Capítulo 5
Microrganismos assintomáticos do cultivo in vitro: natureza e riscos para o cultivo de plantas
Terezinha Rangel Camara
Lilia Willadino
Cynthia Cavalcanti de Albuquerque
Introdução
O tema da contaminação microbiana no cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos de plantas vem merecendo destaque entre os pesquisadores e micropropagadores de todo o mundo. Três simpósios internacionais foram realizados visando discutir os avanços e perspectivas do problema enfrentado por laboratórios científicos e de produção de plantas in vitro. O primeiro encontro foi em 1987, seguido de duas versões que se realizaram em 1996 e em 1999 (CASSELLS, 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001).
Avanços consideráveis têm sido feitos no diagnóstico e manejo de doenças e contaminações microbianas no cultivo in vitro de plantas. Esses avanços são resultantes de tentativas de distinguir os problemas de transmissão de doenças dos de contaminação de laboratório. O controle de doenças é atingido estabelecendo-se cultivos livres de patógenos, enquanto que o controle da contaminação laboratorial baseia-se na adoção de práticas de manipulação apropriadas. O controle de doenças ou de fitopatógenos e da contaminação in vitro está direcionado para a mais importante causa de perdas na indústria de vitroplantas. Tais perdas, entretanto, não se limitam às condições de laboratório e podem se estender na fase de estabelecimento ex vitro, em virtude da má qualidade das vitroplantas ou das partes aéreas, na fase de aclimatização.
No controle da contaminação in vitro, as práticas de prevenção, com destaque para as análises de risco nos pontos de controle crítico (HACCP) sugeridos por Leifert e Waites (1994), passaram a ser mais amplamente adotadas a partir do segundo simpósio internacional sobre contaminação in vitro, em 1996. Os métodos de detecção também vêm sendo aperfeiçoados, permitindo uma identificação mais segura e minuciosa dos microrganismos associados aos tecidos cultivados in vitro, relacionando-os com o estágio do cultivo e com a fonte de contaminação, bem como com o nicho que ele coloniza: epifítico ou endofítico.
A adoção de técnicas adequadas de assepsia superficial assegura o controle dos microrganismos epifíticos e eventuais endofíticos facultativos. A contaminação endofítica, por sua vez, constitui o principal problema da ocorrência de microrganismos no cultivo in vitro, tendo em vista que a detecção desses contaminantes, em geral tardia, muitas vezes se dá em estágios da multiplicação em que a disseminação clonal já ocorreu, e, em termos quantitativos, a perda de plantas pode ser muito alta. Ademais, por natureza, alguns desses microrganismos endofíticos podem se manter no tecido vegetal in vitro sem sinais aparentes, de forma completamente assintomática. Por outro lado, os sintomas podem não ser reconhecidos como decorrentes de microrganismos habitando o interior dos tecidos vegetais, caracterizando-se como um declínio na taxa de crescimento e desenvolvimento das culturas mantidas in vitro. Cabe salientar, entretanto, que alguns desses endofíticos assintomáticos podem se comportar como promotores de crescimento de plantas durante o cultivo in vitro.
Este capítulo dará ênfase à presença desses microrganismos assintomáticos, sua natureza e os riscos para o cultivo in vitro de plantas, apontando sugestões para indexação das plantas estoques visando à prevenção e ao controle do problema.
Pontos de controle crítico
As contaminações causadas por fungos, bactérias e leveduras na micropropagação de plantas constituem as principais causas de perdas de material vegetal, podendo alcançar valores médios de 3% a 15% a cada subcultivo (LEIFERT; WAITES, 1994; PEREIRA et al., 2003). Os contaminantes podem ser introduzidos com os explantes primários, por ocasião do seu estabelecimento in vitro, ou podem entrar em qualquer estágio do processo de cultivo. A exata determinação da fonte ou fontes de contaminação por meio da avaliação visual das culturas é, frequentemente, muito difícil. Os laboratórios de cultura de tecidos de plantas necessitam de alguma forma de controle microbiológico a fim de monitorar, continuamente, todas as possíveis fontes de contaminação visando assegurar a detecção e prevenção da entrada de contaminantes no cultivo in vitro. A indexação de explantes no momento da inoculação permite detectar a presença de contaminantes e selecionar o material a ser cultivado, evitando a propagação dos microrganismos latentes, sobretudo de contaminantes bacterianos (DANTAS et al., 2002). Na sala de crescimento, ácaros e tripes são vetores de fungos, leveduras e bactérias e representam sérios riscos de contaminação na cultura de tecidos de plantas. Por seu tamanho diminuto (< 1,0 mm), eles podem penetrar facilmente nos tubos de cultivo disseminando os microrganismos.
Os riscos associados aos diferentes tipos de contaminantes podem ser classificados de acordo com seu efeito sobre as plantas, ou explantes, in vitro e as perdas econômicas que eles causam. A princípio todas as espécies de fungos e leveduras representam risco severo porque elas crescem bem nos meios de cultura para tecidos vegetais e podem matar as plantas, ou explantes, por causa da redução do pH do meio, da produção de metabólitos tóxicos e da competição por nutrientes (LEIFERT; WAITES, 1994).
Algumas bactérias também são consideradas risco severo porque podem crescer nos meios de cultivo e matar as plantas. Nesse grupo, incluem-se espécies que habitam naturalmente a superfície dos tecidos vegetais in vivo como saprófitas ou patógenos, tais como Lactobacillus plantarum, Corynebacterium spp., Pseudomonas fluorescentes e várias Enterobacteriaceae (LEIFERT et al., 1994).
Um outro risco severo é constituído por bactérias e vírus que permanecem latentes por um longo período da cultura de tecidos, acarretando na sua disseminação ao longo de vários estágios do cultivo in vitro. A manifestação desse tipo de contaminante pode se dar por meio de redução nas taxas de multiplicação e enraizamento, comprometendo, consequentemente, a produtividade (LEIFERT; WAITES, 1994). A produção, por bactérias, de metabólitos fitotóxicos, tais como ácido lático e acético, cianeto, reguladores de crescimento e antibióticos, pode causar a deterioração dos tecidos vegetais (PEREIRA et al., 2003). Por ser detectada tardiamente, as perdas provocadas por esses contaminantes são quantitativamente elevadas.
Embora os contaminantes microbianos possam ser introduzidos ou manifestar-se em qualquer dos estágios da micropropagação estabelecidos por Murashige (1974), tem-se observado que diferentes espécies de fungos, leveduras e especialmente bactérias invadem a cultura de tecidos em diferentes estágios do cultivo in vitro (Tabela 1). O conhecimento sobre a identidade, fontes e epidemiologia de distintos contaminantes microbianos tem aumentado consideravelmente e permite estabelecer pontos de controle críticos, como proposto por Leifert e Waites (1994). Sistemas de garantia de qualidade fitossanitária têm sido introduzidos com êxito em diversos sistemas de cultivo de células e micropropagação de plantas em larga escala (LEIFERT; CASSELLS, 2001). O sistema de análise de risco em pontos de controle crítico (Hazard Analysis Critical Control Point = HACCP) define os pontos de controle crítico (PCCs) associados com os diferentes estágios do cultivo in vitro os quais são, em última análise, parâmetros cruciais a serem monitorados nos distintos estágios da cultura de tecidos de plantas (Tabela 1).
Tabela 1. Pontos de controle crítico (PCC), microrganismos indicadores e estágios da cultura de tecidos com que se relacionam. |
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Estágio da cultura de tecidos de plantas (PCC) |
Parâmetro a ser monitorado |
Microrganismo indicador |
Material/Teste a ser utilizado |
Estágio 0 Tratamento da planta matriz |
- Sintomas de microrganismos patogênicos (vírus, bactérias ou fungos) - Detecção e identificação de microrganismos |
- Lupas de mão; microscópio ótico e com contraste de fase; meios bacteriológicos seletivos; testes sorológicos/provas de DNA; plantas indicadoras |
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Estágio 1 Desinfestação superficial dos explantes |
- Teor de cloro ativo nas soluções de hipoclorito - Atividade de outros biocidas |
- Bactérias gram-negativas: Pseudomonas fluorescens, Erwinia spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Agrobacterium spp. |
- Papel indicador; solução de arsenito; coluna de titulação |
Estágio 2 Indexação |
- Presença de microrganismos nos explantes após desinfestação superficial |
- Meios de indexação; testes sorológicos; testes de hibridação de ácido nucleico |
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Estágio 3 Preparo de meio de cultura |
- Autoclavagem - Distribuição do meio |
- Bacillus spp.: B. circulans, B. subtilis, B. pumilus - Penicillium spp., Candida spp., Staphylococcus spp. |
- Fechamento do autoclave; indicadores de temperatura e pressão - Teste de esterilidade do meio; análise do ar do laboratório e da câmara de fluxo laminar (contador partículas) |
Estágio 4 Subcultivo das plantas |
- Esterilidade do ar - Câmaras de fluxo - Esterilidade do álcool para flambagem; instrumentos de esterilização - Assepsia dos operadores |
- Rhodotorula spp. - Penicillium spp. - Bacillus spp. - Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Candida albicans |
- Contador de partículas do ar - Meios de indexação - Registro da taxa de contaminação individual dos operadores |
Estágio 5 Armazenamento dos meios e plantas |
- Esterilidade do ar - Presença de vetores (insetos e ácaros) |
- Rhodotorula spp., Penicillium spp. |
- Contador de partículas do ar - Aparelhos de esterilização do ar |
Estágio 6 Pré-aclimatação (endurecimento) das plantas |
- Sintomas de microrganismos patogênicos - Detecção e identificação de microrganismos |
Idem estágio 0 plantas |
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Fonte: modificada de Leifert e Cassells (2001) e Leifert e Waites (1994). |
Um controle insuficiente nos PCCs pode impedir a produção das culturas no laboratório e acarretar a perda de um grande número de plantas (LEIFERT; WAITES, 1994). Os sistemas preventivos de controle de riscos têm sido mais eficientes no manejo das contaminações microbianas in vitro do que os tratamentos curativos com antibióticos e outros agentes antimicrobianos. Alguns desses compostos são eficientes apenas em doses muito elevadas e exercem efeitos deletérios sobre as culturas vegetais in vitro. O crescimento de bactérias isoladas de tecidos de partes aéreas de avelã (Corylus avellana L. e C. contorta C.) cultivadas in vitro foi controlado com uma concentração de antibióticos de 3 a 4 vezes inferior àquela necessária para controlar a infecção bacteriana endofítica no tecido (REED et al., 1998). De forma similar, a concentração mínima inibitória do óleo essencial de L. gracillis para controle de bactérias endofíticas isoladas de ápices caulinares de helicônias foi de 420 µL L-1, causando reduções no crescimento bacteriano de 45% a 77%, para os distintos isolados testados (Tabela 2). Por outro lado, quando o óleo foi adicionado ao meio de cultura dos ápices caulinares, a redução na contaminação não ultrapassou os 46% (ALBUQUERQUE, 2005). Registrou-se, ademais, ação fitotóxica do óleo na concentração mínima inibitória. A fitoxidez traduziu-se pela desestruturação da membrana plasmática e demais envoltórios subcelulares (Figura 1) além da coagulação do conteúdo citoplasmático (ALBUQUERQUE et al., 2006).
Tabela 2. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis Schauer. |
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Microrganismo |
Planta hospedeira (helicônia) |
Diâmetro do halo de inibição (cm) |
Percentual de inibição(1) (%) |
Salmonela choleraceuis-diarizonae |
Golden Torch |
3,11 a(2) |
77,7 a |
Enterobacter asburiae |
Golden Torch |
2,74 b |
56,5 ab |
Bacillus thuringiensis |
Latispata |
2,69 b |
48,4 b |
B. pumilus |
Latispata |
2,63 b |
45,3 b |
B. pumilus |
Caribea |
2,54 b |
59,3 ab |
Klebsiella pneumoniae |
Bihai |
2,51 b |
59,9 ab |
E. hormaechei |
Bihai |
2,48 b |
62,8 ab |
B. pumilus |
Bihai |
2,41 b |
53,9 ab |
B. cereus |
Rostrata |
2,01 c |
48,3 b |
(1) Fórmula do percentual de inibição (I = CBs – CBc/CBs x 100), em que I =% de inibição; CBs = crescimento bacteriano no meio sem óleo; CBc = crescimento bacteriano no meio com óleo. (2) Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey com a = 5%. Fonte: nos meios NYDA (PUSEY; WILSON, 1984) e MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962). |

Figura 1. Ápices caulinares de helicônia (Heliconia psittacorum x H. spatocircinata) cv. Golden Torch cultivados em meio MS com (a1 e a2) ou sem (b1 e b2) adição de óleo essencial de Lippia gracillis: (a1) unidade celular em meio com óleo; (a2) parede celular em meio com óleo; (b1) unidade celular em meio sem óleo; (b2) detalhe da parede celular em meio sem óleo. cit = citoplasma; pc = parede celular; mp = membrana plasmática; cl = cloroplasto; ei = espaço intercelular.
Fotos: Cynthia Cavalcanti de Albuquerque
As associações entre diferentes microrganismos presentes no tecido vegetal dificultam o controle e favorecem a expressão do crescimento microbiano. Além disso, o contato dos agentes químicos com os microrganismos é muito maior quando se trata de controlar o crescimento de um organismo isolado, tendo em vista que o tecido vegetal dificulta a penetração dessas substâncias e reduz sua capacidade de ação sobre os microrganismos, exigindo uma maior concentração do princípio ativo para que se obtenha o controle desejado.
Medidas de controle, como o uso de tratamento a frio para descontaminação de explantes de espécies arbóreas medicinais (Podocarpus, Ocotea e Warburgia), permitiu reduzir a contaminação por microrganismo endofítico (Bacillus subtilis) de 100% para 5% a 8% em três espécies de Podocarpus e em O. bullata, e eliminou completamente as contaminações em W. salutaris, P. falcatus e P. latifolius com quatro dias de tratamento dos explantes a 4 °C (KOWALSKI; STADEN, 1998). O material mantido durante nove meses in vitro não apresentou sinais de crescimento microbiano ou sintomas de contaminação, mas os autores salientam que é necessário certificar-se se os contaminantes foram eliminados ou se passaram para uma condição latente, podendo manifestar-se em estágios posteriores da micropropagação.
O reconhecimento dos contaminantes e de sua sintomatologia permite desenvolver e aprimorar as estratégias de controle e prevenção de contaminação, mas a permanência de microrganismos de forma latente no cultivo in vitro de plantas é uma forma particular de contaminação que pode ir minando a produtividade da cultura sem deixar suspeita da causa real do problema.
Microrganismos silenciosos
A contaminação microbiana crônica acarreta sérios problemas nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas. Lotes inteiros de plantas aparentemente axênicas podem apresentar crescimento microbiano de forma síncrona, após vários subcultivos. Essa realidade conflita com o status de livres de patógenos ou microrganismos atribuído às plantas micropropagadas e aos tecidos mantidos in vitro.
Além das já conhecidas portas de entrada para os microrganismos durante o cultivo in vitro de tecidos de plantas, tanto na fase de estabelecimento dos explantes como ao longo do processo de cultivo, há outras possíveis vias de contaminação pouco prováveis, como o álcool usado para flambagem de pinças e bisturis. A indexação desse álcool permitiu constatar a presença de Bacillus (THOMAS, 2004a), demonstrando mais uma insuspeita via de contaminação.
Entre as principais fontes de contaminação dos tecidos cultivados in vitro estão os microrganismos endofíticos e os fastidiosos, patogênicos ou não, que estão protegidos dos agentes assépticos superficiais. Esse tipo de contaminação desperta interesse especial uma vez que não pode ser evitada por meio do aprimoramento das técnicas de esterilização da superfície dos explantes, já que os microrganismos endofíticos não são eliminados por essa via. A flora endofítica pode ser constituída de espécies que habitam os espaços intercelulares e intracelulares, incluindo vírus, viroides, bactérias e fungos (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994). Uma ampla gama de microrganismos que habitam a superfície do tecido vegetal ou a rizosfera pode, oportunisticamente, penetrar e colonizar internamente os tecidos vegetais. Diz-se, portanto, que os microrganismos epifíticos são, potencialmente, endófitos facultativos (CASSELLS, 1991).
Faz-se oportuno estabelecer aqui a terminologia aplicada para os microrganismos que habitam o exterior ou o interior dos tecidos das plantas. Em 1866, DeBary aplicou o termo endófito a fungos vivendo no interior dos tecidos vegetais, enquanto que os epífitos seriam aqueles habitantes da superfície dos tecidos das plantas. Posteriormente, a definição de endófito seria a de um microrganismo (fungo ou bactéria) capaz de causar uma infecção parasítica dentro do tecido vegetal de forma assintomática, uma vez que a definição adotada por DeBary engloba fungos saprófitos, patógenos e simbiontes, e esses grupos compreendem organismos que não habitam exclusivamente o interior ou o exterior das plantas (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994). Embora, em termos gramaticais, devêssemos adotar a palavra endófito para os organismos que colonizam/habitam os nichos endofíticos, os termos endofítico e epifítico vêm sendo adotados para fazer referência tanto aos organismos como ao hábitat dos mesmos. Finalmente, a definição de endofítico foi ampliada de forma a abranger dois grupos de microrganismos: os obrigatórios e os facultativos.
Os endofíticos obrigatórios são aqueles que ocupam exclusivamente o nicho endofítico e não são capazes de crescer e se reproduzir como epifíticos ou fora do hospedeiro. Os endofíticos facultativos, por sua vez, são organismos que apresentam uma certa fidelidade com um hospedeiro em particular, mas estão capacitados a completar seu ciclo de vida fora do tecido do hospedeiro. Os facultativos podem ainda ser classificados como constitutivos ou induzíveis. São considerados constitutivos aqueles que habitam naturalmente os nichos endofíticos ou epifíticos. Por outro lado, os facultativos induzíveis são capazes de sobreviver quando transferidos artificialmente para o ambiente endofítico, embora não apresentem uma multiplicação significativa até que as condições fisiológicas se tornem mais favoráveis ao crescimento.
Os facultativos induzíveis constituem o grupo mais frequentemente associado às plantas cultivadas in vitro. Esse tipo de contaminação microbiana tem origem epifítica, ocorrendo a transferência dos microrganismos para o nicho endofítico durante a excisão do explante e subsequentes manipulações in vitro. Além desses, patógenos facultativos ou obrigatórios podem, igualmente, colonizar os tecidos das plantas, assistidos por vetores ou mediante mecanismos próprios de penetração na planta. A existência de endofíticos obrigatórios e o estabelecimento de endofíticos facultativos no interior dos tecidos vegetais tornam ineficaz a ação dos esterilizantes superficiais e, consequentemente, permite que haja colonização ou invasão microbiana da cultura, ou do meio, no estabelecimento do cultivo in vitro (estágio 1), ou nos estágios subsequentes (multiplicação, enraizamento).
Na fitopatologia, o termo latente é utilizado para descrever infecções, por bactérias em especial, sem efeitos adversos óbvios. Na cultura de tecidos de plantas, embora alguns microrganismos possam permanecer latentes, no sentido de que eles normalmente não se tornam evidentes no meio de cultura, seus efeitos sobre o crescimento do tecido vegetal – seja inibitório, nulo ou promotor – não são claramente conhecidos. Por isso, no inglês, o termo covert, cuja tradução direta para o português é oculto, é adotado por alguns autores (HOLLAND; POLLACO,1994; HORSCH; KING, 1983; THOMAS, 2004b) para designar os microrganismos que não estão normalmente evidentes na cultura de tecidos. Buscando uma terminologia, ainda que fora do rigor do idioma, que possa expressar a natureza dissimulada dos microrganismos que se mantêm de forma assintomática nos tecidos vegetais cultivados in vitro, sugerimos chamá-los de silenciosos.
De silenciosos a evidentes
A desinfecção superficial dos explantes no início do estabelecimento de uma cultura in vitro muitas vezes é ineficiente. Isso pode ser consequência de uma combinação inadequada de tipo, dose e tempo de aplicação do desinfestante, bem como da localização dos microrganismos no tecido vegetal.
A maioria dos microrganismos cresce ativamente nos meios de cultura para tecidos de plantas. Organismos eucarióticos, como fungos e leveduras, geralmente apresentam crescimento visível nos meios de cultura de tecidos de plantas, porque, em geral, a composição desses meios contempla todos os nutrientes essenciais ao crescimento de tais microrganismos (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Dessa forma, fungos filamentosos e leveduras raramente permanecem ocultos no cultivo in vitro de tecidos de plantas, e, portanto, a maioria das contaminações microbianas visíveis logo após a inoculação dos explantes in vitro é em virtude desses microrganismos. Mantell (1998) constatou, entretanto, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), o desenvolvimento de conidiósporos de Colletotrichum gloeosporioides, o agente causal da antracnose, em superfícies foliares de espécies de inhame (Dioscorea sp.) aparentemente saudáveis. Além disso, esse mesmo autor registrou a presença de uma microlevedura não identificada na superfície esterilizada de tecidos de segmento nodal de inhame (Dioscorea alata). Foram adotados, então, processos de assepsia mais rigorosos, incluindo banhos em solventes orgânicos, para facilitar a penetração dos agentes esterilizantes através de uma matriz de exopolissacarídeos do explante, antes do processo de assepsia convencional. Menos de 20% do material vegetal tratado apresentou-se contaminado, e, quando submetido a análises com MEV, constatou-se a microlevedura localizada de forma intercelular, em células da raiz, abaixo da superfície do meio de cultura. Os resultados desse trabalho mostram que essa microlevedura foi capaz de ocupar o nicho endofítico e manter-se em íntima e consistente associação com os tecidos de inhame durante o cultivo in vitro. A despeito da presença desse microrganismo, o autor relata que as plantas de inhame cultivadas in vitro mostraram-se vigorosas e produziram túberas de boa qualidade (MANTELL, 1998).
No que se refere às bactérias, muitas delas são capazes de crescer rapidamente no meio de cultura de tecidos de plantas e tornam-se patogênicas durante o cultivo in vitro, podendo ser consideradas como vitropatógenos. Ápices caulinares de helicônias apresentam, por exemplo, sérios problemas para estabelecimento in vitro por causa da presença de bactérias endofíticas que rapidamente crescem no meio de cultura de tecidos de plantas e impedem o desenvolvimento dos explantes. Foram isoladas e identificadas sete espécies de bactérias (Tabela 3) a partir de ápices caulinares de um híbrido e quatro espécies de helicônias (ALBUQUERQUE et al., 2006).
Tabela 3. Isolados bacterianos obtidos do estabelecimento in vitro de ápices caulinares de um híbrido e de quatro espécies de Heliconia. |
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Hospedeiro |
Espécie de bactérias |
H. bihai |
Klebsiella pneumoniae |
H. bihai |
Enterobacter hormaechei |
H. bihai |
B. pumilus |
H. caribea |
B. pumilus |
H. latispatha |
Bacillus thuringiensis |
H. latispatha |
B. pumilus |
H. rostrata |
B. cereus |
Heliconia psittacorum x H. spathocircinata var. Golden Torch |
Salmonela choleraceuis-diarizonae |
H. psittacorum x H. spathocircinata var. Golden Torch |
Enterobacter asburiae |
Fonte: modificado de Albuquerque et al. (2006). |
Outras bactérias exigem nutrientes e condições de crescimento específicas e podem permanecer associadas ao tecido vegetal sem serem detectadas enquanto as condições não forem favoráveis para seu crescimento. As chamadas bactérias fastidiosas ou não são cultiváveis (fitoplasmas) ou são recalcitrantes (micoplasmas e espiroplasmas) ao cultivo em meio nutritivo artificial (micoplasmas e espiroplasmas). Essas bactérias constituem uma classe de microrganismos desprovidos de parede celular denominados molicutes (do inglês: moll = macio; cute = pele), que reúnem os menores e mais simples organismos autorreplicáveis. Os molicutes estão entre as bactérias que colonizam o sistema vascular, xilema e floema, mas há registros de espécies que não causam doenças nas plantas, ocupando nichos epifíticos (FLETCHER; WAYADANDE, 2002). Por outro lado, embora possam permanecer de forma assintomática ou sem crescimento aparente, as bactérias podem induzir redução na taxa de crescimento e enraizamento, ou até mesmo a morte das plantas (TANPRASERT; REED, 1998). Pertencem a esse grupo, por exemplo, as pseudomonas, as xantomonas e as corinebactérias (LEIFERT; CASSELLS, 2001).
Segmentos nodais e de túberas jovens de inhame esterilizados superficialmente e cultivados em meio bacteriológico mostraram a presença de contaminantes bacterianos em 95% das amostras avaliadas. Os gêneros mais frequentes foram Serratia, Enterobacter, Xanthomonas, Curtobacterium e Pseudomonas. Na maioria dos acessos avaliados por MEV, constatou-se que a sobrevivência das bactérias à esterilização superficial deveu-se, possivelmente, à presença de uma copiosa matriz de exopolissacarídeos, originária tanto dos explantes como dos microrganismos, cobrindo as bactérias existentes em volta e abaixo dos pelos glandulares de folhas e caules de espécies de inhame. Estruturas baciliformes, similares a bactérias, foram observadas em vasos do xilema. A localização verdadeiramente endofítica foi confirmada em ensaios de transformação genética, nos quais muitos resultados falsos-positivos para os ensaios histoquímicos com β-glucuronidase (GUS) foram causados por bactérias localizadas dentro de tecidos vasculares de caules e raízes, destacando-se a espécie Curtobacterium flaccumfaciens. Nem o crescimento nem a tuberização das plantas de inhame foram afetados pela presença das referidas bactérias (MANTELL, 1998).
A existência de microrganismos silenciosos no cultivo in vitro de tecidos de plantas constitui um sério risco de disseminação ao longo das sucessivas etapas da clonagem vegetal, podendo chegar à progênie das plantas micropropagadas. Vários são os fatores que podem contribuir para a permanência assintomática de tais microrganismos no decorrer do cultivo in vitro, entre os quais citam-se: baixo nível de infecção; exigência de tecidos vegetais maduros ou em fase de maturação; composição, potencial osmótico e pH do meio de cultura; luminosidade e temperatura da sala de incubação; adequação de métodos de detecção de microrganismos, entre outros (CASSELLS, 1991; KAMOUN et al., 1998; MANTELL, 1998; THOMAS, 2004b). Existe também a hipótese, ainda não confirmada, de que mecanismos de resistência a microrganismos patogênicos, mais ativos nas plantas sob as condições do cultivo in vitro, contribuam para manter assintomática a presença desses microrganismos durante os diferentes estágios da cultura de tecidos. Há evidências de que esses mecanismos de resistência sejam ativados tanto pela juvenilidade dos tecidos utilizados no cultivo in vitro, como pela presença de reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura (LEIFERT et al., 1994). A produção de compostos antivirais e o aumento na síntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR), envolvidas na resistência a vírus, foram registrados em resposta a certos reguladores de crescimento utilizados no cultivo in vitro de tecidos vegetais. Mecanismo de tolerância cruzada ao estresse, ou seja, a resistência a um patógeno induzida pelo estresse oxidativo em virtude de condições subótimas durante o cultivo in vitro, tais como estresse salino, pode explicar esse fenômeno (CASSELLS; CURRY, 2001). A exsudação de substâncias antibacterianas por células e tecidos de plantas cultivadas in vitro é outro fator que pode reprimir o crescimento microbiano e favorecer a persistência desses microrganismos silenciosos (LEIFERT; CASSELLS, 2001).
Diversos autores destacam que um dos problemas na indexação de tecidos vegetais aparentemente livres de microrganismos é a baixa densidade de inóculo a ponto de não alcançar o nível de detecção de algumas metodologias (CASSELS, 1991; KNAPP et al., 1996; LEIFERT; WOODWARD, 1998; THOMAS et al., 2004). No campo, quando a monocultura é praticada continuamente em uma mesma área, a densidade de inóculo aumenta. De forma similar, a micropropagação vegetativa e a conservação de germoplasma em longo prazo podem levar as culturas ao acúmulo de microrganismos intracelulares (CASSELLS, 1991). As densidades de população de bactérias endofíticas são mais altas nos tecidos de raízes e ficam em torno de 105 UFC g-1 de peso fresco (unidades formadoras de colônias, por mililitro ou grama). Essa densidade é significativamente inferior àquelas registradas para bactérias fitopatogênicas, que superam a marca de 108 UFCg-1 de peso fresco (HALLMANN, 2001). Num alto nível de infecção, populações bacterianas podem atingir até 1010 UFC g-1 de peso fresco e apresentar inclusive ooze a partir de tecidos de caules ou folhas (HALLMANN, 2001; VIDAVER; LAMBRECHT, 2004). Normalmente são necessárias populações de, pelo menos, 106 UFC g-1 para que esses microrganismos expressem sua ação como agentes de biocontrole ou causadores de doenças. (VIDAVER; LAMBRECHT, 2004). O aumento na população dos microrganismos intimamente associados com os tecidos cultivados in vitro é uma das justificativas para o aparecimento de sintomatologia tardia durante a micropropagação, às vezes na discreta forma de declínio no desenvolvimento da cultura.
Outro fator que claramente favorece a permanência dos microrganismos de forma assintomática na cultura de tecidos é o fato de alguns microrganismos colonizarem tecidos vegetais maduros ou em fase de maturação e no cultivo in vitro empregam-se, preferencialmente, tecidos jovens como explantes, ou se induz o rejuvenescimento dos mesmos. Nos subcultivos, ademais, prevalece a prática de seleção de tecidos jovens (gemas, novas brotações, ápices caulinares) e descarte de tecidos mais maduros. Conforme comentado anteriormente, a juvenilidade das células e tecidos cultivados in vitro é apontada como um dos fatores que tornam os mecanismos de resistência a microrganismos mais ativos in vitro do que in vivo (LEIFERT et al., 1994). Quando culturas de inhame foram deixadas durante vários meses no mesmo meio de cultivo, sem serem subcultivadas, a presença de microrganismos silenciosos foi evidenciada pelo crescimento bacteriano no meio de cultura na região basal das partes aéreas (MANTELL, 1998).
A composição do meio de cultura é, sem dúvida, um dos fatores preponderantes para o crescimento de microrganismos silenciosos na cultura de tecidos de plantas. Os distintos estágios da micropropagação exigem alterações na composição dos meios visando à indução de uma determinada via de desenvolvimento fisiológico do material vegetal. Essas alterações podem incluir: adição, supressão ou mudanças nas combinações e concentrações dos reguladores de crescimento; redução na força iônica; redução ou supressão da fonte de carboidrato e outros componentes orgânicos (vitaminas, aminoácidos, poliaminas, etc.); além da adição de misturas complexas (água de coco, extrato de levedura, caseína hidrolisada, extratos vegetais diversos).
Na cultura de tecidos de plantas, bactérias podem ser detectadas por vários tipos de meios de indexação. O próprio meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) permite detectar diversos contaminantes, como constatado em experimentos com genótipos de morango cujos explantes foram submersos em meio MS líquido com metade da força iônica e nos quais foram detectados microrganismos contaminantes em 45 dos genótipos avaliados. A adição de extrato de levedura (265 mg L-1) e peptona (88 mg L-1) ao meio MS aumentou em 10% o número de amostras contaminadas, tendo em vista que se observou um crescimento bacteriano mais óbvio e rápido. A presença de peptona e do extrato de levedura nos meios de crescimento e multiplicação de morangueiros, durante dois subcultivos, permitiu a detecção de todos os contaminantes bacterianos (TRANPASERT; REED, 1998). A essencialidade dos carboidratos para o rápido crescimento da maioria dos microrganismos foi confirmada a partir da transferênica de culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendrum, Maranta e Cordyline, contaminadas com fungos e bactérias, para o cultivo autotrófico usando esponja de poliuretano como suporte, o que permitiu a recuperação dessas culturas (SAYEGH; LONG, 1997). A partir desse resultado, a supressão dos componentes orgânicos dos meios de cultura de tecidos de plantas,chamado cultivo autotrófico ou micro-hidroponia asséptica, vem se constituindo numa nova tendência e é apontada como uma forma de cultivo que permite o uso de recipientes maiores com menor risco de contaminação microbiana (CASSELLS, 2000a; CASSELLS; WALSH, 1998; KOZAI, 1991).
A detecção de bactérias silenciosas de tecidos de Prunus cerasus em meio de indexação só foi possível mediante um tratamento de pré-incubação em soluções com pressão osmótica decrescente (KAMOUN et al., 1998). Células procarióticas desprovidas de parede foram visualizadas por microscopia eletrônica dentro do citoplasma de células do mesofilo das plantas micropropagadas, e, por meio de PCR, foi identificada uma bactéria como pertencente ao gênero Pseudomonas. Os autores argumentam que a incubação preliminar em solução de baixa pressão osmótica seria necessária para a regeneração da parede celular da hipotética forma-L dos contaminantes bacterianos (KAMOUN et al., 1998).
Resultados como esses demonstram que mudanças na composição do meio de cultura, em especial no que se refere aos componentes orgânicos, podem favorecer o crescimento bacteriano levando os microrganismos silenciosos a apresentarem um crescimento visível ou perceptível.
Muitas espécies de plantas reduzem o pH do meio de cultura de 5,6 para 3,8 ou 4,5 durante o crescimento in vitro, acarretando na redução ou prevenção do crescimento de bactérias como Agrobacterium tumefaciens, Bacillus spp., Pseudomonas maltophilia, P. syringae, Staphylococcus saprophyticus e Xanthomonas campestris (LEIFER; WAITES, 1994). Um trabalho para caracterização de contaminantes bacterianos de espécies ornamentais permitiu isolar e purificar 18 espécies bacterianas. A maioria dos isolados requeria, para crescimento, pH entre 5,7 e 8,0, embora alguns tenham tolerado pH 4,0 (BRUNNER et al., 1995). O efeito do pH do meio de cultura sobre a expressão de bactérias silenciosas no cultivo in vitro de tecidos de plantas foi claramente evidenciado por Thomas (2004c) no cultivo in vitro de melancia triploide. Mediante a indexação de tecidos em meio ágar nutriente (NA) a pH 6,4, esse autor observou que todos os 32 frascos de cultivo indexados apresentaram crescimento bacteriano uma semana após a indexação, enquanto que no meio de multiplicação (MM) gelificado com ágar e com pH 5,8 não houve crescimento bacteriano visível, mesmo após duas semanas de incubação. Quando o MM foi gelificado com Phytagel® e o pH ajustado para 6,4, só foi constatada expressão de contaminantes bacterianos quatro semanas após a indexação e em apenas 41% do material vegetal avaliado. Esse percentual caiu para 25% no meio com Phytagel® e pH 5,8 (THOMAS, 2004c).
Alterações de natureza química (pH, composição e concentração) ou física (potencial osmótico, consistência) no meio de cultura podem ser induzidas pelos protocolos de cultivo in vitro ou em consequência da exsudação dos tecidos das plantas. Na micropropagação de melancia triploide, observou-se que o meio de multiplicação recém-preparado (pH ajustado em 5,8 antes da adição do ágar) apresentou pH de 6,12 ± 0,035, o qual aumentou para 6,19 ± 0,042 após um mês de cultivo, passando a 6,62 ± 0,13 e 7,01 ± 0,05 após 2 e 3 meses de cultivo, respectivamente. Evidências de crescimento de bactérias foram frequentes em culturas com mais de dois meses de cultivo in vitro (THOMAS, 2004c).
De forma similar ao que ocorre nos solos, muitos microrganismos sobrevivem em estado quiescente até que os propágulos dormentes sejam ativados por moléculas presentes em exsudatos do tecido vegetal (WILLADINO et al., 2005). Diversos fatores que afetam o crescimento microbiano são decorrentes de exsudatos de células vegetais, tornando os microrganismos intimamente dependentes do tecido da planta (LEIFERT; CASSELLS, 2001).
A atmosfera dos tubos de cultivo é um outro fator que pode afetar, direta ou indiretamente, a manifestação dos microrganismos silenciosos, tornando-os perceptíveis macroscopicamente. A formação de aerênquima em plantas de Zantedeschia aethiopica cultivadas in vitro pode ser influenciada pela permeabilidade das tampas dos tubos de cultivo ao ar. O aerênquima desenvolve-se em raízes privadas de oxigênio em solos alagados por causa do acúmulo de etileno, o que ocorre em tubos de cultura de tecidos. Essa acumulação de etileno pode provocar efeitos deletérios sobre o desenvolvimento dos explantes e, indiretamente, tornar o ambiente mais favorável à proliferação de bactérias endofíticas (JACKSON et al., 1991). A presença de metanol na atmosfera dos tubos de cultivo de Z. aethiopica e a identificação de um contaminante metilotrófico facultativo de pigmentação rósea (pink pigmented facultative methylotroph = PPFM) são um exemplo claro da interferência do ambiente gasoso sobre o crescimento microbiano. A disseminação de PPFM em culturas assintomáticas ocorrerá mecanicamente durante os subcultivos, facilitando a colonização do hospedeiro e sua progênie. Eventualmente, o acúmulo de metanol nos tubos de cultivo combina com um nível crítico de densidade de inóculo favorecendo o crescimento profuso do PPFM e tornando a contaminação visível macroscopicamente, uma vez que o status das bactérias passa de silencioso para evidente (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994).
As condições físicas da sala de incubação, como luminosidade e temperatura, também podem afetar os microrganismos silenciosos e torná-los, ou não, evidentes. Em meio de cultura artificial, bactérias fitopatogênicas geralmente crescem mais lentamente do que aquelas não patogênicas, com temperatura de crescimento ótima na faixa de 20 °C a 30 °C. Umas poucas crescem a 37 °C ou mais, e outras podem crescer lentamente a temperaturas entre 10 °C e 12 °C. Dezoito isolados bacterianos provenientes do cultivo in vitro de Dieffenbachia amoena, Anthurium andreanum e Spathiphyllum sp. apresentaram crescimento ótimo a temperaturas entre 28 °C e 35 °C. As bactérias emergiram dos explantes após 3 a 20 dias de cultivo, embora em alguns explantes, tidos inicialmente como saudáveis, o crescimento bacteriano só ocorreu vários meses após a inoculação do tecido (BRUNNER et al., 1995). Embora muitas salas de crescimento nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas sejam mantidas à temperatura de aproximadamente 25 °C (LEIFERT; CASSELLS, 2001), a faixa de 28 °C a 35 °C coincide com o ótimo para o crescimento das plantas in vitro, o que favorece o crescimento e a proliferação desses contaminantes bacterianos. Mantell (1998) constatou uma ampla gama de microrganismos presentes na superfície de tecidos de espécies de inhame (Dioscorea sp.) cultivados in vitro. O crescimento bacteriano, entretanto, só se tornou aparente quando as culturas, despachadas por correio, foram mantidas no escuro e estiveram sujeitas a temperaturas flutuantes.
Leifert e Waites (1990) propuseram a elaboração de uma base de dados de indicadores de bactérias para facilitar a identificação de contaminantes bacterianos comuns na cultura de tecidos de plantas. Essa base de dados incluiria informações que permitissem relacionar os contaminantes bacterianos com as condições de crescimento favoráveis ao desenvolvimento dos mesmos (BRUNNER et al., 1995).
Os métodos de detecção, caracterização e identificação de contaminantes bacterianos também devem ser considerados quando se trata de detectar microrganismos silenciosos e certificar a sanidade dos tecidos vegetais cultivados in vitro. Em geral, uma combinação de testes morfológicos e bioquímicos é necessária para caracterizar e identificar microrganismos procarióticos (BRUNNER et al., 1995), associando-se, ademais, o cultivo em distintos meios bacteriológicos (THOMAS, 2004b). Uma revisão de modernos métodos para caracterização, identificação e detecção de bactérias associadas com plantas aponta os testes de perfil de ácidos graxos (FAP) e de PCR como os mais adequados métodos de caracterização e identificação, e seleciona, para detecção, os ensaios de imunofluorescência e PCR baseado em provas fluorigênicas (STEAD et al., 2000). Thomas (2004b) propõe um procedimento para detecção de bactérias silenciosas e endofíticas constituído de uma sequência de três passos na seleção de material vegetal cultivado in vitro.
Deve-se ter em mente que microrganismos endofíticos não são um sinônimo de microrganismos silenciosos, embora possam se comportar como tal, e que esses microrganismos podem se tornar evidentes em função de uma variada gama de fatores que devem ser considerados ao longo da cultura de tecidos de plantas.
Microrganismos silenciosos na aclimatização
O estado fisiológico das plantas micropropagadas é um fator decisivo para o transplantio e posterior estabelecimento dessas plantas no campo. Uma etapa de endurecimento ou pré-aclimatação visa adequar a planta fisiologicamente para as novas condições ambientais a que será exposta. O ambiente de cultivo in vitro apresenta características tais que reduzem a corrente transpiratória e, consequentemente, a absorção de cálcio, que é essencial ao funcionamento estomático e à integridade da parede celular e da membrana plasmática. A inibição do movimento das auxinas desde o ápice caulinar para as demais partes da planta pode acarretar em acúmulo desse hormônio na parte aérea e em toxidez auxínica (CASSELLS, 2000b). Tais distúrbios fisiológicos favorecem o desenvolvimento da síndrome da hiperidricidade ou vitrificação, que se caracteriza pela reduzida espessura da parede celular decorrente da inibição da síntese de lignina, movimento estomático deficitário, elevado teor hídrico nos tecidos, etc.
Nas condições ex vitro, vários fatores abióticos são indutores de estresse. Grande ênfase é dada ao estresse hídrico; entretanto, nas etapas de endurecimento ou pré-aclimatização, as plantas são bastante susceptíveis a alguns microrganismos, fitopatogênicos ou não. Esses microrganismos podem entrar no sistema de propagação das plantas através de correntes de ar, pelos regimes de rega ou por meio de insetos ou microartrópodos. É, portanto, de extrema importância proteger as vitroplantas da ação de microrganismos nesse estágio, mas convém destacar que é fundamental a certificação de sanidade das plantas estoque, antes de aclimatá-las.
Alguns gêneros de fungos encontrados em laboratórios de cultura de tecidos de plantas, tais como Alternaria, Botrytis, Phoma e Cladosporium, são conhecidos como fitopatógenos e podem ser disseminados na aclimatização. Um levantamento feito em laboratórios no Reino Unido e outros países da Europa mostraram que em 16 deles foram registradas perdas na aclimatização em virtude de Botrytis cinerea; em 6 deles, registraram-se problemas com Pythium e Rhizoctonia; e em outros 3, o gênero Phytophtora foi o responsável pelas perdas (WILLIAMSON et al., 1998).
A presença de bactéria endofítica em plantas de Prunus cerasus micropropagadas assepticamente foi evidenciada por meio de análise PCR em tecido vegetal e identificada como pertencente ao gênero Pseudomonas (KAMOUN et al., 1998). Uma aberração no DNA de plantas de batata provenientes de cultura de tecidos foi constatada durante comparações entre fingerprints de plantas in vitro e no campo. O fragmento aberrante foi gerado com primer 2-10 de cultivares de batata nos quais se constatou, posteriormente, contaminação com Bacilus pumilus, o que levou à hipótese de que esse fragmento estava associado à presença do microrganismo (ISENEGGER et al., 2003). A detecção desse fragmento de DNA poderia ter tido ramificações no DNA dessas cultivares de batata se a origem bacteriana não tivesse sido identificada (ISENEGGER et al., 2001). Interpretar esse fragmento de DNA como um polimorfismo genético das plantas micropropagadas poderia causar discrepâncias na coleção de cultivares e acarretar na perda desnecessária de plantas provenientes da cultura de tecidos.
A constatação da presença de microrganismos em plantas na fase de aclimatização põe em risco a reputação do material micropropagado, tanto no que se refere à qualidade fitossanitária, quanto à fidelidade genética.
Declínio in vitro
A principal meta da micropropagação é produzir plantas em condições adequadas para o uso a que se destina. Os dois parâmetros de qualidade que devem ser rigorosamente observados são o estado fitossanitário e a identidade genética das plantas. A qualidade fitossanitária das vitroplantas vem sendo bastante discutida (CASSELLS, 1998, 2000b), uma vez que microrganismos silenciosos podem permanecer de forma não detectável durante um longo período do cultivo in vitro de tecidos de plantas e se tornar evidentes mediante o crescimento visível no meio de cultura ou mediante o desenvolvimento de sintomatologia específica no tecido vegetal. A manifestação desses microrganismos como vitropatógenos pode ocorrer em estágios tardios do cultivo in vitro ou após a pré-aclimatação (endurecimento) das plantas. Na prática, a partir do momento em que se detecta a presença de microrganismos, a alternativa mais segura é o descarte e a autoclavagem do material contaminado (PEREIRA; FORTES, 2003), tendo em vista que existe o risco de que os contaminantes microbianos estejam entre os patógenos humanos e possam infectar as pessoas que trabalham nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas (RAFFERTY et al., 2000).
Em alguns casos, entretanto, esses microrganismos não apresentam crescimento visível nem provocam sintomas nas plantas que permitam suspeitar da presença dos mesmos. A ação desses contaminantes pode ser mascarada por mecanismos da planta mediados pela ação de reguladores de crescimento induzidos pelas condições de cultivo in vitro. O efeito da contaminação endofítica silenciosa pode ocorrer sutilmente, na forma de um declínio na capacidade de multiplicação, seja na emissão de gemas adventícias ou de brotações. A taxa de enraizamento também pode sofrer redução comprometendo a produtividade das culturas in vitro com consequente diminuição do número e da qualidade das plantas a serem aclimatadas. Na maioria das vezes, esses efeitos manifestam-se apenas depois de um período relativamente prolongado da cultura de tecidos. Em geral, suspeita-se dos mais variados fatores, desde os componentes do meio de cultura (qualidade do ágar, concentração do açúcar, validade dos reagentes, erro no preparo das soluções estoques ou do próprio meio de cultura, ajuste do pH), como alterações nas exigências hormonais dos tecidos ao longo do tempo de cultivo. Muitas vezes tais suspeitas levam a uma bateria de testes sem que se obtenha um resultado inequívoco da causa do declínio in vitro.
Esse tipo de problema foi enfrentado com culturas de melancia triploide mantidas regularmente in vitro por quatro a cinco anos. Um gradual declínio no desempenho das culturas in vitro traduziu-se numa redução da taxa de formação de parte aérea a partir dos segmentos caulinares. Registraram-se reduções na altura das plantas, número de nós, brotações axilares e expansão foliar, em comparação com cultivos mantidos há menos tempo in vitro. Sintomas como amarelecimento das folhas basais, necrose ao longo das margens das folhas medianas, seca das folhas superiores e gavinhas, além de hiperidricidade tornaram-se comuns nesses cultivos. Até então essa melancia (Citrullus lanatus Thunb. [Matsum. e Nakai]) triploide sem semente vinha sendo mantida in vitro, em frascos de 120 mm x 65 mm, com subcultivos regulares e incubação em meio de multiplicação contendo 1 µM de 6-benzilaminopurina (BAP), 1 µM de ácido giberélico (GA3) e ácido 3-indolacético (AIA), com 10 g L-1 de ágar e pH 5,8 (THOMAS et al., 2000a, 2000b). No meio de enraizamento, a taxa de formação de raízes caiu de 80% a 90% para 10% a 30%, em diferentes frascos de cultivo. Observaram-se inibição no número, comprimento e ramificações das raízes. O aparecimento de todos esses sintomas levou à investigação das possíveis causas do decréscimo nas taxas de multiplicação e enraizamento dessa cultura. A indexação de culturas visivelmente limpas em meios enriquecidos permitiu evidenciar a presença de bactérias silenciosas. Após esterilização superficial, as culturas responderam positivamente com um aumento na multiplicação de brotos e enraizamento, mas as bactérias sobreviveram endofiticamente. Tratamento com antibióticos aplicados em solução superposta ao meio de multiplicação e enraizamento permitiu superar o problema. Os resultados obtidos levaram à constatação de que o declínio na micropropagação das culturas testadas não foi decorrente de erros na formulação dos meios de cultura ou de modificações nas exigências nutricionais e/ou hormonais do material vegetal cultivado. Evidenciou-se que o declínio in vitro foi causado pela presença de contaminantes bacterianos silenciosos, hábeis em sobreviver endofiticamente. As plantas obtidas desses cultivos mostraram-se normais e férteis, indicando a viabilidade do cultivo in vitro prolongado para essa espécie (THOMAS, 2004c).
As culturas micropropagadas geralmente não são mantidas sob cultivo in vitro por um período de tempo prolongado, e as razões para isso residem na perda do potencial de multiplicação ao longo de vários subcultivos e nas chances de variação somaclonal. Embora associações microbianas latentes ou silenciosas com efeitos adversos sobre o crescimento, proliferação ou enraizamento já tenham sido registradas no cultivo de diversas plantas (LEIFERT; WAITES, 1994; LONG et al., 1988), raramente se atribui a elas a causa da degeneração in vitro ou da não sustentabilidade dos cultivos por um tempo prolongado (THOMAS, 2004c). De acordo com Thomas (2004c), problemas de degeneração in vitro em culturas mantidas por longo período de cultivo podem ser contornados por meio da indexação dos tecidos e do meio de cultura, pela diminuição da concentração de inóculo com tratamentos de descontaminação ou pela supressão do crescimento microbiano mediante tratamentos temporários com soluções de antibióticos.
Procedimento de detecção de bactérias silenciosas e endofíticas
Ainda que seja de extrema importância uma metodologia eficiente de detecção de contaminantes durante as etapas do processo do cultivo in vitro, existem poucos trabalhos disponíveis nessa área. Destacam-se entre esses os trabalhos desenvolvidos por Pious Thomas (THOMAS, 2004b, 2004c) que abordam tanto a detecção de microrganismos silenciosos e endofíticos quanto as consequências da presença deles durante o cultivo in vitro. A presença desses microrganismos muitas vezes passa despercebida, e as consequências de sua presença são atribuídas a outros fatores. Uma das consequências mais frequentes, o declínio do crescimento das culturas, expresso como redução das taxas de multiplicação e/ou enraizamento, causa grande preocupação aos laboratórios uma vez que o protocolo utilizado rotineiramente deixa, aparentemente, de ser eficiente. Um grande esforço é realizado para esclarecer a causa do declínio da cultura, incluindo a checagem das soluções dos reguladores de crescimento e demais soluções utilizadas no preparo do meio, a checagem da qualidade do ágar, do tipo e concentração dos carboidratos e do pH, sem que se obtenha nenhum resultado positivo. Eventualmente são realizados ensaios visando avaliar se as culturas modificam seus requerimentos ao longo do tempo de cultivo sem que se obtenham, tampouco, resultados positivos. Por outro lado, a avaliação da presença de microrganismos endofíticos ou silenciosos raramente é realizada.
A presença de bactérias ocultas no cultivo in vitro é, evidentemente, indesejável, seja por causar declínio no crescimento, por resultar na falta de reprodutibilidade de protocolos da cultura de tecidos, por permitir a disseminação de patógenos, pelo risco potencial a bancos de germoplasma ou por colocar em risco o intercâmbio seguro de germoplasma. Todos esses fatores reduzem a confiabilidade dos sistemas de cultivo in vitro de células, tecidos e plantas. Os contaminantes microbianos encontrados no cultivo in vitro de plantas são introduzidos tanto no início do cultivo como posteriormente, em virtude de técnicas de esterilização ineficientes.
Thomas (2004b) apresenta um procedimento para a detecção de bactérias silenciosas e endofíticas em três etapas sequenciais. Esse procedimento envolve uma primeira etapa de diligente exame visual das culturas para qualquer crescimento microbiano não evidente; uma segunda etapa que é a indexação do meio de cultura aparentemente não contaminado, utilizando meio bacteriológico; e a terceira etapa que consiste na indexação do tecido usando segmentos de diferentes partes da planta provenientes de meios com indexação negativa. Trabalhos realizados com uva, melancia, mamão, berinjela, pimenta e gérbera cultivadas in vitro revelaram a existência de bactéria numa proporção que variou de 0% a 100% das culturas, em diferentes lotes. Uma proporção variável de culturas que não revelaram bactérias na segunda etapa mostrou indexação positiva na terceira etapa, indicando ser fundamental a indexação do tecido. O autor sugere o uso de dois meios de indexação de bactérias (BIM), o ágar nutriente (NA = BIM1) e o meio 523 (BIM2), diferindo nos constituintes nutritivos, no pH (6,4 e 7,0, respectivamente) e na consistência (10 g L-1 e 20 g L-1 de ágar). A utilização desses meios com distintas características é fundamental uma vez que diferentes espécies de bactérias diferem na sua habilidade de crescer em um meio particular, e nenhum meio bacteriológico permite detectar todos os contaminantes. Uma pré-incubação das placas contendo o meio de indexação para prevenir a contaminação incidental e testes de esterilização dos instrumentos devem ser realizados antes da utilização dos mesmos. Esse procedimento para detecção de bactérias deve ser praticado por 2 a 4 ciclos permitindo um escrutínio fiável de plantas cultivadas in vitro livres de bactérias, garantindo uma segura certificação de plantas procedentes da cultura de tecidos.
Os dois meios de indexação de bactérias (BIM) utilizados para detecção de bactérias silenciosas e endofíticas, BIM1 e BIM2, foram selecionados como uma combinação eficiente a partir de 17 meios testados, visto que considerações econômicas e operacionais não permitem o uso de um amplo arranjo de meios ou condições de incubação. O meio BIM1, ágar nutriente (NA), é constituído de 5,0 g L-1 de peptona, 5,0 g L-1 de NaCl, 3,0 g L-1 de extrato de carne, e 20 g L-1 de ágar, com o pH ajustado a 6,4. O meio BIM2, meio 523 (VISS et al., 1991), é constituido de 10 g L-1 de sacarose, 8,0 g L-1 de caseína hidrolisada, 4,0 g L-1 de extrato de levedura, 2,0 g L-1 de KH2PO4, 0,15 g L-1 de MgSO4 e 10,0 g L-1 de ágar com o pH ajustado a 7,0 (THOMAS, 2004b). Para assegurar que o meio esteja livre de contaminação incidental, placas de Petri descartáveis, após receberem os meios de indexação (BIM1 e BIM2), são pré-incubadas de ponta-cabeça, à temperatura de 30 oC a 37 oC, por dois ou três dias, seguidos de dois a quatro dias à temperatura ambiente, aproximadamente 25 oC. Esse procedimento visa também garantir a evaporação da água da superfície, evitando qualquer proliferação de crescimento de colônias.
A indexação do meio é feita inserindo-se no meio de cultura com tecido vegetal uma agulha de inoculação flambada durante 30 a 40 segundos em chama de gás, colocando essa agulha em contato com cada um dos meios de indexação, BIM1 e BIM2 (Figura 2).

Figura 2. Esquema ilustrativo do processo de indexação do meio de cultura com auxílio de uma agulha de incubação.
Ilustração: Marta Ribeiro.
Antes da indexação do tecido, pinças e bisturis são indexados nos BIMs para garantir sua esterilidade, e os resultados são obtidos, ao longo do tempo, junto com os da indexação dos tecidos. Na indexação dos tecidos, são utilizados estiletes estéreis para a realização de cortes durante a micropropagação. No caso de culturas micropropagadas por segmentos nodais, por exemplo, após subcultivar as microestacas, os segmentos de tecido restantes, da porção superior, mediana e inferior do caule (de 5 mm a 8 mm) são cortados longitudinalmente e colocados cada um em um dos dois BIMs. A base do explante original e as raízes, quando presentes, são também cortadas e colocadas nos meios de indexação, BIM1 e BIM2 (Figura 3).
Figura 3. Esquema ilustrativo do processo de indexação de tecido de plantas cultivadas in vitro.
Ilustração: Marta Ribeiro.
A distribuição desigual dos organismos endofíticos torna necessária a utilização de diferentes partes da planta, conforme evidenciado na indexação de tecidos caulinares de melancia, na qual os segmentos basais não apresentaram crescimento bacteriano em nenhum dos dois meios testados.
A distribuição desigual dos organismos endofíticos faz desejável a utilização de diferentes partes da planta. Em outras culturas que não sejam propagadas via segmentos nodais são feitas indexações utilizando-se também distintas partes do tecido vegetal, como parte aérea, raiz, tecidos regenerantes e/ou calos, de acordo com a sua disponibilidade. Quadriculando-se as placas de Petri, é possível acomodar de 20 a 32 amostras, quando da indexação do meio (Figura 2), e de 4 a 12 amostras, quando da indexação de tecido (Figura 3).
O último passo consiste na pós-indexação. As placas contendo os meios de indexação são incubadas de ponta-cabeça. As placas contendo o BIM1 são mantidas no escuro a 37 oC, e aquelas contendo BIM2 são incubadas a 25 oC ou 30 oC, por 2 a 7 dias, seguido por um período de 3 a 4 semanas à temperatura ambiente. As placas devem ser observadas nos quatro primeiros dias após a incubação e, posteriormente, a cada semana, para a detecção de qualquer crescimento bacteriano. O resultado da indexação é positivo quando as culturas apresentam crescimento bacteriano visível em um ou mais pontos ou amostras de plantas indexadas.
A indexação do meio é feita, preferencialmente, entre uma ou duas semanas do subcultivo, enquanto que a indexação do tecido deve ser feita por ocasião do subcultivo. A maioria dos contaminates (> 90%) é detectada no período de 2 a 7 dias após a incubação das amostras nos BIMs.
Utilizando a metodologia descrita, Thomas (2004b) realizou um experimento com berinjela, uva, mamão, melancia e gérbera cultivadas in vitro. Cultivos apresentando crescimento evidente de microrganismos (etapa 1) representaram de 0% a 5% dos distintos lotes avaliados e foram facilmente recolhidos e descartados. Cultivos aparentemente livres de contaminantes, mas que apresentavam turbidez no meio de cultura, crescimento tênue, folhas parcialmente secas ou odor desagradável por ocasião da abertura dos frascos, eram geralmente portadores de bactérias silenciosas. As características citadas são, até certo ponto, indicadoras da presença de contaminantes passíveis de detecção mediante uma diligente observação visual.
A indexação do meio (etapa 2) revelou a existência de bactérias silenciosas em 0% a 100% dos vários frascos de cultura avaliados, com resultados consistentes. O teste de indexação do meio apresenta maior eficiência e rapidez quando são amostrados vários pontos do meio de cultura e, em seguida, plaqueados em quatro a cinco pontos do BIM, utilizando-se uma mesma alça ou agulha de inoculação.
A indexação do meio, entretanto, não assegura que o tecido esteja livre de contaminantes endofíticos silenciosos. A indexação de tecidos aparentemente limpos com indexação negativa do meio de cultura permitiu constatar crescimento bacteriano em 0% a 100% dos frascos indexados, em um ou nos dois meios de indexação, após um período de dois a quatro dias (Tabela 4). Tecidos com meio de cultura aderido, como a base do tecido em contato com o meio ou as raízes, apresentaram crescimento bacteriano mais cedo e mais frequente.
Tabela 4. Resultados percentuais da indexação do meio de cultura e de tecidos de diferentes espécies vegetais cultivadas in vitro. |
|||
Cultura |
Tecido vegetal |
Meio de cultura com indexação negativa (%) |
Tecido vegetal com indexação positiva (%) |
Berinjela |
Cotilédone |
100 |
0–10 |
Melancia |
Ápice caulinar |
100 |
0–10 |
Gérbera |
Capítulo |
90 |
25 |
Mamão |
– |
89 |
19 |
Uva |
– |
81 |
81 |
Fonte: modificado de Thomas (2004b). |
Em um lote de 16 frascos de cultura de tecidos de uva avaliados quatro semanas após tratamento com cloreto de mercúrio (HgCl2 a 0,1% por 5 minutos), seis frascos apresentaram indexação negativa. Uma semana depois desse teste, a indexação de diferentes partes do tecido de um dos frascos que permanecia com resultado negativo da indexação do meio revelou a presença de bactéria em todas as partes da planta testadas. Na repicagem subsequente, o meio foi indexado como positivo indicando o aumento na densidade de inóculo com o passar do tempo. Os outros cinco frascos que tinham apresentado resultado negativo para indexação do meio de cultura deram resultado negativo para indexação dos tecidos nos três ciclos de cultivos seguintes, confirmando a ausência de bactérias cultiváveis (THOMAS, 2004b).
No cultivo in vitro de ápices caulinares de melancia sobre ponte de papel em meio líquido, após tratamento de assepsia com HgCl2 (0,05% por 10 minutos), foram constatados 10 frascos com meio aparentemente limpo e 10 frascos com pouca ou moderada turbidez do meio, após 2 semanas de cultivo. Após a 3ª e 4ª semanas, 4 dos 10 frascos com meio aparentemente limpo mantiveram resultado negativo para o meio de cultura quando indexados no BIM1. Quando o material vegetal desses frascos foi testado na 5ª semana, bactérias endógenas foram detectadas em todo tecido avaliado, enquanto que o meio permanecia com resultado negativo para a presença de microrganismos (THOMAS, 2004b).
As etapas 1, diligente exame visual das culturas, e 2, indexação do meio de cultura aparentemente não contaminado, costumam ser suficientes para a produção comercial de plantas. A etapa 3, que consiste na indexação de tecidos de plantas provenientes de meios com resultado de indexação negativo, é essencial para a certificação do estoque e também durante os procedimentos de limpeza de material contaminado. Vale a pena salientar que cultivos previamente tratados com antibióticos podem apresentar falso resultado em razão dos efeitos residuais de reagentes no tecido vegetal, e que as bactérias podem reaparecer meses depois em função da atividade bacteriostática transitória dos antibióticos (REED et al., 1998; TANPRASERT & REED, 1997). Nesses casos, é necessária a indexação do tecido por um período de 2 a 4 ciclos de cultivo após a retirada do antibiótico do meio de cultura.
A utilização desse procedimento de detecção de bactérias silenciosas ou endofíticas (etapas 1, 2 e 3) é uma ferramenta fundamental para garantir a segurança e confiabilidade de bancos de genes in vitro, intercâmbio de germoplasma limpo, controlando a multiplicação de culturas hospedeiras de bactérias patogênicas e evitando o escape para o meio ambiente de sistemas de vetores mediados por Agrobacterium.
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