/ou tripes |
Ocorre especialmente quando salas de crescimento específicas são afetadas |
Fusarium poe |
Sala de crescimento infestada pelos ácaros Sideroptes graminis |
Fusarium poe forma um micélio branco com base rósea |
Mofos cinzento, preto e verde (Botrytis, Aspergillus, Alternaria, Penicillium spp.) e Rhodotorula spp. (leveduras róseas) |
Contaminação elevada do ar do laboratório Defeito na câmara de fluxo laminar |
Penicillium e leveduras róseas são contaminantes comuns do ar em interiores de prédio e demais construções |
Mofos pretos |
Higiene deficiente em salas de crescimento, plantas e soluções estoques contaminadas |
Mofos são frequentemente encontrados em paredes do laboratório com umidade ou crescem em áreas de condensação frequente; os esporos são transmitidos pelo ar |
Cladosporium spp. |
Proteção insuficiente do laboratório contra o ar externo |
Esporos de Cladosporium são muito comuns no ar externo |
Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998). |
Recentemente, demonstraram que certos fungos patogênicos humanos, como Candida albicans e Trichophyton spp., crescem em meio de cultura de tecidos vegetais, sendo que Trichophyton spp. é transmitido via cultura de tecidos contaminados (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Nesses casos, o risco de infecção humana pode ser particularmente alto quando as culturas contaminadas com esses fungos forem transplantadas manualmente (WELLER; LEIFERT, 1996). Também tem sido demonstrado que as bactérias patogênicas humanas Escherichia coli e Serratia marcescens podem persistir nas culturas de tecidos vegetais e tornarem-se fitopatogênicas in vitro quando inoculadas em culturas autotróficas (RAFFERTY et al., 2000).
Uma descrição mais detalhada das diferentes espécies de contaminantes na cultura de células e tecidos vegetais e fonte de informações sobre contaminantes específicos podem ser encontradas na Tabela 1 e em Leifert et al. (1989a, 1989b, 1990, 1991b, 1994a, 1994c) e Danby et al. (1994).
Detecção de contaminantes
Uma das mais importantes fontes de contaminação é o explante durante a iniciação das culturas in vitro. O processo de desinfestação dos explantes prévio ao seu estabelecimento in vitro é frequentemente ineficiente. Esse problema pode ser em virtude do agente desinfestante, que pode ser inativo, ou dos microrganismos, que podem ser protegidos dentro dos tecidos vegetais usados como explantes (CASSELLS, 1998). Fungos e leveduras contaminantes podem ser facilmente detectados quando sobrevivem ao processo de desinfestação porque os mesmos crescem rapidamente no meio de cultura de tecidos vegetais. Por outro lado, as bactérias e vírus contaminantes podem não produzir crescimento visível no meio de cultura. No entanto, a propagação de material com essa infecção latente pode causar perdas severas nos estágios posteriores da cultura de tecidos ou durante o período de aclimatização das plantas.
A detecção de bactérias latentes é normalmente baseada na indexagem dos tecidos vegetais (LEIFERT; WOODWARD, 1998). Essa estratégia envolve a transferência de pedaços de material vegetal para meios bacteriológicos líquidos ou sólidos, após a desinfestação. Os meios utilizados contêm extrato de carne e leveduras, sendo descritos inclusive para testes de esterilidade em outras áreas, como indústrias de alimento e água e microbiologia médica. Diversos meios de indexagem que foram desenvolvidos especificamente para a detecção de contaminantes em cultura de tecidos vegetais, incluindo o meio 523 (LEIFERT; WOODWARD, 1998), o meio TT de detecção de micobactéria (GEORGE; FALKINHAM, 1986) e o meio teste de esterilidade Leifert & Waites (LEIFERT et al., 1994a), podem agora ser obtidos como produtos comerciais. A vantagem de utilizar meios de indexagem é que esses permitem crescer e detectar uma ampla variação de diferentes contaminantes bacterianos, além de serem sensíveis o suficiente para detectar a presença de contaminantes mesmo quando em pouca quantidade. Entretanto, diferentes espécies de bactérias apresentam diferentes taxas de crescimento num mesmo meio em particular (Tabela 2), e nenhum meio bacteriológico é capaz de detectar todos os contaminantes importantes (LEIFERT et al., 1991a, 1994a).
Tabela 2. Crescimento (E625) de contaminantes nos meios Leifert & Waites e Tryptone Soya Broth em diferentes concentrações de nutrientes. |
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Organismo teste |
Leifert & Waites |
Tryptone Soya Broth |
|||||
FS |
HS |
1/10 |
FS |
HS |
1/10 |
||
Bacillus subtilis Cot1 |
0,4 |
0,4 |
0,3 |
0,4 |
0,4 |
0,3 |
|
Bacillus circulans Al 1 |
0,2 |
0,2 |
** |
0,3 |
0,3 |
** |
|
Clavibacter michiganense CM1 |
** |
0,2 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
** |
|
Corynebacterium H416/3 |
** |
- |
0,2 |
0,5 |
0,4 |
0,3 |
|
Lactobacillus plantarum H260/6 |
0,8 |
0,8 |
0,7 |
0,7 |
0,6 |
0,2 |
|
Micrococcus kristinae Ho506/4 |
** |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,3 |
0,2 |
|
Staphylococcus saprophyticus Ch 104/5 |
0,8 |
0,8 |
0,3 |
0,8 |
0,7 |
0,2 |
|
Acinetobacter calcoaceticus Ho295/35 |
0,5 |
0,4 |
0,3 |
0,4 |
0,3 |
** |
|
Agrobacterium radiobacter Ger840/12 |
0,9 |
0,9 |
0,8 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
|
Agrobacterium tumefaciens As001/1 |
0,8 |
0,8 |
0,8 |
0,4 |
0,5 |
0,4 |
|
Pseudomonas maltophilia De1603/20 |
0,7 |
0,6 |
0,4 |
0,8 |
0,8 |
0,7 |
|
Xanthomonas campestris pv. campestris XCCi |
0,5 |
0,7 |
0,3 |
0,5 |
0,2 |
0,5 |
|
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria XVC |
0,3 |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
|
FS - concentração recomendada; HS - metade da concentração recomendada; 1/10 - um décimo da concentração recomendada. **Turbidez não detectada pela avaliação visual (E625 < 0,2). Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998). |
A inspeção visual das culturas é comumente utilizada para monitorar a contaminação in vitro. Essa inspeção pode ser facilitada pelo uso de agentes geleificantes mais claros, como Gelrite®. No entanto, a confiança nesse método traz consigo o risco de propagação clonal em massa de microrganismos latentes. É recomendável que a produção seja disposta numa ordem sequencial na sala de crescimento, e que amostragens de rotina ao acaso para bactérias cultiváveis sejam efetuadas utilizando uma variação de meios apropriados. As contaminações tendem a ser clusterizadas em vez de ao acaso, e quando uma contaminação é detectada numa prateleira, uma série de testes acima e abaixo deverá ser efetuada para determinar a extensão da contaminação (CASSELLS, 1991). A detecção visual de muitas bactérias cultiváveis é frustrada por sua inibição pelos componentes do meio de cultura (GEORGE, 1993). Geralmente, as bactérias crescem em meios bacteriológicos simples, mas a experiência sugere que a utilização de uma variação de meios, em vez de um único meio de cultura, seja necessária para os testes de detecção.
Testes sorológicos podem ser utilizados para identificar diversos contaminantes de origem bacteriana ou virótica em nível de espécie, incluindo Xanthomonas pelargonii, Xanthomonas campestris, Clavibacter michiganense, Haustonia solanacearum (= Pseudomonas solanacearum), Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, que podem permanecer no estado latente in vitro (Tabela 3). Os kits comerciais são mais sensitivos, mas também são mais caros e detectam apenas uma ou poucas espécies de bactéria ou vírus (LEIFERT; WOODWARD, 1998). O sistema de identificação API (bioMerieux AS, França) requer a execução de seis testes padrão para selecionar a fita-teste apropriada. O sistema Biolog (Biolog Inc., EUA), que se baseia em placas de micropoços padrão, requer somente a coloração de gram dos isolados a fim de selecionar o sistema de identificação gram-negativo, gram-positivo ou levedura-específico.
Tabela 3. Métodos de identificação de contaminantes bacterianos. |
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Teste bacteriológico clássico usado |
Família/Gênero suspeito |
|||||
CAT |
OF/F |
MOB |
GRAM |
COCC |
SPOR |
|
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
Staphylococcus spp. |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
- |
Micrococcus spp. |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
Streptococcus spp. |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
Bacillus spp. |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
Bacillus spp. |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
Bacillus spp. |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
Bacillus spp. |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
Corynebacterium spp. |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
Corynebacterium spp. |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
- |
Corynebacterium spp. |
- |
+ |
- |
+ |
- |
- |
Lactobacillus spp. |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
Acinetobacter spp. |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Vibrionaceae |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
Actinobacter spp. |
+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
Pseudomonas spp. |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
Flavobacterium spp. |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Enterobacteriaceae |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
Enterobacteriaceae |
+ |
+ |
+ |
oval |
- |
Leveduras |
|
CAT - catalase; OF/F - crescimento anaeróbico; MOT - motilidade; GRAM - coloração de gram; COCC - formato de coccus; SPOR - esporos resistentes à alta temperatura. Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998). |
A supressão de muitas bactérias e vírus por mecanismos de resistência da planta e resíduos do agente desinfestante usado pode resultar num baixo número de inóculo presente no material vegetal testado. Ambos os testes de indexagem e sorológico devem, portanto, ser repetidos tanto in vitro como após a aclimatização das plantas. Em virtude do custo relativamente elevado dos testes sorológicos, sugere-se que esses sejam usados somente para a detecção de organismos de reconhecido problema para uma determinada espécie vegetal (LEIFERT; WOODWARD, 1998).
A detecção e a caracterização de microrganismos como vírus e viroides apresentavam problemas técnicos consideráveis até o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em ácidos nucleicos. Utilizando-se, por exemplo, sondas contra rDNA 16S, tem sido possível discriminar os diferentes organismos (BOVE; GARNIER, 1997). Metodologias baseadas na técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) têm facilitado o diagnóstico dos contaminantes, pois a facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da técnica a tornam particularmente poderosa em estudos diagnósticos. Em geral, diagnósticos baseados em ácidos nucleicos oferecem o potencial de ser estirpe-específico ou de amplo-espectro e podem ser combinados em ensaios multiplex para a detecção simultânea de uma ampla gama de microrganismos numa mesma amostra. De modo geral, o elevado custo e as dificuldades na automação são as atuais limitações do uso de métodos baseados em ácidos nucleicos para a detecção de contaminantes em cultura de células e tecidos vegetais (O’DONNELL, 2000).
É importante reconhecer também que contaminantes bacterianos latentes podem ser introduzidos no laboratório. Portanto, a indexagem das plantas no estágio de iniciação das culturas pode não prevenir a acumulação de contaminação latente quando os tecidos são continuamente subcultivados. A fim de evitar esse problema, alguns laboratórios mantêm culturas estoques de todas as suas linhagens de plantas produzidas (LEIFERT; WOODWARD, 1998). Esses estoques são regularmente testados para a presença de bactérias latentes a cada 2–4 subcultivos/mês, e as culturas index-positivas, que apresentam crescimento bacteriano nos meios sorológicos, são descartadas. Os estoques index-negativos são regularmente usados para suplementar as culturas de produção e permanecem em produção somente por um período de tempo específico (aproximadamente 2 anos). Tais sistemas de produção têm provado aumentar a confiabilidade, e embora resultem em custo adicional de garantia de qualidade, esse normalmente é mais do que compensado pelo incremento das taxas de crescimento e redução das perdas por contaminação (LEIFERT et al., 1994a).
Sistemas de garantia de qualidade microbiológica
A implementação de sistemas de garantia de qualidade microbiológica, como ARPCC, constitui-se numa importante abordagem para o problema do gerenciamento da contaminação in vitro. Um aspecto importante da estratégia ARPCC é a produção de um sistema de registro que permite traçar com detalhes a história de todas as plantas, incluindo informações sobre a planta estoque, estoque de meio, operador(es), câmara(s) de fluxo laminar e sala de crescimento. A ARPCC envolve basicamente a análise de todos os estágios sequencialmente, a identificação dos riscos em cada estágio e a introdução de monitoramento apropriado e medidas de remediação (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT; WAITES, 1994). Mais especificamente, o sistema ARPCC que tem sido aplicado em muitos laboratórios comerciais de cultura de tecidos vegetais e de micropropagação de plantas envolve:
1. Uma análise profunda de todas as fontes de contaminação em potencial, baseada na identificação/quantificação de microrganismos indicadores de fontes de contaminação específica (Tabela 4).
2. O estabelecimento de sistemas de monitoramento para todas as fontes de contaminação (= pontos críticos de controle ou PCCs), incluindo o desenvolvimento de métodos refinados de detecção de contaminantes e fontes de contaminação.
3. O refinamento dos métodos de prevenção da contaminação em diferentes PCCs.
4. O desenvolvimento de métodos de tratamento no caso de falhas nas estratégias de prevenção.
Os princípios e aplicações dos sistemas de ARPCC em cultura de células e tecidos vegetais têm sido extensivamente revisados por Leifert e Waites (1994), Leifert et al. (1994a) e Leifert e Woodward (1998).
Contaminantes podem ser introduzidos com o explante durante as manipulações no laboratório e/ou por microartrópodes vetores (BERGER et al., 1994; CASSELLS, 1991; LEIFERT et al., 1991a, 1994a). Bactérias gram-negativas, como Pseudomonas fluorescens, Erwinia e Agrobacterium spp., são usualmente encontradas quando o procedimento de desinfestação inicial é ineficiente (Tabela 4). Por outro lado, espécies gram-positivas indicam a ineficiência do procedimento de esterilização do meio de cultura (Bacillus spp.) ou treinamento inadequado do operador em técnicas de assepsia (Staphylococcus spp.). Fungos filamentosos e leveduras contaminantes podem ser introduzidos com o explante e/ou durante todos os estágios in vitro subsequentes (DANBY et al., 1994). Fungos específicos (Fusarium spp.) e/ou uma dispersão rápida de contaminação fúngica numa sala de crescimento específica indicam a presença de microartrópodes vetores como ácaros e/ou tripes. Esses microartrópodes podem facilmente entrar nos recipientes de cultura e, portanto, introduzir esporos de fungos e contaminantes bacterianos nas culturas de tecidos (PYPE et al., 1997).
Tabela 4. Pontos críticos de controle (PCCs), microrganismos indicadores, materiais e métodos usados no controle microbiológico em cultura de tecidos vegetais visando à prevenção de contaminações. |
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Estágio da cultura de tecidos vegetais |
Parâmetros ou PCCs a serem monitorados |
Microrganismos indicadores |
Material necessário |
Referência para os métodos |
Estágio 0 Tratamento da planta/cultura estoque |
Sintomas de vírus, bactérias e fungos patogênicos Detecção e identificação de viroides, vírus, bactérias e fungos |
Lentes de aumento; lupa, microscópio de contraste de fase; meios bacteriológicos seletivos; testes sorológicos ou moleculares; plantas indicadoras |
Vírus: 1, 2 Bactérias: 3, 4 Fungos: 5, 6 |
|
Estágio 1 Desinfestação |
Conteúdo de cloro ativo em soluções de hipoclorito |
Bactérias gram-negativas: Pseudomonas fluorescens, Erwinia spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Agrobacterium spp. |
Papel indicador Whatman, solução de arsenito, coluna de titulação |
7 |
Estágio 2 Indexagem |
Atividade de outros biocidas Presença de vírus, bactérias e fungos nos explantes após a desinfestação |
Depende do composto Meio de indexagem Testes sorológicos Testes moleculares |
8–11 3, 4, 12 1–4 1–4 |
|
Estágio 3 Preparação de meio |
Autoclavagem |
Bacillus spp. (ex.: B. circulans, B. subtilis e B. pumilus) |
Métodos físicos (fita indicadora, indicadores de temperatura) Métodos biológicos (uso de esporos para monitoramento do processo de esterilização) Teste de esterilidade |
13, 14 |
Vertimento do meio |
Penicillium spp. Candida spp. Staphylococcus spp. |
Teste do ar do laboratório e da câmara de fluxo |
12, 15, 16 |
|
Estágio 4 Subcultivo das plantas no laboratório |
Esterilidade do ar |
Rhodotorula spp. (leveduras róseas) |
Amostragem do ar e/ou contador de partículas |
12, 16 |
Câmara de fluxo |
Penicillium spp. |
Contador de partículas |
12 |
|
Esterilização dos instrumentos |
Bacillus spp. |
Meio de indexagem |
||
Técnicas assépticas dos operadores |
Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Candida albicans |
Registro das taxas individuais de contaminação |
||
Estágio 5 Armazenamento de meios e plantas |
Idem esterilidade do ar (Estágio 4) |
Idem esterilidade do ar (Estágio 4) |
Idem esterilidade do ar (Estágio 4) |
Idem esterilidade do ar (Estágio 4) |
Estágio 6 Aclimatização das plantas |
Idem Estágio 0 |
Idem Estágio 0 |
Idem Estágio 0 |
Idem Estágio 0 |
Fonte: adaptado de Leifert e Cassells (2001), dados de Leifert e Waites (1994). (1) Hill (1984); (2) Matthews (1991); (3) Lelliot e Stead (1987); (4) Schaad (1979); (5) Smith et al. (1986); (6) Hoffmann e Schumutterer (1983); (7) Hoffman et al. (1981); (8) Collins et al. (1981); (9) Hugo (1971); (10) Russell et al. (1982); (11) Sykes (1965); (12) Leifert et al. (1991a, 1991c); (13) Kelsey (1958); (14) Kelsey (1961); (15) Danby et al. (1994); (16) Gregor (1973). |
A habilidade para o estabelecimento de culturas assépticas é uma etapa crítica no processo de cultivo in vitro de tecidos vegetais (CASSELLS, 1997, 2000a). Ela envolve o uso de protocolos bem estabelecidos para localizar, produzir e manter os estoques livres de patógenos e de contaminantes. O ponto inicial é o conhecimento dos fitopatógenos da cultura; caso seja insuficiente, o conhecimento dos fitopatógenos de culturas relacionadas deverá ser utilizado. A seleção de plantas estoques é seguida pela seleção de testes diagnósticos e de indexagem apropriados. Nos casos dos testes diagnósticos serem negativos, os resultados deverão ser confirmados inoculando-se, por exemplo, plantas indicadoras. Depois das culturas terem sido estabelecidas in vitro, testes para a confirmação da ausência de contaminantes cultiváveis deverão ser efetuados. Nos casos em que esforços são feitos para eliminar patógenos e/ou contaminantes das culturas introduzidas in vitro, testes rigorosos deverão ser efetuados regularmente.
Numa perspectiva prática, a manutenção de culturas livres de contaminantes é o principal objetivo, assumindo que culturas assépticas foram estabelecidas no estágio 1. Isso envolve rigorosas normas de boas práticas de laboratório em filtração de ar, esterilização de água, meio de cultura e instrumentos, além de experiência de trabalho. Essa última depende do treinamento e da experiência pessoal dos operadores, provisão de vestuário apropriado e precaução, como a remoção de relógios, joias e bijuterias (LEIFERT; WAITES, 1994). Um aspecto importante também é o design dos frascos de cultura, especialmente o tamanho e a tampa. Frascos sem tampa são de grande risco, pois alterações na pressão pela variação de temperatura em virtude das transições luz/escuro podem resultar em pressões de sucção, levando ao rompimento dos filmes de PVC. A troca de gases é importante em relação à qualidade dos tecidos in vitro, sendo que a mesma pode ser encontrada utilizando-se tampas permeáveis a gás e com selos à prova de microrganismos e microartrópodes (CASSELLS; WALSH, 1994). Leifert e Waites (1994) têm listado alguns contaminantes microbianos que podem ser usados para monitorar as boas práticas de laboratório.
Persistência latente
Os contaminantes podem aparecer imediatamente após a sua introdução em cultura de tecidos ou permanecer no estado latente (não produzir sintomas nas plantas e/ou crescimento visível no meio de crescimento vegetal) por um longo período de tempo. Os fungos filamentosos e as leveduras raramente permanecem latentes in vitro porque o meio de cultura de células e tecidos vegetais fornece todos os nutrientes essenciais para o crescimento da maioria dos fungos (DANBY et al., 1994; LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a).
A maioria das bactérias comuns ao ambiente cresce rapidamente no meio de cultura tornando-se patogênica às culturas de células e tecidos vegetais. Por outro lado, algumas bactérias do gênero Pseudomonas, Xanthomonas e as corinebactérias normalmente são de difícil visualização em determinados meios de cultura de plantas e/ou não produzem sintomas in vitro, embora possam afetar as taxas de crescimento e enraizamento vegetal (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1991b; LONG et al., 1988). Os vírus, viroides e algumas bactérias fastidiosas, como micoplasma, espiroplasma e ricketsia, não podem crescer fora de seus hospedeiros (AGRIOS, 1990). Assim, como não existem relatos da transmissão desses organismos por vetores no laboratório, assume-se que esses são introduzidos em cultura juntamente com os explantes. Algumas vezes esses patógenos demonstram sintomas in vitro semelhantes àqueles observados no campo. No entanto, mais frequentemente eles permanecem no estado latente in vitro (WALKEY, 1985), tornando-se virulentos após a transferência das plantas para as condições de campo (LEIFERT; CASSELLS, 2001; WEBER; SCHENK, 1988). Acredita-se que a latência in vitro desses patógenos, que são mais ativos sob condições in vitro, pode ser causada pelo desencadeamento de mecanismos de resistência por parte da planta, embora poucas são as informações disponíveis na literatura acerca da confirmação dessa hipótese (LEIFERT et al., 1994a). A produção de compostos antivirais e de proteínas relacionadas à patogênese (PRs), envolvidas na resistência a viroses, tem aumentado em resposta a determinados reguladores de crescimento utilizados no meio de cultura de células e tecidos vegetais (APOSTOL et al., 1989; DAUB, 1986; THYNN et al., 1989; TOYODA et al., 1985).
Nos últimos 30 anos, muitos são os trabalhos que descrevem métodos para a eliminação de agentes de infecção por meio da cultura de ápices caulinares e tratamento com calor ou frio (HADIDI et al., 1998). No entanto, muito poucas bactérias fastidiosas podem ser cultivadas em meio de cultura especializado, de modo que a maioria delas não é capaz de crescer em meio de cultura de tecidos vegetais (SCHAAD, 1979). Logo, a completa eliminação desses patógenos necessita ser confirmada por algum método diagnóstico, como testes sorológicos, microscopia eletrônica ou técnicas moleculares como hibridização de ácidos nucleicos e/ou PCR (LEIFERT et al., 1994a). Os métodos sorológicos têm sido utilizados rotineiramente com grande sucesso para a detecção de vírus e bactérias fastidiosas (MATTHEWS, 1991; MOLLERS; SARKAR, 1989; WALKEY, 1985). Tais testes podem ser muito sensitivos, mas frequentemente detectam apenas uma espécie de bactéria ou vírus ou espécies intimamente relacionadas. Além disso, a supressão desses patógenos por mecanismos de resistência das plantas, o uso de antibióticos in vitro e/ou acidificação do meio de cultura podem resultar num título ou número de células muito baixo presente no material in vitro, dificultando a detecção de forma confiável pela maioria dos métodos disponíveis atualmente (HADIDI et al., 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a). Recomenda-se que os testes diagnósticos somente devem ser efetuados em tecidos para os quais esses testes tenham sido oficialmente validados (LEIFERT; CASSELLS, 2001).
Contaminantes bacterianos usualmente requerem fatores de crescimento/vitaminas que não estão presentes no meio de cultura de tecidos vegetais, de modo que não podem crescer ou persistir no meio na ausência de tecidos vegetais (LEIFERT; WAITES, 1992). Também, a acidificação do meio de cultura e liberação de exsudatos antibacterianos pelas células e tecidos vegetais podem suprimir o crescimento bacteriano in vitro, resultando em persistência latente (LEIFERT et al., 1994c).
A contaminação latente reduz a confiabilidade dos sistemas de cultura de células e tecidos vegetais, visto que mesmo pequenas mudanças nas condições ambientais (temperatura, pH, composição do meio ou aclimatização) podem permitir a rápida proliferação do contaminante. Isso pode resultar em crescimento e/ou enraizamento vegetal reduzido, morte das células e tecidos vegetais in vitro ou expressão dos sintomas após transferência para as condições de campo (COOKE et al., 1992; LEIFERT; WAITES, 1992). Acredita-se que fatores de crescimento adicionais para o crescimento bacteriano podem ser fornecidos pelos exsudatos produzidos pelas células e tecidos vegetais, tornando assim o crescimento de contaminantes bacterianos completamente dependente dos explantes (LEIFERT; WAITES, 1992; LEIFERT et al., 1994a). O crescimento bacteriano em cultura de tecidos vegetais também é dependente da temperatura de incubação. Os regimes de temperaturas usados para a maioria das culturas são normalmente mais baixos (25 oC) do que aqueles exigidos para o máximo crescimento de contaminantes bacterianos (≥ 35oC). Os contaminantes bacterianos latentes podem, portanto, tornarem-se virulentos (produzir sintomas visíveis em plantas e/ou crescimento visível no meio de cultura) quando o ambiente da cultura for alterado. Por exemplo, a transferência dos explantes para o meio de enraizamento pode aumentar a concentração de exsudatos vegetais, resultando em estímulo do crescimento bacteriano (CASSELLS et al., 1988). De forma similar, a elevação da temperatura na sala de crescimento pode resultar tanto no aumento da exsudação causado pelo estresse do calor, como na adequação da temperatura ótima de crescimento para as bactérias (LEIFERT; WOODWARD, 1998; LEIFERT et al., 1994a).
Inicialmente, acreditava-se que somente os microrganismos vitropats permaneciam no estado latente in vitro (HERMAN, 1990a, 1990b). Mais recentemente, descobriu-se que muitos patógenos bacterianos (bactérias que causam doença no habitat natural ou agrícola das plantas in vivo) podem permanecer latentes in vitro (LEIFERT et al., 1994a). Mais significativo é o fato de que Agrobacterium tumefaciens (bactéria fitopatogênica utilizada como vetor para a transformação genética de plantas) pode persistir no estado latente in vitro, mas não provoca doenças quando as plantas são transferidas para as condições in vivo da casa de vegetação (COOKE et al., 1992). Esse fato demonstra claramente o risco potencial de escape para o meio ambiente que os sistemas de vetores baseados em Agrobacterium oferecem, caso o contaminante não seja eliminado e/ou caso as plantas contaminadas não sejam detectadas e descartadas previamente à sua introdução no meio ambiente.
Weller e Leifert (1996) têm chamado a atenção para os possíveis riscos associados com a contaminação das culturas de tecidos vegetais por bactérias patogênicas humanas. Esse fato tem sido confirmado pela inoculação dessas bactérias em culturas de tecidos vegetais in vitro (RAFFERTY et al., 2000). O risco é que tais microrganismos podem infectar os trabalhadores envolvidos na cadeia de produção de plantas micropropagadas (WELLER; LEIFERT, 1996). A propagação autotrófica, que tem sido comparada à micro-hidroponia asséptica, também pode trazer riscos similares (CASSELLS, 2000b).
Eliminação de contaminantes
As principais estratégias para eliminar contaminantes em cultura de tecidos são o uso de termo- ou quimioterapia na planta estoque, desinfestação dos explantes, cultura de meristemas, termo- e quimioterapia in vitro, variação do meio de cultura e, mais recentemente, a aplicação do conceito de ARPCC (CASSELLS, 2000a; HADIDI et al., 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001). A busca de plantas estoques livres de patógenos e contaminantes deve ser a estratégia preferida. Caso essas plantas não estejam disponíveis no comércio ou não sejam produzidas por organizações especializadas, deve-se então lançar mão do uso da termoterapia e quimioterapia da planta estoque e manter essas plantas sob condições de baixo risco de infecção por patógenos (CASSELLS, 1997, 2000b, 2001).
A aplicação de antibióticos (químicos antibacterianos e antivirais) em plantas in vivo tem sido relatada por reduzir contaminantes na região apical das plantas, facilitando o cultivo de meristemas e ápices caulinares em condições assépticas (CASSELLS, 2001). De maneira similar, a termoterapia tem um longo registro de aplicação para esse propósito. O problema é que ambos os tratamentos podem não eliminar completamente o contaminante, mas meramente reduzir o título de contaminantes abaixo do nível de detecção, de modo que o contaminante pode reemergir após o estabelecimento das células e tecidos in vitro. A termo e a quimioterapia in vitro também necessitam ser cuidadosamente aplicadas em virtude de apresentar os mesmos problemas daquela aplicada às plantas estoques. Uma combinação de termoterapia e quimioterapia pode ser necessária para eliminar completamente os contaminantes (CASSELLS, 1998, 2000b). No entanto, as plantas obtidas devem ser rigorosa e apropriadamente indexadas após o tratamento.
No caso das viroses, o químico antiviral ribavirina (Virazole) tem sido efetivo contra uma ampla gama de fitovírus quando incorporado no meio de cultura e algumas vezes combinado com termoterapia in vitro (CASSELLS, 1998). Como a maioria dos antibióticos utilizados em cultura de tecidos, a ribavirina é virostático e não biocida. Como na termoterapia de plantas in vivo e in vitro, é essencial que após o tratamento com ribavirina as plantas estabelecidas in vitro sejam testadas para a presença de vírus em estágio apropriado do desenvolvimento, a fim de garantir que os vírus tenham sido eliminados em vez de suprimidos (LEIFERT; CASSELLS, 2001).
Investigação da influência dos fatores do meio de cultura e ambientais, incluindo variação nos reguladores de crescimento, acidificação do meio de cultura e culturas autotróficas versus heterotróficas, tem sido feita visando determinar quais fatores que influenciam o título de contaminantes in vitro e estabelecer condições padrões para testes de detecção (CASSELLS, 2001). A acidificação do meio de cultura fornece uma alternativa barata em relação ao uso profilático de antibióticos para determinados sistemas in vitro (LEIFERT et al., 1994b). Entretanto, similar aos tratamentos com antibióticos, o uso curativo da acidificação do meio de cultura pode somente suprimir o crescimento dos contaminantes em vez de eliminá-los completamente. Sayegh e Long (1997) relataram que a transferência de culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendron, Maranta e Cordyline, contaminadas por fungos e bactérias para culturas autotróficas usando um suporte de poliuretano (CASSELLS; WALSH, 1998) permitiu o resgate das culturas contaminadas. Esse fato pode ser atribuído à remoção de carboidratos do meio usado para as culturas autotróficas, nutriente considerado essencial para o rápido crescimento da maioria dos contaminantes.
A cultura de meristemas é, na maioria dos casos, bem sucedida em eliminar muitos fitopatógenos e contaminantes sublimiares (GEORGE, 1993). O problema dessa abordagem é, entretanto, tomar a menor porção apical para garantir a eliminação do patógeno/contaminante sem comprometer a sobrevivência do explante. É recomendado depois cultivar os explantes em meio de expressão bacteriana e testar rigorosamente as culturas estabelecidas antes de embarcar no processo de propagação clonal em massa, visto que as condições de estresse in vitro possivelmente acentuam os mecanismos de resistência vegetal, podendo suprimir o título de contaminantes/patógenos in vitro (CASSELLS, 1991; LEIFERT; CASSELLS, 2001). Consequentemente, uma amostra da produção deverá ser estabelecida e crescida in vivo sempre que possível, a fim de verificar a sua conformidade com os procedimentos padrões já validados.
O sistema ARPCC tem sido a abordagem mais eficaz no gerenciamento da contaminação do que aquelas estratégias baseadas em termoterapia e quimioterapia (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a). Mesmo os compostos antifúngicos e antibacterianos de amplo espectro frequentemente falham em eliminar todos os microrganismos alvos, além de apresentarem efeitos colaterais negativos no crescimento e/ou enraizamento de culturas de tecidos vegetais (COSTA et al., 2000; LEIFERT et al., 1991b, 1991c, 1994b; OTONI et al., 2003). O crescimento bacteriano é somente suprimido (efeito bacteriostático) pelos tratamentos antimicrobianos, de modo que as bactérias são capazes de retomarem o seu crescimento após a interrupção do tratamento (BARRETT; CASSELLS, 1994; CASSELLS, 2001; FALKINER, 1990, 1997). Particularmente, as bactérias gram-negativas são de difícil erradicação das culturas de plantas in vitro (LEIFERT et al., 1991b). Nos casos em que o tratamento com antibiótico resultou no sucesso da eliminação dos contaminantes gram-negativos, este foi eficiente somente para determinada proporção das plantas tratadas (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Como resultado, as plantas tiveram que ser individualmente separadas, a fim de evitar a contaminação cruzada por plantas que permaneceram infectadas durante os subcultivos, e testadas regularmente para a presença de contaminantes por pelo menos três meses após o tratamento com antibiótico, visando garantir a ausência de contaminantes latentes (LEIFERT et al., 1991b).
Conforme já mencionado, vários são os relatos encontrados na literatura acerca das falhas de eliminação de Agrobacterium dos tecidos de plantas geneticamente modificadas (BARRETT et al., 1997; HAMMERSCHLAG et al., 2000; MARTIN et al., 1990). Mesmo quando a contaminação não foi detectada por exame visual ou indexagem durante o crescimento em meio suplementado com antibióticos, a Agrobacterium foi encontrada presente e detectada após transferência das plantas para meio livre de antibióticos (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Também foi demonstrado que aproximadamente 50% das plantas ainda continham células bacterianas com o vetor binário, em níveis de 107 unidades formadoras de colônias (ufc) por grama de tecido vegetal, seis meses após a transformação genética (BARRETT et al., 1997). O mesmo resultado tem sido obtido para vários outros contaminantes microbianos (LEIFERT et al., 1991b). Esses dados claramente indicam que a suposta esterilidade do meio de cultura pode ser ineficiente para se detectar números muito baixos de contaminantes bacterianos e/ou bactérias que são inibidas por tratamento com antibióticos. De maneira similar, acredita-se que os métodos de detecção moleculares e/ou sorológicos disponíveis atualmente podem também ser incapazes de detectar contaminantes bacterianos quando o número de células é muito baixo (O’DONNELL, 2000). Como resultado, o risco de escape dos sistemas de vetores baseados em Agrobacterium para o meio ambiente é elevado.
Indução da tolerância à aclimatização e à resistência a doenças em plantas micropropagadas
A micropropagação tem sido extensivamente utilizada para a rápida multiplicação de plantas para a pesquisa e produção comercial de mudas clonais de qualidade. No entanto, essa técnica tem sido limitada pela baixa sobrevivência de algumas espécies durante a fase de aclimatização em decorrência de alterações no crescimento e no desenvolvimento das plantas em consequência de anormalidades anatômicas, fisiológicas e morfológicas impostas pelo ambiente in vitro (KOZAI et al., 1992). As plantas cultivadas in vitro apresentam capacidade fotossintética reduzida, menos depósitos de ceras, mau funcionamento de estômatos, sistema radicular subdesenvolvido e poucas folhas e pelos radiculares (FROMMEL et al., 1991; NOWAK et al., 1995, 1998). A qualidade genética e fitossanitária do material vegetal tem sido cada vez mais um motivo de preocupação, de modo que esforços devem ser feitos para incrementar ambas visando melhorar o desempenho ex vitro das microplantas oriundas da micropropagação ou da transformação genética (CASSELLS, 1997, 2001). O fato de que as microplantas são ou pelo menos deveriam ser assépticas impõe o risco de ataque por patógenos facultativos durante o estabelecimento in vitro, visto que essas representam um nicho para a colonização. Por outro lado, a biotização in vitro apresenta uma oportunidade não somente para bloquear o sítio de ataque dos patógenos, mas também para utilizar os agentes de biocontrole, as bactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) e os fungos micorrízicos arbusculares (MVAs) na proteção contra possíveis estresses e na promoção do crescimento da microplanta (CASSELLS, 2000b).
Os MVAs são provavelmente o principal componente da biomassa microbiana na rizosfera, embora sejam frequentemente ignorados porque aqueles associados com a maioria das plantas cultivadas não crescem quando cultivados em meio artificial no laboratório (CORDIER et al., 2000). Além disso, os MVAs parecem ser um grupo de micróbios de solo muito distinto, pois não satisfazem a definição clássica de microrganismos da rizosfera e/ou rizoplano (CORDIER et al., 2000). De fato, os MVAs não somente desenvolvem-se em toda a rizosfera, como também dentro de raízes (no caso de fungos endomicorrízicos). Eles mudam a morfologia e a fisiologia das raízes, de modo que as relações das plantas com os compartimentos bióticos e abióticos do solo são modificadas profundamente. A importância dos MVAs para o crescimento e a sanidade vegetal tem sido amplamente demonstrada nos últimos anos. Eles formam uma parte integral de muitas plantas cultivadas, influenciando aspectos da fisiologia vegetal, incluindo a absorção de nutrientes minerais (biofertilizantes), produção de hormônios (bioreguladores) e resistência a estresses abióticos e doenças de raízes (bioprotetores) (CORDIER et al., 2000; PERSELLO-CARTIEAUX et al., 2003).
Quatro fatores principais devem ser observados na produção de microplantas micorrizadas: (i) escolha do inóculo, (ii) tempo de inoculação, (iii) composição do substrato e (iv) aplicações químicas (AZCÓN-AGUILAR; BAREA, 1997; LOVATO et al., 1996). Diversos inóculos de MVAs estão atualmente disponíveis no mercado, embora nem todos sejam bem adaptados ao esquema de micropropagação, podendo haver uma enorme variação em suas eficiências (CORDIER et al., 2000). A inoculação ex vitro durante a fase de aclimatização parece ser o momento mais adequado para a introdução dos MVAs. De fato, o estabelecimento da associação micorrízica tem sido decisivo na fase de aclimatização de plantas micropropagadas, proporcionando maior crescimento a várias espécies (AZCÓN-AGUILAR et al., 1992; COSTA, 2003; DECLERCK et al., 2002; ELMESKAOUI et al., 1995; ESTRADA-LUNA; DAVIES, 2003; LINS et al., 2003; MEIRA, 2004; YANO-MELO et al., 1999). Isso é compatível com a presente tendência de junção das fases de aclimatização e enraizamento após a indução inicial da formação de raízes durante a fase in vitro. A composição do substrato e as aplicações químicas são os aspectos mais problemáticos a serem gerenciados, exigindo o desenvolvimento de um conhecimento prático específico para cada microplanta. A inoculação bem sucedida de MVAs tem sido realizada em esquemas de produção pré-comercial de diversas plantas micropropagadas, como videira (MAZZITELLI; SCHUBERT, 1989), café (SOUZA et al., 1991), maçã (BRANZANTI et al., 1992), abacate (VIDAL et al., 1992), kiwi (SCHUBERT et al., 1992) e aspargo (PARENT et al., 1993). Uma excelente revisão acerca da micorrização de plantas micropropagadas pode ser encontrada em Rai (2001).
Assim como os MVAs, o uso de RPCPs na produção de mudas micropropagadas ainda está em sua infância. Os efeitos benéficos das RPCPs sobre mudas micropropagadas são principalmente o aumento da área foliar, do diâmetro do caule, do número de folhas e matéria seca, a redução do período de aclimatização e a maior sobrevivência das mudas após o transplante (MARIANO et al., 2003). A inoculação das RPCPs pode ser efetuada tanto in vitro como ex vitro. Muitos isolados são incapazes de crescer em meio de cultura quando os explantes estão ausentes, formando populações epifíticas e endofíticas apenas quando cocultivados com os tecidos vegetais (FROMMEL et al., 1991; NOWAK et al., 1997; PILLAY; NOWAK, 1997).
Diversos trabalhos têm demonstrado o efeito das RPCPs na proteção contra patógenos. Plântulas de batata cocultivadas in vitro com o isolado PsJN de Pseudomonas sp. não fluorescente foram mais resistentes à infecção causada pelos fungos Verticillium albo-atrum e Rhizoctonia solani do que plântulas não bacterizadas (Tabela 5) (NOWAK et al., 1998). Em ensaios de pareamento in vitro, PsJN não inibiu o crescimento de ambos os fungos, evidenciando uma possível indução de resistência demonstrada pelo aumento do teor de lignina, maior atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) e maior teor de ácidos fenólicos, como cafeico e clorogênico. Em videira, plântulas provenientes de explantes nodais cocultivados in vitro com PsJN foram mais resistentes contra Botrytis cinerea (BARKA et al., 2000). No Brasil, a aplicação dos isolados de bactérias RAB9 (Bacillus sp.), E2 (não identificado) e ENF24 (B. pumillus) em mudas micropropagadas de bananeira durante a fase de aclimatização reduziu significativamente a severidade e o índice de doença causada pela murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. cubense), conforme pode ser visualizado na Tabela 6 (MARIANO et al., 2003).
Tabela 5. Incidência de doença e rendimento de tubérculos de plantas de batata (Solanum tuberosum) bacterizadas e não bacterizadas inoculadas com Rhizoctonia solani. |
|||||
Cultivar e tratamento |
Infecção da raiz |
Rendimento de tubérculo |
|||
Tamanho de lesão (mm) |
Número de lesões |
Plantas infectadas (%) |
Por planta (g) |
Número |
|
‘Kennebec’ |
|||||
Bacterizada |
6,3 ± 2,3 |
2,0 ± 0,8 |
50 |
33,5 ± 3,9 |
3,8 ± 1,2 |
Não bacterizada |
8,5 ± 1,0 |
5,9 ± 0,7 |
100 |
26,7 ± 7,9 |
2,8 ± 1,1 |
‘Desirée’ |
|||||
Bacterizada |
8,0 ± 2,5 |
1,4 ± 0,5 |
60 |
29,5 ± 4,0 |
2,6 ± 1,3 |
Não bacterizada |
14,4 ± 3,5 |
2,1 ± 0,5 |
80 |
27,8 ± 4,7 |
3,6 ± 1,7 |
Fonte: adaptado de Nowak et al. (1998). |
Tabela 6. Efeito de isolados de Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCPs) no biocontrole da murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) em mudas micropropagadas de bananeira (Musa x paradisiaca). |
||||
Tratamento |
Experimento 1(1) |
Experimento 2(2) |
||
Matéria seca (mg) |
Severidade |
Matéria seca (mg) |
Índice de doença |
|
RAB9 (Bacillus sp.) |
2.520a |
0,00b |
190,0a |
20b |
E2 (não identificado) |
2.320a |
0,50b |
217,5a |
15b |
ENF24 (B. pumillus) |
2.270a |
0,75b |
192,5a |
17b |
Controle não bacterizado |
230b |
4,25a |
120,0b |
52a |
(1) Avaliação aos 60 dias após a inoculação. (2) Avaliação aos 30 dias após a inoculação. Médias seguidas por letras distintas diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Fonte: adaptado de Mariano et al. (2003). |
Dentre os fatores que podem afetar a eficiência das RPCPs no sistema de micropropagação estão o genótipo da planta, a temperatura, a concentração da suspensão bacteriana, a fonte de carbono no meio e o tipo e mistura de isolados (LAZAROVITS; NOWAK, 1997; MARIANO et al., 2003). O isolado PsJN de Pseudomonas sp. não fluorescente tem sido até agora a mais eficiente RPCP já encontrada (CONN et al., 1997; NOWAK et al., 1999). A mistura com organismos bons colonizadores do sistema vascular pode melhorar a sua estabilidade na planta e garantir a predictibilidade de respostas a estresses ambientais (NOWAK et al., 1998). Entretanto, embora PsJN promova o crescimento de plântulas de batata, tomate, pimentão, cebola e outras hortaliças, o isolado é caracteristicamente genótipo-específico e dependente de temperatura (LAZAROVITS; NOWAK, 1997). A elevação da temperatura estimulou as respostas de crescimento in vitro na maioria dos clones de batata (BENSALIM et al., 1998), mas reduziu em tomate (PILLAY; NOWAK, 1997), havendo diferenças dramáticas entre os genótipos (NOWAK, 1998). Com relação a fonte de carbono do meio de cultura, PsJN bem como outras BPCPs testadas sempre estimulam maior crescimento de raízes em meio contendo sacarose e maior crescimento da parte aérea em meio contendo lactose (NOWAK, 1998). Nowak et al. (1999) observaram que as respostas de plantas bacterizadas foram maiores e mais uniformes na terceira geração (após três subcultivos), indicando que é necessário um período de adaptação do hospedeiro ao inoculante para que a promoção do crescimento seja expressa em sua plenitude.
O estresse oxidativo pode induzir uma cascata de respostas em plantas, protegendo-as contra uma ampla variação de estresses (tolerância cruzada a estresse) (CASSELLS, 2001). Potencialmente, os tecidos vegetais in vitro podem ser expostos a diversos tipos de estresses, incluindo estresse hídrico, salino e de temperatura. Esses estresses podem proteger as plantas de forma cruzada contra patógenos e contaminantes.
Considerações finais
Uma vez que as plantas estabeleceram associações íntimas com os micróbios desde um período muito anciente em sua evolução, de modo que usualmente contenham microrganismos vivos em suas células e tecidos em diferentes tipos de associações, não é de se surpreender que a contaminação microbiana seja um dos problemas mais dramáticos afetando a cultura in vitro de células e tecidos vegetais. De fato, o insucesso em reduzir as perdas por contaminação a níveis aceitáveis tem sido a principal causa da queda constante de produção de plantas micropropagadas pelos laboratórios de micropropagação comercial, observada principalmente na última década. Portanto, uma maior ênfase do que a que tem sido dada até o momento deverá ser investida em relação ao problema da contaminação microbiana de plantas cultivadas in vitro, a fim de garantir que as vantagens do uso da cultura in vitro de células e tecidos vegetais continuem sendo exploradas de forma satisfatória.
Recentes avanços têm sido obtidos nos últimos anos em relação ao conhecimento sobre contaminantes e fontes de contaminação em cultura de tecidos vegetais, novos métodos diagnósticos de contaminantes, sistemas de garantia de qualidade microbiológica, persistência latente, eliminação de contaminantes e indução de resistência a doenças em plantas micropropagadas. A aplicação do sistema ARPCC tem provado ser a melhor estratégia para a prevenção da introdução e distribuição de contaminantes no laboratório. A transferência de culturas contaminadas para condições autotróficas oferece o potencial de conter o problema da contaminação e minimizar as perdas por ela causadas. As plantas podem ser tratadas com antibióticos prévio ao seu cultivo em laboratório (estágio 0) a fim de evitar os contaminantes bacterianos, mas a principal estratégia para a eliminação de bactérias continua sendo a cultura de meristemas, preferivelmente feita em meio de expressão bacteriana.
As vitroplantas representam um nicho potencial para a colonização por contaminantes. A recente ideia de colonizar esse nicho com microrganismos benéficos apresenta vantagens reconhecidas, como melhoria da qualidade das plantas e maior resistência aos estresses bióticos e abióticos. Esses microrganismos podem ser introduzidos tanto in vitro, em estágios iniciais de multiplicação, como ex vitro, durante o período de aclimatização, podendo ser propagados por sucessivas gerações como epifíticas ou endofíticas sem a necessidade de reinoculação. A exposição dos tecidos vegetais a diversos tipos de estresses também é capaz de proteger de forma cruzada as plantas contra patógenos e outros contaminantes.
Referências
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