Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Contaminações microbianas
na cultura de células,
tecidos e órgãos de plantas

2ª edição

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Editor Técnico

Embrapa

Brasília, DF

2012

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

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Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

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Embrapa Informação Tecnológica

Coordenação editorial: Fernando do Amaral Pereira, Lucilene Maria de Andrade, Juliana Meireles Fortaleza

Revisão de texto: Maria Cristina Ramos Jubé

Normalização bibliográfica: Iara Del Fiaco Rocha

Revisão do e-book: Aline Pereira de Oliveira

Tratamento editorial do e-book: Alexandre Abrantes Cotta de Mello

Tratamento de imagens: Júlio César da Silva Delfino

Capa: Carlos Eduardo Felice Barbeiro

Conversão e editoração do e-book: WOC Tecnologia da Informação Ltda

1ª edição

1ª impressão (2010): 1.000 exemplares

2ª edição

E-book (2012)

Todos os direitos reservados

Para uso exclusivo de EMBRAPA RECURSOS GENETICOS E BIOTECNOLOGIA. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Embrapa Informação Tecnológica

Contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas / Jonny Everson Scherwinski-Pereira, editor técnico. – 2. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2012.

il. color.

E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.

ISBN 978-85-7035-038-1

1. Biotecnologia. 2. Contaminação. 3. Profilaxia. I. Scherwinski-Pereira, Jonny Everson. II. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

CDD 632.9

© Embrapa 2012

Autores

Abi Soares dos Anjos Marques

Engenheira-agrônoma, doutora em Bacteriologia Vegetal, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
amarques@cenargen.embrapa.br

Alba Regina Pereira

Engenheira-agrônoma, doutora em Botânica e Diversidade Vegetal, designer instrucional da Fundação Centro de Ciências e Educação Superior a Distância/Cederj, Rio de Janeiro, RJ
albaenbt@gmail.com

Alexandre Levi Rodrigues Chaves

Engenheiro-agrônomo, doutor em Agronomia, pesquisador do Instituto Biológico, São Paulo, SP
chaves@biologico.sp.gov.br

Aparecida Gomes de Araujo

Engenheira-agrônoma, doutora em Agronomia, bolsista da Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
agaraujo2003@yahoo.com.br

Cynthia Cavalcanti de Albuquerque

Bióloga, doutora em Botânica, professora da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, Mossoró, RN
cycavalcanti@gmail.com

Fernando Javier Sanhueza Salas

Biólogo, doutor em Ciências, pesquisador do Instituto Biológico, São Paulo, SP
salas@biologico.sp.gov.br

Flavio Alterthum

Farmacêutico e Bioquímico, doutor em Farmácia, professor da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP
falterth@usp.br

Frederico Henrique da Silva Costa

Engenheiro-agrônomo, doutor em Fitotecnia
fredericohenrique@yahoo.com.br

Gilmar Franzener

Engenheiro-agrônomo, mestre em Agronomia, professor da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Marechal Cândido Rondon, PR
gfranzener@hotmail.com

João Batista Teixeira

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biologia de Plantas, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
batista@cenargen.embrapa.br

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Engenheiro-agrônomo, doutor em Ciências, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
jonny@cenargen.embrapa.br

José Renato Stangarlin

Engenheiro-agrônomo, doutor em Agronomia, professor da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Marechal Cândido Rondon, PR
jrstangarlin@unioeste.br

Júlia Kuklinsky-Sobral

Biomédica, doutora em Agronomia, professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Garanhuns, PE
jksobral@uag.ufrpe.br

Leonardo Ferreira Dutra

Engenheiro-agrônomo, doutor em Agronomia, pesquisador da Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS
leonardo.dutra@cpact.embrapa.br

Lilia Willadino

Bióloga, doutora em Ciências Biológicas, professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
lilia@pq.cnpq.br

Marcelo Eiras

Engenheiro-agrônomo, doutor em Agronomia, pesquisador do Instituto Biológico, São Paulo, SP
eiras@biologico.sp.gov.br

Marcio Gilberto Cardoso Costa

Engenheiro-agrônomo, doutor em Genética e Melhoramento, professor da Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA
mcosta@labbi.uesc.br

Marcos César Gonçalves

Engenheiro-agrônomo, doutor em Ciências Biológicas, pesquisador do Instituto Biológico, São Paulo, SP
mcgon@biologico.sp.gov.br

Maria Eugênia da Silva Cruz

Engenheira-agrônoma, doutora em Agronomia, professora da Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR
mescruz@wnet.com.br

Maria Mércia Barradas

Bióloga, doutora em Ciências Biológicas, pesquisadora aposentada do Instituto Biológico, São Paulo, SP
mmerciab@hotmail.com

Moacir Pasqual

Engenheiro-agrônomo, doutor em Genética e Melhoramento, professor da Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
mpasqual@ufla.br

Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada

Engenheira-agrônoma, doutora em Agronomia, professora da Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR
schwan@wnet.com.br

Terezinha Rangel Camara

Engenheira-agrônoma, doutora em Ciências Biológicas, professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
tkrcamara@pq.cnpq.br

Vera Lúcia de Almeida Marinho

Bióloga, doutora em Agronomia, pesquisadora aposentada da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
marinho.vera@gmail.com

Wagner Campos Otoni

Engenheiro-agrônomo, doutor em Genética e Melhoramento, professor da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG
wotoni@ufv.br

Welington Luiz de Araújo

Biólogo, doutor em Agronomia, professor da Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP
welingtonluiz@umc.br

Agradecemos a todos os profissionais, autores e coautores, que colaboraram com a concretização deste livro, permitindo uma fonte segura de dados, conceitos e técnicas.

As autoras do capítulo 5 agradecem ao Dr. Pious Thomas, do Indian Institute of Horticultural Research, pela gentileza no envio de artigos científicos de sua autoria para consulta; à Marta Ribeiro, bolsista Pibic/UFRPE do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, pelas ilustrações.

Apresentação

Na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas as contaminações causadas por microrganismos, especialmente fungos, bactérias, vírus e leveduras, ainda constituem-se nas principais causas de perdas de material vegetal em laboratórios de pesquisa e biofábricas de produção de mudas.

Apesar dessa importância, são relativamente poucos os trabalhos que tratam do assunto, em razão do desconhecimento do tema e, notadamente, das técnicas envolvidas no processo. Acrescentando-se à falta quase absoluta de literatura em língua portuguesa, observa-se uma enorme lacuna entre as técnicas de cultivo in vitro e os problemas relativos às contaminações microbianas.

A publicação Contaminações Microbianas na Cultura de Células, Tecidos e Órgãos de Plantas atende a uma forte demanda relacionada aos processos de boas práticas de laboratório e contribui para preencher algumas lacunas encontradas na área de biotecnologia vegetal referente aos problemas de contaminação in vitro. A estrutura da obra busca se aprofundar em conceitos e informações oriundas da pesquisa com a finalidade de refletir o estado da arte sobre as contaminações, proporcionando à comunidade científica uma fonte de consulta contendo as bases teóricas e aplicações práticas sobre o tema.

Mauro Carneiro

Chefe-Geral

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Prefácio

É consenso entre os profissionais da área que as contaminações microbianas constituem-se muito possivelmente no principal problema encontrado na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas relacionados à perda de materiais nas diferentes fases do cultivo. E apesar da importância do tema, é bastante reduzido o número de profissionais que se dedicam à pesquisa da área. Nenhum livro sobre contaminações microbianas direcionado para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas foi publicado no Brasil até os dias atuais, sendo este, portanto, pioneiro. Em nível internacional, as pesquisas também são reduzidas, e as poucas obras que se encontram sobre o tema são informações isoladas que, na maioria dos casos, fazem parte de textos de artigos, sem maiores aprofundamentos sobre o tema.

O livro Contaminações Microbianas na Cultura de Células, Tecidos e Órgãos de Plantas vem suprir parte da carência de literatura especializada na área, abordando tanto aspectos teóricos quanto práticos das contaminações microbianas. No entanto, é obvio que em um livro dessa importância e abrangência é quase impossível que se esgotem os assuntos ou que soluções prontas sejam apresentadas, seja pela abordagem parcial de alguns capítulos, seja pela não inclusão de outros. De qualquer modo, trata-se do mais completo livro versando sobre o problema das contaminações microbianas publicado no País.

O principal objetivo da obra foi aprofundar conceitos, técnicas e informações oriundas da pesquisa científica com a finalidade de refletir o estado da arte sobre as contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas. Assim, nos 10 capítulos que compõem o livro, escritos por 26 especialistas da área, são tratados assuntos que incluem desde a importância das contaminações e sua prevenção, até aspectos relacionados à identificação, detecção, controle e conservação desses contaminantes.

Espera-se que as informações contidas neste livro sejam de grande valia para todos os que tenham algum vínculo ou interesse pela área de cultura de células, tecidos e órgãos de plantas. Ainda estamos distante do ideal ou de conhecimentos mais aprofundados sobre esse complexo tema, mas, apesar disso, na perspectiva da formação e consolidação de recursos humanos, este livro certamente será uma sólida e importante fonte de informações práticas e teóricas sobre o tema para os diversos atores que compõem a comunidade científica e o setor produtivo brasileiro que está ligado de alguma forma com a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas.

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Editor Técnico

Capítulo 1
Importância das contaminações e dos microrganismos endêmicos na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas

Marcio Gilberto Cardoso Costa

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Wagner Campos Otoni

Introdução

Os termos contaminação microbiana da cultura de tecidos, contaminação da cultura in vitro, contaminação da cultura de tecidos, ou simplesmente contaminação, são rotineiramente utilizados nos trabalhos de micropropagação de plantas para designar, em laboratório, a presença de microrganismos em células, tecidos e órgãos ou numa coleção de plantas. Independentemente do tipo de associação que os diferentes grupos de microrganismos possam estar envolvidos, é procedimento de rotina descartar os frascos que apresentem alguma colônia visível a olho nu e que causem algum tipo de ameaça à cultura. Esse procedimento parte do princípio de que, em geral, os microrganismos nas plantas em fase de micropropagação são passíveis de patogenecidade, adotando-se, dessa forma, o princípio da erradicação parcial ou total da cultura como medida de controle, uma vez que contaminação pode ser definida como o ato de tornar-se infectado, pressupondo a ocorrência de uma doença contagiosa, causada por um agente biológico. No entanto, como já se sabe, a grande maioria dos microrganismos contaminantes na cultura de tecidos de plantas não promovem a morte de materiais estabelecidos in vitro diretamente por causarem doenças nas plantas. Mas sim, por geralmente competirem com as plantas pelos nutrientes do meio de cultura e por excretarem substâncias geralmente tóxicas aos cultivos no meio de cultura.

De fato, o estado normal das plantas é o de coexistir com uma ampla gama de microrganismos simbiontes ou não, presentes nos diversos órgãos das plantas, como folhas e raízes, cujos efeitos ou finalidades são objetos de aprofundadas pesquisas em áreas como a microbiologia. Para se ter ideia da complexidade do tema, estima-se que aproximadamente 90% das espécies vegetais apresentem algum tipo de associação simbiótica com microrganismos, como os rizóbios (associação de bactérias com plantas leguminosas), micorrizas (associação de fungos com plantas), rizobactérias (bactérias promotoras de crescimento de plantas – RPCPs) e as diazotróficas (bactérias fixadoras do nitrogênio atmosférico), de tal modo que muitos benefícios recíprocos foram desenvolvidos, como melhor crescimento, reprodução e resistência a estresses bióticos e abióticos pelas plantas, assim como um local de refúgio, nutrição e disseminação pelo lado dos microrganismos (SAIKKONEN et al., 2004; SELOSSE; LE TACON, 1998).

As contaminações microbianas e seus impactos na cultura de tecidos vegetais

Embora o entendimento sobre a identidade, fontes e epidemiologia dos diferentes contaminantes microbianos tenha avançado consideravelmente nos últimos anos, a detecção de contaminantes bacterianos latentes e a eliminação da contaminação fúngica e bacteriana de culturas estabelecidas in vitro permanecem à espera do desenvolvimento de melhores estratégias. Uma vez seguidos os procedimentos básicos padrões de desinfestação, a contaminação frequentemente origina-se da introdução em cultura de explantes contaminados com microrganismos endofíticos ou microrganismos resistentes ao processo de desinfestação. Esses incluem fungos, leveduras, bactérias, vírus e viroides, os quais podem tornar-se patogênicos (vitropats, microrganismos que podem injuriar as plantas in vitro, mas que normalmente não causam doença no habitat natural ou agrícola das plantas in vivo) (HERMAN, 1990a) ou latentes não patogênicos às plantas in vitro (CASSELLS, 1991, 1997, 2000a, 2001).

A contaminação é o principal problema que afeta os laboratórios de micropropagação comercial, que tem sido estimada na média de 10%, mas podendo resultar no completo insucesso do processo de produção (CASSELLS, 2001). Seguindo a rápida ascensão na produção de plantas micropropagadas nos anos de 1980, um constante declínio do número de laboratórios de micropropagação comercial tem sido observado a partir da década de 1990, provavelmente causado pela inabilidade dos laboratórios em reduzir as perdas por contaminação a níveis satisfatórios que permitam tanto um rendimento de produção preditivo como a obtenção de plantas micropropagadas de qualidade (LEIFERT; WOODWARD, 1998). A tendência geral desses laboratórios é desconsiderar a contaminação das culturas, a menos que esta passe a afetar visivelmente a produção. Essa abordagem pragmática é baseada em duas generalizações: (i) que é difícil descontaminar culturas no estágio 2 ou estágios posteriores, e (ii) que a maioria dos contaminantes, ao contrário dos vitropats, são organismos comuns ao ambiente e por isso não ameaçam a produção ou os seres humanos envolvidos na produção.

Perdas por contaminação de até 2% por subcultivo são usualmente admitidas como o nível máximo necessário para garantir o sucesso da produção. Esse nível não pode ser obtido sem a aplicação de práticas de garantia de qualidade e a introdução de estratégias de controle da produção, comuns em outros segmentos industriais afetados pela contaminação microbiana, como indústrias de processamento de alimentos e farmacêutica. Estratégias de garantia de qualidade/gerenciamento, como a Análise de Risco e Pontos Críticos de Controle (ARPCC), que será discutida mais adiante, podem ser facilmente aplicadas em laboratórios de cultura de tecidos. Em laboratórios de micropropagação que investiram no estabelecimento da ARPCC, os custos adicionais foram mais do que compensados pela redução das perdas e melhor qualidade das plantas (LEIFERT et al., 1994a).

O manejo de contaminantes na cultura in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais depende inicialmente do uso de plantas estoques livres de patógenos e da combinação de métodos de desinfestação e/ou cultura de meristemas para o estabelecimento de culturas livres de patógenos e contaminantes (CASSELLS, 2000a). Quando necessário, a termoterapia ou a quimioterapia podem ser aplicadas à planta doadora, embora a primeira seja menos comum no caso de tratamento de tecidos vegetais, que não os meristemas. Muitos antibióticos utilizados na cultura de tecidos vegetais têm sido selecionados sem o emprego dos procedimentos e testes de sensibilidade padrões (BARRETT; CASSELLS, 1994) e são biostáticos em vez de biocidas (CASSELLS, 1998; FALKINER, 1990; PEREIRA; FORTES, 2003). A atividade bacteriostática da maioria dos antibióticos reforça a necessidade de um método de detecção sensitivo para confirmar a ausência de contaminantes. Tem sido proposto que culturas fotoautotróficas podem ser usadas como uma estratégia para minimizar os efeitos da contaminação microbiana durante a micropropagação, visto que a disponibilidade de nutrientes para sustentar o crescimento dos microrganismos é menor do que em culturas heterotróficas (KOZAI et al., 1992; LONG, 1997). A transferência de culturas heterotróficas para culturas autotróficas também tem sido defendida como uma estratégia para recuperar culturas contaminadas (SAYEGH; LONG, 1997).

Identificação e fontes de contaminação em laboratórios de cultura de tecidos vegetais

A identificação dos contaminantes mais comuns nos laboratórios é uma tarefa relativamente simples de ser realizada. A maioria dos fungos e leveduras contaminantes pode ser facilmente visualizada pelo exame macroscópico dos tecidos vegetais infectados (DANBY et al., 1994). As características de esporo/micélio podem ser usadas para identificar o gênero de fungos/leveduras associado à fonte de contaminação específica (Tabela 1). Também é possível separar as leveduras das bactérias contaminantes por meio da avaliação macroscópica. Leveduras crescem vigorosamente e formam colônias esbranquiçadas ou vermelhas/rosas, produzindo um odor típico de levedura no frasco de cultura, enquanto que as bactérias usualmente apresentam um crescimento mais leve no meio de cultura ou, quando crescem mais vigorosamente, as colônias são de aparência fina e translúcida.

No entanto, poucas espécies de bactérias apresentam crescimento característico ou produzem sintomas típicos em cultura de tecidos vegetais, de modo que a separação dos diferentes gêneros não pode ser feita baseada apenas na morfologia de colônia. Dessa forma, os principais grupos/gêneros de contaminantes bacterianos podem ser identificados apenas empregando-se testes bacteriológicos, muitos desses na forma de kits comerciais que identificam as bactérias em nível de gênero ou espécie. A identificação em nível de gênero, que normalmente não requer o uso de kits caros, é frequentemente suficiente para identificar a fonte de contaminação bacteriana. Contaminantes indicadores, que identificam a fonte de contaminação de forma precisa, são descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Contaminantes indicando fontes de contaminação específicas.

Contaminante

Fonte de contaminação provável

Comentário

Bactérias

Gram-negativas

Gram-positivas

Desinfestação ineficiente dos explantes

Práticas de laboratório inadequadas

Frequentemente Pseudomonas

e Enterobacteriaceae

Cocobacilos gram-positivos

(Staphylococcus epidermis)

Deficiência de técnicas assépticas em:

(i) subcultivo das plantas

(ii) vertimento do meio de cultura

Staphylococcus spp. são considerados parasitas obrigatórios de animais

Bacillus spp.

Esterilização deficiente do meio de cultura

Esterilização ineficiente dos instrumentos usados para subcultivo

Frequentemente Bacillus subtilis e B. pumilus

B. circulans pode sobreviver em álcool 70%

Fungos/leveduras

Diferentes tipos

Sala de crescimento infestada por ácaros e/ou tripes

Ocorre especialmente quando salas de crescimento específicas são afetadas

Fusarium poe

Sala de crescimento infestada pelos ácaros Sideroptes graminis

Fusarium poe forma um micélio branco com base rósea

Mofos cinzento, preto e verde (Botrytis, Aspergillus, Alternaria, Penicillium spp.) e Rhodotorula spp. (leveduras róseas)

Contaminação elevada do ar do laboratório

Defeito na câmara de fluxo laminar

Penicillium e leveduras róseas são contaminantes comuns do ar em interiores de prédio e demais construções

Mofos pretos

Higiene deficiente em salas de crescimento, plantas e soluções estoques contaminadas

Mofos são frequentemente encontrados em paredes do laboratório com umidade ou crescem em áreas de condensação frequente; os esporos são transmitidos pelo ar

Cladosporium spp.

Proteção insuficiente do laboratório contra o ar externo

Esporos de Cladosporium são muito comuns no ar externo

Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998).

Recentemente, demonstraram que certos fungos patogênicos humanos, como Candida albicans e Trichophyton spp., crescem em meio de cultura de tecidos vegetais, sendo que Trichophyton spp. é transmitido via cultura de tecidos contaminados (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Nesses casos, o risco de infecção humana pode ser particularmente alto quando as culturas contaminadas com esses fungos forem transplantadas manualmente (WELLER; LEIFERT, 1996). Também tem sido demonstrado que as bactérias patogênicas humanas Escherichia coli e Serratia marcescens podem persistir nas culturas de tecidos vegetais e tornarem-se fitopatogênicas in vitro quando inoculadas em culturas autotróficas (RAFFERTY et al., 2000).

Uma descrição mais detalhada das diferentes espécies de contaminantes na cultura de células e tecidos vegetais e fonte de informações sobre contaminantes específicos podem ser encontradas na Tabela 1 e em Leifert et al. (1989a, 1989b, 1990, 1991b, 1994a, 1994c) e Danby et al. (1994).

Detecção de contaminantes

Uma das mais importantes fontes de contaminação é o explante durante a iniciação das culturas in vitro. O processo de desinfestação dos explantes prévio ao seu estabelecimento in vitro é frequentemente ineficiente. Esse problema pode ser em virtude do agente desinfestante, que pode ser inativo, ou dos microrganismos, que podem ser protegidos dentro dos tecidos vegetais usados como explantes (CASSELLS, 1998). Fungos e leveduras contaminantes podem ser facilmente detectados quando sobrevivem ao processo de desinfestação porque os mesmos crescem rapidamente no meio de cultura de tecidos vegetais. Por outro lado, as bactérias e vírus contaminantes podem não produzir crescimento visível no meio de cultura. No entanto, a propagação de material com essa infecção latente pode causar perdas severas nos estágios posteriores da cultura de tecidos ou durante o período de aclimatização das plantas.

A detecção de bactérias latentes é normalmente baseada na indexagem dos tecidos vegetais (LEIFERT; WOODWARD, 1998). Essa estratégia envolve a transferência de pedaços de material vegetal para meios bacteriológicos líquidos ou sólidos, após a desinfestação. Os meios utilizados contêm extrato de carne e leveduras, sendo descritos inclusive para testes de esterilidade em outras áreas, como indústrias de alimento e água e microbiologia médica. Diversos meios de indexagem que foram desenvolvidos especificamente para a detecção de contaminantes em cultura de tecidos vegetais, incluindo o meio 523 (LEIFERT; WOODWARD, 1998), o meio TT de detecção de micobactéria (GEORGE; FALKINHAM, 1986) e o meio teste de esterilidade Leifert & Waites (LEIFERT et al., 1994a), podem agora ser obtidos como produtos comerciais. A vantagem de utilizar meios de indexagem é que esses permitem crescer e detectar uma ampla variação de diferentes contaminantes bacterianos, além de serem sensíveis o suficiente para detectar a presença de contaminantes mesmo quando em pouca quantidade. Entretanto, diferentes espécies de bactérias apresentam diferentes taxas de crescimento num mesmo meio em particular (Tabela 2), e nenhum meio bacteriológico é capaz de detectar todos os contaminantes importantes (LEIFERT et al., 1991a, 1994a).

Tabela 2. Crescimento (E625) de contaminantes nos meios Leifert & Waites e Tryptone Soya Broth em diferentes concentrações de nutrientes.

Organismo teste

Leifert & Waites

Tryptone Soya Broth

FS

HS

1/10

FS

HS

1/10

Bacillus subtilis Cot1

0,4

0,4

0,3

0,4

0,4

0,3

Bacillus circulans Al 1

0,2

0,2

**

0,3

0,3

**

Clavibacter michiganense CM1

**

0,2

0,3

0,2

0,2

**

Corynebacterium H416/3

**

-

0,2

0,5

0,4

0,3

Lactobacillus plantarum H260/6

0,8

0,8

0,7

0,7

0,6

0,2

Micrococcus kristinae Ho506/4

**

0,2

0,2

0,2

0,3

0,2

Staphylococcus saprophyticus Ch 104/5

0,8

0,8

0,3

0,8

0,7

0,2

Acinetobacter calcoaceticus Ho295/35

0,5

0,4

0,3

0,4

0,3

**

Agrobacterium radiobacter Ger840/12

0,9

0,9

0,8

0,4

0,4

0,4

Agrobacterium tumefaciens As001/1

0,8

0,8

0,8

0,4

0,5

0,4

Pseudomonas maltophilia De1603/20

0,7

0,6

0,4

0,8

0,8

0,7

Xanthomonas campestris pv. campestris XCCi

0,5

0,7

0,3

0,5

0,2

0,5

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria XVC

0,3

0,4

0,3

0,2

0,2

0,2

FS - concentração recomendada; HS - metade da concentração recomendada; 1/10 - um décimo da concentração recomendada. **Turbidez não detectada pela avaliação visual (E625 < 0,2).

Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998).

A inspeção visual das culturas é comumente utilizada para monitorar a contaminação in vitro. Essa inspeção pode ser facilitada pelo uso de agentes geleificantes mais claros, como Gelrite®. No entanto, a confiança nesse método traz consigo o risco de propagação clonal em massa de microrganismos latentes. É recomendável que a produção seja disposta numa ordem sequencial na sala de crescimento, e que amostragens de rotina ao acaso para bactérias cultiváveis sejam efetuadas utilizando uma variação de meios apropriados. As contaminações tendem a ser clusterizadas em vez de ao acaso, e quando uma contaminação é detectada numa prateleira, uma série de testes acima e abaixo deverá ser efetuada para determinar a extensão da contaminação (CASSELLS, 1991). A detecção visual de muitas bactérias cultiváveis é frustrada por sua inibição pelos componentes do meio de cultura (GEORGE, 1993). Geralmente, as bactérias crescem em meios bacteriológicos simples, mas a experiência sugere que a utilização de uma variação de meios, em vez de um único meio de cultura, seja necessária para os testes de detecção.

Testes sorológicos podem ser utilizados para identificar diversos contaminantes de origem bacteriana ou virótica em nível de espécie, incluindo Xanthomonas pelargonii, Xanthomonas campestris, Clavibacter michiganense, Haustonia solanacearum (= Pseudomonas solanacearum), Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, que podem permanecer no estado latente in vitro (Tabela 3). Os kits comerciais são mais sensitivos, mas também são mais caros e detectam apenas uma ou poucas espécies de bactéria ou vírus (LEIFERT; WOODWARD, 1998). O sistema de identificação API (bioMerieux AS, França) requer a execução de seis testes padrão para selecionar a fita-teste apropriada. O sistema Biolog (Biolog Inc., EUA), que se baseia em placas de micropoços padrão, requer somente a coloração de gram dos isolados a fim de selecionar o sistema de identificação gram-negativo, gram-positivo ou levedura-específico.

Tabela 3. Métodos de identificação de contaminantes bacterianos.

Teste bacteriológico clássico usado

Família/Gênero suspeito

CAT

OF/F

MOB

GRAM

COCC

SPOR

+

+

-

+

+

-

Staphylococcus spp.

+

-

-

+

+

-

Micrococcus spp.

-

+

-

+

+

-

Streptococcus spp.

+

+

+

+

-

+

Bacillus spp.

+

-

+

+

-

+

Bacillus spp.

+

+

-

+

-

+

Bacillus spp.

+

-

-

+

-

+

Bacillus spp.

+

+

+

+

-

-

Corynebacterium spp.

+

-

+

+

-

-

Corynebacterium spp.

+

+

-

+

-

-

Corynebacterium spp.

-

+

-

+

-

-

Lactobacillus spp.

+

-

-

-

+

-

Acinetobacter spp.

+

+

+

-

-

-

Vibrionaceae

+

+

-

-

-

-

Actinobacter spp.

+

-

+

-

-

-

Pseudomonas spp.

+

-

-

-

-

-

Flavobacterium spp.

+

+

+

-

-

-

Enterobacteriaceae

+

+

-

-

-

-

Enterobacteriaceae

+

+

+

oval

-

Leveduras

CAT - catalase; OF/F - crescimento anaeróbico; MOT - motilidade; GRAM - coloração de gram; COCC - formato de coccus; SPOR - esporos resistentes à alta temperatura.

Fonte: adaptado de Leifert e Woodward (1998).

A supressão de muitas bactérias e vírus por mecanismos de resistência da planta e resíduos do agente desinfestante usado pode resultar num baixo número de inóculo presente no material vegetal testado. Ambos os testes de indexagem e sorológico devem, portanto, ser repetidos tanto in vitro como após a aclimatização das plantas. Em virtude do custo relativamente elevado dos testes sorológicos, sugere-se que esses sejam usados somente para a detecção de organismos de reconhecido problema para uma determinada espécie vegetal (LEIFERT; WOODWARD, 1998).

A detecção e a caracterização de microrganismos como vírus e viroides apresentavam problemas técnicos consideráveis até o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em ácidos nucleicos. Utilizando-se, por exemplo, sondas contra rDNA 16S, tem sido possível discriminar os diferentes organismos (BOVE; GARNIER, 1997). Metodologias baseadas na técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) têm facilitado o diagnóstico dos contaminantes, pois a facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da técnica a tornam particularmente poderosa em estudos diagnósticos. Em geral, diagnósticos baseados em ácidos nucleicos oferecem o potencial de ser estirpe-específico ou de amplo-espectro e podem ser combinados em ensaios multiplex para a detecção simultânea de uma ampla gama de microrganismos numa mesma amostra. De modo geral, o elevado custo e as dificuldades na automação são as atuais limitações do uso de métodos baseados em ácidos nucleicos para a detecção de contaminantes em cultura de células e tecidos vegetais (O’DONNELL, 2000).

É importante reconhecer também que contaminantes bacterianos latentes podem ser introduzidos no laboratório. Portanto, a indexagem das plantas no estágio de iniciação das culturas pode não prevenir a acumulação de contaminação latente quando os tecidos são continuamente subcultivados. A fim de evitar esse problema, alguns laboratórios mantêm culturas estoques de todas as suas linhagens de plantas produzidas (LEIFERT; WOODWARD, 1998). Esses estoques são regularmente testados para a presença de bactérias latentes a cada 2–4 subcultivos/mês, e as culturas index-positivas, que apresentam crescimento bacteriano nos meios sorológicos, são descartadas. Os estoques index-negativos são regularmente usados para suplementar as culturas de produção e permanecem em produção somente por um período de tempo específico (aproximadamente 2 anos). Tais sistemas de produção têm provado aumentar a confiabilidade, e embora resultem em custo adicional de garantia de qualidade, esse normalmente é mais do que compensado pelo incremento das taxas de crescimento e redução das perdas por contaminação (LEIFERT et al., 1994a).

Sistemas de garantia de qualidade microbiológica

A implementação de sistemas de garantia de qualidade microbiológica, como ARPCC, constitui-se numa importante abordagem para o problema do gerenciamento da contaminação in vitro. Um aspecto importante da estratégia ARPCC é a produção de um sistema de registro que permite traçar com detalhes a história de todas as plantas, incluindo informações sobre a planta estoque, estoque de meio, operador(es), câmara(s) de fluxo laminar e sala de crescimento. A ARPCC envolve basicamente a análise de todos os estágios sequencialmente, a identificação dos riscos em cada estágio e a introdução de monitoramento apropriado e medidas de remediação (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT; WAITES, 1994). Mais especificamente, o sistema ARPCC que tem sido aplicado em muitos laboratórios comerciais de cultura de tecidos vegetais e de micropropagação de plantas envolve:

1. Uma análise profunda de todas as fontes de contaminação em potencial, baseada na identificação/quantificação de microrganismos indicadores de fontes de contaminação específica (Tabela 4).

2. O estabelecimento de sistemas de monitoramento para todas as fontes de contaminação (= pontos críticos de controle ou PCCs), incluindo o desenvolvimento de métodos refinados de detecção de contaminantes e fontes de contaminação.

3. O refinamento dos métodos de prevenção da contaminação em diferentes PCCs.

4. O desenvolvimento de métodos de tratamento no caso de falhas nas estratégias de prevenção.

Os princípios e aplicações dos sistemas de ARPCC em cultura de células e tecidos vegetais têm sido extensivamente revisados por Leifert e Waites (1994), Leifert et al. (1994a) e Leifert e Woodward (1998).

Contaminantes podem ser introduzidos com o explante durante as manipulações no laboratório e/ou por microartrópodes vetores (BERGER et al., 1994; CASSELLS, 1991; LEIFERT et al., 1991a, 1994a). Bactérias gram-negativas, como Pseudomonas fluorescens, Erwinia e Agrobacterium spp., são usualmente encontradas quando o procedimento de desinfestação inicial é ineficiente (Tabela 4). Por outro lado, espécies gram-positivas indicam a ineficiência do procedimento de esterilização do meio de cultura (Bacillus spp.) ou treinamento inadequado do operador em técnicas de assepsia (Staphylococcus spp.). Fungos filamentosos e leveduras contaminantes podem ser introduzidos com o explante e/ou durante todos os estágios in vitro subsequentes (DANBY et al., 1994). Fungos específicos (Fusarium spp.) e/ou uma dispersão rápida de contaminação fúngica numa sala de crescimento específica indicam a presença de microartrópodes vetores como ácaros e/ou tripes. Esses microartrópodes podem facilmente entrar nos recipientes de cultura e, portanto, introduzir esporos de fungos e contaminantes bacterianos nas culturas de tecidos (PYPE et al., 1997).

Tabela 4. Pontos críticos de controle (PCCs), microrganismos indicadores, materiais e métodos usados no controle microbiológico em cultura de tecidos vegetais visando à prevenção de contaminações.

Estágio da cultura de tecidos vegetais

Parâmetros ou PCCs a serem monitorados

Microrganismos indicadores

Material necessário

Referência para os métodos

Estágio 0

Tratamento da planta/cultura estoque

Sintomas de vírus, bactérias e fungos patogênicos

Detecção e identificação de viroides, vírus, bactérias e fungos

Lentes de aumento; lupa, microscópio de contraste de fase; meios bacteriológicos seletivos; testes sorológicos ou moleculares; plantas indicadoras

Vírus: 1, 2

Bactérias: 3, 4

Fungos: 5, 6

Estágio 1

Desinfestação

Conteúdo de cloro ativo em soluções de hipoclorito

Bactérias gram-negativas:

Pseudomonas fluorescens, Erwinia spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Agrobacterium spp.

Papel indicador Whatman, solução de arsenito, coluna de titulação

7

Estágio 2

Indexagem

Atividade de outros biocidas

Presença de vírus, bactérias e fungos nos explantes após a desinfestação

Depende do composto

Meio de indexagem

Testes sorológicos

Testes moleculares

8–11

3, 4, 12

1–4

1–4

Estágio 3

Preparação de meio

Autoclavagem

Bacillus spp. (ex.: B. circulans, B. subtilis e B. pumilus)

Métodos físicos (fita indicadora, indicadores de temperatura)

Métodos biológicos (uso de esporos para monitoramento do processo de esterilização)

Teste de esterilidade

13, 14

Vertimento do meio

Penicillium spp.

Candida spp.

Staphylococcus spp.

Teste do ar do laboratório e da câmara de fluxo

12, 15, 16

Estágio 4

Subcultivo das plantas no laboratório

Esterilidade do ar

Rhodotorula spp. (leveduras róseas)

Amostragem do ar e/ou contador de partículas

12, 16

Câmara de fluxo

Penicillium spp.

Contador de partículas

12

Esterilização dos instrumentos

Bacillus spp.

Meio de indexagem

Técnicas assépticas dos operadores

Staphylococcus spp.

Streptococcus spp.

Candida albicans

Registro das taxas individuais de contaminação

Estágio 5

Armazenamento de meios e plantas

Idem esterilidade do ar (Estágio 4)

Idem esterilidade do ar (Estágio 4)

Idem esterilidade do ar (Estágio 4)

Idem esterilidade do ar (Estágio 4)

Estágio 6

Aclimatização das plantas

Idem Estágio 0

Idem Estágio 0

Idem Estágio 0

Idem Estágio 0

Fonte: adaptado de Leifert e Cassells (2001), dados de Leifert e Waites (1994). (1) Hill (1984); (2) Matthews (1991); (3) Lelliot e Stead (1987); (4) Schaad (1979); (5) Smith et al. (1986); (6) Hoffmann e Schumutterer (1983); (7) Hoffman et al. (1981); (8) Collins et al. (1981); (9) Hugo (1971); (10) Russell et al. (1982); (11) Sykes (1965); (12) Leifert et al. (1991a, 1991c); (13) Kelsey (1958); (14) Kelsey (1961); (15) Danby et al. (1994); (16) Gregor (1973).

A habilidade para o estabelecimento de culturas assépticas é uma etapa crítica no processo de cultivo in vitro de tecidos vegetais (CASSELLS, 1997, 2000a). Ela envolve o uso de protocolos bem estabelecidos para localizar, produzir e manter os estoques livres de patógenos e de contaminantes. O ponto inicial é o conhecimento dos fitopatógenos da cultura; caso seja insuficiente, o conhecimento dos fitopatógenos de culturas relacionadas deverá ser utilizado. A seleção de plantas estoques é seguida pela seleção de testes diagnósticos e de indexagem apropriados. Nos casos dos testes diagnósticos serem negativos, os resultados deverão ser confirmados inoculando-se, por exemplo, plantas indicadoras. Depois das culturas terem sido estabelecidas in vitro, testes para a confirmação da ausência de contaminantes cultiváveis deverão ser efetuados. Nos casos em que esforços são feitos para eliminar patógenos e/ou contaminantes das culturas introduzidas in vitro, testes rigorosos deverão ser efetuados regularmente.

Numa perspectiva prática, a manutenção de culturas livres de contaminantes é o principal objetivo, assumindo que culturas assépticas foram estabelecidas no estágio 1. Isso envolve rigorosas normas de boas práticas de laboratório em filtração de ar, esterilização de água, meio de cultura e instrumentos, além de experiência de trabalho. Essa última depende do treinamento e da experiência pessoal dos operadores, provisão de vestuário apropriado e precaução, como a remoção de relógios, joias e bijuterias (LEIFERT; WAITES, 1994). Um aspecto importante também é o design dos frascos de cultura, especialmente o tamanho e a tampa. Frascos sem tampa são de grande risco, pois alterações na pressão pela variação de temperatura em virtude das transições luz/escuro podem resultar em pressões de sucção, levando ao rompimento dos filmes de PVC. A troca de gases é importante em relação à qualidade dos tecidos in vitro, sendo que a mesma pode ser encontrada utilizando-se tampas permeáveis a gás e com selos à prova de microrganismos e microartrópodes (CASSELLS; WALSH, 1994). Leifert e Waites (1994) têm listado alguns contaminantes microbianos que podem ser usados para monitorar as boas práticas de laboratório.

Persistência latente

Os contaminantes podem aparecer imediatamente após a sua introdução em cultura de tecidos ou permanecer no estado latente (não produzir sintomas nas plantas e/ou crescimento visível no meio de crescimento vegetal) por um longo período de tempo. Os fungos filamentosos e as leveduras raramente permanecem latentes in vitro porque o meio de cultura de células e tecidos vegetais fornece todos os nutrientes essenciais para o crescimento da maioria dos fungos (DANBY et al., 1994; LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a).

A maioria das bactérias comuns ao ambiente cresce rapidamente no meio de cultura tornando-se patogênica às culturas de células e tecidos vegetais. Por outro lado, algumas bactérias do gênero Pseudomonas, Xanthomonas e as corinebactérias normalmente são de difícil visualização em determinados meios de cultura de plantas e/ou não produzem sintomas in vitro, embora possam afetar as taxas de crescimento e enraizamento vegetal (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1991b; LONG et al., 1988). Os vírus, viroides e algumas bactérias fastidiosas, como micoplasma, espiroplasma e ricketsia, não podem crescer fora de seus hospedeiros (AGRIOS, 1990). Assim, como não existem relatos da transmissão desses organismos por vetores no laboratório, assume-se que esses são introduzidos em cultura juntamente com os explantes. Algumas vezes esses patógenos demonstram sintomas in vitro semelhantes àqueles observados no campo. No entanto, mais frequentemente eles permanecem no estado latente in vitro (WALKEY, 1985), tornando-se virulentos após a transferência das plantas para as condições de campo (LEIFERT; CASSELLS, 2001; WEBER; SCHENK, 1988). Acredita-se que a latência in vitro desses patógenos, que são mais ativos sob condições in vitro, pode ser causada pelo desencadeamento de mecanismos de resistência por parte da planta, embora poucas são as informações disponíveis na literatura acerca da confirmação dessa hipótese (LEIFERT et al., 1994a). A produção de compostos antivirais e de proteínas relacionadas à patogênese (PRs), envolvidas na resistência a viroses, tem aumentado em resposta a determinados reguladores de crescimento utilizados no meio de cultura de células e tecidos vegetais (APOSTOL et al., 1989; DAUB, 1986; THYNN et al., 1989; TOYODA et al., 1985).

Nos últimos 30 anos, muitos são os trabalhos que descrevem métodos para a eliminação de agentes de infecção por meio da cultura de ápices caulinares e tratamento com calor ou frio (HADIDI et al., 1998). No entanto, muito poucas bactérias fastidiosas podem ser cultivadas em meio de cultura especializado, de modo que a maioria delas não é capaz de crescer em meio de cultura de tecidos vegetais (SCHAAD, 1979). Logo, a completa eliminação desses patógenos necessita ser confirmada por algum método diagnóstico, como testes sorológicos, microscopia eletrônica ou técnicas moleculares como hibridização de ácidos nucleicos e/ou PCR (LEIFERT et al., 1994a). Os métodos sorológicos têm sido utilizados rotineiramente com grande sucesso para a detecção de vírus e bactérias fastidiosas (MATTHEWS, 1991; MOLLERS; SARKAR, 1989; WALKEY, 1985). Tais testes podem ser muito sensitivos, mas frequentemente detectam apenas uma espécie de bactéria ou vírus ou espécies intimamente relacionadas. Além disso, a supressão desses patógenos por mecanismos de resistência das plantas, o uso de antibióticos in vitro e/ou acidificação do meio de cultura podem resultar num título ou número de células muito baixo presente no material in vitro, dificultando a detecção de forma confiável pela maioria dos métodos disponíveis atualmente (HADIDI et al., 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a). Recomenda-se que os testes diagnósticos somente devem ser efetuados em tecidos para os quais esses testes tenham sido oficialmente validados (LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Contaminantes bacterianos usualmente requerem fatores de crescimento/vitaminas que não estão presentes no meio de cultura de tecidos vegetais, de modo que não podem crescer ou persistir no meio na ausência de tecidos vegetais (LEIFERT; WAITES, 1992). Também, a acidificação do meio de cultura e liberação de exsudatos antibacterianos pelas células e tecidos vegetais podem suprimir o crescimento bacteriano in vitro, resultando em persistência latente (LEIFERT et al., 1994c).

A contaminação latente reduz a confiabilidade dos sistemas de cultura de células e tecidos vegetais, visto que mesmo pequenas mudanças nas condições ambientais (temperatura, pH, composição do meio ou aclimatização) podem permitir a rápida proliferação do contaminante. Isso pode resultar em crescimento e/ou enraizamento vegetal reduzido, morte das células e tecidos vegetais in vitro ou expressão dos sintomas após transferência para as condições de campo (COOKE et al., 1992; LEIFERT; WAITES, 1992). Acredita-se que fatores de crescimento adicionais para o crescimento bacteriano podem ser fornecidos pelos exsudatos produzidos pelas células e tecidos vegetais, tornando assim o crescimento de contaminantes bacterianos completamente dependente dos explantes (LEIFERT; WAITES, 1992; LEIFERT et al., 1994a). O crescimento bacteriano em cultura de tecidos vegetais também é dependente da temperatura de incubação. Os regimes de temperaturas usados para a maioria das culturas são normalmente mais baixos (25 oC) do que aqueles exigidos para o máximo crescimento de contaminantes bacterianos (≥ 35oC). Os contaminantes bacterianos latentes podem, portanto, tornarem-se virulentos (produzir sintomas visíveis em plantas e/ou crescimento visível no meio de cultura) quando o ambiente da cultura for alterado. Por exemplo, a transferência dos explantes para o meio de enraizamento pode aumentar a concentração de exsudatos vegetais, resultando em estímulo do crescimento bacteriano (CASSELLS et al., 1988). De forma similar, a elevação da temperatura na sala de crescimento pode resultar tanto no aumento da exsudação causado pelo estresse do calor, como na adequação da temperatura ótima de crescimento para as bactérias (LEIFERT; WOODWARD, 1998; LEIFERT et al., 1994a).

Inicialmente, acreditava-se que somente os microrganismos vitropats permaneciam no estado latente in vitro (HERMAN, 1990a, 1990b). Mais recentemente, descobriu-se que muitos patógenos bacterianos (bactérias que causam doença no habitat natural ou agrícola das plantas in vivo) podem permanecer latentes in vitro (LEIFERT et al., 1994a). Mais significativo é o fato de que Agrobacterium tumefaciens (bactéria fitopatogênica utilizada como vetor para a transformação genética de plantas) pode persistir no estado latente in vitro, mas não provoca doenças quando as plantas são transferidas para as condições in vivo da casa de vegetação (COOKE et al., 1992). Esse fato demonstra claramente o risco potencial de escape para o meio ambiente que os sistemas de vetores baseados em Agrobacterium oferecem, caso o contaminante não seja eliminado e/ou caso as plantas contaminadas não sejam detectadas e descartadas previamente à sua introdução no meio ambiente.

Weller e Leifert (1996) têm chamado a atenção para os possíveis riscos associados com a contaminação das culturas de tecidos vegetais por bactérias patogênicas humanas. Esse fato tem sido confirmado pela inoculação dessas bactérias em culturas de tecidos vegetais in vitro (RAFFERTY et al., 2000). O risco é que tais microrganismos podem infectar os trabalhadores envolvidos na cadeia de produção de plantas micropropagadas (WELLER; LEIFERT, 1996). A propagação autotrófica, que tem sido comparada à micro-hidroponia asséptica, também pode trazer riscos similares (CASSELLS, 2000b).

Eliminação de contaminantes

As principais estratégias para eliminar contaminantes em cultura de tecidos são o uso de termo- ou quimioterapia na planta estoque, desinfestação dos explantes, cultura de meristemas, termo- e quimioterapia in vitro, variação do meio de cultura e, mais recentemente, a aplicação do conceito de ARPCC (CASSELLS, 2000a; HADIDI et al., 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001). A busca de plantas estoques livres de patógenos e contaminantes deve ser a estratégia preferida. Caso essas plantas não estejam disponíveis no comércio ou não sejam produzidas por organizações especializadas, deve-se então lançar mão do uso da termoterapia e quimioterapia da planta estoque e manter essas plantas sob condições de baixo risco de infecção por patógenos (CASSELLS, 1997, 2000b, 2001).

A aplicação de antibióticos (químicos antibacterianos e antivirais) em plantas in vivo tem sido relatada por reduzir contaminantes na região apical das plantas, facilitando o cultivo de meristemas e ápices caulinares em condições assépticas (CASSELLS, 2001). De maneira similar, a termoterapia tem um longo registro de aplicação para esse propósito. O problema é que ambos os tratamentos podem não eliminar completamente o contaminante, mas meramente reduzir o título de contaminantes abaixo do nível de detecção, de modo que o contaminante pode reemergir após o estabelecimento das células e tecidos in vitro. A termo e a quimioterapia in vitro também necessitam ser cuidadosamente aplicadas em virtude de apresentar os mesmos problemas daquela aplicada às plantas estoques. Uma combinação de termoterapia e quimioterapia pode ser necessária para eliminar completamente os contaminantes (CASSELLS, 1998, 2000b). No entanto, as plantas obtidas devem ser rigorosa e apropriadamente indexadas após o tratamento.

No caso das viroses, o químico antiviral ribavirina (Virazole) tem sido efetivo contra uma ampla gama de fitovírus quando incorporado no meio de cultura e algumas vezes combinado com termoterapia in vitro (CASSELLS, 1998). Como a maioria dos antibióticos utilizados em cultura de tecidos, a ribavirina é virostático e não biocida. Como na termoterapia de plantas in vivo e in vitro, é essencial que após o tratamento com ribavirina as plantas estabelecidas in vitro sejam testadas para a presença de vírus em estágio apropriado do desenvolvimento, a fim de garantir que os vírus tenham sido eliminados em vez de suprimidos (LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Investigação da influência dos fatores do meio de cultura e ambientais, incluindo variação nos reguladores de crescimento, acidificação do meio de cultura e culturas autotróficas versus heterotróficas, tem sido feita visando determinar quais fatores que influenciam o título de contaminantes in vitro e estabelecer condições padrões para testes de detecção (CASSELLS, 2001). A acidificação do meio de cultura fornece uma alternativa barata em relação ao uso profilático de antibióticos para determinados sistemas in vitro (LEIFERT et al., 1994b). Entretanto, similar aos tratamentos com antibióticos, o uso curativo da acidificação do meio de cultura pode somente suprimir o crescimento dos contaminantes em vez de eliminá-los completamente. Sayegh e Long (1997) relataram que a transferência de culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendron, Maranta e Cordyline, contaminadas por fungos e bactérias para culturas autotróficas usando um suporte de poliuretano (CASSELLS; WALSH, 1998) permitiu o resgate das culturas contaminadas. Esse fato pode ser atribuído à remoção de carboidratos do meio usado para as culturas autotróficas, nutriente considerado essencial para o rápido crescimento da maioria dos contaminantes.

A cultura de meristemas é, na maioria dos casos, bem sucedida em eliminar muitos fitopatógenos e contaminantes sublimiares (GEORGE, 1993). O problema dessa abordagem é, entretanto, tomar a menor porção apical para garantir a eliminação do patógeno/contaminante sem comprometer a sobrevivência do explante. É recomendado depois cultivar os explantes em meio de expressão bacteriana e testar rigorosamente as culturas estabelecidas antes de embarcar no processo de propagação clonal em massa, visto que as condições de estresse in vitro possivelmente acentuam os mecanismos de resistência vegetal, podendo suprimir o título de contaminantes/patógenos in vitro (CASSELLS, 1991; LEIFERT; CASSELLS, 2001). Consequentemente, uma amostra da produção deverá ser estabelecida e crescida in vivo sempre que possível, a fim de verificar a sua conformidade com os procedimentos padrões já validados.

O sistema ARPCC tem sido a abordagem mais eficaz no gerenciamento da contaminação do que aquelas estratégias baseadas em termoterapia e quimioterapia (LEIFERT; CASSELLS, 2001; LEIFERT et al., 1994a). Mesmo os compostos antifúngicos e antibacterianos de amplo espectro frequentemente falham em eliminar todos os microrganismos alvos, além de apresentarem efeitos colaterais negativos no crescimento e/ou enraizamento de culturas de tecidos vegetais (COSTA et al., 2000; LEIFERT et al., 1991b, 1991c, 1994b; OTONI et al., 2003). O crescimento bacteriano é somente suprimido (efeito bacteriostático) pelos tratamentos antimicrobianos, de modo que as bactérias são capazes de retomarem o seu crescimento após a interrupção do tratamento (BARRETT; CASSELLS, 1994; CASSELLS, 2001; FALKINER, 1990, 1997). Particularmente, as bactérias gram-negativas são de difícil erradicação das culturas de plantas in vitro (LEIFERT et al., 1991b). Nos casos em que o tratamento com antibiótico resultou no sucesso da eliminação dos contaminantes gram-negativos, este foi eficiente somente para determinada proporção das plantas tratadas (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Como resultado, as plantas tiveram que ser individualmente separadas, a fim de evitar a contaminação cruzada por plantas que permaneceram infectadas durante os subcultivos, e testadas regularmente para a presença de contaminantes por pelo menos três meses após o tratamento com antibiótico, visando garantir a ausência de contaminantes latentes (LEIFERT et al., 1991b).

Conforme já mencionado, vários são os relatos encontrados na literatura acerca das falhas de eliminação de Agrobacterium dos tecidos de plantas geneticamente modificadas (BARRETT et al., 1997; HAMMERSCHLAG et al., 2000; MARTIN et al., 1990). Mesmo quando a contaminação não foi detectada por exame visual ou indexagem durante o crescimento em meio suplementado com antibióticos, a Agrobacterium foi encontrada presente e detectada após transferência das plantas para meio livre de antibióticos (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Também foi demonstrado que aproximadamente 50% das plantas ainda continham células bacterianas com o vetor binário, em níveis de 107 unidades formadoras de colônias (ufc) por grama de tecido vegetal, seis meses após a transformação genética (BARRETT et al., 1997). O mesmo resultado tem sido obtido para vários outros contaminantes microbianos (LEIFERT et al., 1991b). Esses dados claramente indicam que a suposta esterilidade do meio de cultura pode ser ineficiente para se detectar números muito baixos de contaminantes bacterianos e/ou bactérias que são inibidas por tratamento com antibióticos. De maneira similar, acredita-se que os métodos de detecção moleculares e/ou sorológicos disponíveis atualmente podem também ser incapazes de detectar contaminantes bacterianos quando o número de células é muito baixo (O’DONNELL, 2000). Como resultado, o risco de escape dos sistemas de vetores baseados em Agrobacterium para o meio ambiente é elevado.

Indução da tolerância à aclimatização e à resistência a doenças em plantas micropropagadas

A micropropagação tem sido extensivamente utilizada para a rápida multiplicação de plantas para a pesquisa e produção comercial de mudas clonais de qualidade. No entanto, essa técnica tem sido limitada pela baixa sobrevivência de algumas espécies durante a fase de aclimatização em decorrência de alterações no crescimento e no desenvolvimento das plantas em consequência de anormalidades anatômicas, fisiológicas e morfológicas impostas pelo ambiente in vitro (KOZAI et al., 1992). As plantas cultivadas in vitro apresentam capacidade fotossintética reduzida, menos depósitos de ceras, mau funcionamento de estômatos, sistema radicular subdesenvolvido e poucas folhas e pelos radiculares (FROMMEL et al., 1991; NOWAK et al., 1995, 1998). A qualidade genética e fitossanitária do material vegetal tem sido cada vez mais um motivo de preocupação, de modo que esforços devem ser feitos para incrementar ambas visando melhorar o desempenho ex vitro das microplantas oriundas da micropropagação ou da transformação genética (CASSELLS, 1997, 2001). O fato de que as microplantas são ou pelo menos deveriam ser assépticas impõe o risco de ataque por patógenos facultativos durante o estabelecimento in vitro, visto que essas representam um nicho para a colonização. Por outro lado, a biotização in vitro apresenta uma oportunidade não somente para bloquear o sítio de ataque dos patógenos, mas também para utilizar os agentes de biocontrole, as bactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) e os fungos micorrízicos arbusculares (MVAs) na proteção contra possíveis estresses e na promoção do crescimento da microplanta (CASSELLS, 2000b).

Os MVAs são provavelmente o principal componente da biomassa microbiana na rizosfera, embora sejam frequentemente ignorados porque aqueles associados com a maioria das plantas cultivadas não crescem quando cultivados em meio artificial no laboratório (CORDIER et al., 2000). Além disso, os MVAs parecem ser um grupo de micróbios de solo muito distinto, pois não satisfazem a definição clássica de microrganismos da rizosfera e/ou rizoplano (CORDIER et al., 2000). De fato, os MVAs não somente desenvolvem-se em toda a rizosfera, como também dentro de raízes (no caso de fungos endomicorrízicos). Eles mudam a morfologia e a fisiologia das raízes, de modo que as relações das plantas com os compartimentos bióticos e abióticos do solo são modificadas profundamente. A importância dos MVAs para o crescimento e a sanidade vegetal tem sido amplamente demonstrada nos últimos anos. Eles formam uma parte integral de muitas plantas cultivadas, influenciando aspectos da fisiologia vegetal, incluindo a absorção de nutrientes minerais (biofertilizantes), produção de hormônios (bioreguladores) e resistência a estresses abióticos e doenças de raízes (bioprotetores) (CORDIER et al., 2000; PERSELLO-CARTIEAUX et al., 2003).

Quatro fatores principais devem ser observados na produção de microplantas micorrizadas: (i) escolha do inóculo, (ii) tempo de inoculação, (iii) composição do substrato e (iv) aplicações químicas (AZCÓN-AGUILAR; BAREA, 1997; LOVATO et al., 1996). Diversos inóculos de MVAs estão atualmente disponíveis no mercado, embora nem todos sejam bem adaptados ao esquema de micropropagação, podendo haver uma enorme variação em suas eficiências (CORDIER et al., 2000). A inoculação ex vitro durante a fase de aclimatização parece ser o momento mais adequado para a introdução dos MVAs. De fato, o estabelecimento da associação micorrízica tem sido decisivo na fase de aclimatização de plantas micropropagadas, proporcionando maior crescimento a várias espécies (AZCÓN-AGUILAR et al., 1992; COSTA, 2003; DECLERCK et al., 2002; ELMESKAOUI et al., 1995; ESTRADA-LUNA; DAVIES, 2003; LINS et al., 2003; MEIRA, 2004; YANO-MELO et al., 1999). Isso é compatível com a presente tendência de junção das fases de aclimatização e enraizamento após a indução inicial da formação de raízes durante a fase in vitro. A composição do substrato e as aplicações químicas são os aspectos mais problemáticos a serem gerenciados, exigindo o desenvolvimento de um conhecimento prático específico para cada microplanta. A inoculação bem sucedida de MVAs tem sido realizada em esquemas de produção pré-comercial de diversas plantas micropropagadas, como videira (MAZZITELLI; SCHUBERT, 1989), café (SOUZA et al., 1991), maçã (BRANZANTI et al., 1992), abacate (VIDAL et al., 1992), kiwi (SCHUBERT et al., 1992) e aspargo (PARENT et al., 1993). Uma excelente revisão acerca da micorrização de plantas micropropagadas pode ser encontrada em Rai (2001).

Assim como os MVAs, o uso de RPCPs na produção de mudas micropropagadas ainda está em sua infância. Os efeitos benéficos das RPCPs sobre mudas micropropagadas são principalmente o aumento da área foliar, do diâmetro do caule, do número de folhas e matéria seca, a redução do período de aclimatização e a maior sobrevivência das mudas após o transplante (MARIANO et al., 2003). A inoculação das RPCPs pode ser efetuada tanto in vitro como ex vitro. Muitos isolados são incapazes de crescer em meio de cultura quando os explantes estão ausentes, formando populações epifíticas e endofíticas apenas quando cocultivados com os tecidos vegetais (FROMMEL et al., 1991; NOWAK et al., 1997; PILLAY; NOWAK, 1997).

Diversos trabalhos têm demonstrado o efeito das RPCPs na proteção contra patógenos. Plântulas de batata cocultivadas in vitro com o isolado PsJN de Pseudomonas sp. não fluorescente foram mais resistentes à infecção causada pelos fungos Verticillium albo-atrum e Rhizoctonia solani do que plântulas não bacterizadas (Tabela 5) (NOWAK et al., 1998). Em ensaios de pareamento in vitro, PsJN não inibiu o crescimento de ambos os fungos, evidenciando uma possível indução de resistência demonstrada pelo aumento do teor de lignina, maior atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) e maior teor de ácidos fenólicos, como cafeico e clorogênico. Em videira, plântulas provenientes de explantes nodais cocultivados in vitro com PsJN foram mais resistentes contra Botrytis cinerea (BARKA et al., 2000). No Brasil, a aplicação dos isolados de bactérias RAB9 (Bacillus sp.), E2 (não identificado) e ENF24 (B. pumillus) em mudas micropropagadas de bananeira durante a fase de aclimatização reduziu significativamente a severidade e o índice de doença causada pela murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. cubense), conforme pode ser visualizado na Tabela 6 (MARIANO et al., 2003).

Tabela 5. Incidência de doença e rendimento de tubérculos de plantas de batata (Solanum tuberosum) bacterizadas e não bacterizadas inoculadas com Rhizoctonia solani.

Cultivar e tratamento

Infecção da raiz

Rendimento de tubérculo

Tamanho de lesão (mm)

Número de lesões

Plantas infectadas (%)

Por planta (g)

Número

‘Kennebec’

Bacterizada

6,3 ± 2,3

2,0 ± 0,8

50

33,5 ± 3,9

3,8 ± 1,2

Não bacterizada

8,5 ± 1,0

5,9 ± 0,7

100

26,7 ± 7,9

2,8 ± 1,1

‘Desirée’

Bacterizada

8,0 ± 2,5

1,4 ± 0,5

60

29,5 ± 4,0

2,6 ± 1,3

Não bacterizada

14,4 ± 3,5

2,1 ± 0,5

80

27,8 ± 4,7

3,6 ± 1,7

Fonte: adaptado de Nowak et al. (1998).

Tabela 6. Efeito de isolados de Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCPs) no biocontrole da murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) em mudas micropropagadas de bananeira (Musa x paradisiaca).

Tratamento

Experimento 1(1)

Experimento 2(2)

Matéria seca (mg)

Severidade

Matéria seca (mg)

Índice de doença

RAB9 (Bacillus sp.)

2.520a

0,00b

190,0a

20b

E2 (não identificado)

2.320a

0,50b

217,5a

15b

ENF24 (B. pumillus)

2.270a

0,75b

192,5a

17b

Controle não bacterizado

230b

4,25a

120,0b

52a

(1) Avaliação aos 60 dias após a inoculação.

(2) Avaliação aos 30 dias após a inoculação.

Médias seguidas por letras distintas diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Fonte: adaptado de Mariano et al. (2003).

Dentre os fatores que podem afetar a eficiência das RPCPs no sistema de micropropagação estão o genótipo da planta, a temperatura, a concentração da suspensão bacteriana, a fonte de carbono no meio e o tipo e mistura de isolados (LAZAROVITS; NOWAK, 1997; MARIANO et al., 2003). O isolado PsJN de Pseudomonas sp. não fluorescente tem sido até agora a mais eficiente RPCP já encontrada (CONN et al., 1997; NOWAK et al., 1999). A mistura com organismos bons colonizadores do sistema vascular pode melhorar a sua estabilidade na planta e garantir a predictibilidade de respostas a estresses ambientais (NOWAK et al., 1998). Entretanto, embora PsJN promova o crescimento de plântulas de batata, tomate, pimentão, cebola e outras hortaliças, o isolado é caracteristicamente genótipo-específico e dependente de temperatura (LAZAROVITS; NOWAK, 1997). A elevação da temperatura estimulou as respostas de crescimento in vitro na maioria dos clones de batata (BENSALIM et al., 1998), mas reduziu em tomate (PILLAY; NOWAK, 1997), havendo diferenças dramáticas entre os genótipos (NOWAK, 1998). Com relação a fonte de carbono do meio de cultura, PsJN bem como outras BPCPs testadas sempre estimulam maior crescimento de raízes em meio contendo sacarose e maior crescimento da parte aérea em meio contendo lactose (NOWAK, 1998). Nowak et al. (1999) observaram que as respostas de plantas bacterizadas foram maiores e mais uniformes na terceira geração (após três subcultivos), indicando que é necessário um período de adaptação do hospedeiro ao inoculante para que a promoção do crescimento seja expressa em sua plenitude.

O estresse oxidativo pode induzir uma cascata de respostas em plantas, protegendo-as contra uma ampla variação de estresses (tolerância cruzada a estresse) (CASSELLS, 2001). Potencialmente, os tecidos vegetais in vitro podem ser expostos a diversos tipos de estresses, incluindo estresse hídrico, salino e de temperatura. Esses estresses podem proteger as plantas de forma cruzada contra patógenos e contaminantes.

Considerações finais

Uma vez que as plantas estabeleceram associações íntimas com os micróbios desde um período muito anciente em sua evolução, de modo que usualmente contenham microrganismos vivos em suas células e tecidos em diferentes tipos de associações, não é de se surpreender que a contaminação microbiana seja um dos problemas mais dramáticos afetando a cultura in vitro de células e tecidos vegetais. De fato, o insucesso em reduzir as perdas por contaminação a níveis aceitáveis tem sido a principal causa da queda constante de produção de plantas micropropagadas pelos laboratórios de micropropagação comercial, observada principalmente na última década. Portanto, uma maior ênfase do que a que tem sido dada até o momento deverá ser investida em relação ao problema da contaminação microbiana de plantas cultivadas in vitro, a fim de garantir que as vantagens do uso da cultura in vitro de células e tecidos vegetais continuem sendo exploradas de forma satisfatória.

Recentes avanços têm sido obtidos nos últimos anos em relação ao conhecimento sobre contaminantes e fontes de contaminação em cultura de tecidos vegetais, novos métodos diagnósticos de contaminantes, sistemas de garantia de qualidade microbiológica, persistência latente, eliminação de contaminantes e indução de resistência a doenças em plantas micropropagadas. A aplicação do sistema ARPCC tem provado ser a melhor estratégia para a prevenção da introdução e distribuição de contaminantes no laboratório. A transferência de culturas contaminadas para condições autotróficas oferece o potencial de conter o problema da contaminação e minimizar as perdas por ela causadas. As plantas podem ser tratadas com antibióticos prévio ao seu cultivo em laboratório (estágio 0) a fim de evitar os contaminantes bacterianos, mas a principal estratégia para a eliminação de bactérias continua sendo a cultura de meristemas, preferivelmente feita em meio de expressão bacteriana.

As vitroplantas representam um nicho potencial para a colonização por contaminantes. A recente ideia de colonizar esse nicho com microrganismos benéficos apresenta vantagens reconhecidas, como melhoria da qualidade das plantas e maior resistência aos estresses bióticos e abióticos. Esses microrganismos podem ser introduzidos tanto in vitro, em estágios iniciais de multiplicação, como ex vitro, durante o período de aclimatização, podendo ser propagados por sucessivas gerações como epifíticas ou endofíticas sem a necessidade de reinoculação. A exposição dos tecidos vegetais a diversos tipos de estresses também é capaz de proteger de forma cruzada as plantas contra patógenos e outros contaminantes.

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Capítulo 2
Prevenção de contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas

Moacir Pasqual

Leonardo Ferreira Dutra

Aparecida Gomes de Araujo

Alba Regina Pereira

Introdução

Contaminações são um dos mais sérios problemas da cultura de células e tecidos de plantas (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Inúmeros trabalhos e revisões têm sido feitos com relação a este assunto, destacando-se os realizados por Leifert (LEIFERT et al., 1989a, 1989b, 1990, 1991a, 1991b, 1992, 1994a, 1994b, 1994c; LEIFERT; WAITES, 1992; LEIFERT; WOODWARD, 1998) e Cassells (CASSELLS, 1988, 1991, 2000; CASSELLS et al., 1988).

Cassells (2001) relata que a principal questão para a maioria que trabalha com micropropagação é, possivelmente, o controle da contaminação no laboratório que é estimada em 10%, em média, mas pode resultar na perda completa de toda a produção.

A assepsia de explantes e esterilização do meio de cultura, vidraria e ambiente de inoculação são condições imprescindíveis em trabalhos de cultura de tecidos vegetais. Qualquer microrganismo que entrar em contato com o meio terá condições de se desenvolver e, como consequência, inviabilizará a cultura.

Há relatos da presença de microrganismos endofíticos em tecidos vegetais em um grande número de espécies de plantas. Fungos, leveduras e bactérias têm sido isolados com maior frequência, e sua presença pode ser identificada logo no início do cultivo. Entretanto, maiores problemas normalmente estão relacionados com contaminações bacterianas, especialmente aquelas que permanecem latentes in vitro, ou seja, não apresentam crescimento visível no meio, nem sintomas nos tecidos nos primeiros subcultivos.

Contaminações podem ocorrer: 1) durante o estabelecimento da cultura, provavelmente causadas por ineficientes desinfestações superficiais do explante; 2) após o estabelecimento in vitro, causadas por microrganismos endógenos ou microrganismos que foram introduzidos durante a inoculação e/ou subcultivos; 3) após longo período de armazenamento pós-esterilização. Contaminantes podem ser introduzidos com o explante, durante as manipulações no laboratório e/ou por vetores (BERGER et al., 1994; LEIFERT et al., 1991a, 1994a).

Bactérias gram-negativas, como Pseudomonas, Erwinia e Agrobacterium spp., são usualmente encontradas quando o procedimento de desinfestação inicial é ineficiente (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Já a presença de espécies gram-positivas indica ineficiente esterilização do meio (Bacillus spp.) ou inadequado treinamento dos operadores em técnicas de assepsia (Staphylococcus spp.). Fungos e leveduras podem ser introduzidos com o explante e/ou durante os estágios in vitro (DANBY et al., 1994 citados por LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Para Leggatt et al. (1988), além da principal fonte de contaminação, uma inadequada esterilização, é possível que contaminantes microbianos sejam introduzidos na cultura com o explante como componente de uma microflora sistêmica natural, a qual sobreviveu à desinfestação superficial.

Tipos de contaminação

A lista de microrganismos descritos como contaminantes em plantas de cultura de tecidos incluem bactérias, fungos, leveduras, vírus, ácaros, tripes e formigas (BLAKE, 1988).

Bactérias

As bactérias constituem o mais comum e problemático tipo de contaminação por microrganismos em cultura de tecidos, porque podem ser sistêmicas e sua detecção muitas vezes é difícil. Numerosos gêneros estão associados com desenvolvimento de plantas in vivo, incluindo os listados a seguir. Os gêneros destacados são encontrados frequentemente em cultura de células in vitro, causando sérios problemas: Acinetobacter, Acetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azotomonas, Bacillus, Bordetella, Cellulomonas, Chromobacterium, Citrobacte, Clavibacter, Cloostridium, Corynebacterium, Curtobacterium, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Klebsiella, Kurthia, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Oerskovia, Propionobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus, Xanthomonas.

Embora alguns gêneros de bactérias possam ser patogênicos, muitos são encontrados no solo como saprófitas, ou nas plantas como flora epífita. No entanto, podem interferir no crescimento in vitro e conduzir a cultura de plantas à morte. Para detectar com precisão a contaminação superficial remanescente, ou contaminação endógena por bactérias, é necessário cultivar explantes em um ou mais meios de cultura que permitam rápido crescimento de microrganismos.

Culturas contaminadas por bactérias apresentam o meio com aspecto turvo. Brotos de algumas plantas desenvolvem pontuações marrons em suas folhas ou na base, onde após serem analisadas sob microscópio, são encontradas contaminações bacterianas (GEORGE, 1993).

Algumas bactérias não se multiplicam ou se multiplicam lentamente em meio de cultura de plantas não formando, portanto, colônias visíveis. Contaminações bacterianas no meio de cultura são mais bem visualizadas por meio de ligeira inclinação dos recipientes.

Embora muitos laboratórios usem somente métodos visuais para detectar a contaminação das culturas, este não é o mais adequado. De acordo com Leifert et al. (1989a), o crescimento visível de contaminantes específicos pode ser reduzido no meio de cultura. Alguns contaminantes, como Methylobacteria, têm estreitas relações bioquímicas com plantas e não crescem independentemente destas. Além disso, segundo Holland e Polacco (1994) e Knauss (1976), bactérias, fungos e outros contaminantes frequentemente persistem como endofíticos em culturas de plantas que visualmente parecem livres de contaminantes.

Na Tabela 1 são relacionados alguns gêneros de bactérias e os gêneros de plantas aos quais estão associados.

Tabela 1. Espécies de bactérias gram-positivas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Gênero/espécie da bactéria

Gênero da planta

Actinomyces spp.

Malus

Bacillus spp.

Gerbera, Hevea, Pteris, Malus, Viola

Bacillus circulans

Begonia, Fragaria, Primula

Bacillus cereus

Fragaria, Begonia

Bacillus polymyxa

Gerbera

Bacillus pumilus

Astibe, Cotinus, Pulmonaria, Primula

Bacillus subtilis

Astilbe, Cotinus, Malus, Hemerocallis

Bordetella branchiseptica

Hevea

Coryneforms

Fragaria, Geranium

Staphylococcus spp.

Hemerocallis, Paeony

Micrococcus varians/roseus

Dephinium, Hosta

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Bactérias têm tradicionalmente sido reveladas por uma série de testes morfológicos e fisiológicos, os quais podem ser suplementados com análises químicas como sorologia e outros usando cromatografia gasosa (STEAD, 1988). Os testes para bactérias específicas, por exemplo, aquelas conhecidas por causarem doenças em plantas, podem ser identificadas usando o teste Elisa (enzime-lynked imunosorbent assay), anticorpos monoclonais, técnicas de hibridação de DNA, dentre outros (LEIFERT et al., 1989b). A identificação de 293 estirpes de bactérias por 2 laboratórios comerciais de micropropagação revelou que 26% eram Staphylococcus, 19% Pseudomonas, 13% Bacillus, 12% Enterobacter ou Erwinia, 11% Lactobacillus, 3% Agrobacterium e 3% espécies de Acinetobacter (LEIFERT et al., 1994a).

Algumas bactérias fitopatogênicas, por exemplo Agrobacterium tumefaciens e Erwinia carotovora, produziram sintomas similares in vivo e in vitro. Na Tabela 2 são relacionadas algumas espécies de bactérias gram-negativas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Tabela 2. Espécies de bactérias gram-negativas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Gênero/espécie da bactéria

Gênero da planta

Acinetobacter calcoaceticus

Fragaria, Astilbe

Alcaliges denitrificans

Iris

Agrobacterium radiobacter

Hevea, Paeony, Gerbera

Enterobacter/Erwinia

Coffea, Fragaria, Gerbera, Prunus

Erwinia carotovora

Iris, Saxifraga, Pteris

Klebsiella oxytoca

Delphinium

Flavobacterium spp.

Fragaria, Gerbera, Hosta

Pseudomonas cepacia

Hevea, Hosta

Pseudomonas putida

Hevea, Gerbera

Xanthomonas spp.

Prunus

Hyphomicrobium spp.

Datura

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Em trabalho realizado por Leifert et al. (1991a), das 240 bactérias isoladas em 12 meses de cultivo de 12 diferentes espécies de plantas, 75% foram gram-positivas e apenas 25% gram-negativas (Tabela 3). Mais da metade das bactérias isoladas foram Staphylococcus, Micrococcus ou espécies de Lactobacillus, as quais são geralmente habitantes da pele ou outros tecidos de humanos e outros animais. Esses mesmos autores citam que as contaminações encontradas em diferentes laboratórios são decorrentes de diversos organismos e/ou fontes, e, assim, distintos métodos para prevenção ou tratamento de contaminações podem ser necessários.

Tabela 3. Contaminações bacterianas isoladas em micropropagação de plantas em dois laboratórios de cultura de tecidos.

Espécie de planta

Tempo de cultivo in vitro dos explantes

1 mês

Mais de 12 meses

No de estirpes

Identificação

No de estirpes

Identificação

Astilbe

–

–

1

B. subtilis

–

–

1

A. calcoaceticus

–

–

1

M. kristinae

Arunchus

–

–

4

B. pumilus

Choisya

3

Agrobacterium radiobacter

21

S. saprophyticus

2

Achromobacter group VD

2

S. epidermidis

2

P. paucimobilis

1

E. aglomerans/Erwinia

1

P. luteola/paucimobilis

1

Micrococcus spp.

Cotinus

–

–

5

B. subtilis

–

–

3

B. pumilus

Delphnium

2

P. fluorescens

25

P. maltophila

3

K. oxytoca

6

P. paucimobilis

1

A. calcoaceticus

2

L. aciddophilus

1

B. subtilis

3

S. epidermidis

–

–

3

S. warneri

–

–

2

Staphilicoccus spp.

–

–

1

M. varians/roseus

–

–

3

Micrococcus spp.

–

P. paucimobilis

29

L. plantarum

–

Rhanella aquatillis

24

Coryneforms

–

–

11

S. epidermidis

–

–

6

E. cloacae

–

–

4

M. kristinae

–

–

2

Staphilococcus spp.

–

–

1

B. subtilis

1

Erwinia/
E. agglomerans

7

Erwinia/E. agglomerans

Hosta

2

P. fluorescens

4

M. kristinae

1

P. paucimobilis

1

M. varians/roseus

–

–

11

Micrococcus spp.

–

–

6

S. epidermidis

–

–

3

A. calcoaceticus

–

–

3

S. warneri ou S. capitis

–

–

1

S. intermedius/epidermidis

–

–

2

P. cepacia ou P. luteola

–

–

1

P. paucimobilis

–

–

1

Flavobacterium spp.

Iris

7

Erwinia carotovora

–

–

2

E. cloacae

–

–

1

R. aquatillis

–

–

1

Alcaligenes denitrificans

–

–

1

Serratia plymuthica

–

–

1

P. fluorescens

–

–

Paeony

5

Agrobacterium radiobacter

2

P. maltophilia

–

–

2

S. capitis

–

–

1

S. warneri

–

–

1

Staphilococcus spp.

–

–

1

Micrococcus spp.

–

–

1

P. diminuta

Pulmonaria

–

–

4

B. pumilis

–

3

Enterobacter spp.

Thalictrum

–

–

–

–

Gerbera

7

P. fluorescens/putida

–

–

2

A. calcoaceticus

–

–

2

Erwinia/
E. agglomerans

–

–

2

Agrobacterium radiobacter

–

–

1

Flavobacterium spp.

–

–

Viola

1

P. fluorescens

8

B. subtilis

1

Erwinia/
E. agglomerans

6

Bacillus spp.

1

Afrobacterium radiobacter

–

–

1

Flavobacterium spp.

–

–

Primula

–

–

6

B. circulans

–

–

2

B. pumilus

Total

58

240

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Os contaminantes endógenos não podem ser eliminados por tratamentos superficiais. Pierik (1988) cita Bacillus licheniformis ou B. subtilis como frequentes causas de infecções ocultas. As contaminações latentes não revelam imediatamente sua presença visível no material de propagação ou no meio de cultivo. A bactéria pode necessitar de condições de adaptação in vitro, ou pode não estar apta a multiplicar-se até a cultura ser transferida para meio favorável para seu crescimento.

Frequentemente infecções latentes podem ser identificadas apenas após a cultura ter sido mantida por vários meses. No entanto, durante esse tempo, podem ter ocorrido transferências para muitos frascos durante os subcultivos, contribuindo dessa forma para a ocorrência de novas contaminações. Por exemplo, a contaminação pode não se mostrar no meio utilizado para proliferação e alongamento de brotos, mas pode aparecer no meio de enraizamento (BOXUS; TERZI, 1987).

Em trabalho cujo objetivo era investigar e identificar fontes de contaminação microbiana de cultura de tecidos de plantas em laboratórios da Nigéria, Odutayo et al. (2007) encontraram 19 contaminantes microbianos, sendo 11 bactérias e 8 fungos. As paredes e prateleiras dos laboratórios acumularam muitos contaminantes e o ar do interior dos laboratórios foi associado com todos os contaminantes encontrados.

Fungos

Os fungos são definidos como organismos aclorofilados, eucarióticos, que geralmente se reproduzem sexuada e assexuadamente por esporos, e cujas estruturas somáticas, ramificadas, normalmente filamentosas, são circuncidadas por parede celular (ALEXOPOULOS et al., 1996). São organismos heterotróficos, necessitando de compostos orgânicos, por exemplo, a glicose, como fonte de carbono e energia. Contaminações fúngicas são facilmente visualizadas em virtude da intensa frutificação dos fungos in vitro.

São os patógenos de plantas mais comuns e habitantes saprófitas no solo. Muitos gêneros de fungos estão associados com plantas, mas esses especialmente notificados como contaminantes em cultura de tecidos incluem espécies de Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Candida, Cladosporium, Curvularia, Chyptococcus, Fusarium, Microsprium, Neurospora, Penicillium, Phialophora, Rhizopus, Rhodotorula dentre outros.

O cultivo in vitro de explantes pequenos usados para iniciar as culturas poderá resultar em contaminações fúngicas logo após estarem aparentemente estabelecidas. Infestações fúngicas geralmente resultam na morte do explante, mas algumas vezes a proteção da cultura pode ser obtida e o crescimento do material cultivado pode continuar. Hörner et al. (2000a), em trabalho visando identificar os agentes contaminantes em explantes micropropagados de erva-mate (Ilex paraguariensis), constataram a presença dos gêneros Alternaria sp. e Colletotrichum sp. como contaminantes fúngicos. Todos os explantes contaminados com fungos morreram e, embora tenha ocorrido contaminação por bactérias, estas não foram limitantes ao desenvolvimento dos explantes. Ainda, de acordo com estes autores, os fungos causam maiores danos em relação às bactérias, pois impedem o desenvolvimento dos explantes e matam-nos, enquanto as bactérias raramente o fazem.

Em trabalho visando avaliar e identificar os fungos contaminantes no estabelecimento in vitro de goiabeira (Psidium guajava), Ramírez-Villalobos et al. (2000) constataram que houve 100% de contaminação das culturas, sendo que os gêneros Cladosporium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp. e Curvularia sp. foram responsáveis por 87,50% dos explantes contaminados, enquanto os fungos Drechslera sp., Fusarium sp., Helminthosporium sp. e Rhizopus sp., por 12%.

O fungo Acremonium coenophialum não ocasionou a morte da cultura de calos de Festuca arundinacea, mas causou uma diferente característica no hábito de crescimento (CONGER; MCDANIEL, 1983). A cultura de calos demonstra ser um método rápido de proteção contra infestações, principalmente naquelas em que os sintomas visualizados na planta adulta, ou os contaminantes detectados por microscopia ou teste Elisa. Os fungos podem crescer como saprófitas no meio de cultura de tecidos, e então o crescimento de hifas pode aparecer no meio ou no explante ou em ambos. O patógeno de plantas Alternaria brassicae pode crescer em cultura de calos de Brassica de forma imperceptível, mas o fungo cresce no meio de cultura como saprófita. Muitos fungos e leveduras contaminantes crescem bem no meio onde estão as plântulas e até mesmo na ausência destas (ENJALRIC et al., 1988).

Leveduras

Leveduras são fungos não filamentosos que habitam a superfície externa de plantas. Embora se suspeitasse que elas poderiam contaminar a cultura de células, sua existência in vitro raramente tem sido admitida. Um mau cheiro quando o frasco com a cultura é aberto é um indício de sua presença (GEORGE, 1993). Torulopsis foi isolado por Boxus e Terzi (1987) quando propagavam diversas espécies em grande quantidade; seis leveduras foram observadas no cultivo de brotos de plantas ornamentais (LEGGATT et al., 1988).

As leveduras Candida e Rhodotorula podem criar um ambiente totalmente desfavorável para o crescimento de plântulas. A contaminação por leveduras resulta na morte dos explantes dentro de um a três subcultivos após sua introdução in vitro (LEIFERT; WAITES, 1990).

Vírus

Há uma variável concentração de vírus nas células de plantas intactas. Muitas viroses não são transmitidas por sementes, e os órgãos reprodutivos não são infectados. Em particular, brotos apicais e meristemas de raízes são passíveis de contaminação muito baixa ou podem, no entanto, serem livres de vírus. Já White (1934) havia notado que o vírus do mosaico do fumo ocorria na ponta das raízes de plantas infectadas de tomate e persistiam na cultura de raízes estabelecidas in vitro.

Mesmo quando os explantes são contaminados durante a excisão, a infecção pode desaparecer em algumas ou todas as células dos tecidos no início de cultivo. O porquê disso ainda não está bem claro. De acordo com George (1993), essa erradicação pode ser em virtude de algumas hipóteses:

• Associação da injúria celular causada por excisão do explante e crescimento do meristema.

• Multiplicação rápida do explante, onde o volume celular aumenta de maneira extremamente rápida, fazendo com que a replicação do vírus não acompanhe o crescimento do vegetal. Isso poderia explicar porque as culturas livres de vírus têm melhores resultados por usarem pequenos meristemas apicais com dimensão aproximada de 0,1 mm de comprimento.

• Componentes do meio de cultura podem inibir a replicação de vírus, onde certos aminoácidos e substâncias reguladoras, particularmente auxinas e citocininas, têm sido mencionadas como responsáveis.

Para ocorrer infecção viral sistêmica, os vírus têm de ter acesso ao sistema vascular da planta. Há várias evidências a favor da hipótese de que o floema funcione como veículo para o transporte do vírus a longas distâncias, enquanto que o transporte célula a célula ocorra via plasmodesmatas (GILBERTSON; LUCAS, 1996).

Provavelmente, todas as espécies propagadas vegetativamente estão infectadas com um ou mais vírus, principalmente os latentes que são difíceis de serem detectados pela sintomatologia visual. Esses patógenos são transmitidos e acumulados em clonagens e/ou plantios sucessivos e se manifestam na planta infectada pela redução do vigor e produtividade das culturas.

Ácaros e tripes

Poucos ácaros e tripes em cultura de tecidos vegetais são identificados. Muitas espécies, como Sideroptes graminis, Stemeotorfomemus palidus ou Trhips tabaci, são conhecidas por serem habitantes ou pragas de plantas in vivo, enquanto outros como Tyrophagus putrescentiae podem estar presentes tanto in vivo como in vitro.

Os ácaros são organismos reconhecidos por terem, ao redor de seu corpo, um único segmento e, usualmente, quatro pares de patas. São pragas muito pequenas (menores que 1 mm de comprimento), que se encontram em todos os ambientes, podendo ser levados pela poeira, insetos e animais (incluindo os humanos). Algumas espécies de ácaros são encontradas na alimentação humana, enquanto outros são parasitas ou saprófitas nos animais.

Normalmente causam pequeno dano para a vida das plântulas; entretanto, levam esporos de fungos e bactérias em seus corpos, entrando na cultura de plantas, sendo fonte de múltiplas contaminações. Frequentemente, a primeira indicação perceptível de sua ocorrência é a presença de fungos no crescimento das culturas. Ácaros que não introduzem fungos, mas apenas bactérias, muito dificilmente são identificados. Em ambos os casos, os ácaros podem ser transferidos frasco a frasco durante os subcultivos do material de propagação.

Os tripes são insetos também muito pequenos (menores que 1 mm de comprimento) e são os mais comuns no crescimento de plantas in vitro. Em geral habitam os brotos apicais de plântulas, causando o amolecimento dos tecidos, e se alimentam da seiva que é exsudada. Os tripes colocam seus ovos apenas abaixo da epiderme das plantas, e uma das causas da contaminação pode ser o estabelecimento de culturas com explantes contaminados.

Como os tripes são insetos muito pequenos, dificilmente são detectados nas culturas infectadas por eles. Reustle et al. (1988) observaram que, na infecção das culturas, as folhas de videira adquiriram brilho metálico na superfície. As espécies de tripes que são reportadas como contaminantes na literatura pertencem aos gêneros Thrips, Allothrips e Frankliniella.

Formigas

As formigas são insetos pequenos que estão presentes em diversos locais, trazendo problemas semelhantes aos provocados pelos tripes e ácaros, ou seja, podem contaminar o ambiente do laboratório com esporos de microrganismos.

Efeito da contaminação microbiana no cultivo in vitro

O elevado grau de contaminação e a localização sistêmica de microrganismos são responsáveis, em alguns casos, pelo insucesso da implantação de culturas in vitro. A contaminação tem prejudicado inclusive a condução de experimentos em função do reduzido número de explantes obtidos (PASQUAL, 2001a). Algumas estratégias, como experimentos com seedlings para conseguir informações que serão utilizadas na propagação vegetativa da planta matriz e maior número de subculturas de material adulto, têm sido adotadas. A contaminação em laboratórios de cultura de tecidos é dependente da espécie de planta a ser trabalhada, das condições ambientais locais, do treinamento dos técnicos e das medidas de assepsia seguidas na rotina laboratorial. É difícil obter com precisão o nível de contaminação em um laboratório que produz em grande escala, em virtude de razões comerciais. No entanto, geralmente os laboratórios admitem que as perdas por contaminações sejam elevadas (GEORGE, 1993).

As perdas podem ser advindas de contaminações na etapa de seleção do explante e sua introdução in vitro, bem como do uso de sistemas precários de autoclavagem. Nas etapas seguintes, perdas também podem ocorrer em função de indevidos procedimentos de subcultivos, como falta de assepsia por parte do manipulador. Após as contaminações estarem estabelecidas in vitro e atingirem grande parte do material vegetal, as perdas podem ser muito elevadas, em alguns casos onerando excessivamente o custo de produção.

Os microrganismos competem com os explantes em espaço, carboidratos (fonte de energia), nutrientes e outros compostos, podendo também liberar no meio de cultivo substâncias tóxicas prejudiciais ao crescimento do material vegetal in vitro. Alguns fungos e leveduras reduzem o pH do meio (< 3), onde ocorre fermentação dos carboidratos, produzindo substâncias fitotóxicas e liberando compostos como etanol e ácido lático.

Esterilização

A esterilização é um procedimento mediante o qual qualquer material torna-se completamente livre de microrganismos contaminantes (fungos, bactérias, leveduras, vírus e micoplasmas).

Segundo Pierik (1990), a esterilização pode ser feita dos seguintes modos: destruição física dos microrganismos por meio de ar seco e quente, vapor ou irradiação (luz ultravioleta ou radiação gama); destruição química dos microrganismos, usando compostos esterilizantes (óxido de etileno, álcool, hipoclorito de cálcio ou sódio, etc.) ou antibióticos; eliminação física dos microrganismos por filtração ou lavagem.

A esterilização está relacionada geralmente ao processo de destruição dos microrganismos mediante métodos físicos, enquanto a desinfecção e a desinfestação se referem ao emprego de métodos químicos.

Esterilização de vidrarias

As vidrarias que serão utilizadas no preparo dos meios de cultura devem, após a lavagem, serem secas ao ar, sobre papel de filtro ou papel absorvente e/ou colocadas em estufa com temperatura regulada de 30 oC a 40 oC e depois guardadas em local protegido, a fim de evitar a deposição de poeira (LAMEIRA et al., 2000).

Estufas a seco são utilizadas para esterilizar vidrarias (placas de Petri, erlenmeyer, Becker, e outros) e instrumentos (pinças, cabos de bisturi, estiletes, e outros). A vidraria a ser esterilizada deve ser envolvida por papel alumínio ou de embrulho e os instrumentos em caixas de alumínio ou tubos com tampa. Geralmente, a temperatura de 150 oC por um período de 3 a 4 horas é suficiente. As vidrarias também podem ser esterilizadas por meio da autoclavagem a 121 oC e pressão 1,05 kg cm-2 por 20 minutos. Outra forma de esterilização mencionada na literatura é a utilização de calor úmido. O emprego de calor úmido requer que os materiais sejam imersos em água à temperatura de 100 ºC de 30 a 60 minutos por três dias consecutivos e devem ser mantidos de preferência em incubadora entre uma exposição e outra (MONTARROYOS, 2000).

A limpeza de frascos e tubos de ensaio consiste na retirada de meio de cultura, lavagem em água corrente e imersão em solução com detergente comercial, por no máximo 24 horas. Após este período, com o auxílio de esponjas e escovas de nylon, o material é lavado e enxaguado em água até remover todo o detergente e, por fim, enxaguado em água destilada e colocado para secar (LAMEIRA et al., 2000). Os detergentes empregados na lavagem devem ser de fácil remoção. Em alguns casos, faz-se necessário o emprego de soluções limpadoras, como o ácido crômico.

Recipientes com meio contaminado devem ser autoclavados durante 20 minutos a 121 ºC, visando à eliminação dos microrganismos antes da abertura dos recipientes, evitando assim a disseminação dos patógenos para o ambiente.

Esterilização dos meios de cultura

A esterilização dos meios nutritivos geralmente acontece em autoclave, menos frequentemente por filtração e raramente por irradiação (PIERIK, 1990).

Autoclave – utilizada para esterilização de meios de cultura, vidrarias, água e outros materiais. Este equipamento é regulado para trabalhar a uma pressão de 1,05 kg cm-2, o que resulta numa temperatura de 121 oC, e pode ser do tipo horizontal ou vertical. O meio preparado pode ser autoclavado em vários lotes de pequenos volumes ou em poucos lotes com volumes maiores. Os meios de cultura de tecidos são geralmente autoclavados a 121 °C por 20 a 30 minutos (PASQUAL, 2001b). Na Tabela 4 constam tempos e temperaturas de autoclavagem indicados para diferentes volumes de meios.

Tabela 4. Tempos e temperaturas de autoclavagem indicados para diferentes volumes de meios.

Volume de meio de cultura (mL)

Tempo e temperatura de autoclavagem

20–50

20 minutos a 121 oC

50–500

25 minutos a 121 oC

500–5.000

35 minutos a 121 oC

Fonte: Pasqual (2001a).

As vantagens da autoclave são velocidade, simplicidade, destruição adicional de vírus e não adsorção (como acontece na esterilização por filtração). As desvantagens são mudanças no pH, algumas reações químicas podem acontecer, levando a uma perda de atividade dos componentes dos meios (PIERIK, 1990). Alguns compostos orgânicos são degradados pelo calor, principalmente aminoácidos, vitaminas e alguns reguladores de crescimento, tais como ácido giberélico e ácido abscísico, colchicina, zeatina, ácido pantotênico, antibióticos, extratos vegetais e enzimas (PASQUAL, 2001b; PIERIK, 1990).

Outras reações também ocorrem durante a autoclavagem, como as entre açúcares e aminoácidos (caramelização) e a hidrólise de sacarose. Essas reações se intensificam com o aumento do tempo de autoclavagem. Assim, é aconselhável manter os meios na autoclave pelo mínimo de tempo necessário para completar a esterilização (CALDAS et al., 1998).

Segundo Pierik (1990), na autoclavagem o pH dos meios diminui de 0,3 a 0,5 unidades; a uma temperatura muito alta há caramelização dos açúcares, podendo produzir toxicidade; um processo muito longo pode conduzir à precipitação de sais e despolimerização do ágar, e as substâncias voláteis podem ser destruídas. Embora a autoclavagem seja o método comum de esterilização de vidraria, meios de cultura e instrumentos, ela torna-se dispendiosa em função do custo do equipamento e do consumo de energia.

Nesse sentido, uma alternativa ao processo de autoclavagem seria a esterilização em forno micro-ondas, possibilidade proposta por Teixeira et al. (2005a, 2005b). Entretanto, os autores comentam sobre a baixa eficiência deste como único método de esterilização. Por outro lado, a eficiência dessa técnica já foi relatada na destruição de bactérias (LATIMER; MATSEN, 1977; ROSASPINA et al., 1993), fungos (KELLER et al., 1988) e esterilização de recipientes plásticos para meio de cultura (SANBORN et al., 1982). Já Tisserat et al. (1992) relatam que, para meios líquidos, esse método não apresenta eficiência total, em virtude da ebulição e do transbordamento do líquido, antes de sua completa esterilização.

Teixeira et al. (2005a), avaliando a possibilidade de combinar várias diluições de hipoclorito de sódio (NaOCl) como esterilizante químico no meio de cultura e posterior esterilização deste em forno micro-ondas, observaram, em um primeiro ensaio, que todas as diluições de NaOCl testadas proporcionaram esterilização completa do meio de cultura, embora tenha ocorrido redução constante do pH (2,8; 2,4; 2,3 e 2,1), respectivamente para as diluições de 0,2%; 0,3%; 0,4% e 0,5% de cloro ativo, além da consequente capacidade de solidificação do ágar. Em outro ensaio, em que as diluições de NaOCl foram menores (0,24%; 0,30%; 0,36% e 0,42%), a redução do pH foi pequena, e o meio de cultura solidificou-se normalmente em todos os tratamentos. Obteve-se esterilização de até 93,3% nas diluições de 0,36% e 0,42% de NaOCl.

Em outro trabalho, estudando-se o uso do forno de micro-ondas na esterilização de frasco de cultura contendo meio de cultura líquido, Teixeira et al. (2005b) verificaram variação de 16% de esterilização, quando o meio de cultura foi previamente inoculado com bactérias não identificadas e preparado com água de torneira, a 87% em meio de cultura sem contaminantes e água deionizada. As melhores taxas de desinfestação foram obtidas quando o meio de cultura foi preparado com água previamente ozonizada (80%); água deionizada, autoclavada e adicionada de 30% de peróxido de hidrogênio/água oxigenada (H2O2) a 100% e água deionizada, autoclavada e adicionada de 0,5% de NaOCl (100%).

Teixeira et al. (2006) avaliaram a esterilização do meio de cultura adicionado de NaOCl e o comportamento de abacaxizeiro cv Smooth cayenne (Ananas comosus) in vitro e registraram que as concentrações foram efetivas, não constatando contaminações a partir de 0,0003% de NaOCl. Os autores ainda relataram efeito benéfico do NaOCl adicionado ao meio de cultura, no crescimento e multiplicação do abacaxizeiro. Resposta benéfica do NaOCl também foi observada em um híbrido de Eucalyptus dunnii x E. benthamii por Brondani et al. (2007), onde maior valor médio do comprimento das brotações foi obtido com 1,27% de cloro ativo na desinfestação dos explantes.

Em trabalho cujo objetivo era comparar o emprego de hipoclorito de sódio e a autoclavagem para esterilização de meios de cultura de tecidos vegetais de Pfaffia glomerata, Eucalyptus pellita, Ananas comosus e Sequoia sempervirens, Ribeiro (2006) concluiu que concentrações superiores a 0,003% de cloro ativo total em meios de cultura semissólidos, submetidos a tratamento de fusão do agente gelificante em forno de micro-ondas, asseguram total esterilização do meio nutritivo. Resultado semelhante foi obtido para meios líquidos, entretanto sem a utilização do forno de micro-ondas. Concentrações entre 0,005% e 0,007% de cloro ativo total no meio de cultura de Eucalyptus pellita estimulam a formação de ramos com maiores comprimentos médios, embora em menor número do que em meio autoclavado; concentrações entre 0,0003% e 0,0005% de cloro ativo total no meio de cultura de Ananas comosus estimulam a formação de maior número de brotações e maior peso de biomassa fresca; concentrações entre 0,003% e 0,004% de cloro ativo total no meio de cultura de Sequoia sempervirens induzem a formação de brotações em maior número, porém com menor comprimento do que em meio autoclavado.

Esterilização a frio – vários reguladores de crescimento podem ser desnaturados por autoclavagem. O grau de degradação de algumas auxinas e citocininas é leve e pode ser ignorado em micropropagação de rotina. Embora alguma degradação das auxinas AIA e AIB tenha sido detectada em meios autoclavados, é possível compensar a perda de atividade, aumentando a concentração destes no meio. Algumas citocininas e auxinas comumente utilizadas são consideradas como sendo termoestáveis. Alguns pesquisadores consideram vantajosa a esterilização por filtro do AIA (ácido indolacético) e cinetina. Harvais (1982 citado por PASQUAL, 2001a), constatou que citocininas e auxinas eram mais ativas em promover a germinação e o crescimento de plântulas de orquídea se fossem esterilizadas em filtros de membrana ao invés de autoclavadas.

No caso do ácido giberélico é sabido que não deve ser autoclavado, pois é hidrolisado por aquecimento em solução e pode se tornar inativo (perda de 90% da reatividade), segundo Pierik (1990). Entretanto, alguns pesquisadores não descreveram perdas significativas de atividade, necessitando assim de pesquisas mais aprofundadas (PASQUAL, 2001a).

Na esterilização por filtração, as soluções, meios líquidos, e outros, atravessam um filtro de membrana, sendo retidas todas as partículas, microrganismos e vírus que são maiores que o diâmetro do poro correspondente do filtro. A vantagem desse método é que as substâncias termolábeis, que se decompõem durante a autoclavagem, podem atravessar o filtro sem sofrer qualquer modificação. As desvantagens podem ser: adsorção de substâncias no filtro, às vezes alguns vírus podem atravessá-lo, o procedimento consome mais tempo e não é tão simples como a autoclave (PIERIK, 1990).

É recomendado um filtro de nitrato ou acetato celulose, com um diâmetro de poro de 0,22 μm. Primeiro os meios são autoclavados em um frasco sem a substância; depois com o meio ainda líquido (aproximadamente de 45 °C a 50 °C), a substância, com ajuda de uma seringa hipodérmica mais um filtro de membrana, é injetada no meio de cultura. Essa operação é feita na câmara de fluxo laminar. A mistura (meio + substância) é distribuída em tubos de ensaio previamente esterilizados. Também é possível filtrar um meio nutritivo já completo, contendo a substância (PIERIK, 1990). Obviamente os componentes do filtro (filtro, agulha, etc.) devem ser esterilizados antes do uso, por meio da autoclave, ou com álcool 96%.

Irradiação – a esterilização de meios nutritivos por irradiação com raios gama quase não é usada em cultivo de tecidos, pois é muito cara se comparada com o procedimento habitual, por autoclavagem. Além disso, a esterilização realizada em autoclave é tão efetiva quanto à esterilização por raios gama, e o crescimento vegetal que se obtém é significativamente menor nos meios esterilizados dessa forma.

Na esterilização de tubos, caixas ou outros recipientes de plástico, onde o uso da autoclave é impossível, quase sempre é usada a esterilização por meio de raios gama. Os meios esterilizados em autoclave são distribuídos nos recipientes estéreis, na câmara de fluxo laminar (PIERIK, 1990).

Estocagem do meio e materiais após a esterilização

A área destinada à estocagem do meio de cultura bem como os materiais autoclavados chama-se sala de transferência, e a mesma deve ser higiênica e livre de microrganismos.

Os meios nutritivos, como também qualquer outro material esterilizado, devem ser armazenados em armários ou caixas metálicas que tenham sido previamente desinfestados com álcool 96% (PIERIK, 1990). O meio de cultivo, depois de esterilizado, deve ser utilizado o mais rápido possível para evitar prováveis contaminações.

Sala de inoculação ou de transferência

Um nível elevado de assepsia é condição obrigatória em qualquer situação, já que fungos e bactérias encontram no meio nutritivo utilizado ambiente apropriado para se desenvolverem rapidamente. Para evitar isso, as culturas são mantidas em recipientes fechados após serem previamente esterilizados. Algumas espécies necessitam de que haja trocas gasosas do interior com o exterior dos recipientes, o que se consegue, normalmente, por meio de um pequeno espaço livre deixado entre a tampa e o recipiente, por onde podem penetrar insetos e também os microrganismos do ar. Isso pode acontecer também durante a introdução dos explantes nos frascos e quando são feitas as transferências do material em um recipiente para um outro contendo meio de cultura novo. Daí surge a importância de um ambiente com características apropriadas, bem como de equipamentos e normas de trabalho que possibilitem a criação de um ambiente externo ao redor do recipiente com elevado nível de assepsia. Essa necessidade torna-se mais importante à medida que aumenta o tamanho do laboratório, pois, com maior demanda das atividades, cresce também o risco de contaminação. Deve-se também limitar a circulação de pessoas nas áreas que exigem maior assepsia.

Além dessas observações, é importante que se façam limpezas frequentes da sala de inoculação usando produtos sanitários para evitar insetos e ácaros. Os técnicos responsáveis pela manipulação de plântulas in vitro devem higienizar os antebraços e mãos com álcool 70% e retirar todo tipo de material pessoal, como anéis, colares, e prender os cabelos, quando necessário.

Câmara de fluxo laminar

A câmara de fluxo laminar é um equipamento que força a passagem do ar por meio de um filtro bacteriológico, de modo que seja criado um ambiente estéril com pressão positiva, evitando a entrada de ar externo contaminado. Após borrifar álcool a 70% na câmara, deve-se, com auxílio de uma gaze, espalhar o álcool para que ocorra perfeita descontaminação. Dependendo da região, como em locais de alta umidade relativa, é aconselhável repetir a operação por mais uma vez. É importante ressaltar que em todas as etapas antes da inoculação do material vegetal é de crucial importância uma assepsia criteriosa, visto que após os microrganismos se instalarem in vitro, o controle torna-se oneroso podendo o laboratório ou biofábrica ter grandes prejuízos.

Portanto, após a câmara de fluxo laminar estar desinfestada, os frascos ou tubos com o material vegetal, bem como todos os utensílios, devem ser borrifados com álcool 70% para depois serem colocados no interior da câmara.

Quando a câmara de fluxo possui luz ultravioleta (germicida), esta deve ser ligada 15 minutos antes de iniciar os trabalhos, devendo tomar cuidado para evitar lesões nos olhos e pele. Durante o período em que a luz estiver ligada, deve-se evitar entrar na sala de manipulação. Além da câmara de fluxo laminar, a área de manipulação asséptica deve possuir esterilizadores de esfera de vidro, bicos de Bunsen ou lamparinas para a esterilização dos instrumentos durante o trabalho. Essa sala deve ser mantida sempre fechada e com entrada restrita (LAMEIRA et al., 2000).

Quanto mais próximo da saída de ar da câmara, mais certificada está a qualidade do ar. Alguns autores mencionam que os primeiros 10% da câmara, de fora para dentro, embora desinfestados, podem contaminar os utensílios. Portanto recomenda-se colocar os materiais o mais dentro possível da câmara.

O uso de máscaras é obrigatório, visto que a respiração pode liberar vírus e outros contaminantes. Pinças e bisturis devem ser flambados em álcool 95% constantemente. Embora alguns autores relatem que a chama produzida pelo álcool não seja muito quente, o uso do aparelho esterilizador se mostra eficiente, principalmente em locais de alta umidade relativa. Diversos laboratórios mantêm as fitas de parafilme acopladas dentro da câmara de fluxo laminar para selar os frascos e tubos de ensaio com a finalidade de reduzir o risco de contaminação.

Sempre que se retirar as mãos da câmara, ao retorná-las deve-se borrifar novamente álcool 70% nas mãos e antebraços. Além disso, deve-se manter o corpo corretamente apoiado na cadeira, evitando introduzir a cabeça dentro da câmara.

Em trabalho cujo objetivo era avaliar e caracterizar os níveis de contaminação microbiana em diferentes ambientes de um laboratório de cultura de tecidos, Oliveira et al. (2007) verificaram que a câmara de fluxo laminar ligada constitui-se em ambiente completamente asséptico. Em contrapartida, as maiores taxas de contaminação fúngica foram observadas na sala de preparo de material vegetal e nas salas de lavagem e de preparo de meio. Já maiores taxas de contaminação bacteriana foram observadas na sala de preparo de meio de cultura.

De acordo com Dantas et al. (2002a), a avaliação periódica da eficiência das câmaras de fluxo laminar e troca de filtros dentro dos prazos de validade devem ser realizadas. Esses cuidados são importantes para garantia de efetividade do equipamento.

Sala de crescimento

É o local destinado à permanência das culturas após a inoculação. As condições de temperatura, umidade e luminosidade são controladas, e as condições de assepsia devem ser rigorosamente mantidas. Estas condições podem ser obtidas por meio de salas aclimatizadas, controlando-se a temperatura com ar condicionado e fornecimento de luz por lâmpadas fluorescentes brancas-frias (comum) e/ou grow-lux (especial). O sistema de refrigeração precisa controlar a temperatura para que permaneça entre 30 °C e 15 °C. Essa sala deve possuir estantes metálicas para apoio dos frascos, onde são instaladas lâmpadas na parte inferior da prateleira, distanciadas de 40 cm a 50 cm entre si.

Dependendo do mecanismo de regeneração da planta e da espécie, em alguns casos é necessária a incubação de culturas no escuro, por meio do uso de câmara do tipo Biosystem Organized Development (BOD), ou de salas aclimatizadas na ausência de luz, além das culturas de células em suspensão, que deve ser feita sob agitação. Os agitadores devem estar instalados dentro da sala climatizada.

É expressamente proibida a entrada de pessoas estranhas a esse local, ficando restrita apenas aos técnicos e funcionários do laboratório. Todos esses cuidados são empregados, visto que as vestimentas das pessoas podem levar esporos de microrganismos, ácaros e insetos e contaminar a sala.

Descarte de material senescente e contaminado

Todo material contaminado e senescente deve ser conduzido para uma sala denominada sala de descarte, onde o material é novamente autoclavado a 121 ºC por 20 minutos para que os recipientes possam ser abertos e lavados.

Alimentação no laboratório

O laboratório é um ambiente asséptico, e resíduos de alimentos como bolachas, pães e outros são iscas para o surgimento de insetos que trazem consigo esporos de microrganismos. A proibição estende-se aos cigarros e a bebidas em geral.

Os laboratórios, de maneira geral, possuem procedimentos considerados padrões e que necessitam ser seguidos para um bom andamento das atividades. Existem referências que abrangem amplamente esse assunto (BARKER, 2002; HIRATA; MANCINI FILHO, 2002).

Limpeza nos compartimentos do laboratório

Todas as repartições do laboratório devem ser bem organizadas. Deve-se evitar entulhos, o que favorece acomodação de insetos e ácaros, e realizar limpezas e desinfestações constantes. Muitos laboratórios realizam fumigação no laboratório, anualmente, para certificar-se da assepsia.

Permanência no laboratório

Muitos laboratórios comerciais adotam como critério o uso de únicas vestimentas para os técnicos e funcionários. Assim, ao chegarem, se dirigem ao vestuário e colocam a roupa e calçados destinados ao uso diário no laboratório. Esse procedimento evita a entrada de contaminações por esporos, ácaros e insetos. Posteriormente, as mãos e antebraços são lavados com sabão bactericida. Os operadores, ao se dirigirem para a sala de crescimento, passam antes por um local chamado pedilúvio, onde os sapatos são desinfestados em cal e outros germicidas.

Flambagem dos instrumentos

A flambagem dos instrumentos (bisturis e pinças) de uso no laboratório tem a única finalidade de eliminar o álcool, responsável pela desinfestação. O álcool 95% é usado para flambagem, já o álcool 70% é usado para pulverizar mãos e mesa da câmara.

Todos os instrumentos são flambados após imersão em etanol absoluto e devem ser utilizados somente quando estiverem frios. Para evitar o uso de instrumentos ainda quentes, é interessante utilizar mais de um conjunto de instrumentos. Lâminas limpas, livres de resíduos e oxidações são indispensáveis (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Muito tempo de exposição ao fogo da lamparina ou bico de Bunsen durante a flambagem pode destemperar os instrumentos.

A troca frequente do álcool de flambagem e dos respectivos recipientes é uma das medidas preventivas tomadas durante as repicagens para se evitar a contaminação.

Uma alternativa ao uso da flambagem é a utilização de esterilizador elétrico para instrumentos de laboratório, como pinças, agulhas, espátulas, alças e outros. É manuseado no interior de câmaras de fluxo laminar e elimina riscos decorrentes da queima de combustíveis líquidos (GLP ou outros) no laboratório. Conectado à rede de alimentação elétrica, atinge até 800 °C e o instrumento a ser esterilizado poderá ser retirado alguns segundos após sua introdução na câmara de esterilização.

Cuidados especiais com a planta matriz

Plantas matrizes ou plantas-mãe são aquelas destinadas a fornecer os explantes primários, que serão estabelecidos no cultivo in vitro. Em virtude da grande influência das características destas plantas sobre o estabelecimento e o crescimento in vitro, é muito importante considerar alguns aspectos, incluindo a sua condição fisiológica, qualidade genética e fitossanitária.

A condição fitossanitária da planta matriz é de grande valor, pois determinará a facilidade em descontaminar o explante durante o isolamento. Apesar de se realizar uma desinfestação dos explantes, diversos microrganismos de natureza endógena não são expostos aos agentes desinfestantes e devem ser controlados já na planta matriz (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Frequentemente plantas matrizes são rejeitadas por apresentarem doenças, sejam elas causadas por fungos, bactérias, vírus ou outros organismos. Tais problemas fitossanitários afetam não somente a introdução do material in vitro como também a qualidade final da muda (PASQUAL, 2001b).

Seleção de explantes

Os melhores explantes são obtidos a partir de plantas matrizes sadias, vigorosas, isentas de qualquer tipo de estresse e em pleno crescimento vegetativo. A planta matriz selecionada para fornecer os explantes deve estar nutricionalmente equilibrada, pois favorece seu crescimento vegetativo e facilita a retirada do material propagativo. Nos casos específicos de adubações de plantas matrizes, devem-se fazer análises tanto do solo como de folhas para obtenção de melhores resultados (PASQUAL, 2001b).

Ao proceder a retirada de explantes da planta matriz e conduzi-los ao laboratório, faz-se necessário avaliar o estado fitossanitário da planta, eliminando, assim, partes vegetais ou plantas inteiras com sintomas de doenças e/ou ataque de pragas.

Conforme Grattapaglia e Machado (1998), a retirada de explantes deve ser feita de preferência a partir de brotações novas que são formadas durante a fase ativa de crescimento da planta, após o final do período de dormência, durante os meses mais quentes do ano (primavera e verão). Essa recomendação está de acordo com os resultados obtidos por Mroginski et al. (1997) e Bernasconi et al. (1998) com erva-mate. Os autores relataram que os melhores resultados de estabelecimento foram obtidos com explantes coletados nas épocas mais quentes do ano no hemisfério sul (janeiro, fevereiro e março), e que nos meses mais frios (julho e agosto) a taxa de estabelecimento foi nula.

Em contrapartida, resultado divergente foi obtido também com erva-mate por Rosa et al. (2006), em que o mês de agosto (inverno) foi o mais adequado para extração e estabelecimento de segmentos nodais com uma taxa de 57% de indivíduos sadios. Hörner et al. (2000a), testando os meses de março, abril e setembro para inoculação de explantes de erva-mate, constataram que em abril obtiveram-se maior porcentagem de explantes não contaminados. Buzkan et al. (1997) testaram a primavera, o verão e o outono para coleta de gemas terminais e axilares de cerejeira doce (Prunus fruticosa x Prunus avium), visando ao isolamento de meristemas, e verificaram que a contaminação bacteriana foi maior em explantes coletados no verão.

Geralmente são utilizados explantes coletados de regiões meristemáticas juvenis. Diversas práticas horticulturais são adotadas para se obter brotações juvenis ou promover o rejuvenescimento de tecidos adultos (FRANCLET, 1987). A mais comum é a poda drástica, quebrando a dominância apical e estimulando o desenvolvimento das gemas, que ainda mantêm a condição juvenil, na porção inferior da planta mais próxima da raiz.

Durante a coleta dos materiais que darão origem aos explantes, deve ser mantido o maior nível de assepsia possível, utilizando-se instrumentos limpos ou até esterilizados, como tesouras, pinças, bisturis.

No caso de plantas doentes, deve-se procurar coletar explantes de tamanho bem reduzido. A dificuldade maior nessa etapa reside em se obter material vegetal descontaminado, sem, no entanto, conduzi-lo à morte quando isolado (PASQUAL, 2001b).

Manutenção no campo

Quando a planta é mantida em ambiente externo, fica exposta a todo tipo de intempéries e insetos que provocam ferimentos, permitindo a entrada de microrganismos patogênicos.

O tratamento com fungicidas, bactericidas e inseticidas é uma das técnicas mais utilizadas no condicionamento de plantas matrizes, pois permite a redução da carga de patógenos sobre a planta e, futuramente, sobre os explantes, diminuindo a contaminação quando do estabelecimento in vitro. Recomendam-se aplicações quinzenais de fungicidas sistêmicos, de amplo espectro, principalmente nos dias anteriores à coleta do explante. Têm sido bastante eficaz, para determinadas espécies, pulverizações com o fungicida mais inseticida granulado sistêmico à base de disulfoton mais triadimenol de acordo com a recomendação do fabricante.

Em trabalho de Hörner et al. (2000b), mudas de erva-mate, de um ano de idade, mantidas em viveiro, foram pré-tratadas com cinco pulverizações alternadas, em intervalos quinzenais, de mancozeb (2 g L-1) e benomyl (1 g L-1). Decorridos 20 dias da última pulverização, segmentos nodais foram coletados, desinfestados com álcool 70% e hipoclorito de sódio por 15 minutos e inoculados em meio de cultura contendo combinações de benomyl (0 mg L-1, 1 mg L-1, 5 mg L-1 e 10 mg L-1) e rifampicina (0 mg L-1, 10 mg L-1, 25 mg L-1 e 50 mg L-1). Os autores concluíram que os pré-tratamentos foram eficientes no controle das contaminações, pois não houve diferença entre as combinações de fungicida e bactericida adicionados ao meio de cultura.

Erig e Fortes (2002), visando ao estabelecimento in vitro de pereira (Pyrus spp.), pulverizaram plantas matrizes mantidas no campo com o antibiótico Agrimicina (Oxitetraciclina e Sulfato de Estreptomicina) e o fungicida Dithane (Mancozeb) 10 dias antes da coleta dos explantes. Durante o cultivo, os autores constataram contaminações bacterianas de 45,7% em gemas e 18,8% em meristemas, enquanto a contaminação fúngica chegou até 11,5%. Também constataram diferenças de contaminação bacteriana entre cultivares, com 17,7%, 13,5% e 5,1% para Garber, Smith e Carrick, respectivamente.

Plantas matrizes de pereira conduzidas no campo e pulverizadas de maneira intercalada a cada dois dias, duas semanas antes da coleta dos ramos, com benomyl (1 mg L-1) e Agrimicina (2,4 mg L-1), forneceram gemas e meristemas para introdução in vitro (DANTAS et al., 2002b). As contaminações foram nulas em algumas cultivares quando utilizaram meristemas, chegando no máximo a 3,3%, enquanto que percentuais de 73,5% a 95,7% de contaminação ocorreram quando os explantes foram gemas.

Em extenso trabalho, Pence (2005) coletou 85 espécies de área tropical e 49 de área temperada, visando comparar os sítios de coleta e a necessidade da utilização de agentes antimicrobianos nos subsequentes níveis de contaminação nas culturas. Os percentuais de contaminação dos explantes coletados em área temperada foram menores do que em área tropical; entretanto, os fungos de áreas tropicais foram, de maneira geral, mais responsivos à adição do Benlate do que os fungos de explantes coletados em áreas temperadas. A adição do fungicida Benlate e dos antibióticos Cefotaxima e Vancomicina, em determinados explantes, reduziram a contaminação.

Por outro lado, Ramírez-Villalobos et al. (2002), embora tendo coletado explantes de matrizes de Annona muricata conduzidas no campo e sem nenhum tratamento fitossanitário, obtiveram altas taxas de estabelecimento quando a desinfestação foi realizada com hipoclorito de sódio a 1% por 5 ou 10 minutos.

Outra prática indicada para planta matriz em campo, assim como em casa de vegetação, é a poda, que facilita o controle fitossanitário, pois permite a retirada de ramos atacados por pragas e doenças.

A nutrição mineral adequada da planta matriz é de fundamental importância, pois diminui as chances de ataques de pragas e doenças. Recomenda-se fazer análise de solo e análise foliar e corrigir as deficiências nutricionais da planta matriz quando necessário.

Explantes extraídos de plantas mais novas apresentam menores índices de contaminação (PASQUAL, 2001b). Porém, quando as plantas são mais velhas, faz-se uso de podas para proporcionar o rejuvenescimento da planta e pode-se fazer uma cobertura desses ramos podados com sacos plásticos ou papel impermeabilizado, recuperando, em seguida, brotações novas que se desenvolveram dentro do ambiente protegido.

Manutenção em casa de vegetação

A manutenção da planta matriz em ambiente mais limpo, como uma casa de vegetação ou câmara de crescimento, é uma forma de reduzir ao máximo os estresses e a contaminação quando do estabelecimento in vitro, além de permitir a brotação mais intensa e, consequentemente, o aumento do rendimento de explantes por planta matriz.

A manutenção da planta matriz em casa de vegetação permite ainda o controle de insetos e microrganismos mediante a aplicação de fungicidas, inseticidas e bactericidas. Têm sido bastante eficazes, em diversas espécies, irrigação e pulverização com soluções de agentes sistêmicos, como o benomyl (solução 0,2%) e terramicina (oxitetraciclina) com sulfato de estreptomicina (Agrimicina solução 0,1%), alternados com fungicidas não sistêmicos com princípios ativos diferentes (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

As aplicações de fungicidas, bactericidas e inseticidas devem seguir um cronograma bastante rígido, e a coleta de explantes deve ser realizada, preferencialmente, de 24 a 48 horas após a última aplicação do produto. O controle de ácaros e pulgões é muito importante, e inspeções constantes devem ser realizadas.

Recomenda-se utilizar casas de vegetação sem nebulização e sem irrigação por aspersão, pois esse tipo de irrigação aumenta a contaminação da planta matriz. A irrigação, nesse caso, deve ser feita direta e unicamente no substrato, mantendo a planta adequadamente irrigada.

A manutenção das plantas matrizes em substrato esterilizado (fumigado ou autoclavado), em vasos sem contato direto com o solo, de preferência sobre bancadas, é outra medida preventiva indicada para condicionamento dessas plantas.

Quando se trata de uma planta arbórea ou arbustiva em campo, utiliza-se a enxertia ou estaquia ou ainda qualquer outro método que permita trazer esse indivíduo para ambiente controlado (PASQUAL, 2001b).

De acordo com Mroginski et al. (1997), o êxito do estabelecimento in vitro dos explantes depende inicialmente da fonte de onde foram retirados. Explantes de erva-mate proveniente diretamente das plantas matrizes adultas conduzidas no campo, na sua totalidade oxidam ou são contaminados com bactérias e/ou fungos. Entretanto, quando os explantes são oriundos de matrizes cultivadas em casa de vegetação, obtidas do enraizamento de estacas, percentuais de brotação de 75% são obtidos. Tal comportamento foi comprovado em trabalhos anteriores (MROGINSKI et al., 1996; REY; MROGINSKI, 1988).

Em mamoeiro, as plantas doadoras de explantes são obtidas em condições de casa de vegetação, apresentando menor contaminação fúngica e bacteriana em relação àquelas cultivadas no campo (VIANNA et al., 1997). Uma taxa de 95% de contaminação microbiana foi observada em explantes de mamoeiro provenientes de plantas do campo, mesmo após a descontaminação (LITZ; CONOVER, 1977, 1978).

De plantas matrizes de mirtilo (Vaccinium ashei Reade) com 1,5 ano, mantidas em casa de vegetação, Silva et al. (2008) coletaram segmentos nodais de ramos herbáceos e lenhosos. Esses foram desinfestados por imersão em álcool 70% por 10 segundos e em hipoclorito de sódio a 2,5% adicionado de 2 gotas de Tween 20, durante 10 minutos, seguida de três lavagens com água autoclavada. Após a inoculação, os explantes permaneceram no escuro por sete dias e posteriormente levados para sala de crescimento. Os autores observaram que os explantes de ramos herbáceos apresentaram menor contaminação fúngica e bacteriana respectivamente (0,16% e 8,16%) do que as de ramos lenhosos (18,05% e 29,03%).

No estabelecimento in vitro de macieira, Erig e Schuch (2003) realizaram experimentos visando definir metodologia para o controle de contaminação. As plantas matrizes, das quais foram retiradas os explantes, foram mantidas em casa de vegetação e pulverizadas semanalmente com agrimicina (oxitetraciclina e sulfato de estreptomicina) e dithane (mancozeb) a 2,4 e 1,0 g L-1, respectivamente. Obtiveram-se altas percentagens de sobrevivência dos explantes em função da efetividade da desinfestação proporcionada pelo hipoclorito de sódio.

Erig e Schuch (2005), em trabalho visando estabelecer in vitro o mirtilo cv. Flórida, coletaram segmentos nodais obtidos de brotações novas de mudas mantidas em casa de vegetação. As mudas foram pulverizadas semanalmente 45 dias antes da coleta das brotações com 2,4 g L-1 de agrimicina (oxitetraciclina e sulfato estreptomicina) e 0,7 g L-1 e 3 g L-1 dos fungicidas cercobin (tiofanato metílico) e kumulus (enxofre), respectivamente. Após coletados, os explantes foram desinfestados com álcool 70% e hipoclorito de sódio (2%–2,5%). A contaminação bacteriana dos explantes foi nula, enquanto a fúngica foi de apenas 1,36%, o que foi atribuído à manutenção das plantas matrizes em ambiente limpo e protegido e à sua pulverização prévia com antibiótico e fungicidas. Em contraste a este resultado, Gonzales et al. (2000) constataram a ocorrência de 50% de contaminação quando utilizaram explantes oriundos de brotações de plantas matrizes mantidas no campo.

Explantes de oliveira (Olea europaea), retirados de plantas matrizes mantidas em casa de vegetação e desinfestados conforme o protocolo padrão (álcool 70% por 30 segundos e hipoclorito de sódio a 2,5% do princípio ativo), tiveram contaminação bacteriana nula e fúngica de 1,66%. A manutenção das plantas em ambiente protegido e pulverizações com agrimicina (estreptomicina) a 2,4 g L-1 e cercobin (tiofanato metílico) a 0,7 g L-1 foram determinantes para o resultado encontrado (DONINI et al., 2008).

Horbach (2008), com o objetivo de estabelecer segmentos nodais de erva-mate in vitro, manteve mudas oriundas de cepas de plantas, com aproximadamente 10 anos de idade, em casa de vegetação. Antes da coleta dos explantes, as mudas foram submetidas à aplicação diária de Captan® (2 mL L-1) e Cercobin® (1,5 g L-1), durante 5 dias. Os explantes foram desinfestados com álcool 70% por 2 ou 4 minutos e NaOCl a 2% durante 15, 25 ou 35 minutos. A maior taxa de sobrevivência (42,5%) foi obtida com imersão dos explantes em álcool 70% por 4 minutos e em NaOCl por 25 minutos. Mesmo com a manutenção das mudas em ambiente protegido e tratamento com fungicidas, foram observadas médias de contaminação fúngica e bacteriana de 42,5% e 27,1%, respectivamente. Entretanto, a erva-mate é reconhecidamente uma espécie muito difícil de ser introduzida in vitro, não tendo, por isso, até o momento, nenhum protocolo de micropropagação estabelecido.

Desinfestação inicial de sementes e explantes

Os pré-tratamentos aplicados na planta matriz são de fundamental importância nessa etapa de desinfestação de sementes e explantes, principalmente no que se refere aos microrganismos endógenos. Geralmente, na descontaminação dos tecidos, os mesmos são levados à morte quando isolados, sendo a maior dificuldade nesta etapa.

Conforme Pasqual (2001b), para a desinfestação na fase de assepsia dos propágulos, que antecede a remoção dos explantes, deve-se tomar alguns cuidados:

– Remoção de partes atacadas: remoção de folhas e partes danificadas, eliminação de pelos (tecido muito pubescente é mais sujeito a contaminação).

– O material coletado, principalmente se for proveniente do campo, pode ser mantido em água corrente por algumas horas para lavagem superficial de partículas de poeira e outras fontes de contaminação superficial.

Quando o material a ser desinfestado apresenta superfícies muito irregulares, como reentrâncias em tegumentos de sementes ou grande quantidade de pêlos superficiais, algumas medidas podem ser tomadas para permitir uma completa exposição dos tecidos e a não formação de bolhas de ar ao longo do material. Durante a imersão nas soluções, pode-se promover a agitação com agitadores horizontais ou magnéticos.

Várias substâncias com ação germicida (Tabela 5) podem ser utilizadas para a desinfestação dos explantes. As mais comuns são o etanol e os compostos à base de cloro como o hipoclorito de sódio (0,5% a 2%) e de cálcio. Algumas gotas de detergente são comumente adicionadas às soluções à base de cloro para melhorar o contato destas com os tecidos. Um espalhante adesivo é utilizado, a exemplo do Tween 20 (1 gota/100 mL a 2 gotas/100 mL) que aumenta a penetração da solução no tecido. O uso de vácuo à solução aumenta a dilatação dos poros do propágulo, facilitando a penetração da solução desinfestante (PASQUAL, 2001b).

Tabela 5. Características de alguns desinfestantes utilizados na cultura de tecidos.

Desinfestante

Concentração (%)

Facilidade de remoção

Tempo (minutos)

Eficiência

Hipoclorito Ca

9–10

+++

5–30

Alta

Hipoclorito Na

0,5–2

+++

5–30

Alta

H2O2

10–12

+++++

5–15

Boa

Br2. H2O

1–2

+++

2–10

Alta

Nitrato Ag

1

+

5–30

Boa

HgCl2

1

+

2–30

Satisfatória

Fonte: Pasqual (2001a).

Protocolo para desinfestação de sementes e explantes

A persistente contaminação dos tecidos por bactérias é problema sério, considerando que tratamentos sucessivos com solução de hipoclorito de sódio ou outro desinfestante qualquer são mais prejudiciais ao tecido do que à bactéria. O processo de desinfestação deve ser realizado em câmara de fluxo laminar em condições assépticas, utilizando vidraria previamente esterilizada (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Após a desinfestação, seguem-se a lavagens sucessivas com água destilada ou deionizada e autoclavada, geralmente de 3 a 5. A seguir, o explante é colocado no meio de cultura sendo levado posteriormente para sala de crescimento.

Podem-se utilizar fungicidas e antibióticos para controle de bactérias durante a desinfestação, ou incorporá-los ao meio nutritivo de isolamento (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Deve-se procurar um fungicida que apresente amplo espectro de ação e seja pouco tóxico às culturas nas concentrações necessárias para controlar fungos.

Sato et al. (2001), estudando metodologias de estabelecimento in vitro do Celtis sp., realizaram experimentos visando à redução de contaminação por microrganismos, mantendo segmentos nodais sob efeito de lavagens em água e gemas apicais e laterais tratadas com diferentes concentrações de Benlate®. As lavagens em água favoreceram a disseminação de fungos, enquanto o Benlate®, na concentração de 200 mg L-1, inibiu o crescimento de fungos sem causar fitotoxidez aos explantes. Santos et al. (2003), visando ao controle de contaminação bacteriana em Prunus sp. in vitro, utilizaram peróxido de hidrogênio (água oxigenada) em segmentos nodais. Explantes contaminados com bactérias foram tratados com solução de peróxido de hidrogênio nas concentrações 0%, 10%, 20% e 30%, durante 0, 5, 10 e 15 minutos. Em todas as avaliações o uso de solução a 30% de peróxido de hidrogênio por 5 minutos eliminou 100% da contaminação bacteriana.

Na otimização da micropropagação de Pfaffia tuberosa (ginseng brasileiro), Flores et al. (2006) inicialmente trataram brotos de plantas jovens mantidas em recipientes no laboratório com benomyl a 0,1%. Posteriormente, os brotos foram submetidos a uma sequência de seis etapas realizadas sucessivamente: 1) lavagem em água com detergente comercial (2 gotas 100 mL-1) durante 2 minutos; 2) imersão em solução de álcool 70% por 10 segundos; 3) imersão em solução de hipoclorito de sódio a 1% acrescido de detergente (2 gotas 100 mL-1) por 10 minutos; 4) três lavagens em água; 5) imersão em solução de bicloreto de mercúrio (HgCl2) a 0,1% por cinco minutos; 6) seis lavagens consecutivas em água. De acordo com os autores, a metodologia de desinfestação foi efetiva, em função da ausência de contaminações fúngicas ou bacterianas, embora 38,5% dos explantes tenham mostrado sintomas de toxidez na porção basal ou aérea, o que foi atribuído ao uso do HgCl2, sem, contudo, comprometer o desenvolvimento das plantas. Em contrapartida, Nicoloso et al. (2001) verificaram que a desinfestação de explantes de Pfaffia glomerata com solução de HgCl2 pode interferir no crescimento de brotos e raízes.

Nietsche et al. (2006) testaram dois protocolos de desinfestação em explantes de três cultivares de bananeira, um por imersão em solução de Carbendazim (Derosol p.a.) a 3,3% por 20 minutos, em álcool comercial (92,8%) por 1 minuto e agitação em solução de hipoclorito de sódio a 2% por 20 minutos. No outro procedimento, os explantes foram inicialmente lavados com água destilada adicionada de 2% de detergente, posteriormente imersos em solução de Derosol a 6,6% por 20 minutos, em álcool 70% por 5 minutos e hipoclorito de cálcio a 2% sob agitação por 25 minutos adicionado de três gotas de tween 20 L-1 de solução. Os autores constataram que não houve diferença significativa entre os dois procedimentos de desinfestação.

Em trabalho com estabelecimento in vitro de mamoeiro, constatou-se que a escarificação mecânica das sementes, seguida de imersão por 10 minutos em ácido sulfúrico (H2SO4), mais 10 minutos em solução de álcool 70% mais 23 gotas de tween 80, 20 minutos em hipoclorito de cálcio (CaOCl) a 20%, cinco lavagens com água estéril e armazenamento por 19 dias em freezer, proporcionou a menor taxa de contaminação (20,7%). Nos demais tratamentos, o percentual de contaminação variou de 46,6% a 100%. Borges et al. (2006) ressaltaram que a utilização de hipoclorito de cálcio, em detrimento do hipoclorito de sódio, diminuiu as taxas de contaminação e oxidação.

Sementes de jabuticabeira (Myrciaria spp.) foram eficientemente desinfestadas com 5% de NaOCl (PICOLOTTO et al., 2007). Segundo os autores, a contaminação fúngica é inversamente proporcional à concentração de NaOCl utilizada, entretanto, não interfere na contaminação bacteriana. Coutinho et al. (2000), estudando a efetividade do NaOCl contra alguns fungos transmitidos por sementes, observaram que a germinação de conídios foi inferior nas concentrações de 1%, 2% e 5% de NaOCl em relação à testemunha e à concentração de 0,5%.

Zaniolo e Zanette (2002), em trabalho visando estabelecer um protocolo de micropropagação de erva-mate, mantiveram mudas de dois anos em casa de vegetação, sob pulverizações semanais com benomyl a 2 g L-1. Dessas retiraram brotações que foram desinfestadas com NaOCl a 0,50% e 0,75% (5% de cloro livre) por 5, 10 ou 15 minutos. As menores taxas de contaminação fúngica (5,7%) e bacteriana (15,7) foram obtidas com a desinfestação dos explantes com 0,75% de NaOCl por 10 minutos. A manutenção das plantas matrizes em casa de vegetação e o tratamento destas com fungicida são alguns dos fatores que contribuíram para os resultados obtidos.

Trabalhando para desenvolver um procedimento eficiente para produção de mudas de bananeiras tetraploides (Musa sp. FHIA-01), Oliveira et al. (2001) desinfestaram os explantes retirados de plantas matrizes conduzidas no campo, com álcool comercial 90% por 2 minutos e hipoclorito de cálcio 6% por 30 minutos sob agitação. Observaram que as taxas de contaminação variaram de 1,07% a 22,32% e que a porcentagem de contaminação sofre redução à medida em que os explantes vão sendo subcultivados. Os autores consideraram elevada a taxa média de contaminação de 12,53% na micropropagação massal da bananeira.

Em mangueira, pesquisas foram desenvolvidas visando otimizar o estabelecimento in vitro (ANDRADE et al., 2005; CORDEIRO et al., 2002), observando-se percentuais de contaminação de 0% a 100%, variando em função de inúmeros fatores.

Quando sementes são utilizadas como explante inicial, normalmente as taxas de contaminação são praticamente nulas. Galvanese et al. (2007) não observaram contaminações na germinação in vitro de sementes de Aechmea blanchetiana, enquanto Pickens et al. (2003) obtiveram percentuais de descontaminação acima de 90% na germinação de sementes in vitro de Tillandsia eizii.

Donini et al. (2008), estudando a desinfestação de lâminas foliares em 14 espécies de aráceas ornamentais, verificaram que a concentração ideal de NaOCl é variável e depende do genótipo estudado, sendo que as concentrações entre 0,5% e 2,0% de cloro ativo são mais efetivas no combate à contaminação.

No estabelecimento in vitro de sementes de Physalis peruviana, Chaves et al. (2005), testando procedimentos de desinfestação com álcool, hipoclorito de sódio e de cálcio, isolados e em combinação, obtiveram taxas de contaminação praticamente nulas, à exceção da desinfestação com hipoclorito de cálcio utilizado isoladamente.

Para a desinfestação de explantes de eucalipto, Alfenas et al. (2004) recomendam a imersão em cloro ativo a 0,5% durante 20 minutos para segmentos nodais mais lignificados, e 0,3% durante 2 minutos para segmentos nodais mais tenros. Brondani (2008), visando determinar a melhor concentração de NaOCl para a assepsia de explantes de clones de Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii, utilizou segmentos nodais oriundos de minicepas conduzidas sob sistema semi-hidropônico e tratadas uma semana antes da coleta das brotações com Kumulus DF®. Após assepsia com álcool 70% por 15 segundos, os explantes foram tratados com 1,0%; 1,5% e 2,0% de NaOCl acrescido de tween 20% a 0,05% durante 10 minutos. A contaminação bacteriana foi nula para um clone, de 1% a 9% para outros dois. Já a taxa média de contaminação fúngica foi de 41,33%. O autor sugere tratamentos com maior tempo de exposição ao NaOCl e/ou aplicações mais frequentes de fungicidas nas plantas matrizes.

Outros trabalhos com estabelecimento de eucalipto in vitro têm sido realizados, testando HgCl2 (HAJARI et al., 2006; SHARMA; RAMAMURTHY, 2000; WATT et al., 2003), hipoclorito de sódio (BENNETT et al., 1994; FANTINI JUNIOR; GRAÇA, 1990; JOSHI et al., 2003; SANTOS et al., 2004) e hipoclorito de cálcio (HAJARI et al., 2006; WATT et al., 2003).

Na Tabela 6, estão relacionados alguns protocolos de desinfestação de explantes primários de algumas espécies ornamentais e frutíferas.

Tabela 6. Protocolos de desinfestação de explantes primários de algumas espécies ornamentais e frutíferas.

Espécie

Explante

Desinfestação

Amarílis (Hppeastrum sp.)

Bulbos

Lavar os bulbos inicialmente com água e detergente, posteriormente com álcool 70% durante 1 minuto, seguido de imersão em solução de hipoclorito de cálcio a 3% mais 5 gotas de Tween 20 por 10 minutos, com agitação. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Antúrio (Anthurium andraeanum Lindl.)

Folhas jovens

Lavar as folhas em água corrente com detergente e esponja bem macia. Colocá-las em recipiente adequado e lavá-las com álcool 70% por 5 minutos. Escorrer. Adicionar solução de hipoclorito de cálcio a 1,5% mais 3–4 gotas de Tween 20 e, sob agitação, permanecer por 10 minutos. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Bromélia (Neoregelia carolinae)

Plantas após frutificação

Lavar a planta em água corrente para a retirada total de solo e das folhas. Mergulhar o caule, primeiramente, em solução de cisteína (65 mM) por 5 minutos. Colocar em frasco apropriado e cobri-lo com álcool 70%, por 10 segundos. Escorrer. Adicionar solução de hipoclorito de cálcio 1,5% mais Tween 20 (2–3 gotas) por 10 minutos, sob agitação. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Copo-de-Leite Neozelandês (Zantedeschia elliottii)

Brotações dos tubérculos

Imersão em álcool etílico 70%, durante 10 segundos. Escorrer. Imersão, durante 20 minutos, em solução de hipoclorito de sódio a 1,5%. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Gérbera (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook)

Inflorescências

Retirar as lígulas. Imersão em álcool etílico 70%, durante 1 minuto. Imersão, durante 30 minutos, em solução de hipoclorito de sódio preparado com 25 mL de produto comercial de 5% a 6% em 200 mL de água destilada e esterilizada. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Orquídea

Cápsula fechada

Lavar as cápsulas fechadas com solução de hipoclorito de sódio (1 parte de água sanitária: 1 parte de água) por 30 minutos. Escorrer. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Rosa

Hastes de roseira com gemas

Lavar as hastes em água destilada e, em seguida, em álcool 70%, em fluxo laminar

Banana (Musa spp. Musaceae)

Rizomas

Imersão em álcool 70% (v/v) por cerca de 1 minuto. Posteriormente, tratamento com hipoclorito de sódio de 1% a 2%, com algumas gotas de Tween 20 (0,01% v/v) durante 15 minutos. Após, sob câmara de fluxo laminar asséptica, lavar cinco vezes com água destilada esterilizada

Fonte: adaptado de Lameira et al. (2000) e Tombolato e Costa (1998).

Manipulação dos explantes nas subculturas

Bactérias endógenas de crescimento lento podem ter origem no explante inicial, aparecendo algumas semanas após o isolamento. Esse caso não chega a representar grande problema, pois, nesse estágio, apenas um reduzido número de plantas derivou do explante contaminado (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

O problema se estabelece quando uma contaminação persistente se instala em culturas anteriormente limpas em estágios avançados da multiplicação. Estas bactérias, em geral, não são patogênicas, mas, competindo pelo meio de cultura, comprometem a multiplicação, o crescimento e o posterior enraizamento da planta. Uma vez instaladas na cultura, por terem crescimento lento e serem de difícil visualização, elas podem ser transmitidas de um material para outro. Um fator complicador que favorece a disseminação dessas bactérias é sua resistência às rápidas imersões em etanol absoluto e às temperaturas normalmente atingidas durante a flambagem dos instrumentos.

Um método de indexação das culturas consiste em transferir os explantes suspeitos de contaminação durante duas ou três subculturas em meio rico em nutrientes que estimulam o crescimento das bactérias (extrato de levedura-peptona-glucose-ágar), descartando aqueles que apresentarem contaminação e passando adiante apenas aqueles não contaminados (BOULAY, 1984).

Na fase de multiplicação, o enfoque maior deve ser dado às medidas preventivas tomadas durante a repicagem, tais como:

– Cuidadosa observação da base das culturas na contraluz, que pode ser facilitada com a utilização de agentes solidificantes que deixam o meio mais transparente, detectando mais facilmente a contaminação.

– A troca frequente do álcool de flambagem e dos respectivos recipientes (estes devem ser esterilizados anteriormente).

– A utilização de dois conjuntos de ferramentas de repicagem (cada conjunto composto por duas pinças e dois bisturis), em alternância de 10 a 15 minutos cada, ficando o conjunto não utilizado imerso em hipoclorito de sódio concentrado ou em álcool 95%.

– Flambagens demoradas e repetidas dos instrumentos em intervalos de 5 minutos ou a cada certo número de frascos repicados.

– A não ocorrência de trabalho simultâneo com material contaminado ou suspeito de contaminação e material limpo.

Mecanismo de ação de produtos utilizados na desinfestação inicial dos explantes e adicionados ao meio de cultura

Álcool – Está entre os mais efetivos e largamente utilizados contra contaminantes bacterianos, que agem desnaturando proteínas e incrementam a permeabilidade da membrana (INGRAM, 1990; INGRAM; BUTKE, 1984). Segundo Pelczar et al. (1996), a atividade antimicrobiana dos álcoois deve-se principalmente à sua capacidade de desnaturar proteínas. Os álcoois são também solventes de lipídios, lesando assim as estruturas lipídicas da membrana de células microbianas. Além disso, parte de sua eficiência como desinfestante da superfície pode ser atribuída à ação detergente e de limpeza que auxilia na remoção mecânica de microrganismos.

A imersão dos instrumentos em etanol a 70% ou concentrações maiores, seguida de flambagem, é um método comum de esterilização empregado por laboratórios de cultura de tecidos (SINGHA et al., 1987), e, enquanto o álcool proporciona a esterilização, a flambagem é realizada para queimar o etanol. O etanol absoluto é relativamente menos efetivo como esterilizante. A água incrementa a molhabilidade do álcool com atividade máxima de desinfestação em torno de 70% a 80% v/v. Álcoois não são unicamente germicidas, mas também removem as ceras superficiais dos tecidos de plantas. Uma imersão preliminar em etanol permite que os tecidos das plantas possam ser mais efetivamente molhados e penetrados por outros germicidas.

Da maioria dos álcoois, o etanol é o mais usual para desinfestação, mas raramente este é utilizado unicamente. Higuchi e Amoki (1989) constataram que 4 minutos de imersão em etanol 70% foi mais efetivo do que de 10 a 15 minutos em 1% de hipoclorito de sódio na remoção de contaminantes em segmentos de rizomas de Asplenium.

A duração do pré-tratamento varia de acordo com o tipo de tecido ou órgão (30 segundos a 1 minuto é o mais recomendado para material tenro) a ser desinfestado, manipula-se a concentração da solução e tempo de exposição de maneira inversamente proporcional. O etanol 70% e 80% geralmente são utilizados por alguns segundos, uma vez que acima destas concentrações é menos eficiente e pode desidratar rapidamente os tecidos (PASQUAL, 2001b). Não há diferença em se utilizar o etanol antes ou após o hipoclorito de cálcio.

Por outro lado, Wistreich e Lechtman (1988) e Nester et al. (1995) citados por Thomas (2004), evidenciam que endósporos de bactérias são difíceis de hidratar e requerem prolongada exposição. A possibilidade de disseminação de esporos de Bacillus resistentes ao calor por meio dos instrumentos flambados com álcool já foi relatada (BOXUS; TERZI, 1987; SINGHA et al., 1987).

No isolamento e caracterização de bactéria sobrevivente ao álcool associada à cultura de tecidos de videira, Thomas (2004) identificou a bactéria Bacillus pumilus, que pode permanecer como endofítica em cultura de tecidos de videira e sobreviveu em etanol aquoso por longos períodos (14 dias). Etanol a 90% foi a concentração mais efetiva como bactericida.

Hipoclorito – É um produto químico utilizado para esterilização de superfícies, frutas e hortaliças, água, entre outros. Sua utilização em larga escala é devido ao seu vasto espectro de atividade biocida contra bactérias, fungos e vírus, além do fato de ser um produto relativamente barato (EMMANUEL et al., 2004). O hipoclorito de sódio causa alterações biossintéticas no metabolismo celular e a destruição de fosfolipídios, formando cloraminas que interferem no metabolismo celular. Gera reações oxidativas com inativação enzimática irreversível em bactérias e a degradação de lipídios e ácidos graxos (ESTRELA et al., 2002). O íon hipoclorito é usualmente obtido do NaOCl ou CaOCI. A ação bactericida de soluções de hipoclorito se deve ao ácido hipocloroso (HOCl) e o íon OCl-. O primeiro é muito mais ativo que o segundo em função da eficiência da clorina. O ácido hipocloroso (HClO) é formado quando o cloro livre é responsável pela ação antimicrobiana do cloro e seus compostos.

Quando adicionados à água, os hipocloritos e as cloraminas sofrem hidrólise, dando origem ao ácido hipocloroso. Este ácido sofre nova reação, originando o oxigênio nascente (O). O oxigênio nascente liberado nesta reação é um poderoso agente oxidante que pode destruir substâncias celulares vitais. O cloro pode também combinar diretamente com proteínas celulares e destruir suas atividades biológicas (PELCZAR et al., 1996). Para uma desinfestação mais efetiva do material vegetal, soluções de hipoclorito devem ser usadas com um pH entre 6 e 7. A atividade germicida do hipoclorito de sódio e cálcio é relatada por sua capacidade oxidativa (AMONEX DO BRASIL, 2004).

Água oxigenada – A ação da H2O2 se deve ao ataque da membrana lipídica, DNA e outros componentes das células, pelos radicais livres tóxicos que o peróxido produz. Alguns microrganismos aeróbicos são capazes de produzir catalase ou superóxido dismutase, assim eles se protegem da atividade microbicida transformando o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Para evitar esse efeito, o peróxido de hidrogênio utilizado para esterilização é de concentração maior e possui estabilizantes (AMONEX DO BRASIL, 2004).

Formaldeído – O formaldeído tem uma estrutura química simples (HCHO). É um gás que se mostra estável somente em altas concentrações e em temperaturas elevadas. É extremamente tóxico, e seus vapores são intensamente irritantes às mucosas. Em temperatura ambiente, o formaldeído gasoso polimeriza-se, formando uma substância sólida incolor chamada paraformaldeído que rapidamente libera formaldeído pelo aquecimento. O formaldeído é também comercializado em solução aquosa como formalina, que contém de 37% a 40% (p/v) da substância. O metanol é usualmente adicionado (de 10% a 15%) para prevenir a polimerização de formaldeído. Em solução, o formaldeído é utilizado para a esterilização de certos instrumentos. Na forma gasosa pode ser utilizado para desinfecção e esterilização de ação fechada.

O formaldeído é um composto químico extremamente reativo, e sua atividade microbiana parece ser devida à capacidade de inativar constituintes celulares, como proteínas e ácidos nucleicos. As células vegetativas são destruídas mais rapidamente com o formaldeído do que formas esporuladas.

O formaldeído tem ação lenta e, em concentração de 5%, necessita de 6 a 12 horas para agir como bactericida e de 18 horas, a 8%, para agir como fungicida, além de apresentar alta toxicidade.

Segundo Fior (2004), o paraformaldeído (PF) pode ser empregado como agente de desinfestação de tecidos vegetais destinados ao cultivo in vitro. Para a desinfestação de segmentos nodais de Limonium platyphyllum, foi suficiente a exposição dos tecidos a duas drágeas de 500 mg de PF 99,9% por duas horas, à temperatura ambiente, dentro de um frasco de vidro lacrado de 150 mL. Porém, a exposição de tecidos vegetais por tempo prolongado provoca altas taxas de oxidação.

Óxido de etileno – O óxido de etileno é um composto orgânico líquido a temperaturas abaixo de 10,8 oC, mas torna-se um gás acima destas. Uma característica importante é o seu poder de penetração. Atravessa e esteriliza o interior de grandes pacotes, como objetos, roupas e mesmo certos plásticos. Assim, certos materiais, como seringas, podem ser adicionados e então esterilizados.

O óxido de etileno inativa enzimas e outras proteínas que têm átomos de hidrogênio lábeis, como em grupos sulfidrilas. Essa reação é denominada alquilação. O anel da molécula do óxido de etileno se rompe para formar -CH2CH2O-, que se insere entre os átomos de enxofre e hidrogênio do grupo sulfidrila (PELCZAR et al., 1996).

Detergentes – Também denominados surfactantes, são compostos que diminuem a tensão superficial dos tecidos e também utilizados para limpar superfícies. A ação umectante deve-se ao fato de serem compostos anfipáticos. Quando uma substância apolar, como as gorduras, é colocada em uma solução aquosa de detergente, os grupos hidrofóbicos do detergente ligam-se às substâncias, enquanto os grupos hidrofílicos criam uma superfície que pode ser encharcada com a água (PELCZAR et al., 1996).

PPM – O PPM TM (Preservative Plant Mixture) é um biocida de amplo espectro de ação e é mais barato em relação a antibióticos. Ele pode ser usado na concentração de 0,5 mL L-1 a 2 mL L-1 combinado ou não com antibióticos com a metade de sua concentração. Pode ser usado para reduzir a contaminação de bactérias e fungos em cultura de tecidos de plantas, e em altas concentrações para reduzir contaminações endógenas (PLANT CELL TECHNOLOGY, 2009).

Conforme Niedz e Bausher (2002), as isotiazolonas são uma classe de biocidas industriais que têm sido utilizadas profilaticamente na forma de Preservative Plant Mixture (PPM) no meio de cultura para controlar contaminação microbiana.

O PPM TM penetra na parede celular de bactérias ou fungos e inibe a atividade de enzimas chaves, como o ciclo do ácido cítrico e cadeia de transporte de elétrons. Dados recentes indicam que o PPM pode inibir o transporte de monossacarídeos e aminoácidos.

Em plantas lenhosas como citrus, o controle de contaminação bacteriana e fúngica é muito difícil de ser obtido. Niedz e Bausher (2002) reduziram a contaminação por fungos e bactérias em citrus, mas constataram fitotoxidade em explantes oriundos de matrizes mantidas no campo, quando tratados com 20 mL L-1 de PPM; já os contaminantes dos explantes coletados de plantas mantidas em casa de vegetação foram adequadamente controlados com 5 mL L-1. Niedz e Bausher (2002) relatam que pequena fitotoxicidade foi observada até altas concentrações testadas de 2 mL L-1, duas vezes maior do que a recomendada pelos fabricantes.

De acordo com Compton e Koch (2001), o PPM afeta a embriogênese somática em melão. Além disso, afirmam que o efeito do PPM TM é dependente da espécie. Lemos (2000), em trabalho com microestacas de gravioleira (Annona muricata) tratadas com 10 mL L-1 de PPMTM por 4 horas antes da inoculação em meio de cultura, e Digonzelli et al. (2001), em explantes de cana-de-açúcar e com adição de 0,250 mL de PPM TM adicionado ao meio de cultura, constataram a eficiência desse anticontaminante. De acordo com Palú (2002), o anticontaminante PPM TM, na concentração de 0,5 mg L-1, adicionado ao meio de cultura e em pré-tratamento com solução 25% (v/v), é eficiente na desinfestação de anteras de cafeeiro.

Fungicidas – Efetivamente, todos os fungicidas sistêmicos inibem, seletivamente, processos metabólicos específicos, compartilhados apenas por grupos restritos de fungos, atuando tão somente contra os patógenos visados. A alta especificidade de ação leva à alta fungitoxicidade inerente aos fungos sensíveis e à baixa fitotoxicidade. A baixa fitotoxidade, aliada à absorção e à capacidade de translocação, leva ao efeito sistêmico.

Dentre os fungicidas sistêmicos, o mais importante grupo utilizado comercialmente são os benzimidazóis, incluindo os fungicidas benomil, carbendazim, tiofanato metílico e thiabendazole. Segundo Coutinho et al. (2006), a introdução dos fungicidas sistêmicos do grupo dos benzimidazóis, na década de 1960, tornou-se um marco na história do desenvolvimento dos fungicidas. Dentre os fungicidas desse grupo, os mais utilizados são benomil, tiofanato-metílico e carbendazim (MAZELLIER et al., 2002).

O sítio primário de ação dos benzimidazóis é a Tubulina, e o processo afetado é a mitose. Segundo Davidse (1988 citado por COUTINHO et al., 2006), os benzimidazóis atuam nos fungos pela inibição de proteínas específicas, chamadas de a e b tubulinas, que mediante polimerização constituem os microtúbulos (LEROUX, 2003). Quando essas proteínas entram em contato com tais fungicidas, a formação dos microtúbulos é inibida. Como resultado as células não se dividem e passam a ser multinucleadas, levando o fungo à morte.

O ingrediente ativo benomil pertence ao grupo químico dos benzimidazóis; entretanto, foi proibido no Brasil. Os ingredientes ativos desse grupo, carbendazim, tiabendazol e tiofanato metílico, podem ser utilizados como substitutos.

Outro grupo de fungicidas são os inibidores da biossíntese de ergosterol, uma rota importante para o ótimo crescimento e metabolismo dos fungos. Muitos fungicidas deste grupo têm sido sintetizados e desenvolvidos, e, dentre estes, o miconazole tem demonstrado forte micotoxicidade e ausência de fitotoxidade (TYNAN et al., 1993).

Fungicidas como reguladores de crescimento – A incorporação de fungicidas nos meios de cultura vem sendo utilizada, apresentando efeitos positivos na multiplicação de plantas cultivadas tanto in vitro com in vivo (COLOMBO et al., 2004). O benomil é muito utilizado no controle de contaminações fúngicas do meio de cultura e do material vegetal (HAUPTMANN et al., 1985).

Apesar de proibido no Brasil, o benomil não só previne contaminações fúngicas (BECKER, 1971; ERWIN, 1973; SAENGER, 1970) como também possui algumas propriedades reguladoras de crescimento de plantas (BECKER, 1971; SAENGER, 1970; SCHREIBER; HOCK, 1975; SCHRUFT, 1970). Ele depreciou o crescimento de seedlings de Ulmus americana L., Tagets sp., Rhamnus frangula L., Platanus occidentialis L., Acer saccharinum L. (SCHREIBER; HOCK, 1975); entretanto, promoveu vigorosas brotações em videira (Vitis vinifera L.) (BECKER, 1971), tabaco (Nicotiana tabacum e N. clevelandii) (SAENGER, 1970) e certas espécies de turfa (SCHREIBER; HOCK, 1975) e aumentou o enraizamento de estacas de Pinus (Pinus strobus L. e Pinus mugo var. mughs Zeneri.) (KIANG et al., 1974; THIELGES; HOITINK, 1972).

Atividade citocinínica do benomil foi observada em calos de soja (Glycine max L.) e em cotilédones de Raphanus sativus L. (SKENER, 1972). Yang (1976), testando o efeito do benomil na multiplicação e enraizamento de aspargo (Asparagus officinalis L.) em meio MS, verificou que concentrações entre 50 ppm e 250 ppm proporcionaram maior número de novas brotações; entretanto, menores porcentagens de enraizamento. Já concentrações entre 25 ppm e 100 ppm estimularam novas brotações com maior comprimento. De acordo com Thomas (1973), esse efeito do benomil deve-se, possivelmente, à sua semelhança estrutural com as citocininas.

Haldeman et al. (1987), utilizando benomil em associação com rifampicina no cultivo in vitro de ápices caulinares de Camellia sinensis e Camellia japonica, obtiveram efetivo controle de contaminação fúngica e bacteriana. Na desinfestação de explantes lenhosos de jabuticabeira e goiabeira, Caldas e Taketomi (1993) constataram que o tratamento mais eficaz para reduzir a contaminação foi com a adição de benomil em concentrações de 10 mg L-1 a 100 mg L-1 no meio de cultura.

Brown et al. (1981) testaram fungicidas e bactericidas no cultivo in vitro de orquídeas e constataram que amphotericina B, benomil, gentamicina, nistatina, penicilina G, omadine sódico e vancomicina isolados ou em diversas combinações não tiveram efeito deletério na germinação de sementes, mas inibiram o crescimento de ápices caulinares.

Também foi constatada a influência como fitorregulador do fungicida clorotalonil. Colombo et al. (2004) constataram que concentrações entre 0,1 g L-1 e 0,2 g L-1 desse fungicida influenciaram tanto a propagação in vitro quanto a percentagem de sobrevivência durante a aclimatização das orquídeas Cattleya loddigesii e Laelia lundii.

Antibióticos – São compostos produzidos por microrganismos, que inibem outros microrganismos, em baixas concentrações, exibindo alto grau de especificidade. Os antibióticos atuam sobre os microrganismos de diversas maneiras. Os principais pontos de ação incluem: 1) inibição da síntese do peptideoglucano da parede celular bacteriana; 2) lesão da membrana citoplasmática, e 3) interferência na síntese de ácido nucleico e proteínas.

Pelczar et al. (1996) relataram a eficiência comprovada da combinação de antibióticos, visto que é muito mais difícil um microrganismo tornar-se resistente contra dois antibióticos simultaneamente. Inúmeros trabalhos têm sido conduzidos para estudar contaminações bacterianas in vitro (BUCKLEY et al., 1995; HOUWE; SWENNEN, 2000; HUMARA; ORDÁS, 1999; KESKITALO et al., 1998; KNEIFEL; LEONHARDT, 1992; ODUTAYO et al., 2004; PEREIRA et al., 2003; REED et al., 1995; TENG; NICHOLSON, 1997). Neste sentido, vários antibióticos têm sido utilizados em cultura de tecidos, a exemplo de cefatoxima (TOLEDO; ROCA, 2001), ampicilina (ANDRADE et al., 2003), estreptomicina (ANDRADE et al., 2003), rifampicina (ANDRADE et al., 2003; HALDEMAN et al., 1987; HÖRNER et al., 2000b; LEGGATT et al., 1988; PHILLIPS et al., 1981; POLLOCK et al., 1983; VIANNA et al., 1997; YOUNG et al., 1984), kasugamicina (ARRUDA; DAMIÃO FILHO, 2001), tetraciclina e gentamicina (VIANNA et al., 1997), neomicina e cloranfenicol (LEGGATT et al., 1988), sulfametaxazol e trimetroprima (ANDRADE et al., 2005).

Na Tabela 7 estão relacionados alguns antibióticos utilizados na quimioterapia de infecções bacterianas e fúngicas.

Tabela 7. Alguns antibióticos utilizados na quimioterapia de infecções bacterianas e fúngicas.

Antibiótico

Ativo contra

Mecanismo de ação

Efeito

Bactericida

Bacteriostático

Canamicina

Maioria das bactérias gram-negativas, exceto Pseudomonas

Induz a síntese anormal de proteínas

+

Tetraciclinas

Largo espectro; muitas bactérias gram-positivas e gram-negativas

Interfere com a síntese de proteínas

+

Cloranfenicol

Largo espectro; infecções graves por gram-negativas

Interfere com a síntese de proteínas

+

Vancomicina

Bactérias gram-positivas, incluindo estafilococos produtores de penicilinase e enterococos

Interfere com a síntese de proteínas

+

Rifampicina

Tuberculose

Bloqueia a síntese proteica bacteriana pela inibição da RNA polimerase DNA dependente, que transcreve o DNA em mRNA

+

Antifúngicos (Nistatina e Polienos)

Infecções fúngicas

Lesão da membrana celular

+

Fonte: adaptado de Pelczar et al. (1996).

Medidas de controle de microrganismos

A determinação exata da fonte de contaminação muitas vezes é dificultada, já que, como mencionado anteriormente, os microrganismos podem ser introduzidos em vários pontos do processo de micropropagação. Contudo existem formas de prevenir o aparecimento de contaminações, para tanto é necessário que se verifique e controle sistematicamente todas as operações e áreas onde possam ser introduzidos os microrganismos contaminantes.

Como regra geral, as plântulas contaminadas devem ser eliminadas do processo de micropropagação. No entanto, essa regra pode ser desconsiderada nos casos em que o material vegetal em questão for de grande valor ou de difícil controle e encontrar-se contaminado por microrganismos. Como exemplos, citam-se materiais raros do banco de germoplasma, orquídeas raras e caras, ipeca (planta medicinal, cujo preço das raízes é altíssimo), dentre outras.

Segundo Leifert et al. (1994a), os sistemas de Análise dos Postos de Controle Crítico de Risco (APCCR) são as mais eficientes técnicas de manejo de contaminações do que o tratamento com antibióticos e outros antimicrobianos. Comentam também que compostos antibacterianos e antifúngicos de amplo espectro nem sempre conseguem eliminar todos os organismos-alvo, além de terem efeitos negativos no crescimento e/ou enraizamento de culturas de tecidos de plantas. Frequentemente o crescimento bacteriano é somente suprimido (efeito bacteriostático) pelos tratamentos antimicrobianos e, quando estes são removidos, o crescimento bacteriano recomeça (BARRETT; CASSELLS, 1994; FALKINER, 1990).

Uma alternativa barata ao uso profilático de antibióticos em determinados sistemas in vitro é a acidificação do meio de cultura, prevenindo o estabelecimento e/ou a proliferação dos contaminantes bacterianos (LEIFERT et al., 1994b). A utilização de um sistema fotoautotrófico também possibilita o cultivo de tecidos sem a proliferação de contaminantes, pois nesses sistemas há a remoção dos carboidratos, essenciais para o rápido crescimento de muitos contaminantes. De acordo com Kubota e Tadokoro (1999), uma das vantagens da micropropagação fotoautotrófica é o baixo risco de contaminação, o que facilita o uso de grandes recipientes de cultura, contribuindo para a redução do custo de produção. Sayegh e Long (1997 citados por LEIFERT; CASSELLS, 2001), resgataram culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendron, Maranta e Cordyline, contaminadas com fungos e bactérias, transferindo-as para cultura autotrófica usando espuma de poliuretano como suporte.

Um outro conceito, a biotização, em que as microplantas são inoculadas in vitro ou in vivo com inoculantes bacterianos e fungos micorrízicos arbusculares, representa uma oportunidade (CASSELLS, 2000), e seus benefícios foram reportados por Cordier et al. (2000).

Diversos compostos químicos, como hipoclorito de sódio ou cálcio (já descritos), antibióticos, cloreto de mercúrio, álcoois e fungicidas, também têm sido usados para tratamentos superficiais dos explantes. Concentrações e tempo de exposição dos diferentes compostos químicos dependem grandemente do tipo e tamanho do explante (LEIFERT et al., 1991a).

Bactericidas

Se as culturas não são descartadas; por exemplo, se a limpeza do material propagativo não é possível ou se a contaminação é apenas detectada após grandes quantidades de plântulas terem sido produzidas; as mesmas podem ser descontaminadas pela incorporação de antibióticos no meio de cultura. Vários autores têm descrito a sensibilidade dos antibióticos às bactérias isoladas em cultura de tecidos vegetais (POUSEN, 1988) ou têm incluído antibióticos no meio de crescimento de plântulas para suprimir ou eliminar contaminações bacterianas.

Alguns autores constataram que certos tratamentos com antibióticos não têm efeito na contaminação, e outros ainda afirmam que muitos dos antibióticos têm sido tóxicos para as plantas in vivo e in vitro, podendo apenas ser incorporados no meio de cultivo com as plântulas por determinados períodos de tempo.

Entretanto, Pereira et al. (2003), conduzindo trabalho com o objetivo de isolar, caracterizar e identificar bactérias endofíticas contaminantes encontradas em tecidos de batata durante a micropropagação e selecionar antibióticos para o controle in vitro desses microrganismos, constataram que brotações apresentando contaminação bacteriana durante a etapa de multiplicação in vitro foram superficialmente desinfestadas. Os internódios foram transferidos para placas de Petri com ágar nutriente, onde permaneceram incubados a 28 oC por até cinco dias. Após purificação, as bactérias foram caracterizadas e identificadas por testes taxonômicos. Um total de oito estirpes bacterianas foram isoladas e identificadas como pertencentes às famílias Acetobacteriaceae e Enterobacteriaceae e aos gêneros Corynebacterium, Pseudomonas e Xanthomonas. Os melhores resultados para a inibição do crescimento bacteriano foram obtidos com os antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina em concentrações que variaram de 32 mg L-1 a 256 mg L-1.

Liu et al. (2005), visando detectar bactérias endofíticas associadas à necrose do ápice foliar em plantas micropropagadas de Limonium sinuatum, identificaram a ocorrência de Pasteurella multocida, Stenotrophomonas maltophilia e Alcaligenes sp. Observaram que a adição de augmentina e cofotaxima foi eficiente na eliminação das bactérias endofíticas das culturas. Em contrapartida, a acidificação do meio de cultura não foi efetivo.

Andrade et al. (2003) obtiveram sucesso no controle do desenvolvimento de bactérias em explantes de mangueira (Mangifera indica L.) com a utilização do antibiótico Trim (sulfametaxazol + trimetoprima). A incorporação de sulfato de cobre e própolis ao meio de cultura não evitou o crescimento da bactéria.

De acordo com Phillips et al. (1981), apenas a rifampicina, entre seis antibióticos testados, controlou a contaminação bacteriana sem afetar o desenvolvimento dos explantes, em Helianthus tuberosus. Posteriormente, Vianna et al. (1997) confirmaram esse resultado, concluindo que nos tratamentos contendo rifampicina houve de 70% a 75% de explantes sadios de mamoeiro. Reuveni et al. (1990) afirmam que a rifampicina, além de reduzir o nível de contaminação, não prejudica o desenvolvimento dos explantes.

Em trabalho com 10 diferentes cultivares de plantas, Leggatt et al. (1988) isolaram e caracterizaram 31 microrganismos, dentre os quais muitos isolados foram resistentes a antibióticos. Rifampicina, cloranfenicol e neomicina foram os mais eficientes na inibição de bactérias.

Habiba et al. (2002) isolaram e caracterizaram bactérias endógenas associadas ao rizoma de bananeira, bem como medidas de controle. Os explantes foram coletados de matrizes mantidas no campo e, após remoção das camadas superficiais de tecidos, foram tratados com HgCl2 a 0,1% por 15 minutos e posteriormente imersos em soluções dos antibióticos ampicilina, gentamicina e tetraciclina. Uma taxa de 100% de culturas livre de contaminação foi obtida pela imersão dos explantes em 160 mg L-1 de gentamicina por 100 minutos.

Testando a eficiência dos antibióticos rifampicina, tetraciclina, penicilina, ampicilina, agrimicina e norfloxacino e os fungicidas Benlate® e Anfotericina® na assepsia para estabelecimento in vitro de porta-enxertos de macieira, Souza et al. (2003b) constataram que nenhum dos antibióticos foi eficiente. A anfotericina apresentou resultados positivos na eliminação de contaminantes fúngicos.

Pereira e Fortes (2003), com o objetivo de avaliar a toxicidade de antibióticos no cultivo in vitro da batata, verificaram que a ampicilina foi o único antibiótico que não afetou a sobrevivência e o desenvolvimento dos explantes de batata em meio de multiplicação, podendo ser indicada para trabalhos de descontaminação in vitro dessa espécie. A estreptomicina apresentou efeito fitotóxico mais pronunciado sobre a cultura da batata quando presente em meio de cultura de consistência líquida. Os antibióticos tetraciclina e cloranfenicol, independente da consistência, não devem ser adicionados ao meio de cultura, pois afetam severamente o desenvolvimento in vitro da batata.

Mistura de antibióticos

A cultura de plantas pode conter mais que um contaminante, sendo a mistura de agentes antimicrobianos a melhor medida profilática.

Stimart (1986) constatou que, utilizando 500 µg L-1 de estreptomicina e 500 µg L-1 de carbenicilina separadamente, não poderia eliminar o contaminante Hyphomicrobium da suspensão de células de Datura, mas o controle foi obtido quando 100 µg L-1 de ambos componentes foi usado em combinação. A mistura de antibióticos frequentemente mostra efeitos sinergísticos, não apenas no controle de microrganismos, mas também na indução de plantas mais bem formadas. A mistura de 10 µg L-1 de rifampicina e 1 g L-1 de benomil foi uma combinação efetiva para o controle de fungos e bactérias de Camellia, mas a mistura de rifampicina e trimetoprima recomendada aumentou a oxidação fenólica de explantes de café (HANUS; ROHR, 1987).

Leggatt et al. (1988) constataram, em trabalho com dez diferentes cultivares de plantas, que rifampicina, cloranfenicol e neomicina foram os antibióticos mais eficientes na inibição de bactérias. Complementaram recomendando que a combinação de dois destes pode produzir maior sucesso do que seu uso isolado.

Seguem alguns exemplos adicionais do uso da mistura de antibióticos para a remoção de contaminantes (GEORGE, 1993):

1. 250 µg mL-1 carbenicilina + 2,5 µg L-1 de anfotericina B por uma semana.

2. 15 µg mL-1 de rifamicina + 15 µg mL-1 de trimetoprima + 0,1% de fungicida Tilt MBC.

3. 25 µg mL-1 de cefolotoxina + 25 µg mL-1 de tetraciclina + 6 µg mL-1 de rifampicina e 6 µg mL-1 de polimixina B.

4. 10 µg mL-1 de rifampicina + 1 g L-1 de benomil.

5. De 50 µg mL-1 a 100 µg mL-1 (dependendo da cultivar) de canamicina + 200 µg mL-1 de cefalotoxina.

6. Mistura complexa de 20 µg mL-1 de gentamicina + 20 µg mL-1 de canamicina + 30 µg mL-1 de clortetraciclina + 60 µg mL-1 cloranfenicol + 75 µg mL-1 de rifampicina + 750 µg mL-1 de benomil.

7. Vancomicina-HCl + micostatina.

8. 20 µg mL-1 de rinfampicina + 20 µg mL-1 trimetoprima.

9. 250 µg mL-1 de carbenicilina + 25 mL-1 de nistatina por uma semana.

Outros métodos utilizando antibióticos

Tratamento dos explantes

Os antibióticos não necessitam de ser adicionados ao meio de cultura. Os explantes podem ser embebidos ou colocados em solução com o antibiótico antes de inoculados, ou as plantas-mãe podem ser borrifadas com antibióticos antes dos explantes serem removidos.

Tratamento da planta-mãe com compostos antimicrobianos

O efeito bacteriostático da mistura complexa de compostos antimicrobianos em brotos apicais e axiais de Hevea foi maior quando ele foi adicionado ao meio de cultivo. A embebição dos explantes não foi efetiva (ENJALRIC et al., 1988).

A utilização de antibiótico em cultura de tecidos é uma questão delicada, uma vez que ele deve manter sua capacidade bactericida ou bacteriostática, ser solúvel, apresentar-se estável durante o crescimento das culturas, não ser tóxico às células vegetais, ter amplo espectro de ação e ter baixo custo. Trabalhos nos quais foi avaliado o nível de toxidez de vários antibióticos demonstraram que os do grupo dos betalactamos, tais como ampicilina, carbecilina e, particularmente, as cefalosporinas, possuem amplo espectro de ação, e sua toxidez é mínima nas concentrações que controlam bactérias. A rifampicina sozinha ou em combinação com trimetoprima também forneceu amplo espectro de ação. Os antibióticos do grupo dos aminoglicosídeos, como a estreptomicina, neomicina, canamicina e gentamicina, são os menos recomendados por causa de sua toxidez aos tecidos vegetais (MONTARROYOS, 2000).

A Tabela 8 apresenta alguns exemplos de antibióticos comumente utilizados em cultura de tecidos com suas respectivas toxicidades e/ou segurança.

Tabela 8. Exemplos de fitotoxidade de antibióticos e seus usos contra contaminantes de cultura de tecidos vegetais.

Composto

Segurança ou fitotoxicidade relatada

Concentração
(µg mL-1)

Sucesso na remoção do contaminante

Efeito

Dose
(µg mL-1)

Planta/resultado

Planta

Organismo

Resultado

Amphotericina

S

I G

C R

–

1

10

Cultura de células

Vanda

Brotos apicais de Cymbidium

Ampicilina (sódio)

S

–

Cultura de células

400

Protoplasto de Petúnia

Contaminantes

Bactericida (com outros compostos)

Augmentina

S

S

–

–

N. plumbaginifolia

Cultura de células

Bracitracina

I C

E C

100

5

Flores de verão

Calos de Rumex acetosa

100

Helianthus annus

Contaminantes

Bactericida

Carbenicilina (sódio)

Cefaloridine

S

500–1.000

Protoplasto de Nicotiana

Sungonium, Ficus

Agrobacterium

Vários

Bactericida

Bacteriostático

S - seguro; I G - inibição da germinação; E C - estímulo do crescimento; C R - crescimento reduzido; I C - inibição do crescimento.

Fonte: adaptado de George (1993).

Pulverizando plantas de Geranium com 200 µg mL-1 de oxitetraciclina em intervalos semanais de março até agosto, Falkiner (1990) reduziu a incidência de escoriações causadas pela bactéria sistêmica Corynebacterium fascians.

Fungicidas

Alguns fungicidas podem ser incorporados ao meio para suprimir a introdução de fungos por ácaros, mas observou-se que eles reduzem a razão de crescimento e/ou enraizamento de plântulas.

Diversos trabalhos são conhecidos por usarem fungicidas sintéticos para o controle de fungos em material excisado e em culturas estabelecidas, mas a fitotoxidade é potencialmente dependente do genótipo (GEORGE, 1993).

Quando quantidade de 5 µg mL-1 a 50 µg mL-1 de benomil foi dissolvida em dimetilsulfóxido e adicionada ao meio contendo calos de Cymbidium, houve inibição da formação de plantas. Similarmente 50 µg mL-1 inibiu in vitro a germinação de sementes de três gêneros de orquídeas. Portanto, benomil dissolvido em dimetilsulfóxido é tóxico para a suspensão de culturas (GEORGE, 1993).

Existem alguns fungicidas alternativos como imazalil (20 µg mL-1) e captafol (100 µg mL-1), que contiveram contaminações fúngicas e o crescimento de fungos saprófitas como Alternaria brassicae em cultura de calos de Brassica junceae sem ocorrer toxicidade (POUSEN, 1988).

Três fungicidas naturais (Mycosin, Mycosan e Chitosan) foram comparados com fungicidas-padrão (carbendazim e enxofre) e avaliados com relação ao controle de Botrytis cinerea em kiwizeiro in vitro e em condições de campo (PAK et al., 1998). Os fungicidas Mycosin e Mycosan tiveram boa eficácia contra o fungo e foram os únicos produtos que inibiram a germinação dos conídios. Em contrapartida, Chitosan teve atividade fungicida muito baixa. O fungicida Carbendazim foi eficaz no comprimento do tubo germinativo e crescimento micelial em baixas concentrações, embora não tenha inibido a germinação dos conídios. Os fungicidas naturais proporcionaram a vantagem de serem efetivos tanto contra cepas sensitivas quanto resistentes.

Trabalho para avaliar a efetividade de fungicidas do grupo das anilinopyrimidinas, cyprodinil e pyrimethanil contra cepas de Botrytis cinerea resistentes a benzimidazóis, dicarboximidas e a uma mistura de benzimidazol-diethofencarb foi conduzido por Petsikos-Panayotarou et al. (2003). Os autores constataram que ambos os fungicidas foram efetivos contra as cepas de Botrytis cinerea.

Clotrinazole foi recomendado para eliminar as leveduras de cultura de tecidos, sendo apenas efetivo sobre uma das duas leveduras identificadas como contaminantes de cultura de meristema de macieira. A concentração 10 µg mL-1 de iminooctodine controlou ambos os organismos, mas, no entanto, 0,1 µg mL-1 foi tóxico. A anfotericina B e nistatina que foram usadas para eliminar leveduras de cultura de tecidos de macieira foram inofensivas (GEORGE, 1993).

Tynan et al. (1993) avaliaram a efetividade do miconazole como agente antifúngico para cultura de tecidos de várias espécies vegetais, testando-o contra 23 fungos comumente associados com plantas ou cultura de tecidos destas. O crescimento de todas as culturas de fungos testados foi inibido na presença do fungicida. Além da inibição do crescimento das hifas, a prevenção ou redução da esporulação foi efetiva. A adição de miconazole ao meio de cultura não causou nenhuma toxicidade na maioria das culturas testadas.

Em trabalho para controlar o desenvolvimento de Rhodotorula spp. em macieira cultivada in vitro, Nagy et al. (2005) utilizaram vários fungicidas. Dentre estes, ProClin® 300, mancozeb, triforine, myclobutanil, tiabendazole, mancozeb + zoxamid e nitrato de prata inibiram o crescimento das leveduras isoladas e não foram fitotóxicos. Já os fungicidas miconazole, PPMTM, sulfato de cobre, sorbato de potássio e cycloheximida inibiram o crescimento das leveduras, mas foram fitotóxicos. O benomil não demonstrou ser fitotóxico, mas somente foi efetivo contra os contaminantes em altas concentrações.

Visando à diminuição da contaminação in vitro por fungos e bactérias na micropropagação de pau d’alho (Gallesia gorazema), Sato et al. (2004) testaram concentrações de benomil adicionadas ao meio de cultura. Constataram que a contaminação fúngica diminuiu com o aumento das concentrações de benomil e que a contaminação bacterina foi menor nas concentrações de 200 mg L-1 a 500 mg L-1. Em contrapartida, com o aumento de sua concentração, o benomil induziu a oxidação, provavelmente por fitotoxidez causada aos explantes.

Shields et al. (1984) testaram inúmeros agentes antifúngicos em N. plumbaginifolia e N. Tabacum. Segundo os autores, dos que foram utilizados [benomil, carbendazim, tiabendazole, fenbendazole, nistatin, fungizone (amfotericina B), clotrimazole, griseofulvin, imazalil e miconazole], carbendazim, fenbendazole e imazalil podem ser empregados com relativa segurança e possuem atividade antifúngica de largo espectro. Os fungicidas de uso clínico, clotrimazole e miconazole, afetaram negativamente os explantes.

Em trabalho para avaliar a fitotoxicidade de fungicidas e germicida na micropropagação de Oncidium varicosum, Oda et al. (2003) verificaram que o fungicida chlorotalonil e o hipoclorito de sódio não tiveram nenhum efeito fitotóxico sobre as plântulas. Em contrapartida, os fungicidas azoxystrobin, em todas as concentrações testadas, e o benomil, a 0,8 g L-1, foram letais. Resultado semelhante foi obtido por Watt et al. (1996), que observaram que o benomil (de 0,5 g L-1 a 1 g L-1) e chlorotalonil (de 0,25 g L-1 a 0,5 g L-1) foram prejudiciais ao cultivo in vitro de Eucalyptus grandis. Em contrapartida, constataram que o fungicida sistêmico cloridrato de propamocarbe , a 0,36 g L-1, não afetou significativamente o desenvolvimento das plantas e é um potencial fungicida para uso na erradicação de infecções fúngicas em culturas de Eucalyptus.

Santana et al. (2003), avaliando a eficácia de substâncias antimicrobianas (benomil e ampicilina) sobre microrganismos superficiais e endofíticos em três espécies de Annonacenae in vitro, constataram que existe considerável diferença nas taxas de contaminação entre as espécies estudadas. O benomil foi efetivo na desinfestação dos segmentos foliares e, na concentração de 1,0 g L-1, eliminou todos os fungos, enquanto a ampicilina foi ineficaz contra a contaminação bacteriana.

Hipoclorito e outros produtos

Em trabalho visando ao controle da contaminação no estabelecimento in vitro de macieira (Malus domestica Borkh.), Erig e Schuch (2003) observaram que a desinfestação dos explantes com NaOCl, de modo geral, foi mais eficiente. A lavagem das brotações em água corrente, antes da desinfestação, diminuiu a oxidação, porém aumentou a contaminação bacteriana.

Na assepsia de sementes de bromélia imperial (Alcantarea imperialis), Rodrigues et al. (2003) testaram concentrações de NaOCl (100%, 70% e 40%) e tempos de imersão (5, 15 e 25 minutos). Os autores concluíram que a imersão das sementes por 25 minutos em hipoclorito de sódio a 70% proporcionou o melhor resultado.

Silva et al. (2003), testando o efeito de concentrações de NaOCl (20%, 30% e 40% da concentração comercial) e tempo de imersão (8 e 12 minutos) na desinfestação de explantes de inhame roxo (Dioscorea rotundata Poir) coletados no campo, não verificaram eficiência dos tratamentos, constatando contaminação por fungos e bactérias de 66,7% a 100%.

Visando ao estabelecimento de protocolos de assepsia de ápices caulinares de bacurizeiro (Platonia insignis Mart.), cajazeira (Spondias mombin L.) e umbu-cajazeira (S. mombim x S. tuberosa), Souza et al. (2003a) testaram tempos de imersão (0, 5, 10, 15 e 20 minutos) em solução de NaOCl a 1% e de bicloreto de mercúrio a 0,02%. O uso do HgCl2 resultou em menores índices de contaminação quando comparado ao tratamento controle e ao NaOCl, porém sem diferir significativamente deste último. O NaOCl apresentou maior eficiência (45,21% de contaminação aos 30 dias de incubação) no tempo de imersão de 15 minutos e menor (66,8%) quando o tempo de imersão foi de 5 minutos. Para o HgCl2, a maior eficiência (35,10% de contaminação após 30 dias de incubação) ocorreu para o tempo de imersão de 10 minutos, com a menor eficiência (59%) sendo observada para o tempo de imersão de 5 minutos.

Cox et al. (2003), visando à otimização dos procedimentos de desinfestação para posterior germinação e crescimento in vitro de samambaia (Schizaea dichotoma), realizaram a desinfestação de esporos utilizando NaOCl, estreptomicina e a combinação destes. Foi constatado que somente os esporos desinfestados com estreptomicina germinaram.

O HgCl2 tem sido relativamente usado para a desinfestação. Entretanto, de acordo com George (1993), o produto é tóxico e deve ser manipulado com cuidado. Segundo Teixeira (2001), pode ser usado em concentrações de 0,05% a 0,2%. Em trabalho com Pfaffia tuberosa, Flores et al. (2006) constataram que danos causados em explantes foram devidos ao uso do HgCl2. No entanto, Martins e Nicoloso (2004) verificaram que apenas o uso de HgCl2 durante 5 minutos não foi eficiente para a desinfestação dos explantes, sendo necessárias várias limpezas sucessivas para obter 40% de explantes desinfestados.

No estabelecimento de culturas assépticas de peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron), Ribas et al. (2005) utilizaram, com matrizes, mudas com dois anos e mantidas em casa de vegetação climatizada sob pulverizações quinzenais com benomil a 0,5 g L-1. Os explantes retirados de brotações apicais foram submetidos a tratamentos com NaOCl (0,125% e 0,25%) ou HgCl2 (0,025%; 0,05% e 0,1%). Os tratamentos com 0,25% de NaOCl e 0,05% de HgCl2 proporcionaram os melhores resultados de controle de contaminação. Para os autores, HgCl2 foi mais eficiente do que o NaOCl.

Outra forma na tentativa de eliminar ou minimizar contaminações in vitro é a adição de compostos ao meio de cultura. Nesse sentido, trabalhos têm sido conduzidos utilizando diferentes substâncias, como NaOCl (TEIXEIRA et al., 2005a, 2005b, 2006), H2O2 (YANAGAWA et al., 1995). Albuquerque et al. (2006) verificaram a eficiência do óleo essencial de Lippia gracillis adicionado ao meio de cultura, constatando inibição de 95%, 58% e 89,4% para Curvularia lunata e uma das espécies do gênero Aspergillus, respectivamente. Os fungos Trichoderma sp., Cladosporium sp., Penicillium sp., Sporotrichum sp., Chrysosporium sp. e duas espécies de Aspergillus foram inibidos completamente. Outras espécies e gêneros também têm sido estudados e suas propriedades antimicrobianas avaliadas, como Achillea (BAREL et al., 1991; ÜNLÜ et al., 2002); Artemisia caerulescens subsp. Gallica (MORÁN et al., 1989); Actinidia chinensis, Feijoa sellowiana e Aberia caffra (BASILE et al., 1997); Azadirachta indica (GOVINDACHARI et al., 1999, 2000); Toona ciliata e Amoora rohituka (CHOWDHURY et al., 2003); Mentha spicata, Lavanula angustifolia e Salvia fruticosa (ADAM et al., 1998); Salvia officinalis e Salvia triloba (DELAMARE et al., 2007); Cinnamomum zeylanicum, Mentha piperita, Ocimum basilicum, Origanum vulgare, Teloxys ambrosioides, Syzygium aromaticum, Thymus vulgaris e C. zeylanicum (MONTES-BELMONT; CARVAJAL, 1998); Salvia santolinifolia (AHMED et al., 1994); Inula helenium e Rosmarinus officinalis (BOATTO et al., 1994; CELIKTAS et al., 2007); Carissa lanceolata (LINDASAY et al., 2000); Yersinia pseudotuberculosis (BAKHOLDINA et al., 2001); Origanum (ADAM et al., 1998; BENDAHOU et al., 2008; DEMETZOS et al., 2001; MANOHAR et al., 2001); Lippia (PASCUAL et al., 2001, PESSOA et al., 2005); Adiantum lunulatum (REDDY et al., 2001); Thymus (ARRAS; USAI, 2001; BOUNATIROU et al., 2007; DOB et al., 2006; EBRAHIMI et al., 2008; PINA-VAZ et al., 2004; RASSOLI; MIRMOSTAFA, 2003; REDDY et al., 1998; ROTA et al., 2008; SOKMEN et al., 2004); Heteropyxis natalensis (VUUREN et al., 2007); Garcinia smeathmannii (KUETE et al., 2007); Guatteriopsis (COSTA et al., 2008); Pelargonium (LALLI et al., 2008); Treculia (KUETE et al., 2008); e Citrus (SHARMA; TRIPATHI, 2008; VIUDA-MARTOS et al., 2008).

Além destes, outros trabalhos com inúmeras espécies foram desenvolvidos: Amin et al. (2005); Bankova et al. (1999); Braca et al. (2008); Chang et al. (2001); Cos et al. (2006); Datefera et al. (2003); Dorman e Deans (2000); Dwivedi e Singh (1998); Franzblau e Cross (1986); George et al. (2006); Gundidza e Gaza (1993); Isman (2000); Lambert et al. (2001); Machado et al. (2003); Maksimović et al. (2005); Matasyoh et al. (2007); Najjaa et al. (2007); Ojala et al. (2000); Oyedeji et al. (1999); Pérez et al. (1999); Periago et al. (2002); Rios et al. (1987, 1988); Rios e Recio (2005); Skočibušić et al. (2006); Wannissorn et al. (2005); Yang et al. (2007).

Vírus

A seguir serão descritas as principais medidas de controle para as viroses em cultura de tecidos vegetais.

Cultura de ápices caulinares

Considera-se meristema apical o tecido que se encontra distal ao mais novo primórdio foliar, tendo o aspecto de uma cúpula proeminente ou plataforma achatada, estando, algumas vezes, embutido numa depressão. Seu tamanho não deve exceder 0,1 mm. As células desse tecido têm a propriedade de permanecerem na condição embrionária e, por meio de atividades morfogenéticas complexas, darão origem ao eixo vascular, folhas, gemas, órgãos de reprodução e outras estruturas laterais (CLARK, 1997).

A cultura de ápices caulinares, erroneamente chamada de cultura de meristemas, é utilizada para propagação de plantas in vitro, recuperação de plantas livres de vírus, conservação e intercâmbio de germoplasma e transformação (TORRES et al., 1998).

Provavelmente, todas as espécies propagadas vegetativamente estão infectadas com um ou mais vírus, principalmente os latentes que são difíceis de serem detectados pela sintomatologia visual.

A cultura de ápices caulinares é uma estratégia para o estabelecimento de estoques de plantas matrizes livres de vírus. Esse método baseia-se na premissa de que a concentração desse patógeno na planta infectada não é uniforme. A estratégia consiste em reproduzir, in vitro, plantas a partir de tecidos pressupostamente livres de vírus. Basicamente, a metodologia consiste na excisão da cúpula meristemática apical com um ou dois primórdios foliares, onde ainda não se observa conexão vascular com os tecidos da planta, podendo ser cultivada em meio nutritivo adequado para diferenciação e desenvolvimento dos sistemas caulinar e radicular. Existem hipóteses que relatam que os vasos condutores não conseguem atingir o meristema ainda indiferenciado e em constante multiplicação e, portanto, onde as partículas virais não conseguem alcançar. No entanto essas hipóteses ainda não estão comprovadas.

Microenxertia

Esta técnica consiste em microenxertar, em condições assépticas, um ápice caulinar, contendo de dois a três primórdios foliares, excisado de uma planta matriz, sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro. A microenxertia é aplicável quando não é possível a obtenção de plantas livres de viroses por cultura de meristemas.

A obtenção do porta-enxerto é feita por meio da germinação de sementes in vitro, que, na sua formação embrionária, eliminam a maioria dos vírus. Em seguida, o ápice caulinar é microenxertado em uma excisão em forma de T invertido no porta-enxerto, obtendo-se assim uma planta possivelmente livre de vírus (PASQUAL et al., 2001). Para que a microenxertia possa ser usada em toda a sua potencialidade, é necessário que seja implementado um sistema de indexação que permita identificar os vírus presentes na planta escolhida para matriz. Para citros, a indexação é realizada mediante a utilização de plantas indicadoras; por exemplo, a identificação da sorose do citrus é feita pela plantas indicadoras Laranja Pineapple e tangor Dweet (TORRES et al., 1998).

Termoterapia

Elevadas temperaturas são efetivas para a inativação e eliminação eventual de muitas viroses e algumas doenças bacterianas sistêmicas. Para este propósito é necessário selecionar um regime de temperatura que seja efetivo no tratamento, mas não letal para a planta ou material propagativo (GEORGE, 1993).

Quimioterapia

A erradicação de vírus em cultura de tecidos e órgãos poderia obviamente ser simplificada se houvesse um composto químico que pudesse limitar a replicação ou se movimentar em um largo espectro de espécies.

A prevenção de infecções viróticas em algumas plantas se dá por 2-thiouracil. Ele pode inibir a síntese de RNA ou vir a ser incorporado no seu RNA, caso o vírus seja não infectante.

O composto químico 1-β-D-ribofuranos-y1-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ribavirin) é o agente antiviral mais usado com sucesso em cultura de tecidos, mas ele não é suficientemente efetivo para ser usado em locais que utilizam outras técnicas em conjunto para eliminação do vírus (GEORGE, 1993).

Na recuperação de plantas de Cymbidium livres do CyMV, adicionou-se ao meio de cultura, respectivamente, ditiouracil (0,1 mmol L–1) e ribavirin (0,2 mmol L-1). Esse tratamento foi bastante efetivo, e a maioria das plantas obtidas permaneceu livre de vírus 2,5 anos após a quimioterapia (PORTER; KUEHNLE, 1997).

Reguladores de crescimento

Alguns autores têm sugerido que citocininas podem ser responsáveis pela erradicação de vírus durante a cultura de meristemas, mas isso não é ainda uma ideia concreta. Há relatos de que elevadas concentrações de citocininas produziram estruturas temporárias nas folhas de algumas espécies ornamentais semelhantes às produzidas pelo ribavirin.

O ácido giberélico (GA3) também é usado para o controle de viroses, visto que esse regulador de crescimento induz o alongamento celular rapidamente, fazendo com que a replicação viral não acompanhe o crescimento do vegetal.

Eletroterapia

A eletroterapia refere-se à manutenção da planta ou parte desta em corrente elétrica contínua durante um determinado período de tempo. Em plantas de Solanum tuberosum infectadas com PVX, porções de caule de 4 cm a 5 cm de tamanho, submetidas a 15 mA durante 5 minutos, formaram brotações em até 80% dos explantes. Ao mesmo tempo não foi detectada a presença do vírus X entre 60% e 100% das plantas regeneradas (LOZOYA-SALDANÃ, 1996 citado por TORRES et al., 1998). Esses autores ainda ressaltaram que essa estratégia tem mais vantagem que a termoterapia, pois produz, com maior eficiência, plantas livres de vírus em um menor intervalo de tempo. Em adição, os pulsos elétricos têm mostrado efeito no crescimento e morfogênese in vitro.

Estiolamento

O desenvolvimento da planta no escuro faz com que não haja formação de clorofila; as folhas permanecem pequenas e rudimentares, e os entrenós alongam-se acentuadamente. A taxa de replicação e/ou movimentação viral não acompanha o alongamento do ápice, e, assim, esse explante tem maior possibilidade de estar livre de contaminantes. A combinação dessa técnica com a termoterapia é mais eficiente para recuperação de plantas livres de vírus (TORRES et al., 1998).

Insetos e ácaros

Muitos insetos e ácaros são resistentes a uma gama de inseticidas e acaricidas, e muitos destes, como o endossulfan, são ativos contra tripes e ácaros e altamente fitotóxicos quando presentes no meio de cultivo de plantas (GEORGE, 1993). Medidas preventivas como desinfestação dos explantes antes do estabelecimento in vitro, bem como limpezas dos compartimentos do laboratório, assepsia e detetização anual do mesmo, são eficazes na redução da entrada desses patógenos in vitro. Portanto, deve-se majoritariamente evitar a entrada destes no laboratório por meio do controle preventivo, visto que o tratamento com produtos químicos no meio de cultivo é problemático.

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Capítulo 3
Detecção, isolamento e preservação de microrganismos contaminantes da cultura de células, tecidos e órgãos de plantas

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Flavio Alterthum

Introdução

Numerosos gêneros de microrganismos têm sido encontrados vivendo associados epifítica ou endofiticamente a tecidos e órgãos de plantas. Especialmente os de origem endofítica, ou seja, que vivem internamente nas mais diversas partes das plantas, podem escapar do efeito das substâncias desinfestantes utilizadas antes do estabelecimento in vitro dos propágulos vegetativos, introduzindo-se ao meio de cultura junto com o explante inicial. Algumas espécies apresentam a capacidade de se expressarem em meio de cultivo de plantas logo nos primeiros dias de cultivo. Outras, porém, permanecem latentes no interior dos tecidos permanecendo protegidas dos agentes químicos. Por meio de mecanismos de permanência no interior dos tecidos, podem se propagar com o material vegetal durante os subcultivos, permanecendo latentes por longos períodos de tempo, em virtude de inibições ocasionadas por fatores como concentrações de certos sais e pH do meio, resíduos de substâncias desinfetantes utilizadas nos explantes e compostos antimicrobianos no meio de cultura.

Na maioria das vezes, a contaminação em um cultivo in vitro não é por causa de uma única espécie contaminante. Assim, é possível que o uso isolado de uma substância antimicrobiana, sem a relativa comprovação de sua eficiência em relação ao agente contaminante, não promova a eliminação por completo dos contaminantes presentes no cultivo. Por isso, um número considerável de autores combina duas ou mais substâncias, seja para aumentar as chances controle do total de microrganismos crescidos no meio de cultura ou para tornar essas substâncias mais efetivas no controle de uma determinada espécie contaminante (GILBERT et al., 1991; YEPES; ALDWINCKLE, 1994).

Mas mesmo que se faça a combinação de antimicrobianos, a adição destes no meio de cultura não é garantia de êxito no controle dos contaminantes por não se conhecer o tipo de contaminante e por não se saber a efetividade dessas substâncias junto ao contaminante aparente no meio de cultura. Portanto, além de ineficaz, o tratamento também pode se tornar caro pelo elevado preço desse tipo de substância. Além disso, assim como no tratamento de doenças, a identificação do patógeno é de fundamental importância para a seleção de substâncias de controle.

Boa parte dos antibióticos atualmente encontrados no mercado apresentam amplo espectro de ação, sendo eficazes tanto para espécies do grupo das gram-negativas como das gram-positivas. No entanto, para quem trabalha na cultura de tecidos, o detalhe da fitotoxicidade não pode ser esquecido, uma vez que os antibióticos normalmente usados na cultura de tecidos são os mesmos recomendados para a cura de doenças em plantas e seres humanos. Isso significa dizer que determinados tipos e concentrações de antibióticos quando adicionados ao meio de cultura podem ser tóxicos ao cultivo e, dessa forma, causar a perda do material vegetal (PEREIRA et al., 2003). Chama-se a atenção também para o fato de que o conhecimento e a interação dos microrganismos com o habitat e a descoberta de substâncias para seu controle são baseados em estudos com culturas puras.

Estratégias para a detecção inicial de contaminantes

Durante o ciclo vegetativo, os vários processos resultantes do desenvolvimento de um vegetal são importantes portas de entrada de microrganismos. É assim que acontece com a maioria das espécies causadoras de doenças de plantas, os saprófitos e os endofíticos encontrados nas plantas. Assim, basta que uma planta seja estabelecida em solo não desinfetado e sob condições externas para qualquer tipo de abertura favorecer a entrada de microrganismos, quer seja por aberturas naturais, como estômatos, lenticelas e flores ou pela expansão de raízes, quer seja por ferimentos causados mecanicamente ou por insetos e animais.

Diferente de muitos tipos de fungos, normalmente bactérias só são capazes de penetrar num vegetal por aberturas, uma vez que não são capazes de romper as camadas iniciais de células da planta. E, nesse contexto, a penetração causada por ferimentos é normalmente até mais importante que a penetração por aberturas naturais. Isso se deve ao fato de que logo após o ferimento há liberação de exsudados na parte ferida que podem servir como substâncias atrativas ao microrganismo em questão. Além disso, esse tipo de abertura proporciona o contato direto e mais profundo do microrganismo com as células e espaços intercelulares do hospedeiro, facilitando sua penetração e consequente translocação pela planta. E como é praticamente impossível se cultivar plantas em condições totalmente assépticas, a não ser sob condições in vitro, pode-se afirmar que todos os vegetais possuem uma importante flora microbiana no interior de seus tecidos.

Mas se ainda estamos longe de elucidarmos a importância e a relação desses microrganismos endógenos com a fisiologia e o desenvolvimento das plantas, sabidamente se reconhece que eles são as grandes causas de perdas de material em laboratórios de micropropagação, especialmente na etapa de estabelecimento do material. Para tanto, sua detecção prévia é altamente necessária para que se evite a multiplicação de materiais contaminados.

De modo geral, não há dificuldades para a detecção prévia de microrganismos num vegetal ou parte dele. As estratégias limitam-se a observar a presença dessa flora endofítica diretamente nos tecidos da planta por meio da microscopia ou então pela sua detecção por meio do crescimento de microrganismos em meios de cultura nutritivos enriquecidos. Apesar de raramente ser utilizada na cultura de tecidos para fins de visualização de contaminação, a técnica de detecção ou visualização por microscopia é a mais precisa quando se deseja observar a localização dos microrganismos nas diversas partes da planta, por exemplo, os espaços intra e intercelulares e o interior de tecidos vascularizados. Embora a detecção por microscopia nos proporcione importantes informações sobre a localização dos microrganismos na planta, na cultura de tecidos é uma técnica muito pouco utilizada. A grande maioria dos trabalhos de pesquisa visando à detecção de microrganismo é realizada cultivando tecidos ou órgãos de plantas em meios de cultura enriquecidos.

De maneira geral, qualquer meio de cultura que promova um eficiente crescimento microbiano pode ser utilizado para a detecção da flora microbiana presente nos tecidos das plantas. Em razão do elevado número de meios disponíveis e da complexidade na composição destes, uma vez que para muitas espécies já foram determinados meios específicos, torna-se difícil listar um meio de cultura ideal para o cultivo desses microrganismos in vitro. Além disso, normalmente não se sabe o tipo de contaminante na amostra, o que sugere a utilização de meios enriquecidos visando proporcionar o aparecimento do maior número possível de espécies nas placas.

Nesse aspecto, deve-se atentar para o fato de que determinadas formulações, pelas altas concentrações de nutrientes minerais, podem causar seletividade no crescimento microbiano, uma vez que muitos requerem condições e meios especiais para sustentar seu crescimento. Acrescente-se a isso o fato de que determinados grupos de microrganismos produzem substâncias que, em baixas concentrações, são antagônicas ao crescimento de outros grupos taxonomicamente afins. Este é o caso de algumas estirpes bacterianas que produzem bacteriocinas, consideradas por definição como substâncias com efeito antibiótico.E, em se tratando de ecologia microbiana, assume-se que esses grupos apresentam vantagem adicional em termos de sobrevivência e competição sobre aquelas incapazes de sintetizar tais substâncias.

Não bastasse a seletividade ocasionada pelas condições nutricionais dos meios e antagônicas dos microrganismos, sabe-se que os diferentes grupos de microrganismos apresentam crescimento mais ou menos lento que outros levando, muitas vezes, a erros de interpretação sobre a presença ou não de contaminantes no material em estudo. Portanto, propiciar condições ótimas de crescimento, especialmente relacionadas às condições nutricionais e físicas do meio, é aspecto importante que deve ser observado no estudo.

Como sabemos, os nutrientes para o crescimento microbiano são fornecidos por meios de cultura, e, assim como para qualquer tipo de organismo vivo, todas as células necessitam de uma fonte de carbono e energia e de diferentes tipos de sais inorgânicos (N, P, K, Fe, etc.) para seu crescimento. Os meios de cultura destinados ao cultivo de plantas, além de conter nutrientes minerais essenciais para o crescimento das plantas, contêm altas concentrações de sacarose e outros nutrientes orgânicos (vitaminas e aminoácidos) que garantem o crescimento das plantas sob condições in vitro. A sacarose é adicionada ao meio para a geração de esqueletos de carbono e produção de energia, visto que a fotossíntese das plantas é inferior ou quase inexistente nessas condições, quando comparada à das plantas sob condições naturais.

Se por um lado a sacarose constitui componente essencial para as plantas, sua adição combinada a outros componentes orgânicos torna o meio de cultura também como um excelente substrato para o crescimento de fungos, leveduras e bactérias (Tabela 1). E é por isso que apesar de não serem específicos para o crescimento microbiano, mesmo em meios de cultura como o de Murashige e Skoog (1962), amplamente usado para o cultivo de plantas in vitro, observa-se o aparecimento de contaminantes fúngicos e bacterianos.

Tabela 1. Composição iônica de macro e micronutrientes de dois meios de cultura utilizados para o cultivo de plantas e fungos.

Nutriente

Elemento

Meio de Murashige & Skoog (1962): cultivo de plantas

Meio de Vogel (1966): crescimento de fungos

Macronutrientes (mM)

Nitrato

NO-3

39,40

16,85

Amônio

NH4

20,61

8,13

Potássio

K+

20,04

10,56

Cloreto

Cl-

5,98

0,57

Cálcio

Ca2+

2,99

0,33

Magnésio

Mg2+

1,50

0,34

Sulfato

SO3-4

1,50

1,32

Fosfato

PO3-4

1,24

26,18

Micronutrientes (µM)

Ferro

Fe

337,54

12,75

Boro

B

100,25

0,79

Manganês

Mn

99,97

22,40

Zinco

Zn

29,90

18,28

Molibdênio

Mo

1,03

0,21

Cobre

Cu

0,10

0,1

Sacarose

87,60

–

Glucose

–

55,00

Nutrientes orgânicos (µM)

Glicina

25,40

–

Inositol

555,00

–

Tiamina

0,30

0,19

Ácido nicotínico

4,06

–

Piridoxina

2,43

–

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1994).

Rotineiramente, os meios de cultura mais utilizados para o isolamento de fungos e bactérias contaminantes têm sido o Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e o Ágar Nutriente (AN), respectivamente. Mas diversos outros meios ou formulações, como o 523 (KADO; HESKETT, 1970), Triptic Soy Agar (TSA 10%), Triptic Soy Broth (TSB 5%), ou mesmo formulações mais pobres como o ágar-água, podem ser utilizados para o isolamento e crescimento fúngico e bacteriano. O uso de dois ou mais meios de cultura visando aperfeiçoar o crescimento e obter o maior número de isolados possíveis é uma prática recomendável para se evitar que a comunidade associada ao hospedeiro seja subestimada. Essa estratégia foi utilizada por Oliveira et al. (2000) que utilizaram três diferentes tipos de meio de cultura indicadores para a detecção inicial de contaminantes no estabelecimento in vitro de gemas apicais de bananeira. Embora não tenham observado diferenças quanto ao tipo de meio utilizado, os autores relataram a dificuldade de visualização das colônias crescidas e relacionaram esse problema à translucidez dos meios, especialmente para o tipo de solidificante utilizado.

Dependendo do tipo de microrganismos que se quer detectar, normalmente o meio para fungos e bactérias apresenta uma pequena variação de pH. Para fungos o pH do meio é ligeiramente ácido (pH de 5 a 6), enquanto que para bactérias tende a alcalinidade (pH entre 7,0 e 7,2). Assim, dependendo dos microrganismos, os meios de cultura devem ser ajustados dentro dessas faixa específicas de pH à temperatura ambiente antes de serem autoclavados. Dependendo ainda dos microrganismos que se quer isolar e estudar, o meio de cultura pode ser suplementado com substâncias antifúngicas (fungicidas) ou antibacterianas (bactericidas) adicionando-as ao meio depois da esterilização, a frio, enquanto o meio estiver em processo de resfriamento, com temperatura não superior a 50 °C.

Outro fator a ser observado refere-se à temperatura de incubação. Além de variar de acordo com os grupos microbianos a serem isolados, a temperatura de incubação está diretamente relacionada com as reações metabólicas e necessidades nutricionais dos microrganismos, influenciando, dessa forma, o crescimento microbiano in vitro. As faixas de crescimento microbiano são bastan-te amplas, podendo situarem-se entre 20 °C e 37 °C. No entanto, como normalmente não se conhece o tipo de contaminante presente no material vegetal, pode-se utilizar inicialmente a temperatura padrão de 28 °C, embora testes de crescimento em diferentes padrões de temperatura sejam altamente recomendados.

O tempo de incubação pode variar de um dia a várias semanas, uma vez que algumas espécies podem apresentar crescimento mais lento que outras. No entanto, recomenda-se que, uma vez sob cultivo, as avaliações de crescimento sejam feitas diariamente para evitar que o tempo excessivo de isolamento possa levar ao aparecimento de contaminantes externos aos pretendidos.

Métodos empregados para o isolamento de contaminantes

Como as bactérias apresentam pouca variação morfológica, é praticamente impossível identificá-las pelo exame direto no microscópio, como normalmente acontece com os fungos. Assim, é necessário que elas sejam devidamente isoladas e purificadas de forma a permitir sua identificação por um conjunto de características e técnicas que incluem a morfologia das colônias e as técnicas bioquímicas, as reações a tratamentos com corantes e as moleculares, que são especificadas no capítulo 4.

De modo geral, são poucos os métodos empregados para o isolamento de contaminantes. Especialmente na área de cultura de tecidos, o isolamento de microrganismos contaminantes pode ser feito de duas formas: direta ou indireta.

Isolamento de forma direta

A forma direta é a mais comumente utilizada nos trabalhos visando à identificação e ao controle de microrganismos contaminantes de plantas in vitro. A técnica consiste em isolar os microrganismos logo após a comprovação visual do crescimento do contaminante in vitro. Com o auxílio de uma alça de platina ou palito esterilizado, colhe-se uma amostra do material contaminante, inoculando-o em um meio de cultura enriquecido (ME), como o ágar nutriente (AN), sendo em seguida colocado para crescer em temperatura de 28 °C a 30 °C. Uma vez crescido, esse material poderá ser utilizado para a etapa seguinte, ou seja, de purificação das colônias bacterianas.

Forma indireta

A forma indireta é a mais aconselhável para estudos de prevenção e conhecimento de populações endógenas presentes nos tecidos da planta. É pouco utilizada na cultura de tecidos, pelo menos para o controle, mas trata-se de uma técnica amplamente utilizada por microbiologistas no estudo de populações endofíticas e suas relações com as plantas e o ambiente.

A técnica consiste em cultivar explantes de qualquer parte da planta (brotações, folhas, entrenós, raízes, etc.) em meio de cultura enriquecido para promover o crescimento dos microrganismos presentes no vegetal em estudo. Nesse sentido, dependendo do tipo que se quer isolar, o meio de cultura pode ser suplementado com substâncias antifúngicas e antibacterianas visando à seletividade do crescimento. Nessa etapa, é fundamental que se obtenha o máximo possível de amostras da comunidade interiorana da planta, que represente as diferentes populações e espécies presentes naquele hospedeiro.

O passo inicial para o isolamento desses tipos de microrganismos refere-se à coleta das amostras. Estas devem ser provenientes de plantas sadias, sem nenhum sintoma que denote a presença de doenças. Deve-se também levar em consideração que diferenças de clima (época do ano), região (locais diferentes de coleta), estágio de desenvolvimento da planta (juvenil e adulta), bem como o tipo de material a ser coletado (folhas, raízes, hastes, brotações) podem proporcionar o crescimento de diferentes espécies de microrganismos, já que estes podem estar localizados em locais específicos dentro de uma mesma planta.

Uma vez selecionadas as partes da planta a serem cultivadas, os materiais são levados para o laboratório onde são submetidos à desinfestação superficial visando à completa eliminação da comunidade epifítica ou saprófita no tecido que se quer cultivar, tomando-se o cuidado de manter íntegras as partes internas do vegetal. Apesar da ampla gama de produtos possíveis de serem utilizados nessa etapa (peróxido de hidrogênio, formaldeído, etc.), os protocolos mais citados são aqueles que usam álcool (70%), hipoclorito de sódio ou cálcio, seguidos de lavagens consecutivas em água destilada e esterilizada. Os tempos de imersão variam em função da consistência do material. Assim, tecidos foliares normalmente requerem menos tempo de contato com essas substâncias quando comparadas a brotações ou internódios. Outro importante fator a considerar refere-se aos enxágues com água esterilizada, cujo objetivo é eliminar o excesso das substâncias desinfestantes que pode tanto ferir o material em cultivo, como inibir o crescimento microbiano pela ação tóxica.

Técnicas empregadas para o isolamento de forma indireta

Em seguida ao processo de desinfestação, o próximo passo para o cultivo desses explantes visando ao conhecimento da flora microbiana presente no vegetal é o cultivo fracionado dos explantes ou do extrato desses tecidos em meio de cultura.

Fracionamento dos explantes

A técnica por fracionamento dos explantes consiste em seccionar os explantes, colocando-os em contato com o meio de cultura. Cada explante é normalmente dividido em partes de 0,5 cm a 1 cm, tomando-se o cuidado de eliminar as extremidades no caso de hastes, brotações e internódios, e as bordas, no caso de folhas, que sofreram influência direta dos agentes desinfestantes. Após devidamente identificados e com o auxílio de uma pinça, os explantes são transferidos para placas de Petri com meio enriquecido onde permanecem incubados sob temperatura de 28 °C a 30 °C. O tempo de incubação será aquele necessário para que se visualize o crescimento dos microrganismos ao redor dos explantes em cultura, que, dependendo da espécie e do tipo, podem variar de algumas horas a semanas, embora o crescimento de fungos seja normalmente mais lento do que bactérias, e num prazo não superior a cinco dias uma importante flora microbiana deve ser observada. Essa técnica é a menos trabalhosa e a mais simples de ser executada, sendo indicada especialmente para o isolamento de espécies que colonizam os vasos condutores do hospedeiro.

Maceração dos tecidos

Quando o objetivo do trabalho for a determinação total da flora microbiana, independentemente de sua localização no vegetal, é mais indicado que os tecidos previamente selecionados sejam macerados em água, solução salina ou meio de cultura líquido esterilizados, e que este seja inoculado sobre um meio de cultura semissólido capaz de promover o crescimento microbiano. Também nesse caso, a desinfestação prévia dos explantes a serem utilizados é de fundamental importância para que se evite a contaminação das amostras por microrganismos epifíticos ou saprófitas, que possivelmente seriam eliminados pela desinfestação externa do tecido em estudo.

Uma vez realizada a desinfestação, com o auxílio de cadinhos e maceradores (pistilos) e sob absoluta condições de assepsia, 1,5 g de tecido vegetal é macerado em 5 mL de solução, com o intuito de liberar células dos endófitos presentes nas amostras. Para melhorar a difusão dos microrganismos para a solução diluidora e aumentar, assim, as chances de isolamento de microrganismos de baixa frequência nos tecidos e de crescimento lento em meio artificial, aconselha-se que o material macerado fique em repouso ou suave agitação de 20 a 30 minutos.

Uma vez terminado esse tempo, realiza-se o semeio desse macerado sobre a superfície do meio de cultura semissólido contido em placas de Petri e espalhamento com o auxílio de alça de repicagem. O uso dessa técnica pode permitir o surgimento de colônias isoladas. Para tanto, é aconselhável que se realizem diluições seriadas da solução macerada a fim de promover um eficiente crescimento individual de colônias, facilitando, dessa forma, as primeiras observações sobre as características morfológicas (tamanho da colônia, cor, brilho, bordas, etc.) dos isolados, além de ser uma importante indicação da diversidade naquele material vegetal.

Purificação dos contaminantes

Uma vez isolados os contaminantes, o crescimento das colônias em meio de cultura enriquecido normalmente não ultrapassa cinco dias. A partir de então, com as colônias desenvolvidas, realiza-se a purificação deles, já que na maioria das vezes pode haver mais de uma espécie contaminante.

As colônias são purificadas, tendo como critério as características morfológicas e microscópicas distintas dos isolados. As colônias assim selecionadas sofrem purificação pela técnica de esgotamento por estrias, no mesmo meio em que são repicadas (AN), sendo incubadas nas mesmas condições iniciais para crescimento. O número de subcultivos (repicagens) é variável e deve ser feito até que se obtenham colônias puras, comprovadas por meio de observações em microscópio estereoscópio (lupa).

Após os subcultivos, as colônias isoladas podem ser repicadas para tubos de ensaio com 20 mL de meio em bisel e armazenadas por curtos períodos de tempo a 4 ºC.

Controle da contaminação por meio da indexação dos materiais propagativos nos subcultivos

Mesmo que aparentemente após alguns dias passados do estabelecimento de material vegetal in vitro não se observe contaminação visual, bactérias podem permanecer latentes no interior dos tecidos e não apresentar crescimento por alguns subcultivos. Por isso, para evitar que o trabalho de vários subcultivos seja prejudicado ou até mesmo perdido com o aparecimento de contaminantes, testes simples de indexação dos materiais em cada multiplicação são indicados. Além de ser um indicativo da eficiência ou não do protocolo de descontaminação, a indexação do material nos subcultivos é importante por poder indicar a fonte da contaminação, uma vez que o aparecimento de contaminantes durante o subcultivo pode ser um indicativo da manipulação do material pelos operadores.

Para a detecção dos contaminantes, recomenda-se que utilizem meios de cultura enriquecidos, nos quais são semeados ou cultivados amostras do material em estudo.

Método da semeadura

Partindo-se de material aparentemente asséptico e já estabelecido, a parte interna recém dividida do explante no subcultivo é suavemente tocada com uma alça de platina ou com a lâmina do bisturi. Em seguida, a alça ou a lâmina é cuidadosamente colocada em contato com a superfície do meio de cultura escolhido para o teste, promovendo, assim, a semeadura de possíveis contaminantes. É possível também que essa semeadura seja feita de forma direta, tocando com a superfície do explante recém cortado o meio de cultura enriquecido. Sinais de crescimento microbiano nesse meio após alguns dias da semeadura são um indicativo de que o material está contaminado, embora em meio de multiplicação esse aspecto possa não ser evidente.

Método do cultivo de partes do explante

A indexação das plantas durante os subcultivos por meio de partes do explante consiste em cultivar as extremidades dos explantes no momento em que estes são subcultivados para um novo meio de cultura, preferencialmente enriquecido. Esse método é mais confiável que o anterior pelo fato de que, havendo presença de contaminantes, estes se desenvolvem próximos ao explante, eliminando possíveis dúvidas sobre a origem da contaminação.

Além da utilização de meio semissólido, o cultivo de partes do explante também pode ser feito em meio líquido sob agitação, com a vantagem de se observar um crescimento mais rápido de eventuais contaminantes. No entanto, assim como para o método de semeadura, nessa consistência do meio não é possível se ter certeza da contaminação ter sido originada do explante ou da manipulação.

Testes para avaliar a possível fitopatogenicidade dos isolados

Apesar de muitos autores declararem que as espécies contaminantes in vitro são raramente fitopatogênicas, a distinção entre ser ou não fitopatogênico é difícil de ser feita, pois a colonização de plantas por microrganismos endofíticos pode ser semelhante, em muitos casos, às infecções latentes por fitopatógenos. Esse fato foi citado por Bashan et al. (1982) que verificaram que isolados de Xanthomonas foram capazes de se multiplicarem endofiticamente em folhas de pimenta até que, sob determinadas condições ambientais, causaram sintomas no hospedeiro. Dessa forma, alguns testes rápidos podem ser realizados visando determinar essa característica dos organismos isolados.

Um dos métodos mais simples e rotineiramente utilizados é o teste de hipersensibilidade. O estudo de reações de hipersensibilidade em plantas por alguns tipos de bactérias permite detectar a fitopatogenicidade dos isolados, sendo uma importante fonte de informação sobre os microrganismos isolados, uma vez que, em virtude da elevada diversidade de bactérias muitas vezes crescidas nas placas, algumas podem se mostrar patogênicas ou serem de origem saprófita, ou seja, não causarem sintomas nos tecidos das plantas, mas serem consideradas contaminantes dos meios de cultura. Embora seja uma prática bastante comum nos laboratórios de fitopatologia, alguns cuidados especiais devem ser levados em consideração na aplicação da técnica.

Como citado previamente, o teste destina-se a detectar reações de hipersensibilidade das plantas a microrganismos, desde que estes sejam incompatíveis com o hospedeiro. Em outras palavras, significa dizer que na prática deve-se ter o cuidado de utilizar como planta-teste uma espécie não hospedeira para evitar resultados negativos, quando estes são na verdade positivos. Mas mesmo que se utilizem plantas não hospedeiras, existem inúmeros relatos sobre reações alternadas de potenciais microrganismos patogênicos mesmo em plantas não hospedeiras, como nos casos relatados por Gomide e Romeiro (1992) e Romeiro et al. (1988), que verificaram que algumas espécies de Xanthomonas e Erwinia apresentavam reações de sensibilidade típicas, mas outras vezes comportavam-se como saprófitas, deixando de incitar qualquer tipo de sintoma visível nas plantas testadas. Além disso, é comum que determinadas espécies de plantas escolhidas para o teste apresentem resultados divergentes e nem sempre respondem de maneira hipersensível à inoculação de microrganismos fitopatogênicos. Esse é o caso de plantas de fumo que podem facilmente apresentar reações típicas de sensibilidade em detrimento a outras plantas que podem não apresentar esses sintomas, mesmo utilizando o mesmo isolado para os testes. Por isso a importância de se utilizar, quando possível, mais de uma espécie de planta, como fumo, feijão, café, pimentão, soja, etc., para confirmar os resultados do teste.

Procedimentos para a realização do teste

Apesar de ser simples e rotineiro, o teste de hipersensibilidade requer que alguns aspectos básicos sejam observados na sua realização: que se utilizem células bacterianas em concentrações adequadas (de 107 UFC mL-1 a 108 UFC mL-1), que estas estejam vivas, que sejam aplicadas sob condições ambientais adequadas, além de se usar uma planta não hospedeira.

Nesse teste, os isolados bacterianos a serem testados são colocados para se desenvolverem em meios de cultura por 18 a 48 horas, preferencialmente utilizando-os na fase exponencial de crescimento. Uma vez desenvolvido o cultivo, utilizando-se água estéril ou solução salina (5 mL em tubo de ensaio), prepara-se uma suspensão bacteriana, que com o auxílio de uma seringa sem agulha é infiltrada no espaço internerval da face inferior da folha, sob a epiderme. A infiltração deve ser realizada lentamente até que se observe uma área encharcada na folha em razão do encharcamento dos espaços intercelulares. Uma vez terminado o processo, a área infiltrada toma uma coloração verde escura, que desaparece dentro de 30 minutos. Nesse teste, pode-se fazer a infiltração de vários isolados numa mesma planta, desde que na inoculação se utilize uma folha por isolado, e a identificação seja feita com atenção.

Uma vez realizada a infiltração dos isolados, as plantas devem ser mantidas sob condições de temperatura que não ultrapasse a 30 ºC, pois temperaturas superiores podem induzir resultados falso-positivos. O resultado do teste é rápido e bastante informativo, pois em pouco tempo após a infiltração já é possível verificar os resultados. A reação é positiva quando a parte infiltrada se necrosa dentro de um prazo de 12 a 24 horas. Necrose, amarelecimento ou dessecamento que começarem a surgir após esse período não devem ser interpretados como sintomas de sensibilidade.

Preservação dos microrganismos

Uma vez isolado um microrganismo, é desejável e, às vezes, necessário conservá-lo em laboratório para identificação, estudo ou uso no futuro. São várias as técnicas empregadas, e a escolha dependerá do tipo (gênero, espécie, grupo, subgrupo, raça, cepa, etc.) e do número de microrganismos diferentes, do tamanho do laboratório de microbiologia, das disponibilidades material e humana, bem como dos recursos financeiros disponíveis e da qualificação dos técnicos, entre outros fatores (GHERNA, 1995; ISAAC; JENNINGS, 1995).

Subculturas periódicas

A técnica mais comum consiste em semear o microrganismo em meio de cultura sólido, distribuído em tubos e periodicamente transferi-lo para novo meio. O tempo decorrido de uma transferência para outra dependerá da resistência do microrganismo bem como da composição do meio de cultura. É conveniente que o metabolismo microbiano seja reduzido tanto quanto possível, pois nessas condições ele permanecerá viável por tempo mais prolongado. Para conseguir tal resultado, há vários recursos que poderão ser aplicados de acordo com o tipo de microrganismo. Um deles, o mais simples, consiste em conservar as culturas microbianas à temperatura de geladeira; há bactérias e fungos que permanecem viáveis durante semanas e até meses. Outra técnica consiste em recobrir a cultura, após seu crescimento, com uma camada de óleo mineral estéril, reduzindo dessa forma o suprimento de oxigênio e, consequentemente, o metabolismo microbiano.

Para evitar o ressecamento das culturas, recomenda-se usar tubos com rosca e, além disso, recobrir a tampa com parafilme ou parafina.

A conservação em meio de cultura sólido envolve um trabalho intenso e constante, principalmente quando o número de microrganismos na coleção é grande. Além disso, são necessários muita atenção e cuidados na transferência ou repiques para evitar contaminações, ou seja, a proliferação de microrganismos indesejáveis. Outro aspecto relevante nessa técnica de conservação é que alguns microrganismos podem sofrer mutações durante sua multiplicação e com isto ter suas características genéticas alteradas.

Congelamento (até -20 ºC)

Algumas espécies bacterianas e fúngicas podem ser conservadas a temperaturas que variam de 0 ºC a -20 ºC, por período de alguns meses até dois anos. Para períodos maiores, não deve ser usado esse método, pois no seu procedimento de resfriamento há perdas significativas da viabilidade.

Nesse método, prepara-se uma suspensão microbiana, adiciona-se um crioprotetor como o glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) e procede-se ao congelamento lento. Esse detalhe técnico é importante, pois congelamentos rápidos ou bruscos levam a formação de cristais de gelo intracelulares e consequentemente a perda de viabilidade. Considera-se satisfatório a diminuição de 1 ºC a cada dez minutos. Crioprotetor é uma substância que penetra com facilidade na célula, atóxica na concentração empregada, e que protege ou diminui a formação de cristais que poderiam romper a membrana.

Congelamento (até -70 ºC)

O congelamento a -70 ºC é melhor que o anterior a -20 ºC no aspecto do tempo de conservação. O procedimento é semelhante, ou seja, a suspensão é misturada a um crioprotetor, por exemplo, glicerol, na concentração de 1/1. Essa mistura é acondicionada em pequenos tubos estéreis e colocada em congelador a -70 ºC.

Alguns cuidados são essenciais: a) a suspensão microbiana deve conter de 108 a 109 microrganismos por mL; b) não congelar ou descongelar mais do que uma vez; c) se for descongelar, faça-o rapidamente, colocando o frasco em banho-maria; d) marcar os tubos ou frascos com tintas ou marcadores que não saiam a baixas temperaturas. Os rótulos normalmente não suportam temperaturas tão baixas.

Uma pequena variante desse método, mas muito útil, é preparar pérolas de vidro que serão embebidas na suspensão citada acima e colocadas em pequenos frascos. Quando houver necessidade de recuperar o microrganismo, basta retirar uma pérola de vidro e colocar num meio de cultura adequado ao crescimento.

Congelamento (até -196 ºC)

Temperaturas em torno de -196 ºC têm sido obtidas em nitrogênio líquido e se mostrado muito eficientes para preservar microrganismos. Assim como em outros procedimentos, cultiva-se o microrganismo em condições ideais de crescimento, e a seguir as culturas são centrifugadas. Às células distribuídas em frascos de plásticos com capacidade para 4 mL, adiciona-se um crioprotetor, e a seguir inicia-se o abaixamento da temperatura. Inicialmente é lento até atingir -40 ºC, e em seguida coloca-se o crioprotetor em nitrogênio líquido para atingir -196 ºC. A essa temperatura os microrganismos podem ser conservados por muitos anos, dependendo sempre do tipo de microrganismo.

A recuperação é feita pelo descongelamento rápido em banho-maria e adiciona-se meio de cultura adequado para o crescimento do microrganismo.

Secagem

A maior parte das culturas de microrganismos morrem se dessecadas. Algumas, porém, se forem esporuladas (bactérias e fungos), podem ser preservadas por anos a fio. Os esporos (bacterianos) já são formas de resistência em virtude de seu protoplasma menos hidratado e, quando colocados em ambientes mais secos, tendem a se tornar ainda mais resistentes. Deve-se, portanto, cultivar o microrganismo de forma a esporular antes de prepará-lo para a conservação.

Uma forma simples e econômica de armazenar esporos é secá-los em fitas ou discos de papel de filtro e armazená-los num tubo de ensaio. Cada vez que for necessário, remove-se uma fita ou disco com auxílio de uma pinça e inocula-se num meio de cultura adequado. É recomendado que seja colocado em torno de 108 esporos viáveis por fita ou disco.

Outra forma econômica de armazenar bactérias é adsorvê-las à superfície de pérolas de vidro previamente lavadas, secadas e esterilizadas. A estas pérolas, adiciona-se uma suspensão de 108 bactérias por mL. Deixa-se secar, removendo, se necessário, excessos de suspensão e a seguir são colocadas em tubos de ensaio hermeticamente fechados e mantidos em temperatura de geladeira.

Fungos são conservados misturando-os com areia ou solo previamente esterilizados. Em alguns casos são cultivados no próprio solo e aí preservados, e em outros são adicionados após seu crescimento.

Liofilização

Este é um dos melhores métodos de preservação de microrganismos, e o processo é conduzido em aparelhos chamados liofilizadores. Em linhas gerais, o método consiste em cultivar o microrganismo em ótimas condições de crescimento e centrifugar ao final da fase logarítmica (se for uma cultura líquida). Adicionar às células um crioprotetor previamente esterilizado irá protegê-las para a fase seguinte que é a de congelar os microrganismos a -70 ºC. Glicerol, DMSO, leite desnatado são alguns dos protetores mais empregados. A suspensão microbiana é acondicionada em frascos ou ampolas de vidro, congeladas e a seguir colocadas no liofilizador para a secagem das células por meio do processo da sublimação, ou seja, a água é retirada da fase sólida e transportada à fase gasosa sem passar pela fase líquida. Para tanto, as células são submetidas ao alto vácuo no liofilizador. Concluída essa etapa, os frascos ou ampolas de vidro são fechados ou selados. Após a liofilização, as culturas devem ser mantidas em ambientes secos e temperaturas de geladeira, ou melhor ainda em congelador, a -30 ºC.

Referências

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GHERNA, R. L. G. Culture preservation. In: GERHARDT, P.; MURRAY, R. G. E.; WOOD, W. A.; KRIEG, N. R. Methods of general and molecular bacteriology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1995. p. 278-294.

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GOMIDE, A. F.; ROMEIRO, R. S. Levantamento de doenças bacterianas em hortaliças na Região do Cinturão Verde de Belo Horizonte. Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v. 17, p. 49-52, 1992.

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Capítulo 4
Identificação de bactérias de origem ambiental

Welington Luiz de Araújo

Júlia Kuklinsky-Sobral

Introdução

A utilização dos recursos genéticos, incluindo isolados microbianos coletados desde 1993, é orientada pelo Convention of Biological Diversity (CBD), que foi ratificado por mais de 180 países. Essa convenção deu o direito de soberania ao país de origem dos recursos e objetiva que, em caso de exploração comercial, o país detentor da diversidade obtenha os seus direitos de exploração. Entretanto, é sabido que para ocorrer uma correta utilização desses recursos, é necessário que a biodiversidade seja conhecida e mantida em coleções para que possa ser utilizada por grupos de pesquisa com especial interesse em determinadas áreas. Atualmente, grande parte das amostras microbianas conhecidas está depositada em coleções de cultura internacionais como o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) da Alemanha, Bacteria Collection – Laboratorium voor Microbiologie (BCCM) na Bélgica, Japan Collection of Microrganisms (JCM) do Japão e American Type Culture Collection (ATCC) nos Estados Unidos. Além disso, estas coleções também são as maiores responsáveis pela identificação e classificação bacteriana, incluindo os isolados obtidos com potencial biotecnológico.

A taxonomia é a ciência que lida com a classificação (= criação de novos taxa), identificação (= alocação de isolados dentro de espécies conhecidas) e nomenclatura de seres vivos. A taxonomia bacteriana foi criada para permitir o desenvolvimento de um sistema estável, previsível e altamente informativo que contribui para o avanço de vários ramos da ciência, como a biotecnologia, ecologia, epidemiologia, evolução, genômica, medicina e a microbiologia. No início, a taxonomia bacteriana foi baseada somente em características bioquímicas e morfológicas (HOLT et al., 1994), resultando na formação de grupos taxonômicos polifiléticos sem relação filogenética. Entretanto, a partir de 1970, a utilização da taxonomia polifásica, incluindo análises de DNA como a hibridização de DNA-DNA (COLWELL, 1970), produziu grupos taxonômicos monofiléticos que foram posteriormente posicionados no espaço filogenético com o auxílio de sequências do 16S rDNA. Atualmente, a estrutura da taxonomia de bactérias é baseada na filogenia do gene 16S rDNA (LUDWIG; KLENK, 2001), sendo a descrição de novas espécies publicada no International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM), que é o jornal oficial para caracterizações taxonômicas, descrições de novos taxa e reclassificação de procariotos.

Um dos principais problemas na taxonomia de procariotos, em geral, é a identificação de linhagens em nível de espécie por meio de testes fenotípicos e de sequências de 16S rDNA, pois as características fenotípicas e de sequências das espécies são muito semelhantes. Nesse caso, o critério decisivo para identificação de espécies ainda é a similaridade obtida em ensaios de hibridização de DNA entre genomas de dois organismos (STACKEBRANDT et al., 2002). Outro problema enfrentado para a identificação e classificação de bactérias por meio de análises fenotípicas é o fato de que muitas espécies ainda não descritas não são cultivadas nas condições empregadas para o crescimento microbiano, dificultando dessa forma a sua caracterização.

Identificação de bactérias

Métodos tradicionais – série bioquímica

A identificação e classificação clássica de bactérias são baseadas, principalmente, nas características bioquímicas de cada espécie. Dessa forma, para se determinar essas características, os isolados bacterianos devem ser cultivados puros, isto é, de culturas que são obtidas a partir de uma única célula ou de uma única colônia isolada. A temperatura de incubação correta é muito importante para se obter resultados adequados. Como regra, testes devem ser feitos sob temperatura ótima de crescimento, variando, no caso de isolados ambientais, entre 20 °C e 30 °C, dependendo das condições de isolamento utilizadas.

O oxigênio é essencial na caracterização de bactérias; além disso, para obter resultados reproduzíveis, o tempo de incubação é de grande importância. Em um estágio de multiplicação suficiente, deve-se obter no meio líquido uma turbidez ou precipitação, ou um bom crescimento superficial no meio sólido. O tempo padrão de incubação é específico para cada teste, e assim um período de incubação mais curto do que o prescrito é geralmente suficiente, especialmente se o teste for positivo.

Um ponto essencial na identificação é o controle de qualidade. Todos os meios de cultura e reagentes devem ser testados com culturas apropriadas ou linhagem-tipo antes de serem colocados no uso rotineiro. Linhagem-tipo é uma linhagem que foi designada como padrão representativo de uma dada espécie. Todas as outras linhagens incluídas como pertencentes à mesma espécie devem ser comparadas com a linhagem-tipo. É importante considerar que toda identificação bacteriana deve começar com separação dos grupos em gram-positivo ou gram-negativo (Tabela 1). Para isso, utiliza-se a coloração de gram ou o teste com hidróxido de potássio (KOH). Após isso, as bactérias gram-negativas devem ser submetidas ao teste de O/F (oxidação e fermentação de glicose). Nesse ponto, bactérias fermentadoras devem ser submetidas a testes específicos de fermentação de açúcares, enquanto as não fermentadoras devem ser submetidas a outros testes bioquímicos. Para maiores detalhes a respeito dos testes necessários, deve-se consultar o Manual de Bergey’s (HOLT et al., 1994). As bactérias gram-negativas fermentadoras mais frequentemente isoladas em associação com plantas pertencem aos gêneros Enterobacter, Erwinia, Klebsiela e Pantoea, enquanto as bactérias gram-negativas não fermentadoras pertencem aos gêneros Burkholderia, Pseudomonas, Ralstonia e Xanthomonas.

Tabela 1. Testes preliminares e específicos que podem ser utilizados na identificação de bactérias.

Característica

Requerimento mínimo para identificação

Teste específico

Morfológica

• Coloração de gram

• Teste com KOH

• Forma e arranjo

• Motilidade

• Posição e números de flagelos

• Cápsulas e inclusões

Crescimento

• Pigmentação

• Colônia em meio sólido

• Forma, consistência, superfície, elevação, borda, odor

• Colônia em meio líquido, depósito, turbidez

Fisiológica

• Requerimento de oxigênio

• Temperatura ótima de crescimento

• Tolerância a temperatura, pH

• Fatores de crescimento

• Inibição por antibióticos

• Meios seletivos, NaCl

Bioquímica

• Utilização de glicose

• Fermentativo

• OxidativaInerte

• Catalase

• Oxidase

• Produção de ácido a partir açúcares

• Redução de nitrato

• Denitrificação

• Voges Proskauer

• Vermelho de metila

• Descarboxilase de arginina lisina, ornitina, gelatina, esculina, Tween 80

• Hidrólise de amido

• Utilização de citrato – malonato

• Hidrólise de amido

• Produtos de fermentação

• Hemólise

Fonte: adaptado de Araújo et al. (2002).

Para bactérias gram-positivas, devem ser avaliadas a forma das células (cocos ou bastonetes) e a presença de endósporos. Normalmente, tem sido observado que isolados com endósporos e células na forma de bastonete pertencem ao gênero Bacillus, embora outros gêneros como Paenibacillus, Brevibacillus (aeróbio) e Clostridium (anaeróbio restrito) possam também ser isolados.

Sistemas automatizados para identificação bioquímica – kits

Para facilitar os trabalhos de caracterização de bactérias, inúmeros kits comerciais foram desenvolvidos, tornando essa análise rápida e barata. Apesar da variedade de kits disponíveis no mercado, o seu uso tem sido restrito, pois muitos são direcionados para propósitos específicos, principalmente na identificação de grupos de bactérias de importância médica. Nesse contexto, é importante notar que o meio ambiente contém uma variedade maior de taxa do que a encontrada nos laboratórios clínicos. Essencialmente, dois tipos de kits comerciais foram desenvolvidos: aqueles que visam a respostas bioquímicas dos microrganismos e aqueles baseados em reações sorológicas:

• Sistemas API: suspensões de células são adicionadas nas cavidades plásticas e incubadas por 24 horas. Alguns testes requerem adição de reagentes. Os resultados são analisados e registrados por códigos num perfil de registros. Há também serviços de computação para identificação. Podem ser usados os testes API 20E (enterobacteria, gram-negativos não fermentadores), API20S (estreptococos) e Apia (anaeróbios).

• Rapid E: semelhante ao API 20E, porém com 21 reações e incubação por 4 horas.

• Enterotubos: são usados para identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae. É um tubo plástico contendo substrato. Após a remoção da tampa do tubo plástico, inoculam-se as bactérias, através de alça inoculadora já acoplada ao tubo, ao longo dos compartimentos. Os tubos são fechados e incubados a 37 °C por 18 a 24 horas. Alguns testes necessitam de adição de reagentes.

• Oxi-Ferm: este sistema permite a identificação de organismos gram-negativos não fermentadores. O sistema Oxi-Ferm é semelhante ao enterotubo, porém oito meios são usados no tubo para a identificação.

• Sistema Micro ID: é usado para identificação de Enterobacteriaceae, utilizando substratos incorporados em tiras de papel. O sistema Micro ID é baseado nos resultados de 15 testes bioquímicos que podem ser analisados em menos de 4 horas. Os resultados são interpretados com o auxílio de um manual de códigos.

• Sistema Minitek II: permite a identificação de Enterobacteriaceae, gram-negativos não fermentadores (21 reações), cocos gram-positivos (20 reações), Neisseria spp. (4 reações de caracterização). Consiste em discos de papel impregnados com substratos desidratados, nos quais uma suspensão celular é adicionada para a determinação de reações características. O período de incubação é variável, dependendo do organismo em teste. Resultados são interpretados utilizando-se uma tabela de cores.

• Minitek Anaerobe II: esse teste é semelhante ao Minitek II, são 20 reações de caracterização com incubação em condições anaeróbicas. Computadores facilitam e auxiliam na identificação de microrganismos. Os dados obtidos de um microrganismo desconhecido podem ser rapidamente comparados com o banco de dados contendo as informações sobre as características de um taxon definido. É possível usar tabelas de diagnósticos em conjunto com computador. As tabelas são incorporadas na memória do computador, sendo os resultados de organismos desconhecidos comparados com cada uma das possibilidades, e a correlação mais alta é dada como uma identificação. Os sistemas de identificação computadorizados têm sido desenvolvidos para avaliar a probabilidade estatística de identificação de microrganismos. Tal tipo de sistema de identificação muitas vezes envolve o desenvolvimento e o uso de matrizes de probabilidade, que são compilações de frequência de ocorrência das características de um microrganismo desconhecido dentro de um grupo taxonômico.

• RapIDNH: esse sistema identifica Neisseria, Haemophilus e Moraxella spp. Suspensões celulares são inoculadas nas cavidades com substratos e incubadas. Após a incubação, os reagentes são adicionados. Os resultados são analisados e comparados com padrões do manual ou por meio de serviços de computador.

• Biolog Nutritional System: as placas do sistema Biolog testa a habilidade de uma bactéria em utilizar (oxidar) 95 diferentes fontes de carbono pré-selecionadas. A identificação da bactéria dá-se por uma combinação de propriedades metabólicas dos isolados com a base de dados dos padrões. Os testes GN MicroPlates são para gram-negativas, enquanto os GP MicroPlate são para gram-positivas. Uma suspensão de bactérias (150 mL) em 0,85% de solução salina é dispensada em cada uma das cavidades da placa e incubadas por 18 a 24 horas, entre 33 °C e 35 °C. Os resultados podem ser analisados visualmente ou por meio de um leitor de placas (590 nm) e, posteriormente, comparados com uma base de dados.

• Vitek: este sistema é rápido e muito usado nas indústrias. O material é inoculado nas cavidades por um multipipetador. Um módulo computadorizado faz a leitura, e a identificação é feita após 8 horas de incubação. O sistema serve para a caracterização de anaeróbios (ANI), Bacillus spp. (Bacillus Biochemical Card), gram-negativos (Gram-negative identification card- GNI) e gram-positivos (Gram-positive identification card- GPI).

Estratégias e técnicas modernas de identificação de bactérias

Tipagem molecular

A taxonomia polifásica integra dados fenotípicos, quimiotaxonômicos, moleculares e genômicos com o objetivo de representar a biodiversidade nos seus diferentes níveis, isto é, de linhagem a suprafamílias. Nesse contexto, várias técnicas genômicas baseadas em padrões de banda ou códigos de barra, como o Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (Ardra), Repetitive Extragenic Palindromic (rep-PCR) e ribotipagem, podem ser utilizadas (DIJKSHOORN et al., 2001). Embora exista um grande número de técnicas que revelam polimorfismo de DNA é importante considerar o tipo de organismo a ser avaliado.

A técnica de RAPD utiliza iniciadores ou primers curtos e aleatórios que se anelam em diferentes locais no DNA genômico, gerando novos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (WELSH; MCCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990). O teste RAPD é extremamente útil para estudos de filogenia e caracterização de indivíduos, estudos da comunidade microbiana de ambientes aquáticos, além de bactérias endofíticas (ARAÚJO et al., 2001; FRANKLIN et al., 1999; LOUWS et al., 1999). O Ardra consiste na amplificação e posterior digestão do rDNA com enzimas de restrição. Esse método é baseado no princípio de que os sítios de restrição no rDNA são conservados de acordo com padrões filogenéticos. Dessa forma, pode ser utilizado o 16S rDNA para o estudo de grupos heterogêneos, ou a região espaçadora entre o 16S e o 23S rDNA para o estudo de grupos muito similares (ELSAS et al., 1998; HEYNDRICKX et al., 1996; RANJARD et al., 2000). O rep-PCR é baseado em famílias de sequências repetitivas de DNA presentes no genoma de bactérias que têm sido utilizadas na caracterização e subdivisão de espécies bacterianas em nível intraespecífico. Entre essas famílias podem-se citar as sequências repetitivas extragênicas palindrômicas (REP) de 35 pb a 40 pb, consensuais intergênicas repetitivas enterobacterianas (Eric) de 124 pb a 127 pb, e os elementos BOX de 154 pb. Os elementos BOX podem estar envolvidos na ligação da DNA girase e terminação da replicação do DNA. A utilização de rep-PCR para caracterização de bactérias e estudos de diversidade genética tem se mostrado uma ferramenta útil (VINUESA et al., 1998). Portanto, pode-se observar que essas técnicas citadas auxiliam tanto na identificação quanto em estudos de diversidade microbiana.

O AFLP também se caracteriza como uma técnica de tipagem molecular, pois combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição com as vantagens da PCR. Estudos independentes mostraram uma alta correlação entre a similaridade de padrões de AFLP e de hibridização de DNA-DNA para diversos grupos taxonômicos modelo, incluindo Aeromonas (HUYS et al., 1996), Agrobacterium (MOUGEL et al., 2001), Bradyrhyzobium (WILLEMS et al., 2001), Burkholderia (COENYE et al., 2000), Vibrios (THOMPSON et al., 2004) e Xanthomonas (RADEMAKER et al., 2000). Por esse motivo, sugeriu-se que AFLP poderia ser uma alternativa para as hibridizações de DNA (STACKEBRANDT et al., 2002; THOMPSON et al., 2004). Apesar de a técnica de AFLP ser rápida, altamente discriminatória, e os resultados poderem ser acumulados em bases de dados locais, a comparação de padrões de AFLP gerados em diferentes laboratórios é muito difícil, comprometendo tremendamente a criação de bancos de dados públicos para a identificação de procariotos.

A não portabilidade de dados fenotípicos, por exemplo, perfis de ácidos graxos e de proteínas, e dados moleculares, por exemplo, AFLP, resulta na concentração do conhecimento taxonômico sobre diferentes grupos de procariotos em poucos laboratórios internacionais de referência. Essa tendência leva a uma maior demora na catalogação da biodiversidade global, uma vez que taxonomistas de várias partes do mundo usam diferentes ferramentas para estudarem os mesmos grupos taxonômicos.

Identificação molecular sem o cultivo microbiano

A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana e, em especial, para a identificação de microrganismos de amostras ambientais. Dados derivados de estudos comparativos apontam para o fato de que apenas uma pequena fração dos microrganismos na natureza (entre 0,1% e 1%, dependendo do habitat) é cultivada por meio do emprego de métodos microbiológicos convencionais (AMANN et al., 1995).

Nesse contexto, técnicas moleculares baseadas no gene do 16S rRNA têm sido utilizadas para a avaliação de comunidades microbianas não cultiváveis (AMANN et al., 1995). Dentre essas técnicas, e em especial para o estudo de populações microbianas complexas, o Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) identifica diferenças baseadas no comportamento desnaturante da dupla fita de DNA. Nesse caso, o ambiente desnaturante é criado pela combinação uniforme da temperatura de corrida, variando entre 50 oC e 65 oC, e um gradiente desnaturante linear de ureia e formamida (HEUER; SMALLA, 1997). O DGGE tem recebido especial atenção por ter sido utilizado com sucesso em diversos habitats naturais e na detecção de variações na comunidade microbiana decorrente da presença de poluentes e planta hospedeira. Dessa forma, essa técnica se mostra eficiente na identificação de bactérias não cultiváveis de diferentes amostras ambientais.

Outra técnica utilizada para a identificação de microrganismos de amostras ambientais é a hibridização de DNA das amostras com sondas de rRNA complementares ao microrganismo alvo. Existem dois diferentes tipos de hibridização utilizados em estudos de taxonomia microbiana: hibridização slot-blot e hibridização fluorescente in situ (Fish). A hibridização slot-blot requer a extração de ácidos nucleicos, imobilização deles em membranas e hibridização com sondas (rRNA) radioativas ou não radioativas. Na técnica de Fish, os ácidos nucleicos alvos são detectados diretamente nas células. Para acontecer a detecção in situ, as células devem ser permeabilizadas para possibilitar o acesso das sondas ao interior celular (AMANN et al., 1995). Uma das características positivas do Fish é que as células ficam intactas e podem ser utilizadas para outros estudos.

O desenvolvimento da biologia molecular está proporcionando o surgimento de novas técnicas que auxiliem a identificação de microrganismos. Dentre as mais recentes, pode-se citar a Metagenômica e Microarranjos de DNA (DNA chips ou microarray). Metagenômica, também conhecida como genômica ambiental, é a análise do genoma de microrganismos por extração direta do DNA de uma amostra, amplificação de genes específicos (para a identificação é utilizado o gene 16S rRNA), clonagem dos fragmentos amplificados em vetores (plasmídeos) e posterior sequenciamento dos clones (HANDELSMAN, 2004). A tecnologia de microarranjos de DNA permite uma oportunidade única para uma múltipla detecção de ácidos nucleicos (SMALL et al., 2001). Os microarranjos são, em princípio e prática, extensões de métodos baseados em hibridizações que têm sido utilizados por décadas para identificar e quantificar ácidos nucleicos em amostras biológicas (EISEN; BROWN, 1999; SOUTHERN et al., 1999). Entretanto, a tecnologia de microarranjos envolve a integração de áreas da ciência, como biologia molecular, genética, bioinformática, bioquímica, engenharia de materiais, robótica e outros (HELLER, 2002). Essa técnica permite que a expressão de milhares de genes seja avaliada simultaneamente, trazendo novas perspectivas para o entendimento da expressão e regulação de genes (CHAUSSABEL; SHER, 2002), detecção de microrganismos no ambiente (KOIZUMI et al., 2002; PEPLIES et al., 2003; SMALL et al., 2001), tipagem de bactérias (GARAIZAR et al., 2002), comparação genômica entre isolados bacterianos (NUNES et al., 2003), identificação de genes específicos (CALL et al., 2003; DONG et al., 2001) e estudos filogenéticos.

MLST – biodiversidade e evolução

O uso de Multi Locus Sequence Typing (MLST) tem ampliado a visão sobre a biodiversidade e evolução de bactérias. Essa técnica se originou da eletroforese de enzimas, amplamente usada por biologistas de populações (CAUGANT, 2001). A metodologia moderna consiste no sequenciamento e análise de fragmentos de 5 a 7 genes, conservados geralmente em housekeeping, espaçados ao longo do genoma bacteriano com pelo menos 100 Kb de distância ou do outro (MAIDEN et al., 1998). A grande vantagem dessa técnica é que a diferença entre linhagens é indexada diretamente nas sequências de DNA. Como esses genes evoluem muito lentamente, tornam-se ideais para estudos de longo termo de epidemiologia e identificação. Além disso, sequências gênicas, diferentemente de padrões de bandas, como AFLP, rep-PCR, podem ser acumuladas em bases de dados de domínio público e comparadas com facilidade.

Dados de MLST podem ser utilizados para calcular a contribuição de mutação e recombinação na evolução de complexos clonais dentro de uma dada espécie de bactérias (FEIL et al., 2003). É importante ressaltar que MLST tem sido empregado apenas na tipagem de alguns poucos patógenos humanos, como Bacillus cereus, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e V. cholerae. Pouco ainda é conhecido sobre o uso da metodologia de MLST para a diferenciação de espécies, gêneros e famílias no domínio Bacteria.

O estudo da filogenia e evolução de procariotos tem melhorado consideravelmente com a inclusão de novas metodologias baseadas na genômica, do conteúdo e ordem de genes, de sequências concatenadas (WOLF et al., 2002), superárvores (DAUBIN et al., 2001) e análises de distâncias evolucionárias entre genes ortológos (WOLF et al., 2002). Análises evolutivas em nível de espécie, que incluem a delineação de genótipos ancestrais, complexos clonais e da taxa de recombinação entre linhagens, têm sido aprimoradas pelo uso dos algorítimos Burst e Splits tree decomposition (FEIL; SPRATT, 2001; FEIL et al., 2003). Aplicando esses novos princípios, Cohan (2002) reflete que as espécies bacterianas atualmente delineadas são, na verdade, equivalentes a gêneros. Realmente, a definição atual de espécie bacteriana é pragmática. Atualmente, essa definição compreende grupos de isolados genomicamente coerentes, que compartilham elevado grau de similaridade em diversas características independentes. Apesar de intensa crítica (LAN; REEVES, 2000, 2001; SMITH et al., 2000), a hibridização de DNA-DNA ainda é a técnica melhor descrita para a definição de espécies em Bacteriologia. Linhagens da mesma espécie apresentam, sob condições controladas de ensaios, pelo menos 70% de hibridização entre seus genomas, conforme definido pelo Comitê Internacional de Sistemática Bacteriana (STACKEBRANDT et al., 2002). Tem sido sugerido que novas metodologias devem ser desenvolvidas para suplantar as limitações da hibridização DNA-DNA, rDNA 16S, características fenotípicas e fingerprints. Nesse contexto, o Multi Locus Sequence Analysis (MLSA) poderia ser uma alternativa, visto que diversos pesquisadores têm sugerido que a definição de espécie seja baseada em sequências de genes (LA SCOLA et al., 2003). Entretanto, não há um consenso sobre o conceito de espécie em bactérias, mas diferentes modelos evolutivos baseados na seleção natural e na transferência horizontal de genes têm sido propostos.

Taxonomia eletrônica

A proposta da taxonomia eletrônica vem causando muito debate por parte de diversos taxonomistas (BISBY et al., 2002; SMITH, 2004), mas sem dúvida ela produzirá um sistema de catalogação de espécies mais rápido, eficiente, transparente, barato e acessível para toda a comunidade científica por meio de bases de dados disponíveis via Internet. Dados de marcadores moleculares poderiam ser facilmente disponibilizados em bases de dados públicas, necessitando apenas de trabalho de atualização, por meio da inclusão de sequências de novas espécies e a manutenção e atualização dos dados, com o intuito de evitar erros e/ou falta de informação sobre as espécies. Obviamente, as bases de dados de marcadores moleculares, com exceção às sequências de genes, ainda precisam ser produzidas para a maioria das espécies conhecidas; mas, estando montadas, possibilitarão que descrições taxonômicas sejam feitas com maior rapidez e objetividade, resultando em um rápido desenvolvimento da taxonomia e exploração da biodiversidade.

Existem várias iniciativas para o desenvolvimento de websites dedicadas à taxonomia e de descrições eletrônicas de novas espécies. Species 2000 deseja enumerar todas as espécies de organismos vivos no planeta em uma base de dados eletrônica que sirva de portal de entrada para estudos sobre biodiversidade. Até o presente já foram listadas 500 mil espécies (PEPLOW, 2005). Enquanto que o Global Biodiversity Information Facility (GBIF) pretende globalizar todo o conhecimento atual sobre biodiversidade pela internet.

Finalmente, a escolha de um método adequado para identificar um microrganismo deve ser feita de acordo com a natureza da investigação, o conhecimento profissional, a habilidade do pesquisador ou da equipe técnica e a disponibilidade do laboratório. Além disso, o conhecimento sobre o procedimento de consulta à literatura correlata é fundamental para o êxito na identificação segura de um microrganismo.

Protocolos

Caracterização morfológica

Determinação da forma da célula

Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:

a) As lâminas são coradas com safranina por 1 minuto.

b) Elas são lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.

As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. Nessa análise, é possível observar a forma das células (cocos ou bastonetes), bem como outras estruturas como filamentos ou arranjos em cachos.

Coloração de gram

Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:

a) As lâminas são coradas com cristal violeta por 1 minuto.

b) Elas são lavadas cuidadosamente com solução de lugol forte.

c) As lâminas são cobertas com lugol forte por 1 minuto.

d) Elas são lavadas com solução descorante por 1 minuto e posteriormente com água.

e) As lâminas são coradas com safranina por 1 minuto.

f) Elas são lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.

As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. As células das bactérias gram-positivas mantêm a coloração violeta por causa da retenção dos corantes iniciais, enquanto as bactérias gram-negativas apresentam coloração rosa-avermelhada, por causa da coloração de contraste com safranina. Células velhas podem resultar em falso gram-negativo.

Coloração de Wirtz (coloração de esporos)

Deve ser preparado um fino esfregaço de células jovens das culturas bacterianas em lâmina de microscópio, secado levemente na chama para fixação. Logo após, o esfregaço é tratado como a seguir:

a) As lâminas são coradas com verde malaquita por 15 minutos.

b) Lavadas cuidadosamente com água corrente.

c) As lâminas são coradas com safranina por 30 segundos.

d) Lavadas cuidadosamente com água e secadas com papel absorvente.

As lâminas são observadas no microscópio óptico em um aumento de 1.000X. Os esporos apresentam coloração verde enquanto que as células vegetativas apresentam coloração rosa-avermelhada, por causa da coloração de contraste com safranina.

Identificação bioquímica

EPM (ácido e gás de glicose, urease, H2S, L-triptofano desaminase)

Com auxílio de uma alça de ponta reta (agulha), as bactérias devem ser inoculadas por meio de picada profunda no meio EPM e incubadas a 28 °C por 24 horas. A formação de bolhas indica a produção de gás a partir da glicose; a passagem da cor do meio de verde para amarelo, na base do tubo, indica que houve produção de ácido a partir da glicose; porém, quando houver produção de H2S nesse mesmo local, ocorre a formação de pigmentos pretos. A coloração verde escura na superfície do meio indica a produção de L-triptofano desaminase, e a produção de urease é verificada quando a cor do meio passa de verde para azul.

Mili (motilidade, indol – lisina)

As culturas bacterianas devem ser inoculadas com o auxílio de uma alça de ponta reta no interior do tubo contendo o meio Mili, e incubadas a 28 °C por 24 horas. Após o crescimento bacteriano, é realizada a leitura do teste: a presença de zonas túrbidas ao redor da picada indica motilidade positiva, quando a cor do meio passa de roxo-violeta para amarelo indica lisina descarboxilase negativa, enquanto que a produção de indol a partir de triptofano é verificada colocando de 3 a 5 gotas do reagente de Kovacs. Nesse caso, o teste é considerado positivo quando ocorre a formação de um anel vermelho (anel indólico).

Utilização de citrato

A bactéria deve ser inoculada por meio de estrias na superfície do meio citrato de Simmmons e incubada a 28 °C. O crescimento bacteriano e a alteração da coloração do meio devem ser examinados diariamente durante 7 dias. O resultado positivo é caracterizado pela passagem da cor do meio de verde para azul.

Utilização de diferentes fontes de carbono

No momento do uso deve ser adicionada a fonte de carbono desejada (D-glicose, D-frutose, D-galactose, D-manose, L-arabinose, D-xilose, L-ramnose, celobiose, D-lactose, D-melibiose, sacarose, Trealose, rafinose, D-melizitose, dextrana, inulina, D-manitol, meso-inositol, Adonitol, xilitol e salicina), em solução estoque esterilizada a 20% em água, numa concentração final em meio básico para açúcares de 1%. Após a formulação do meio de cultura, 5,0 mL deste meio são distribuídos em tubos de ensaio esterilizados. Após a inoculação da bactéria de interesse, o tubo deve ser incubado a 28 °C por 7 dias. O resultado positivo é caracterizado pela passagem da cor meio de verde para amarela por causa da acidificação do meio e queda do pH.

Teste de oxidação e fermentação da glicose (O/F glicose)

A bactéria de interesse deve ser inoculada com picada profunda em dois tubos contendo o meio para teste de O/F . Sobre a superfície de um dos tubos devem ser colocados 3,0 mL de óleo mineral esterilizado, e ambos os tubos devem ser incubados a 28 °C por 72 horas. A mudança da cor do meio de verde para amarela nos dois tubos indica a fermentação da glicose (F), mas se essa alteração ocorrer apenas na superfície do tubo sem óleo indica oxidação da glicose (O). Entretanto, se houver crescimento bacteriano, e o meio passar de verde para azul, não ocorreu utilização da glicose, mas o pH aumentou em virtude de produtos do metabolismo proteico.

Hidrólise do amido

Os isolados bacterianos devem ser inoculados em placas de petri contendo o meio de amido e incubados a 28 °C por 48 horas. Após o crescimento, essas colônias devem ser cobertas com solução de lugol. O resultado positivo é caracterizado por um halo incolor ao redor da colônia bacteriana.

Hidrólise da gelatina

O meio de gelatina deve ser deixado a 4 °C durante 2 horas para solidificar. O inóculo deve ser por picada profunda com auxílio de uma alça de ponta reta. O tubo deve ser incubado a 28 °C durante 30 dias. Para observações diárias, os tubos inoculados juntamente com um tubo controle (sem inóculo) devem ser colocados a 4 °C por 1 hora antes da análise. A manutenção do estado líquido do meio após essa inoculação a 4 °C indica a hidrólise da gelatina.

Crescimento em diferentes temperaturas

As bactérias devem ser inoculadas em meio NA ou outro de crescimento específico e incubadas em diferentes temperaturas (4 °C, 10 °C, 20 °C, 28 °C, 32 °C, 37 °C, 45 °C e 55 °C) durante 7 dias para verificar o crescimento.

Crescimento em NaCI 5%

Para este teste, deve ser utilizado o meio NA ou outro de melhor taxa de crescimento, acrescido de NaCI na concentração de 5%. Após o inóculo, as placas devem ser incubadas a 28 °C por 72 horas para se observar o crescimento bacteriano.

Crescimento em diferentes pHs

Para esta análise, pode ser utilizado o meio LB ou outro de interesse. O pH do meio deve ser ajustado ao nível desejado. Após a inoculação da bactéria de interesse, o tubo deve ser incubado a 28 oC por 72 horas para se verificar o crescimento bacteriano.

Catalase

Com auxílio de um palito de madeira, deve ser cortada uma amostra de colônia bacteriana e colocada sobre uma gota de H2O2 (3%). O resultado positivo é caracterizado pelo desprendimento de gás imediatamente ou após cinco minutos.

Oxidase

Sobre um papel de filtro impregnado com 2 a 3 gotas de dimetil-ρ-fenilenediamina (1%), devem ser colocadas amostras de colônia bacteriana. O resultado positivo é determinado pelo aparecimento de coloração violeta sobre o papel em 10 segundos.

Produção de indol

As bactérias devem ser semeadas em caldo para determinação da produção de indol e incubadas a 28 oC por 48 horas. Após o crescimento, devem ser adicionadas 4 gotas do reagente de Kovacs, e um halo vermelho na fase alcoólica indica presença de indol.

Redução de nitrato a nitrito

As bactérias devem ser inoculadas em meio com nitrato e incubadas a 28 oC por 48 horas. Após o crescimento, devem ser adicionadas 2 gotas da solução A e 2 gotas da solução B dos reagentes para o teste de nitrato. O resultado positivo é caracterizado pelo aparecimento de uma coloração vermelha intensa na superfície do meio.

Reação de Voges-Proskauer

Com auxílio de uma alça de platina, as bactérias devem ser inoculadas em tubos contendo o meio VP e incubadas a 28 oC por 72 horas. A leitura da reação deve ser feita alcalinizando o meio com 2 a 3 gotas de KOH (40%) e posteriormente adicionando de 3 a 5 gotas de solução de α-naftol. O teste positivo é caracterizado pela presença de halo vermelho, alguns segundos após a adição do reagente. Esse halo se forma a partir da superfície de contato com o O2 por causa da oxidação da acetoína.

Meios de cultura utilizados para o estudo de bactérias

Meio TSA (Tryptone Soy Agar) 10%

Triptona: 1,5 g

Peptona de soja: 0,5 g

NaCl: 1,5 g

Ágar: 15,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 7,3

Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio TSA pronto (Merck, Difco Oxoid) na concentração de 4 g L-1 (10%), acrescido de 1,5% de ágar.

Meio TSB (Tryptone Soy Broth) 5%

Caseína de digestão pancreática: 0,85 g

Digestão papaínica de soja: 0,15 g

NaCl: 0,25 g

Na2HPO4: 0,125 g

Glicose: 0,125 g

Ágar: 15,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 7,3

Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio TSB pronto (Merck, Difco ou Oxoid) na concentração de 1,5 g L-1 (5%), acrescido de 1,5% de ágar.

Meio LB – Luria Bertani

Triptona: 10,0 g

Extrato de levedura: 5,0 g

NaCl: 10,0 g

Ágar bacteriológico (Difco): 15,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 7,0

Meio nutriente ágar (NA)

Extrato de carne: 3,0 g

Peptona: 5,0 g

Ágar: 15,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 6,8

Como uma alternativa, pode ser utilizado o meio NA pronto (Difco) na concentração de 23 g L-1 .

Meio para oxidação/fermentação de glicose (O/F)

Peptona: 2,0 g

NaCl: 5,0 g

KH2 PO4: 0,30 g

Azul de bromotimol (1% em água): 0,8 mL

Ágar: 3,0 g

Completar o volume com água destilada para: 900 mL

O meio deve ser autoclavado (1 atm) por 20 minutos a 120 °C, e posteriormente devem-se acrescentar 100 mL de solução de glicose (10%). O meio deve ser distribuído em tubos de ensaio (10 mL tubo-1).

Meio para detecção de indol

Extrato de carne: 3,0 g

Triptona: 10,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 6,8

Meio para redução de nitrato

Extrato de carne: 3,0 g

Peptona: 5,0 g

KNO3: 1,0 g

Ágar: 12,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 6,8

Meio EPM (TOLEDO et al., 1982)

Solução base: A

Extrato de carne: 2,0 g

Triptona: 10,0 g

NaCl: 5,0 g

NaH2 PO4 . 5 H2 O: 2,0 g

L-triptofano: 1,0 g

Azul de bromotimol (sol. 1%): 0,8 mL

Ágar: 11,0 g

Água destilada 1.000 mL

Após solubilização dos componentes, o pH deve ser ajustado para 7,4 e deve-se acrescentar o ágar. O meio de cultura deve ser autoclavado a 120 oC durante 20 minutos.

Solução base B

Citrato de ferro amoniacal: 2,35 g

Na2S2O3 . 5 H2O: 2,35 g

Glicose: 11,76 g

Ureia: 47,06 g

Água destilada: 100 mL

Os compostos devem ser homogeneizados e aquecidos em banho-maria a 65 °C por 1 hora, agitando constantemente até completa dissolução.

Preparo final

Solução A: 982,5 mL

Solução B: 17,5 mL

Após misturar duas soluções, 4 mL do meio de cultura deve ser distribuído assepticamente em tubos e inclinados para solidificação.

Meio de gelatina

Extrato de carne: 3,0 g

Peptona: 5,0 g

Gelatina: 12,0 g

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 6,8

Meio para reação de Voges-Proskauer (VP)

Peptona: 5,0 g

K2HPO4: 5,0 g

Solução de glicose 5%: 100 mL

Completar o volume com água destilada para: 900 mL

pH: 7,5

A peptona e o K2HPO4 devem ser dissolvidos, distribuídos em tubos com 1,35 mL do meio e autoclavados. Posteriormente, devem ser adicionados 150 µL da solução de glicose já esterilizada em cada tubo.

Meio para fermentação de açúcares

Peptona: 10,0 g

NaCl: 5,0 g

Azul de bromotimol (1%): 2 mL

Completar o volume com água destilada para: 1.000 mL

pH: 7,2

Soluções utilizadas na identificação de microrganismos

Solução de cristal violeta

Solução A

Cristal violeta: 2 g

Etanol 95%: 20 mL

Solução B

Oxalato de amônia: 0,8 g

Água destilada: 80 mL

Solução final

As soluções A e B devem ser misturadas e deixadas em repouso por 48 horas. Após esse período, a solução deve ser filtrada em papel e armazenada à temperatura ambiente.

Solução de iodo forte (lugol)

Iodo: 10 g

Iodeto de potássio: 6 g

Água destilada: 20 mL

Etanol 95% – completar para: 100 mL

O iodo e o iodeto de potássio devem ser triturados e dissolvidos em 20 mL de água, e o volume completado para 100 mL com etanol 95%.

Solução de safranina (0,025%)

Safranina: 12,5 µg

Etanol: 50 mL

Água destilada: 50 mL

No momento do uso, diluir 1:10 em água destilada.

Solução de verde malaquita

Verde malaquita: 0,01 mg

Água destilada: 200 mL

Solução descorante

Solução de iodo forte: 3 mL

Acetona: 97 mL

Reagente para o teste do nitrato

Solução A

Ácido sulfanílico: 160 µL

Ácido acético 5N: 20 mL

Solução B

α-naftilamina: 100 µL

Ácido acético 5N: 20 mL

Reagente de Kovacs

ρ-dimetilaminobenzaldeído: 0,005 mg

Álcool amílico: 75,0 mL

HCl concentrado: 25,0 mL

O ρ-dimetilaminobenzaldeído deve ser solubilizado no álcool em banho-maria entre 50 °C e 55 °C e em seguida deve ser adicionado o ácido. O reagente deve ser armazenado em frasco escuro a 4 °C.

Solução de α-naftol

α-naftol: 0,01 mg

Etanol: 200 mL

Solução de azul de bromotimol

Azul de bromotimol: 1,0 mg

Etanol: 50 mL

Água destilada: 50 mL

Referências

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Capítulo 5
Microrganismos assintomáticos do cultivo in vitro: natureza e riscos para o cultivo de plantas

Terezinha Rangel Camara

Lilia Willadino

Cynthia Cavalcanti de Albuquerque

Introdução

O tema da contaminação microbiana no cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos de plantas vem merecendo destaque entre os pesquisadores e micropropagadores de todo o mundo. Três simpósios internacionais foram realizados visando discutir os avanços e perspectivas do problema enfrentado por laboratórios científicos e de produção de plantas in vitro. O primeiro encontro foi em 1987, seguido de duas versões que se realizaram em 1996 e em 1999 (CASSELLS, 1998; LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Avanços consideráveis têm sido feitos no diagnóstico e manejo de doenças e contaminações microbianas no cultivo in vitro de plantas. Esses avanços são resultantes de tentativas de distinguir os problemas de transmissão de doenças dos de contaminação de laboratório. O controle de doenças é atingido estabelecendo-se cultivos livres de patógenos, enquanto que o controle da contaminação laboratorial baseia-se na adoção de práticas de manipulação apropriadas. O controle de doenças ou de fitopatógenos e da contaminação in vitro está direcionado para a mais importante causa de perdas na indústria de vitroplantas. Tais perdas, entretanto, não se limitam às condições de laboratório e podem se estender na fase de estabelecimento ex vitro, em virtude da má qualidade das vitroplantas ou das partes aéreas, na fase de aclimatização.

No controle da contaminação in vitro, as práticas de prevenção, com destaque para as análises de risco nos pontos de controle crítico (HACCP) sugeridos por Leifert e Waites (1994), passaram a ser mais amplamente adotadas a partir do segundo simpósio internacional sobre contaminação in vitro, em 1996. Os métodos de detecção também vêm sendo aperfeiçoados, permitindo uma identificação mais segura e minuciosa dos microrganismos associados aos tecidos cultivados in vitro, relacionando-os com o estágio do cultivo e com a fonte de contaminação, bem como com o nicho que ele coloniza: epifítico ou endofítico.

A adoção de técnicas adequadas de assepsia superficial assegura o controle dos microrganismos epifíticos e eventuais endofíticos facultativos. A contaminação endofítica, por sua vez, constitui o principal problema da ocorrência de microrganismos no cultivo in vitro, tendo em vista que a detecção desses contaminantes, em geral tardia, muitas vezes se dá em estágios da multiplicação em que a disseminação clonal já ocorreu, e, em termos quantitativos, a perda de plantas pode ser muito alta. Ademais, por natureza, alguns desses microrganismos endofíticos podem se manter no tecido vegetal in vitro sem sinais aparentes, de forma completamente assintomática. Por outro lado, os sintomas podem não ser reconhecidos como decorrentes de microrganismos habitando o interior dos tecidos vegetais, caracterizando-se como um declínio na taxa de crescimento e desenvolvimento das culturas mantidas in vitro. Cabe salientar, entretanto, que alguns desses endofíticos assintomáticos podem se comportar como promotores de crescimento de plantas durante o cultivo in vitro.

Este capítulo dará ênfase à presença desses microrganismos assintomáticos, sua natureza e os riscos para o cultivo in vitro de plantas, apontando sugestões para indexação das plantas estoques visando à prevenção e ao controle do problema.

Pontos de controle crítico

As contaminações causadas por fungos, bactérias e leveduras na micropropagação de plantas constituem as principais causas de perdas de material vegetal, podendo alcançar valores médios de 3% a 15% a cada subcultivo (LEIFERT; WAITES, 1994; PEREIRA et al., 2003). Os contaminantes podem ser introduzidos com os explantes primários, por ocasião do seu estabelecimento in vitro, ou podem entrar em qualquer estágio do processo de cultivo. A exata determinação da fonte ou fontes de contaminação por meio da avaliação visual das culturas é, frequentemente, muito difícil. Os laboratórios de cultura de tecidos de plantas necessitam de alguma forma de controle microbiológico a fim de monitorar, continuamente, todas as possíveis fontes de contaminação visando assegurar a detecção e prevenção da entrada de contaminantes no cultivo in vitro. A indexação de explantes no momento da inoculação permite detectar a presença de contaminantes e selecionar o material a ser cultivado, evitando a propagação dos microrganismos latentes, sobretudo de contaminantes bacterianos (DANTAS et al., 2002). Na sala de crescimento, ácaros e tripes são vetores de fungos, leveduras e bactérias e representam sérios riscos de contaminação na cultura de tecidos de plantas. Por seu tamanho diminuto (< 1,0 mm), eles podem penetrar facilmente nos tubos de cultivo disseminando os microrganismos.

Os riscos associados aos diferentes tipos de contaminantes podem ser classificados de acordo com seu efeito sobre as plantas, ou explantes, in vitro e as perdas econômicas que eles causam. A princípio todas as espécies de fungos e leveduras representam risco severo porque elas crescem bem nos meios de cultura para tecidos vegetais e podem matar as plantas, ou explantes, por causa da redução do pH do meio, da produção de metabólitos tóxicos e da competição por nutrientes (LEIFERT; WAITES, 1994).

Algumas bactérias também são consideradas risco severo porque podem crescer nos meios de cultivo e matar as plantas. Nesse grupo, incluem-se espécies que habitam naturalmente a superfície dos tecidos vegetais in vivo como saprófitas ou patógenos, tais como Lactobacillus plantarum, Corynebacterium spp., Pseudomonas fluorescentes e várias Enterobacteriaceae (LEIFERT et al., 1994).

Um outro risco severo é constituído por bactérias e vírus que permanecem latentes por um longo período da cultura de tecidos, acarretando na sua disseminação ao longo de vários estágios do cultivo in vitro. A manifestação desse tipo de contaminante pode se dar por meio de redução nas taxas de multiplicação e enraizamento, comprometendo, consequentemente, a produtividade (LEIFERT; WAITES, 1994). A produção, por bactérias, de metabólitos fitotóxicos, tais como ácido lático e acético, cianeto, reguladores de crescimento e antibióticos, pode causar a deterioração dos tecidos vegetais (PEREIRA et al., 2003). Por ser detectada tardiamente, as perdas provocadas por esses contaminantes são quantitativamente elevadas.

Embora os contaminantes microbianos possam ser introduzidos ou manifestar-se em qualquer dos estágios da micropropagação estabelecidos por Murashige (1974), tem-se observado que diferentes espécies de fungos, leveduras e especialmente bactérias invadem a cultura de tecidos em diferentes estágios do cultivo in vitro (Tabela 1). O conhecimento sobre a identidade, fontes e epidemiologia de distintos contaminantes microbianos tem aumentado consideravelmente e permite estabelecer pontos de controle críticos, como proposto por Leifert e Waites (1994). Sistemas de garantia de qualidade fitossanitária têm sido introduzidos com êxito em diversos sistemas de cultivo de células e micropropagação de plantas em larga escala (LEIFERT; CASSELLS, 2001). O sistema de análise de risco em pontos de controle crítico (Hazard Analysis Critical Control Point = HACCP) define os pontos de controle crítico (PCCs) associados com os diferentes estágios do cultivo in vitro os quais são, em última análise, parâmetros cruciais a serem monitorados nos distintos estágios da cultura de tecidos de plantas (Tabela 1).

Tabela 1. Pontos de controle crítico (PCC), microrganismos indicadores e estágios da cultura de tecidos com que se relacionam.

Estágio da cultura de tecidos de plantas (PCC)

Parâmetro a ser monitorado

Microrganismo indicador

Material/Teste a ser utilizado

Estágio 0

Tratamento da planta matriz

- Sintomas de microrganismos patogênicos (vírus, bactérias ou fungos)

- Detecção e identificação de microrganismos

- Lupas de mão; microscópio ótico e com contraste de fase; meios bacteriológicos seletivos; testes sorológicos/provas de DNA; plantas indicadoras

Estágio 1

Desinfestação superficial dos explantes

- Teor de cloro ativo nas soluções de hipoclorito

- Atividade de outros biocidas

- Bactérias gram-negativas: Pseudomonas fluorescens, Erwinia spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Agrobacterium spp.

- Papel indicador; solução de arsenito; coluna de titulação

Estágio 2

Indexação

- Presença de microrganismos nos explantes após desinfestação superficial

- Meios de indexação; testes sorológicos; testes de hibridação de ácido nucleico

Estágio 3

Preparo de meio de cultura

- Autoclavagem

- Distribuição do meio

- Bacillus spp.: B. circulans, B. subtilis, B. pumilus

- Penicillium spp., Candida spp., Staphylococcus spp.

- Fechamento do autoclave; indicadores de temperatura e pressão

- Teste de esterilidade do meio; análise do ar do laboratório e da câmara de fluxo laminar (contador partículas)

Estágio 4

Subcultivo das plantas

- Esterilidade do ar

- Câmaras de fluxo

- Esterilidade do álcool para flambagem; instrumentos de esterilização

- Assepsia dos operadores

- Rhodotorula spp.

- Penicillium spp.

- Bacillus spp.

- Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Candida albicans

- Contador de partículas do ar

- Meios de indexação

- Registro da taxa de contaminação individual dos operadores

Estágio 5

Armazenamento dos meios e plantas

- Esterilidade do ar

- Presença de vetores (insetos e ácaros)

- Rhodotorula spp., Penicillium spp.

- Contador de partículas do ar

- Aparelhos de esterilização do ar

Estágio 6

Pré-aclimatação (endurecimento) das plantas

- Sintomas de microrganismos patogênicos

- Detecção e identificação de microrganismos

Idem estágio 0 plantas

Fonte: modificada de Leifert e Cassells (2001) e Leifert e Waites (1994).

Um controle insuficiente nos PCCs pode impedir a produção das culturas no laboratório e acarretar a perda de um grande número de plantas (LEIFERT; WAITES, 1994). Os sistemas preventivos de controle de riscos têm sido mais eficientes no manejo das contaminações microbianas in vitro do que os tratamentos curativos com antibióticos e outros agentes antimicrobianos. Alguns desses compostos são eficientes apenas em doses muito elevadas e exercem efeitos deletérios sobre as culturas vegetais in vitro. O crescimento de bactérias isoladas de tecidos de partes aéreas de avelã (Corylus avellana L. e C. contorta C.) cultivadas in vitro foi controlado com uma concentração de antibióticos de 3 a 4 vezes inferior àquela necessária para controlar a infecção bacteriana endofítica no tecido (REED et al., 1998). De forma similar, a concentração mínima inibitória do óleo essencial de L. gracillis para controle de bactérias endofíticas isoladas de ápices caulinares de helicônias foi de 420 µL L-1, causando reduções no crescimento bacteriano de 45% a 77%, para os distintos isolados testados (Tabela 2). Por outro lado, quando o óleo foi adicionado ao meio de cultura dos ápices caulinares, a redução na contaminação não ultrapassou os 46% (ALBUQUERQUE, 2005). Registrou-se, ademais, ação fitotóxica do óleo na concentração mínima inibitória. A fitoxidez traduziu-se pela desestruturação da membrana plasmática e demais envoltórios subcelulares (Figura 1) além da coagulação do conteúdo citoplasmático (ALBUQUERQUE et al., 2006).

Tabela 2. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis Schauer.

Microrganismo

Planta hospedeira (helicônia)

Diâmetro do halo de inibição (cm)

Percentual de inibição(1) (%)

Salmonela choleraceuis-diarizonae

Golden Torch

3,11 a(2)

77,7 a

Enterobacter asburiae

Golden Torch

2,74 b

56,5 ab

Bacillus thuringiensis

Latispata

2,69 b

48,4 b

B. pumilus

Latispata

2,63 b

45,3 b

B. pumilus

Caribea

2,54 b

59,3 ab

Klebsiella pneumoniae

Bihai

2,51 b

59,9 ab

E. hormaechei

Bihai

2,48 b

62,8 ab

B. pumilus

Bihai

2,41 b

53,9 ab

B. cereus

Rostrata

2,01 c

48,3 b

(1) Fórmula do percentual de inibição (I = CBs – CBc/CBs x 100), em que I =% de inibição; CBs = crescimento bacteriano no meio sem óleo; CBc = crescimento bacteriano no meio com óleo.

(2) Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey com a = 5%.

Fonte: nos meios NYDA (PUSEY; WILSON, 1984) e MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962).

Figura 1. Ápices caulinares de helicônia (Heliconia psittacorum x H. spatocircinata) cv. Golden Torch cultivados em meio MS com (a1 e a2) ou sem (b1 e b2) adição de óleo essencial de Lippia gracillis: (a1) unidade celular em meio com óleo; (a2) parede celular em meio com óleo; (b1) unidade celular em meio sem óleo; (b2) detalhe da parede celular em meio sem óleo. cit = citoplasma; pc = parede celular; mp = membrana plasmática; cl = cloroplasto; ei = espaço intercelular.

Fotos: Cynthia Cavalcanti de Albuquerque

As associações entre diferentes microrganismos presentes no tecido vegetal dificultam o controle e favorecem a expressão do crescimento microbiano. Além disso, o contato dos agentes químicos com os microrganismos é muito maior quando se trata de controlar o crescimento de um organismo isolado, tendo em vista que o tecido vegetal dificulta a penetração dessas substâncias e reduz sua capacidade de ação sobre os microrganismos, exigindo uma maior concentração do princípio ativo para que se obtenha o controle desejado.

Medidas de controle, como o uso de tratamento a frio para descontaminação de explantes de espécies arbóreas medicinais (Podocarpus, Ocotea e Warburgia), permitiu reduzir a contaminação por microrganismo endofítico (Bacillus subtilis) de 100% para 5% a 8% em três espécies de Podocarpus e em O. bullata, e eliminou completamente as contaminações em W. salutaris, P. falcatus e P. latifolius com quatro dias de tratamento dos explantes a 4 °C (KOWALSKI; STADEN, 1998). O material mantido durante nove meses in vitro não apresentou sinais de crescimento microbiano ou sintomas de contaminação, mas os autores salientam que é necessário certificar-se se os contaminantes foram eliminados ou se passaram para uma condição latente, podendo manifestar-se em estágios posteriores da micropropagação.

O reconhecimento dos contaminantes e de sua sintomatologia permite desenvolver e aprimorar as estratégias de controle e prevenção de contaminação, mas a permanência de microrganismos de forma latente no cultivo in vitro de plantas é uma forma particular de contaminação que pode ir minando a produtividade da cultura sem deixar suspeita da causa real do problema.

Microrganismos silenciosos

A contaminação microbiana crônica acarreta sérios problemas nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas. Lotes inteiros de plantas aparentemente axênicas podem apresentar crescimento microbiano de forma síncrona, após vários subcultivos. Essa realidade conflita com o status de livres de patógenos ou microrganismos atribuído às plantas micropropagadas e aos tecidos mantidos in vitro.

Além das já conhecidas portas de entrada para os microrganismos durante o cultivo in vitro de tecidos de plantas, tanto na fase de estabelecimento dos explantes como ao longo do processo de cultivo, há outras possíveis vias de contaminação pouco prováveis, como o álcool usado para flambagem de pinças e bisturis. A indexação desse álcool permitiu constatar a presença de Bacillus (THOMAS, 2004a), demonstrando mais uma insuspeita via de contaminação.

Entre as principais fontes de contaminação dos tecidos cultivados in vitro estão os microrganismos endofíticos e os fastidiosos, patogênicos ou não, que estão protegidos dos agentes assépticos superficiais. Esse tipo de contaminação desperta interesse especial uma vez que não pode ser evitada por meio do aprimoramento das técnicas de esterilização da superfície dos explantes, já que os microrganismos endofíticos não são eliminados por essa via. A flora endofítica pode ser constituída de espécies que habitam os espaços intercelulares e intracelulares, incluindo vírus, viroides, bactérias e fungos (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994). Uma ampla gama de microrganismos que habitam a superfície do tecido vegetal ou a rizosfera pode, oportunisticamente, penetrar e colonizar internamente os tecidos vegetais. Diz-se, portanto, que os microrganismos epifíticos são, potencialmente, endófitos facultativos (CASSELLS, 1991).

Faz-se oportuno estabelecer aqui a terminologia aplicada para os microrganismos que habitam o exterior ou o interior dos tecidos das plantas. Em 1866, DeBary aplicou o termo endófito a fungos vivendo no interior dos tecidos vegetais, enquanto que os epífitos seriam aqueles habitantes da superfície dos tecidos das plantas. Posteriormente, a definição de endófito seria a de um microrganismo (fungo ou bactéria) capaz de causar uma infecção parasítica dentro do tecido vegetal de forma assintomática, uma vez que a definição adotada por DeBary engloba fungos saprófitos, patógenos e simbiontes, e esses grupos compreendem organismos que não habitam exclusivamente o interior ou o exterior das plantas (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994). Embora, em termos gramaticais, devêssemos adotar a palavra endófito para os organismos que colonizam/habitam os nichos endofíticos, os termos endofítico e epifítico vêm sendo adotados para fazer referência tanto aos organismos como ao hábitat dos mesmos. Finalmente, a definição de endofítico foi ampliada de forma a abranger dois grupos de microrganismos: os obrigatórios e os facultativos.

Os endofíticos obrigatórios são aqueles que ocupam exclusivamente o nicho endofítico e não são capazes de crescer e se reproduzir como epifíticos ou fora do hospedeiro. Os endofíticos facultativos, por sua vez, são organismos que apresentam uma certa fidelidade com um hospedeiro em particular, mas estão capacitados a completar seu ciclo de vida fora do tecido do hospedeiro. Os facultativos podem ainda ser classificados como constitutivos ou induzíveis. São considerados constitutivos aqueles que habitam naturalmente os nichos endofíticos ou epifíticos. Por outro lado, os facultativos induzíveis são capazes de sobreviver quando transferidos artificialmente para o ambiente endofítico, embora não apresentem uma multiplicação significativa até que as condições fisiológicas se tornem mais favoráveis ao crescimento.

Os facultativos induzíveis constituem o grupo mais frequentemente associado às plantas cultivadas in vitro. Esse tipo de contaminação microbiana tem origem epifítica, ocorrendo a transferência dos microrganismos para o nicho endofítico durante a excisão do explante e subsequentes manipulações in vitro. Além desses, patógenos facultativos ou obrigatórios podem, igualmente, colonizar os tecidos das plantas, assistidos por vetores ou mediante mecanismos próprios de penetração na planta. A existência de endofíticos obrigatórios e o estabelecimento de endofíticos facultativos no interior dos tecidos vegetais tornam ineficaz a ação dos esterilizantes superficiais e, consequentemente, permite que haja colonização ou invasão microbiana da cultura, ou do meio, no estabelecimento do cultivo in vitro (estágio 1), ou nos estágios subsequentes (multiplicação, enraizamento).

Na fitopatologia, o termo latente é utilizado para descrever infecções, por bactérias em especial, sem efeitos adversos óbvios. Na cultura de tecidos de plantas, embora alguns microrganismos possam permanecer latentes, no sentido de que eles normalmente não se tornam evidentes no meio de cultura, seus efeitos sobre o crescimento do tecido vegetal – seja inibitório, nulo ou promotor – não são claramente conhecidos. Por isso, no inglês, o termo covert, cuja tradução direta para o português é oculto, é adotado por alguns autores (HOLLAND; POLLACO,1994; HORSCH; KING, 1983; THOMAS, 2004b) para designar os microrganismos que não estão normalmente evidentes na cultura de tecidos. Buscando uma terminologia, ainda que fora do rigor do idioma, que possa expressar a natureza dissimulada dos microrganismos que se mantêm de forma assintomática nos tecidos vegetais cultivados in vitro, sugerimos chamá-los de silenciosos.

De silenciosos a evidentes

A desinfecção superficial dos explantes no início do estabelecimento de uma cultura in vitro muitas vezes é ineficiente. Isso pode ser consequência de uma combinação inadequada de tipo, dose e tempo de aplicação do desinfestante, bem como da localização dos microrganismos no tecido vegetal.

A maioria dos microrganismos cresce ativamente nos meios de cultura para tecidos de plantas. Organismos eucarióticos, como fungos e leveduras, geralmente apresentam crescimento visível nos meios de cultura de tecidos de plantas, porque, em geral, a composição desses meios contempla todos os nutrientes essenciais ao crescimento de tais microrganismos (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Dessa forma, fungos filamentosos e leveduras raramente permanecem ocultos no cultivo in vitro de tecidos de plantas, e, portanto, a maioria das contaminações microbianas visíveis logo após a inoculação dos explantes in vitro é em virtude desses microrganismos. Mantell (1998) constatou, entretanto, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), o desenvolvimento de conidiósporos de Colletotrichum gloeosporioides, o agente causal da antracnose, em superfícies foliares de espécies de inhame (Dioscorea sp.) aparentemente saudáveis. Além disso, esse mesmo autor registrou a presença de uma microlevedura não identificada na superfície esterilizada de tecidos de segmento nodal de inhame (Dioscorea alata). Foram adotados, então, processos de assepsia mais rigorosos, incluindo banhos em solventes orgânicos, para facilitar a penetração dos agentes esterilizantes através de uma matriz de exopolissacarídeos do explante, antes do processo de assepsia convencional. Menos de 20% do material vegetal tratado apresentou-se contaminado, e, quando submetido a análises com MEV, constatou-se a microlevedura localizada de forma intercelular, em células da raiz, abaixo da superfície do meio de cultura. Os resultados desse trabalho mostram que essa microlevedura foi capaz de ocupar o nicho endofítico e manter-se em íntima e consistente associação com os tecidos de inhame durante o cultivo in vitro. A despeito da presença desse microrganismo, o autor relata que as plantas de inhame cultivadas in vitro mostraram-se vigorosas e produziram túberas de boa qualidade (MANTELL, 1998).

No que se refere às bactérias, muitas delas são capazes de crescer rapidamente no meio de cultura de tecidos de plantas e tornam-se patogênicas durante o cultivo in vitro, podendo ser consideradas como vitropatógenos. Ápices caulinares de helicônias apresentam, por exemplo, sérios problemas para estabelecimento in vitro por causa da presença de bactérias endofíticas que rapidamente crescem no meio de cultura de tecidos de plantas e impedem o desenvolvimento dos explantes. Foram isoladas e identificadas sete espécies de bactérias (Tabela 3) a partir de ápices caulinares de um híbrido e quatro espécies de helicônias (ALBUQUERQUE et al., 2006).

Tabela 3. Isolados bacterianos obtidos do estabelecimento in vitro de ápices caulinares de um híbrido e de quatro espécies de Heliconia.

Hospedeiro

Espécie de bactérias

H. bihai

Klebsiella pneumoniae

H. bihai

Enterobacter hormaechei

H. bihai

B. pumilus

H. caribea

B. pumilus

H. latispatha

Bacillus thuringiensis

H. latispatha

B. pumilus

H. rostrata

B. cereus

Heliconia psittacorum x H. spathocircinata var. Golden Torch

Salmonela choleraceuis-diarizonae

H. psittacorum x H. spathocircinata var. Golden Torch

Enterobacter asburiae

Fonte: modificado de Albuquerque et al. (2006).

Outras bactérias exigem nutrientes e condições de crescimento específicas e podem permanecer associadas ao tecido vegetal sem serem detectadas enquanto as condições não forem favoráveis para seu crescimento. As chamadas bactérias fastidiosas ou não são cultiváveis (fitoplasmas) ou são recalcitrantes (micoplasmas e espiroplasmas) ao cultivo em meio nutritivo artificial (micoplasmas e espiroplasmas). Essas bactérias constituem uma classe de microrganismos desprovidos de parede celular denominados molicutes (do inglês: moll = macio; cute = pele), que reúnem os menores e mais simples organismos autorreplicáveis. Os molicutes estão entre as bactérias que colonizam o sistema vascular, xilema e floema, mas há registros de espécies que não causam doenças nas plantas, ocupando nichos epifíticos (FLETCHER; WAYADANDE, 2002). Por outro lado, embora possam permanecer de forma assintomática ou sem crescimento aparente, as bactérias podem induzir redução na taxa de crescimento e enraizamento, ou até mesmo a morte das plantas (TANPRASERT; REED, 1998). Pertencem a esse grupo, por exemplo, as pseudomonas, as xantomonas e as corinebactérias (LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Segmentos nodais e de túberas jovens de inhame esterilizados superficialmente e cultivados em meio bacteriológico mostraram a presença de contaminantes bacterianos em 95% das amostras avaliadas. Os gêneros mais frequentes foram Serratia, Enterobacter, Xanthomonas, Curtobacterium e Pseudomonas. Na maioria dos acessos avaliados por MEV, constatou-se que a sobrevivência das bactérias à esterilização superficial deveu-se, possivelmente, à presença de uma copiosa matriz de exopolissacarídeos, originária tanto dos explantes como dos microrganismos, cobrindo as bactérias existentes em volta e abaixo dos pelos glandulares de folhas e caules de espécies de inhame. Estruturas baciliformes, similares a bactérias, foram observadas em vasos do xilema. A localização verdadeiramente endofítica foi confirmada em ensaios de transformação genética, nos quais muitos resultados falsos-positivos para os ensaios histoquímicos com β-glucuronidase (GUS) foram causados por bactérias localizadas dentro de tecidos vasculares de caules e raízes, destacando-se a espécie Curtobacterium flaccumfaciens. Nem o crescimento nem a tuberização das plantas de inhame foram afetados pela presença das referidas bactérias (MANTELL, 1998).

A existência de microrganismos silenciosos no cultivo in vitro de tecidos de plantas constitui um sério risco de disseminação ao longo das sucessivas etapas da clonagem vegetal, podendo chegar à progênie das plantas micropropagadas. Vários são os fatores que podem contribuir para a permanência assintomática de tais microrganismos no decorrer do cultivo in vitro, entre os quais citam-se: baixo nível de infecção; exigência de tecidos vegetais maduros ou em fase de maturação; composição, potencial osmótico e pH do meio de cultura; luminosidade e temperatura da sala de incubação; adequação de métodos de detecção de microrganismos, entre outros (CASSELLS, 1991; KAMOUN et al., 1998; MANTELL, 1998; THOMAS, 2004b). Existe também a hipótese, ainda não confirmada, de que mecanismos de resistência a microrganismos patogênicos, mais ativos nas plantas sob as condições do cultivo in vitro, contribuam para manter assintomática a presença desses microrganismos durante os diferentes estágios da cultura de tecidos. Há evidências de que esses mecanismos de resistência sejam ativados tanto pela juvenilidade dos tecidos utilizados no cultivo in vitro, como pela presença de reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura (LEIFERT et al., 1994). A produção de compostos antivirais e o aumento na síntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR), envolvidas na resistência a vírus, foram registrados em resposta a certos reguladores de crescimento utilizados no cultivo in vitro de tecidos vegetais. Mecanismo de tolerância cruzada ao estresse, ou seja, a resistência a um patógeno induzida pelo estresse oxidativo em virtude de condições subótimas durante o cultivo in vitro, tais como estresse salino, pode explicar esse fenômeno (CASSELLS; CURRY, 2001). A exsudação de substâncias antibacterianas por células e tecidos de plantas cultivadas in vitro é outro fator que pode reprimir o crescimento microbiano e favorecer a persistência desses microrganismos silenciosos (LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Diversos autores destacam que um dos problemas na indexação de tecidos vegetais aparentemente livres de microrganismos é a baixa densidade de inóculo a ponto de não alcançar o nível de detecção de algumas metodologias (CASSELS, 1991; KNAPP et al., 1996; LEIFERT; WOODWARD, 1998; THOMAS et al., 2004). No campo, quando a monocultura é praticada continuamente em uma mesma área, a densidade de inóculo aumenta. De forma similar, a micropropagação vegetativa e a conservação de germoplasma em longo prazo podem levar as culturas ao acúmulo de microrganismos intracelulares (CASSELLS, 1991). As densidades de população de bactérias endofíticas são mais altas nos tecidos de raízes e ficam em torno de 105 UFC g-1 de peso fresco (unidades formadoras de colônias, por mililitro ou grama). Essa densidade é significativamente inferior àquelas registradas para bactérias fitopatogênicas, que superam a marca de 108 UFCg-1 de peso fresco (HALLMANN, 2001). Num alto nível de infecção, populações bacterianas podem atingir até 1010 UFC g-1 de peso fresco e apresentar inclusive ooze a partir de tecidos de caules ou folhas (HALLMANN, 2001; VIDAVER; LAMBRECHT, 2004). Normalmente são necessárias populações de, pelo menos, 106 UFC g-1 para que esses microrganismos expressem sua ação como agentes de biocontrole ou causadores de doenças. (VIDAVER; LAMBRECHT, 2004). O aumento na população dos microrganismos intimamente associados com os tecidos cultivados in vitro é uma das justificativas para o aparecimento de sintomatologia tardia durante a micropropagação, às vezes na discreta forma de declínio no desenvolvimento da cultura.

Outro fator que claramente favorece a permanência dos microrganismos de forma assintomática na cultura de tecidos é o fato de alguns microrganismos colonizarem tecidos vegetais maduros ou em fase de maturação e no cultivo in vitro empregam-se, preferencialmente, tecidos jovens como explantes, ou se induz o rejuvenescimento dos mesmos. Nos subcultivos, ademais, prevalece a prática de seleção de tecidos jovens (gemas, novas brotações, ápices caulinares) e descarte de tecidos mais maduros. Conforme comentado anteriormente, a juvenilidade das células e tecidos cultivados in vitro é apontada como um dos fatores que tornam os mecanismos de resistência a microrganismos mais ativos in vitro do que in vivo (LEIFERT et al., 1994). Quando culturas de inhame foram deixadas durante vários meses no mesmo meio de cultivo, sem serem subcultivadas, a presença de microrganismos silenciosos foi evidenciada pelo crescimento bacteriano no meio de cultura na região basal das partes aéreas (MANTELL, 1998).

A composição do meio de cultura é, sem dúvida, um dos fatores preponderantes para o crescimento de microrganismos silenciosos na cultura de tecidos de plantas. Os distintos estágios da micropropagação exigem alterações na composição dos meios visando à indução de uma determinada via de desenvolvimento fisiológico do material vegetal. Essas alterações podem incluir: adição, supressão ou mudanças nas combinações e concentrações dos reguladores de crescimento; redução na força iônica; redução ou supressão da fonte de carboidrato e outros componentes orgânicos (vitaminas, aminoácidos, poliaminas, etc.); além da adição de misturas complexas (água de coco, extrato de levedura, caseína hidrolisada, extratos vegetais diversos).

Na cultura de tecidos de plantas, bactérias podem ser detectadas por vários tipos de meios de indexação. O próprio meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) permite detectar diversos contaminantes, como constatado em experimentos com genótipos de morango cujos explantes foram submersos em meio MS líquido com metade da força iônica e nos quais foram detectados microrganismos contaminantes em 45 dos genótipos avaliados. A adição de extrato de levedura (265 mg L-1) e peptona (88 mg L-1) ao meio MS aumentou em 10% o número de amostras contaminadas, tendo em vista que se observou um crescimento bacteriano mais óbvio e rápido. A presença de peptona e do extrato de levedura nos meios de crescimento e multiplicação de morangueiros, durante dois subcultivos, permitiu a detecção de todos os contaminantes bacterianos (TRANPASERT; REED, 1998). A essencialidade dos carboidratos para o rápido crescimento da maioria dos microrganismos foi confirmada a partir da transferênica de culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendrum, Maranta e Cordyline, contaminadas com fungos e bactérias, para o cultivo autotrófico usando esponja de poliuretano como suporte, o que permitiu a recuperação dessas culturas (SAYEGH; LONG, 1997). A partir desse resultado, a supressão dos componentes orgânicos dos meios de cultura de tecidos de plantas,chamado cultivo autotrófico ou micro-hidroponia asséptica, vem se constituindo numa nova tendência e é apontada como uma forma de cultivo que permite o uso de recipientes maiores com menor risco de contaminação microbiana (CASSELLS, 2000a; CASSELLS; WALSH, 1998; KOZAI, 1991).

A detecção de bactérias silenciosas de tecidos de Prunus cerasus em meio de indexação só foi possível mediante um tratamento de pré-incubação em soluções com pressão osmótica decrescente (KAMOUN et al., 1998). Células procarióticas desprovidas de parede foram visualizadas por microscopia eletrônica dentro do citoplasma de células do mesofilo das plantas micropropagadas, e, por meio de PCR, foi identificada uma bactéria como pertencente ao gênero Pseudomonas. Os autores argumentam que a incubação preliminar em solução de baixa pressão osmótica seria necessária para a regeneração da parede celular da hipotética forma-L dos contaminantes bacterianos (KAMOUN et al., 1998).

Resultados como esses demonstram que mudanças na composição do meio de cultura, em especial no que se refere aos componentes orgânicos, podem favorecer o crescimento bacteriano levando os microrganismos silenciosos a apresentarem um crescimento visível ou perceptível.

Muitas espécies de plantas reduzem o pH do meio de cultura de 5,6 para 3,8 ou 4,5 durante o crescimento in vitro, acarretando na redução ou prevenção do crescimento de bactérias como Agrobacterium tumefaciens, Bacillus spp., Pseudomonas maltophilia, P. syringae, Staphylococcus saprophyticus e Xanthomonas campestris (LEIFER; WAITES, 1994). Um trabalho para caracterização de contaminantes bacterianos de espécies ornamentais permitiu isolar e purificar 18 espécies bacterianas. A maioria dos isolados requeria, para crescimento, pH entre 5,7 e 8,0, embora alguns tenham tolerado pH 4,0 (BRUNNER et al., 1995). O efeito do pH do meio de cultura sobre a expressão de bactérias silenciosas no cultivo in vitro de tecidos de plantas foi claramente evidenciado por Thomas (2004c) no cultivo in vitro de melancia triploide. Mediante a indexação de tecidos em meio ágar nutriente (NA) a pH 6,4, esse autor observou que todos os 32 frascos de cultivo indexados apresentaram crescimento bacteriano uma semana após a indexação, enquanto que no meio de multiplicação (MM) gelificado com ágar e com pH 5,8 não houve crescimento bacteriano visível, mesmo após duas semanas de incubação. Quando o MM foi gelificado com Phytagel® e o pH ajustado para 6,4, só foi constatada expressão de contaminantes bacterianos quatro semanas após a indexação e em apenas 41% do material vegetal avaliado. Esse percentual caiu para 25% no meio com Phytagel® e pH 5,8 (THOMAS, 2004c).

Alterações de natureza química (pH, composição e concentração) ou física (potencial osmótico, consistência) no meio de cultura podem ser induzidas pelos protocolos de cultivo in vitro ou em consequência da exsudação dos tecidos das plantas. Na micropropagação de melancia triploide, observou-se que o meio de multiplicação recém-preparado (pH ajustado em 5,8 antes da adição do ágar) apresentou pH de 6,12 ± 0,035, o qual aumentou para 6,19 ± 0,042 após um mês de cultivo, passando a 6,62 ± 0,13 e 7,01 ± 0,05 após 2 e 3 meses de cultivo, respectivamente. Evidências de crescimento de bactérias foram frequentes em culturas com mais de dois meses de cultivo in vitro (THOMAS, 2004c).

De forma similar ao que ocorre nos solos, muitos microrganismos sobrevivem em estado quiescente até que os propágulos dormentes sejam ativados por moléculas presentes em exsudatos do tecido vegetal (WILLADINO et al., 2005). Diversos fatores que afetam o crescimento microbiano são decorrentes de exsudatos de células vegetais, tornando os microrganismos intimamente dependentes do tecido da planta (LEIFERT; CASSELLS, 2001).

A atmosfera dos tubos de cultivo é um outro fator que pode afetar, direta ou indiretamente, a manifestação dos microrganismos silenciosos, tornando-os perceptíveis macroscopicamente. A formação de aerênquima em plantas de Zantedeschia aethiopica cultivadas in vitro pode ser influenciada pela permeabilidade das tampas dos tubos de cultivo ao ar. O aerênquima desenvolve-se em raízes privadas de oxigênio em solos alagados por causa do acúmulo de etileno, o que ocorre em tubos de cultura de tecidos. Essa acumulação de etileno pode provocar efeitos deletérios sobre o desenvolvimento dos explantes e, indiretamente, tornar o ambiente mais favorável à proliferação de bactérias endofíticas (JACKSON et al., 1991). A presença de metanol na atmosfera dos tubos de cultivo de Z. aethiopica e a identificação de um contaminante metilotrófico facultativo de pigmentação rósea (pink pigmented facultative methylotroph = PPFM) são um exemplo claro da interferência do ambiente gasoso sobre o crescimento microbiano. A disseminação de PPFM em culturas assintomáticas ocorrerá mecanicamente durante os subcultivos, facilitando a colonização do hospedeiro e sua progênie. Eventualmente, o acúmulo de metanol nos tubos de cultivo combina com um nível crítico de densidade de inóculo favorecendo o crescimento profuso do PPFM e tornando a contaminação visível macroscopicamente, uma vez que o status das bactérias passa de silencioso para evidente (GUNSON; SPENCER-PHILLIPS, 1994).

As condições físicas da sala de incubação, como luminosidade e temperatura, também podem afetar os microrganismos silenciosos e torná-los, ou não, evidentes. Em meio de cultura artificial, bactérias fitopatogênicas geralmente crescem mais lentamente do que aquelas não patogênicas, com temperatura de crescimento ótima na faixa de 20 °C a 30 °C. Umas poucas crescem a 37 °C ou mais, e outras podem crescer lentamente a temperaturas entre 10 °C e 12 °C. Dezoito isolados bacterianos provenientes do cultivo in vitro de Dieffenbachia amoena, Anthurium andreanum e Spathiphyllum sp. apresentaram crescimento ótimo a temperaturas entre 28 °C e 35 °C. As bactérias emergiram dos explantes após 3 a 20 dias de cultivo, embora em alguns explantes, tidos inicialmente como saudáveis, o crescimento bacteriano só ocorreu vários meses após a inoculação do tecido (BRUNNER et al., 1995). Embora muitas salas de crescimento nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas sejam mantidas à temperatura de aproximadamente 25 °C (LEIFERT; CASSELLS, 2001), a faixa de 28 °C a 35 °C coincide com o ótimo para o crescimento das plantas in vitro, o que favorece o crescimento e a proliferação desses contaminantes bacterianos. Mantell (1998) constatou uma ampla gama de microrganismos presentes na superfície de tecidos de espécies de inhame (Dioscorea sp.) cultivados in vitro. O crescimento bacteriano, entretanto, só se tornou aparente quando as culturas, despachadas por correio, foram mantidas no escuro e estiveram sujeitas a temperaturas flutuantes.

Leifert e Waites (1990) propuseram a elaboração de uma base de dados de indicadores de bactérias para facilitar a identificação de contaminantes bacterianos comuns na cultura de tecidos de plantas. Essa base de dados incluiria informações que permitissem relacionar os contaminantes bacterianos com as condições de crescimento favoráveis ao desenvolvimento dos mesmos (BRUNNER et al., 1995).

Os métodos de detecção, caracterização e identificação de contaminantes bacterianos também devem ser considerados quando se trata de detectar microrganismos silenciosos e certificar a sanidade dos tecidos vegetais cultivados in vitro. Em geral, uma combinação de testes morfológicos e bioquímicos é necessária para caracterizar e identificar microrganismos procarióticos (BRUNNER et al., 1995), associando-se, ademais, o cultivo em distintos meios bacteriológicos (THOMAS, 2004b). Uma revisão de modernos métodos para caracterização, identificação e detecção de bactérias associadas com plantas aponta os testes de perfil de ácidos graxos (FAP) e de PCR como os mais adequados métodos de caracterização e identificação, e seleciona, para detecção, os ensaios de imunofluorescência e PCR baseado em provas fluorigênicas (STEAD et al., 2000). Thomas (2004b) propõe um procedimento para detecção de bactérias silenciosas e endofíticas constituído de uma sequência de três passos na seleção de material vegetal cultivado in vitro.

Deve-se ter em mente que microrganismos endofíticos não são um sinônimo de microrganismos silenciosos, embora possam se comportar como tal, e que esses microrganismos podem se tornar evidentes em função de uma variada gama de fatores que devem ser considerados ao longo da cultura de tecidos de plantas.

Microrganismos silenciosos na aclimatização

O estado fisiológico das plantas micropropagadas é um fator decisivo para o transplantio e posterior estabelecimento dessas plantas no campo. Uma etapa de endurecimento ou pré-aclimatação visa adequar a planta fisiologicamente para as novas condições ambientais a que será exposta. O ambiente de cultivo in vitro apresenta características tais que reduzem a corrente transpiratória e, consequentemente, a absorção de cálcio, que é essencial ao funcionamento estomático e à integridade da parede celular e da membrana plasmática. A inibição do movimento das auxinas desde o ápice caulinar para as demais partes da planta pode acarretar em acúmulo desse hormônio na parte aérea e em toxidez auxínica (CASSELLS, 2000b). Tais distúrbios fisiológicos favorecem o desenvolvimento da síndrome da hiperidricidade ou vitrificação, que se caracteriza pela reduzida espessura da parede celular decorrente da inibição da síntese de lignina, movimento estomático deficitário, elevado teor hídrico nos tecidos, etc.

Nas condições ex vitro, vários fatores abióticos são indutores de estresse. Grande ênfase é dada ao estresse hídrico; entretanto, nas etapas de endurecimento ou pré-aclimatização, as plantas são bastante susceptíveis a alguns microrganismos, fitopatogênicos ou não. Esses microrganismos podem entrar no sistema de propagação das plantas através de correntes de ar, pelos regimes de rega ou por meio de insetos ou microartrópodos. É, portanto, de extrema importância proteger as vitroplantas da ação de microrganismos nesse estágio, mas convém destacar que é fundamental a certificação de sanidade das plantas estoque, antes de aclimatá-las.

Alguns gêneros de fungos encontrados em laboratórios de cultura de tecidos de plantas, tais como Alternaria, Botrytis, Phoma e Cladosporium, são conhecidos como fitopatógenos e podem ser disseminados na aclimatização. Um levantamento feito em laboratórios no Reino Unido e outros países da Europa mostraram que em 16 deles foram registradas perdas na aclimatização em virtude de Botrytis cinerea; em 6 deles, registraram-se problemas com Pythium e Rhizoctonia; e em outros 3, o gênero Phytophtora foi o responsável pelas perdas (WILLIAMSON et al., 1998).

A presença de bactéria endofítica em plantas de Prunus cerasus micropropagadas assepticamente foi evidenciada por meio de análise PCR em tecido vegetal e identificada como pertencente ao gênero Pseudomonas (KAMOUN et al., 1998). Uma aberração no DNA de plantas de batata provenientes de cultura de tecidos foi constatada durante comparações entre fingerprints de plantas in vitro e no campo. O fragmento aberrante foi gerado com primer 2-10 de cultivares de batata nos quais se constatou, posteriormente, contaminação com Bacilus pumilus, o que levou à hipótese de que esse fragmento estava associado à presença do microrganismo (ISENEGGER et al., 2003). A detecção desse fragmento de DNA poderia ter tido ramificações no DNA dessas cultivares de batata se a origem bacteriana não tivesse sido identificada (ISENEGGER et al., 2001). Interpretar esse fragmento de DNA como um polimorfismo genético das plantas micropropagadas poderia causar discrepâncias na coleção de cultivares e acarretar na perda desnecessária de plantas provenientes da cultura de tecidos.

A constatação da presença de microrganismos em plantas na fase de aclimatização põe em risco a reputação do material micropropagado, tanto no que se refere à qualidade fitossanitária, quanto à fidelidade genética.

Declínio in vitro

A principal meta da micropropagação é produzir plantas em condições adequadas para o uso a que se destina. Os dois parâmetros de qualidade que devem ser rigorosamente observados são o estado fitossanitário e a identidade genética das plantas. A qualidade fitossanitária das vitroplantas vem sendo bastante discutida (CASSELLS, 1998, 2000b), uma vez que microrganismos silenciosos podem permanecer de forma não detectável durante um longo período do cultivo in vitro de tecidos de plantas e se tornar evidentes mediante o crescimento visível no meio de cultura ou mediante o desenvolvimento de sintomatologia específica no tecido vegetal. A manifestação desses microrganismos como vitropatógenos pode ocorrer em estágios tardios do cultivo in vitro ou após a pré-aclimatação (endurecimento) das plantas. Na prática, a partir do momento em que se detecta a presença de microrganismos, a alternativa mais segura é o descarte e a autoclavagem do material contaminado (PEREIRA; FORTES, 2003), tendo em vista que existe o risco de que os contaminantes microbianos estejam entre os patógenos humanos e possam infectar as pessoas que trabalham nos laboratórios de cultura de tecidos de plantas (RAFFERTY et al., 2000).

Em alguns casos, entretanto, esses microrganismos não apresentam crescimento visível nem provocam sintomas nas plantas que permitam suspeitar da presença dos mesmos. A ação desses contaminantes pode ser mascarada por mecanismos da planta mediados pela ação de reguladores de crescimento induzidos pelas condições de cultivo in vitro. O efeito da contaminação endofítica silenciosa pode ocorrer sutilmente, na forma de um declínio na capacidade de multiplicação, seja na emissão de gemas adventícias ou de brotações. A taxa de enraizamento também pode sofrer redução comprometendo a produtividade das culturas in vitro com consequente diminuição do número e da qualidade das plantas a serem aclimatadas. Na maioria das vezes, esses efeitos manifestam-se apenas depois de um período relativamente prolongado da cultura de tecidos. Em geral, suspeita-se dos mais variados fatores, desde os componentes do meio de cultura (qualidade do ágar, concentração do açúcar, validade dos reagentes, erro no preparo das soluções estoques ou do próprio meio de cultura, ajuste do pH), como alterações nas exigências hormonais dos tecidos ao longo do tempo de cultivo. Muitas vezes tais suspeitas levam a uma bateria de testes sem que se obtenha um resultado inequívoco da causa do declínio in vitro.

Esse tipo de problema foi enfrentado com culturas de melancia triploide mantidas regularmente in vitro por quatro a cinco anos. Um gradual declínio no desempenho das culturas in vitro traduziu-se numa redução da taxa de formação de parte aérea a partir dos segmentos caulinares. Registraram-se reduções na altura das plantas, número de nós, brotações axilares e expansão foliar, em comparação com cultivos mantidos há menos tempo in vitro. Sintomas como amarelecimento das folhas basais, necrose ao longo das margens das folhas medianas, seca das folhas superiores e gavinhas, além de hiperidricidade tornaram-se comuns nesses cultivos. Até então essa melancia (Citrullus lanatus Thunb. [Matsum. e Nakai]) triploide sem semente vinha sendo mantida in vitro, em frascos de 120 mm x 65 mm, com subcultivos regulares e incubação em meio de multiplicação contendo 1 µM de 6-benzilaminopurina (BAP), 1 µM de ácido giberélico (GA3) e ácido 3-indolacético (AIA), com 10 g L-1 de ágar e pH 5,8 (THOMAS et al., 2000a, 2000b). No meio de enraizamento, a taxa de formação de raízes caiu de 80% a 90% para 10% a 30%, em diferentes frascos de cultivo. Observaram-se inibição no número, comprimento e ramificações das raízes. O aparecimento de todos esses sintomas levou à investigação das possíveis causas do decréscimo nas taxas de multiplicação e enraizamento dessa cultura. A indexação de culturas visivelmente limpas em meios enriquecidos permitiu evidenciar a presença de bactérias silenciosas. Após esterilização superficial, as culturas responderam positivamente com um aumento na multiplicação de brotos e enraizamento, mas as bactérias sobreviveram endofiticamente. Tratamento com antibióticos aplicados em solução superposta ao meio de multiplicação e enraizamento permitiu superar o problema. Os resultados obtidos levaram à constatação de que o declínio na micropropagação das culturas testadas não foi decorrente de erros na formulação dos meios de cultura ou de modificações nas exigências nutricionais e/ou hormonais do material vegetal cultivado. Evidenciou-se que o declínio in vitro foi causado pela presença de contaminantes bacterianos silenciosos, hábeis em sobreviver endofiticamente. As plantas obtidas desses cultivos mostraram-se normais e férteis, indicando a viabilidade do cultivo in vitro prolongado para essa espécie (THOMAS, 2004c).

As culturas micropropagadas geralmente não são mantidas sob cultivo in vitro por um período de tempo prolongado, e as razões para isso residem na perda do potencial de multiplicação ao longo de vários subcultivos e nas chances de variação somaclonal. Embora associações microbianas latentes ou silenciosas com efeitos adversos sobre o crescimento, proliferação ou enraizamento já tenham sido registradas no cultivo de diversas plantas (LEIFERT; WAITES, 1994; LONG et al., 1988), raramente se atribui a elas a causa da degeneração in vitro ou da não sustentabilidade dos cultivos por um tempo prolongado (THOMAS, 2004c). De acordo com Thomas (2004c), problemas de degeneração in vitro em culturas mantidas por longo período de cultivo podem ser contornados por meio da indexação dos tecidos e do meio de cultura, pela diminuição da concentração de inóculo com tratamentos de descontaminação ou pela supressão do crescimento microbiano mediante tratamentos temporários com soluções de antibióticos.

Procedimento de detecção de bactérias silenciosas e endofíticas

Ainda que seja de extrema importância uma metodologia eficiente de detecção de contaminantes durante as etapas do processo do cultivo in vitro, existem poucos trabalhos disponíveis nessa área. Destacam-se entre esses os trabalhos desenvolvidos por Pious Thomas (THOMAS, 2004b, 2004c) que abordam tanto a detecção de microrganismos silenciosos e endofíticos quanto as consequências da presença deles durante o cultivo in vitro. A presença desses microrganismos muitas vezes passa despercebida, e as consequências de sua presença são atribuídas a outros fatores. Uma das consequências mais frequentes, o declínio do crescimento das culturas, expresso como redução das taxas de multiplicação e/ou enraizamento, causa grande preocupação aos laboratórios uma vez que o protocolo utilizado rotineiramente deixa, aparentemente, de ser eficiente. Um grande esforço é realizado para esclarecer a causa do declínio da cultura, incluindo a checagem das soluções dos reguladores de crescimento e demais soluções utilizadas no preparo do meio, a checagem da qualidade do ágar, do tipo e concentração dos carboidratos e do pH, sem que se obtenha nenhum resultado positivo. Eventualmente são realizados ensaios visando avaliar se as culturas modificam seus requerimentos ao longo do tempo de cultivo sem que se obtenham, tampouco, resultados positivos. Por outro lado, a avaliação da presença de microrganismos endofíticos ou silenciosos raramente é realizada.

A presença de bactérias ocultas no cultivo in vitro é, evidentemente, indesejável, seja por causar declínio no crescimento, por resultar na falta de reprodutibilidade de protocolos da cultura de tecidos, por permitir a disseminação de patógenos, pelo risco potencial a bancos de germoplasma ou por colocar em risco o intercâmbio seguro de germoplasma. Todos esses fatores reduzem a confiabilidade dos sistemas de cultivo in vitro de células, tecidos e plantas. Os contaminantes microbianos encontrados no cultivo in vitro de plantas são introduzidos tanto no início do cultivo como posteriormente, em virtude de técnicas de esterilização ineficientes.

Thomas (2004b) apresenta um procedimento para a detecção de bactérias silenciosas e endofíticas em três etapas sequenciais. Esse procedimento envolve uma primeira etapa de diligente exame visual das culturas para qualquer crescimento microbiano não evidente; uma segunda etapa que é a indexação do meio de cultura aparentemente não contaminado, utilizando meio bacteriológico; e a terceira etapa que consiste na indexação do tecido usando segmentos de diferentes partes da planta provenientes de meios com indexação negativa. Trabalhos realizados com uva, melancia, mamão, berinjela, pimenta e gérbera cultivadas in vitro revelaram a existência de bactéria numa proporção que variou de 0% a 100% das culturas, em diferentes lotes. Uma proporção variável de culturas que não revelaram bactérias na segunda etapa mostrou indexação positiva na terceira etapa, indicando ser fundamental a indexação do tecido. O autor sugere o uso de dois meios de indexação de bactérias (BIM), o ágar nutriente (NA = BIM1) e o meio 523 (BIM2), diferindo nos constituintes nutritivos, no pH (6,4 e 7,0, respectivamente) e na consistência (10 g L-1 e 20 g L-1 de ágar). A utilização desses meios com distintas características é fundamental uma vez que diferentes espécies de bactérias diferem na sua habilidade de crescer em um meio particular, e nenhum meio bacteriológico permite detectar todos os contaminantes. Uma pré-incubação das placas contendo o meio de indexação para prevenir a contaminação incidental e testes de esterilização dos instrumentos devem ser realizados antes da utilização dos mesmos. Esse procedimento para detecção de bactérias deve ser praticado por 2 a 4 ciclos permitindo um escrutínio fiável de plantas cultivadas in vitro livres de bactérias, garantindo uma segura certificação de plantas procedentes da cultura de tecidos.

Os dois meios de indexação de bactérias (BIM) utilizados para detecção de bactérias silenciosas e endofíticas, BIM1 e BIM2, foram selecionados como uma combinação eficiente a partir de 17 meios testados, visto que considerações econômicas e operacionais não permitem o uso de um amplo arranjo de meios ou condições de incubação. O meio BIM1, ágar nutriente (NA), é constituído de 5,0 g L-1 de peptona, 5,0 g L-1 de NaCl, 3,0 g L-1 de extrato de carne, e 20 g L-1 de ágar, com o pH ajustado a 6,4. O meio BIM2, meio 523 (VISS et al., 1991), é constituido de 10 g L-1 de sacarose, 8,0 g L-1 de caseína hidrolisada, 4,0 g L-1 de extrato de levedura, 2,0 g L-1 de KH2PO4, 0,15 g L-1 de MgSO4 e 10,0 g L-1 de ágar com o pH ajustado a 7,0 (THOMAS, 2004b). Para assegurar que o meio esteja livre de contaminação incidental, placas de Petri descartáveis, após receberem os meios de indexação (BIM1 e BIM2), são pré-incubadas de ponta-cabeça, à temperatura de 30 oC a 37 oC, por dois ou três dias, seguidos de dois a quatro dias à temperatura ambiente, aproximadamente 25 oC. Esse procedimento visa também garantir a evaporação da água da superfície, evitando qualquer proliferação de crescimento de colônias.

A indexação do meio é feita inserindo-se no meio de cultura com tecido vegetal uma agulha de inoculação flambada durante 30 a 40 segundos em chama de gás, colocando essa agulha em contato com cada um dos meios de indexação, BIM1 e BIM2 (Figura 2).

Figura 2. Esquema ilustrativo do processo de indexação do meio de cultura com auxílio de uma agulha de incubação.

Ilustração: Marta Ribeiro.

Antes da indexação do tecido, pinças e bisturis são indexados nos BIMs para garantir sua esterilidade, e os resultados são obtidos, ao longo do tempo, junto com os da indexação dos tecidos. Na indexação dos tecidos, são utilizados estiletes estéreis para a realização de cortes durante a micropropagação. No caso de culturas micropropagadas por segmentos nodais, por exemplo, após subcultivar as microestacas, os segmentos de tecido restantes, da porção superior, mediana e inferior do caule (de 5 mm a 8 mm) são cortados longitudinalmente e colocados cada um em um dos dois BIMs. A base do explante original e as raízes, quando presentes, são também cortadas e colocadas nos meios de indexação, BIM1 e BIM2 (Figura 3).

Figura 3. Esquema ilustrativo do processo de indexação de tecido de plantas cultivadas in vitro.

Ilustração: Marta Ribeiro.

A distribuição desigual dos organismos endofíticos torna necessária a utilização de diferentes partes da planta, conforme evidenciado na indexação de tecidos caulinares de melancia, na qual os segmentos basais não apresentaram crescimento bacteriano em nenhum dos dois meios testados.

A distribuição desigual dos organismos endofíticos faz desejável a utilização de diferentes partes da planta. Em outras culturas que não sejam propagadas via segmentos nodais são feitas indexações utilizando-se também distintas partes do tecido vegetal, como parte aérea, raiz, tecidos regenerantes e/ou calos, de acordo com a sua disponibilidade. Quadriculando-se as placas de Petri, é possível acomodar de 20 a 32 amostras, quando da indexação do meio (Figura 2), e de 4 a 12 amostras, quando da indexação de tecido (Figura 3).

O último passo consiste na pós-indexação. As placas contendo os meios de indexação são incubadas de ponta-cabeça. As placas contendo o BIM1 são mantidas no escuro a 37 oC, e aquelas contendo BIM2 são incubadas a 25 oC ou 30 oC, por 2 a 7 dias, seguido por um período de 3 a 4 semanas à temperatura ambiente. As placas devem ser observadas nos quatro primeiros dias após a incubação e, posteriormente, a cada semana, para a detecção de qualquer crescimento bacteriano. O resultado da indexação é positivo quando as culturas apresentam crescimento bacteriano visível em um ou mais pontos ou amostras de plantas indexadas.

A indexação do meio é feita, preferencialmente, entre uma ou duas semanas do subcultivo, enquanto que a indexação do tecido deve ser feita por ocasião do subcultivo. A maioria dos contaminates (> 90%) é detectada no período de 2 a 7 dias após a incubação das amostras nos BIMs.

Utilizando a metodologia descrita, Thomas (2004b) realizou um experimento com berinjela, uva, mamão, melancia e gérbera cultivadas in vitro. Cultivos apresentando crescimento evidente de microrganismos (etapa 1) representaram de 0% a 5% dos distintos lotes avaliados e foram facilmente recolhidos e descartados. Cultivos aparentemente livres de contaminantes, mas que apresentavam turbidez no meio de cultura, crescimento tênue, folhas parcialmente secas ou odor desagradável por ocasião da abertura dos frascos, eram geralmente portadores de bactérias silenciosas. As características citadas são, até certo ponto, indicadoras da presença de contaminantes passíveis de detecção mediante uma diligente observação visual.

A indexação do meio (etapa 2) revelou a existência de bactérias silenciosas em 0% a 100% dos vários frascos de cultura avaliados, com resultados consistentes. O teste de indexação do meio apresenta maior eficiência e rapidez quando são amostrados vários pontos do meio de cultura e, em seguida, plaqueados em quatro a cinco pontos do BIM, utilizando-se uma mesma alça ou agulha de inoculação.

A indexação do meio, entretanto, não assegura que o tecido esteja livre de contaminantes endofíticos silenciosos. A indexação de tecidos aparentemente limpos com indexação negativa do meio de cultura permitiu constatar crescimento bacteriano em 0% a 100% dos frascos indexados, em um ou nos dois meios de indexação, após um período de dois a quatro dias (Tabela 4). Tecidos com meio de cultura aderido, como a base do tecido em contato com o meio ou as raízes, apresentaram crescimento bacteriano mais cedo e mais frequente.

Tabela 4. Resultados percentuais da indexação do meio de cultura e de tecidos de diferentes espécies vegetais cultivadas in vitro.

Cultura

Tecido vegetal

Meio de cultura com indexação negativa (%)

Tecido vegetal com indexação positiva (%)

Berinjela

Cotilédone

100

0–10

Melancia

Ápice caulinar

100

0–10

Gérbera

Capítulo

90

25

Mamão

–

89

19

Uva

–

81

81

Fonte: modificado de Thomas (2004b).

Em um lote de 16 frascos de cultura de tecidos de uva avaliados quatro semanas após tratamento com cloreto de mercúrio (HgCl2 a 0,1% por 5 minutos), seis frascos apresentaram indexação negativa. Uma semana depois desse teste, a indexação de diferentes partes do tecido de um dos frascos que permanecia com resultado negativo da indexação do meio revelou a presença de bactéria em todas as partes da planta testadas. Na repicagem subsequente, o meio foi indexado como positivo indicando o aumento na densidade de inóculo com o passar do tempo. Os outros cinco frascos que tinham apresentado resultado negativo para indexação do meio de cultura deram resultado negativo para indexação dos tecidos nos três ciclos de cultivos seguintes, confirmando a ausência de bactérias cultiváveis (THOMAS, 2004b).

No cultivo in vitro de ápices caulinares de melancia sobre ponte de papel em meio líquido, após tratamento de assepsia com HgCl2 (0,05% por 10 minutos), foram constatados 10 frascos com meio aparentemente limpo e 10 frascos com pouca ou moderada turbidez do meio, após 2 semanas de cultivo. Após a 3ª e 4ª semanas, 4 dos 10 frascos com meio aparentemente limpo mantiveram resultado negativo para o meio de cultura quando indexados no BIM1. Quando o material vegetal desses frascos foi testado na 5ª semana, bactérias endógenas foram detectadas em todo tecido avaliado, enquanto que o meio permanecia com resultado negativo para a presença de microrganismos (THOMAS, 2004b).

As etapas 1, diligente exame visual das culturas, e 2, indexação do meio de cultura aparentemente não contaminado, costumam ser suficientes para a produção comercial de plantas. A etapa 3, que consiste na indexação de tecidos de plantas provenientes de meios com resultado de indexação negativo, é essencial para a certificação do estoque e também durante os procedimentos de limpeza de material contaminado. Vale a pena salientar que cultivos previamente tratados com antibióticos podem apresentar falso resultado em razão dos efeitos residuais de reagentes no tecido vegetal, e que as bactérias podem reaparecer meses depois em função da atividade bacteriostática transitória dos antibióticos (REED et al., 1998; TANPRASERT & REED, 1997). Nesses casos, é necessária a indexação do tecido por um período de 2 a 4 ciclos de cultivo após a retirada do antibiótico do meio de cultura.

A utilização desse procedimento de detecção de bactérias silenciosas ou endofíticas (etapas 1, 2 e 3) é uma ferramenta fundamental para garantir a segurança e confiabilidade de bancos de genes in vitro, intercâmbio de germoplasma limpo, controlando a multiplicação de culturas hospedeiras de bactérias patogênicas e evitando o escape para o meio ambiente de sistemas de vetores mediados por Agrobacterium.

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Capítulo 6
Estratégias de seleção e uso de substâncias químicas antimicrobianas para o controle de contaminantes na cultura de tecidos de plantas

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Frederico Henrique da Silva Costa

Introdução

É inegável o avanço da biotecnologia nas últimas décadas. E, à medida que se intensifica seu uso e aplicações nas mais diversas áreas, a impressão que temos é que, a cada problema surgido, a pesquisa científica se encarrega de achar soluções, anos antes muitas vezes inimagináveis. Na área vegetal, a biotecnologia avança a passos largos, e há muito deixou de ser novidade. Muito embora algumas áreas, como a engenharia genética, ainda sejam um tema relativamente recente, há pelo menos um século pesquisadores desenvolvem e aperfeiçoam técnicas de manipulação vegetal in vitro e, mais recentemente, a propagação clonal em larga escala. Particularmente nesse último caso, a otimização de protocolos, aliada ao desenvolvimento de ferramentas mais práticas para a multiplicação de espécies, como o uso de biorreatores, proporcionou avanços consideráveis quanto ao aspecto da multiplicação de materiais-elite.

Mas, apesar disso, há pelo menos uma área na cultura de tecidos de plantas que, apesar de sua extrema importância, avançou muito pouco: a das contaminações. Por isso, é quase unanimidade entre os profissionais da área que o problema das contaminações constitui-se como a principal causa da perda de materiais in vitro. Nesse sentido, medidas, como uma adequada esterilização dos equipamentos, dos meios de cultura e do material vegetal inicial, associadas a um ambiente asséptico e de prevenção daqueles que manipulam o material, são indispensáveis para a diminuição desse problema (LEIFERT; WOODWARD, 1998; LONG et al., 1988; PEREIRA et al., 2003). No entanto, na maioria das vezes, esses cuidados básicos nem sempre são suficientes para evitar os problemas de contaminação; assim, outras medidas de controle dos contaminantes, normalmente por meio do uso de substâncias antimicrobianas, são necessárias.

De modo geral, as contaminações são mais comuns na fase de estabelecimento dos cultivos. Nessa fase, a ocorrência de microrganismos no cultivo pode ser em virtude de variados fatores, como a deficiente esterilização superficial dos explantes, dos meios de cultura e das vidrarias, ou ainda pela presença de microrganismos que habitam o interior dos tecidos da planta durante o desenvolvimento vegetal, usualmente denominados de endofíticos (LEIFERT et al., 1989; REED et al., 1998). De fato, é possível que todos os vegetais apresentem microrganismos em seus tecidos. Entretanto, apesar de ainda se saber muito pouco sobre a relação de microrganismos endofíticos com as plantas, além da identidade, diversidade e níveis populacionais, para a cultura de tecidos de plantas este tipo de contaminante é considerado o mais problemático, pois pode não se desenvolver no período inicial de cultivo, permanecendo latente nos tecidos das plantas em meio de cultura, vindo a se desenvolver somente após um determinado período de tempo, quando as condições do meio de cultura ou do ambiente tornam-se favoráveis para seu crescimento (PEREIRA et al., 2003). Assim, basta que um único explante esteja contaminado para que a disseminação aconteça nos estágios mais avançados de multiplicação do material vegetal, com o agravante de alguns desses microrganismos poderem ser resistentes às rápidas imersões em álcool e às temperaturas atingidas durante a flambagem dos instrumentos. Outro fator a se considerar nesse caso refere-se ao estado físico do meio de cultura. Normalmente, a multiplicação de cultivos em meio líquido, sob agitação, cria condições favoráveis para o desenvolvimento desses microrganismos endógenos, tornando-se um fator limitante para o crescimento dos explantes em meios com essa consistência (PEREIRA; FORTES, 2003).

As contaminações comprometem o crescimento e desenvolvimento dos explantes, pois, normalmente, competem com as plantas pelos nutrientes e vitaminas do meio de cultura, afetando o normal desenvolvimento destes, podendo levá-los, inclusive, a morte. Essa deterioração dos explantes está relacionada com a produção de metabólitos fitotóxicos, tais como os ácidos láctico e acético, cianeto, além de certos reguladores de crescimento e antibióticos (BAKKER; SCHIPPERS, 1987; KLOEPPER et al., 1989; LEIFERT et al., 1991; STANIER et al., 1987; YEPES; ALDWINCKLE, 1994).

Na prática, a diferença básica entre as fontes de contaminações está no fato de que fungos e leveduras podem ser mais facilmente percebidos no meio de cultura após poucos dias de cultivo, o que, de certo modo, facilita a eliminação de material contaminado. Já no caso das bactérias, por serem muitas vezes de difícil visualização, nem sempre a presença é evidenciada no início do cultivo e, dessa forma, podem ser disseminadas facilmente de um material para outro durante as etapas de multiplicação. Do ponto de vista prático, a melhor medida a ser tomada no caso de contaminação de cultivos é o descarte e a autoclavagem do material contaminado, ou em alguns casos, a convivência com o organismo contaminante por meio da aclimatização imediata do material em casa de vegetação. No entanto, a eliminação de material vegetal nem sempre é possível, e o número de plantas é insuficiente para a aclimatização: dessa forma, tratamentos curativos são recomendados (LEIFERT et al., 1989).

Nesse sentido, as estratégias empregadas rotineiramente para contornar essas limitações incluem desde a desinfestação superficial dos explantes com produtos à base de cloro até a adição de substâncias antifúngicas e antibacterianas no meio de cultura. No entanto, na maioria das vezes a desinfestação superficial é ineficaz para atenuar ou eliminar a ocorrência de contaminantes do explante. Assim, a seleção in vitro de tipos e concentrações de substâncias químicas antimicrobianas é necessária.

Estratégias de controle de bactérias por agentes químicos: testes de seleção de antibióticos e avaliação da fitotoxicidade aos cultivos

Para o controle das contaminações bacterianas, normalmente utilizam-se substâncias antibióticas que são incorporadas ao meio de cultura ou usadas diretamente sobre os explantes contaminados. Mesmo que se utilizem antibióticos bactericidas de amplo espectro e não tóxico às plantas in vitro, o controle bacteriano na cultura de tecidos é problemático. Na maioria dos trabalhos, a frequência de descontaminação não é total, pois, de alguma forma, os tecidos vegetais podem interferir no controle, seja destoxificando essas substâncias ou servindo como hábitat para os contaminantes que se translocam pelos tecidos das plantas. Dessa forma, é comum que as concentrações de antibióticos devam ser mais elevadas quando estes são adicionados ao meio juntamente com o cultivo. Nesse caso, o problema refere-se à toxicidade que essas substâncias podem causar aos explantes.

Uma das alternativas para se evitar o efeito tóxico dos antibióticos sobre os explantes é reduzir ao máximo o tempo do tratamento dos explantes com o agente antimicrobiano. No entanto, a não utilização de concentrações elevadas por períodos prolongados muitas vezes causam efeitos apenas bacteriostáticos ao invés de bactericidas, constituindo-se como uma ação paliativa frente ao principal objetivo que é a eliminação por completo do organismo contaminante. Os antibióticos bacteriostáticos induzem bloqueios reversíveis da síntese proteica dos microrganismos, fato que impede temporariamente a multiplicação normal das bactérias, mas não impede posteriormente a retomada do crescimento bacteriano, uma vez que o meio esteja livre dessas substâncias. As tetraciclinas, as sulfonamidas e o cloranfenicol são exemplos clássicos de bacteriostáticos. Por outro lado, substâncias bactericidas podem inibir a síntese proteica dos microrganismos ou destruir a membrana citoplasmática provocando lesões profundas e irreversíveis nas células bacterianas. Dessa forma, ao longo do tempo, verifica-se uma redução no número de microrganismos que será tanto menor quanto maior for a concentração do antibiótico. Os beta-lactâmicos, como as penicilinas e as cefalosporinas, e os aminoglicosídicos, como a gentamicina, são exemplos típicos de bactericidas.

O sucesso do trabalho com antibióticos somente pode ser obtido após o isolamento, a identificação e realização de testes de sensibilidade das bactérias aos antibióticos, além de avaliações quanto à toxidez dessas substâncias ao cultivo. Ressalte-se que em razão da fitotoxicidade e do alto custo do tratamento, os antibióticos devem ser utilizados apenas para contaminantes específicos das culturas, pois somente as bactérias que estiverem dentro do espectro de ação de cada antibiótico serão controladas (LEIFERT et al., 1991; PEREIRA et al., 2003; TENG; NICHOLSON, 1997).

Provas para determinar a sensibilidade dos isolados bacterianos a antibióticos

A suscetibilidade de bactérias isoladas a partir de cultivos in vitro pode ser avaliada por diversas técnicas. Contudo, pela praticidade e economicidade, as provas de sensibilidade por difusão com disco (antibiograma) e de determinação da concentração bactericida mínima inibitória (CBMI) são as mais recomendadas. Na verdade, ambos os testes referem-se à determinação da resistência ou suscetibilidade de uma bactéria a um ou mais antibióticos. No entanto, como normalmente na cultura de tecidos de plantas os testes são feitos utilizando-se discos de papel impregnados com concentrações fixas do antibiótico, é necessário que se realize, complementariamente a este teste, a determinação da CBMI como forma de se precisar, a partir de gradientes, a mais baixa concentração do antibiótico capaz de inibir ou eliminar uma população bacteriana. Além disso, ao final da seleção dos antibióticos, é de fundamental importância que se realizem testes visando verificar a toxicidade do antibiótico sobre o material vegetal em estudo.

Antibiograma

Uma vez isoladas e purificadas (ver capítulo 3), suspensões bacterianas a serem utilizadas nos testes são usualmente preparadas, colhendo-se um inóculo da cultura pura e transferindo-o para Erlenmeyer com 50 mL de meio caldo nutritivo (mesma formulação do meio ágar nutritivo, excluindo-se o solidificante ágar), o qual será incubado por 18 a 24 horas de 30 °C a 35 °C em agitação a 360 rpm. A partir de então, uma alíquota de 100 µL do agente microbiano, crescido anteriormente em meio de cultura, é espalhado sobre a superfície do meio de cultura ágar nutritivo (AN) ou Mueller – Hinton de consistência semissólida, contido em placas de Petri. Em seguida, discos de papel impregnados com os antibióticos que se quer testar são colocados, assepticamente, sobre o meio, sendo as placas então incubadas invertidas e no escuro à 30 °C–35 °C. Cada disco pode ser considerado como uma unidade de observação. Nesse ensaio, são normalmente testados diversos tipos de antibióticos, justamente para avaliar a maior ou menor suscetibilidade dos isolados a esses produtos. A sensibilidade dos isolados bacterianos aos antibióticos-teste é avaliada após 24 horas de incubação, determinando-se o tamanho do halo de inibição (Figura 1). Dessa forma, são considerados mais suscetíveis ao antibiótico os isolados que apresentarem a formação de um halo de inibição. Quanto maior o halo formado, maior será a suscetibilidade do isolado ao antibiótico, sendo este um tipo de agente indicado para as etapas seguintes do controle microbiano in vitro. Num estudo com bactérias endofíticas contaminantes na cultura da batata, Pereira et al. (2003) verificaram que entre doze antibióticos testados, seis apresentaram algum tipo de controle, e, destes, os que proporcionaram os melhores resultados para a inibição do crescimento bacteriano foram a ampicilina, o cloranfenicol, a estreptomicina e a tetraciclina em concentrações que variaram de 32 mg L-1 a 256 mg L-1 (Tabela 1).

Figura 1. Espécies de Pseudomonas isoladas de plantas de batata mostrando resistência (A) e suscetibilidade (B e C) a antibióticos.

Foto: Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Tabela 1. Sensibilidade a antibióticos de isolados bacterianos contaminantes de batata durante a propagação in vitro.

Antibiótico

Isolado

Concentração (mcg mL-1)

B2

B3

B4A

B4B

B7A

B7B

B8A

B8B

Amicacina

30,0

13,0 s

4,0 r

3,5 r

2,5 r

10,7 s

0 r

7,5 r

7,2 r

Ampicilina

10,0

5,5 r

9,5 s

10,0 s

10,2 s

10,7 s

0 r

0 r

0 r

Cefoxina

30,0

4,2 r

4,0 r

3,5 r

3,7 r

8,5 s

0 r

1,0 r

0 r

Cefalotina

30,0

5,0 r

9,2 s

9,2 s

12,7 s

9,5 s

0 r

0,5 r

0 r

Cloranfenicol

30,0

5,2 r

9,2 s

7,2 r

7,5 r

7,5 r

1,0 r

14,0 s

3,7 r

Eritromicina

15,0

8,5 s

10,5 s

10,0 s

9,7 s

4,7 r

0 r

10,0 s

3,2 r

Estreptomicina

10,0

13,2 s

4,5 r

3,2 r

3,2 r

8,5 s

0 r

0 r

0 r

Novobiocin

5,0

11,2 s

7,2 r

6,0 r

8,2 s

6,2 r

0 r

7,0 r

3,0 r

Penicilina

10,0

3,2 r

6,5 r

7,2 r

9,2 s

4,7 r

0 r

0 r

0 r

Rifampicina

5,0

9,2 s

12,5 s

11,5 s

9,7 s

5,2 r

0,25 r

6,5 r

5,0 r

Tetraciclina

30,0

16,0 s

9,2 s

8,2 s

8,2 s

14,2 s

1,2 r

13,7 s

7,7 r

Vancomicina

30,0

10,0 s

4,7 r

5,2 r

5,7 r

9,5 s

0,7 r

5,2 r

3,7 r

Sensibilidade dos isolados: r - resistente (halo < 8,0 mm); s - suscetível (halo ≥ 8,0 mm).
Fonte: Pereira et al. (2003).

Determinação da concentração bactericida mínima inibitória

Neste tipo de teste, é importante primeiramente que se ajuste o número de células bacterianas viáveis, entre 30 UFC mL-1 e 300 UFC mL-1, capazes de se reproduzir para que os resultados do teste sejam confiáveis, uma vez que em cada alíquota é possível que existam milhões de células bacterianas, nem todas viáveis. Uma das formas mais simples de se determinar o número de células viáveis (Unidade Formadora de Colônia – UFC) envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana cultivadas em meio líquido, sua inoculação superficial em meio sólido e posterior contagem do número de colônias crescidas, num determinado período de tempo, não devendo ultrapassar 24 horas para cada etapa. Para se alcançar o número ideal de células viáveis formadoras de colônias, é necessário que se façam diluições seriadas, de 10-1 a 10-8, das amostras em solução salina (0,85% NaCl) estéril, geralmente em triplicata para evitar possíveis erros como o de mais de uma célula bacteriana originar uma única colônia.

A determinação da concentração bactericida mínima inibitória (Minimal Bactericidal Concentration – MBC) consiste em se determinar a mais baixa concentração de antibiótico capaz de eliminar um contaminante. O método é realizado por meio de diluições seriadas do agente microbiano em caldo AN e na presença do isolado bacteriano em estudo. Geralmente, 11 tubos de ensaios com caldo AN são preparados em duplicata e esterilizados por autoclavagem (15 minutos sob 121 °C e 1,5 atm de pressão). Em câmara de fluxo laminar, as soluções dos antibióticos em teste são esterilizadas por filtração (Millipore, 0,22 µm) e adicionadas individualmente ao meio de cultura de forma a se obter uma diluição seriada de 1/2 a 1/1.024, correspondendo a concentrações que variam de 2,0 mg L-1 a 1.024 mg L-1 do produto testado. O meio do 11º tubo é usado como padrão, sem a adição de antibiótico. Em seguida, cada tubo de ensaio é inoculado com 100 µL da suspensão bacteriana (de 30 UFC mL-1 a 300 UFC mL-1) e incubados a 30 °C–35 °C no escuro. As bactérias testadas são crescidas por 24 horas sob agitação (360 rpm) em Erlenmeyers com 50 mL de caldo nutritivo.

A avaliação da turvação do meio de cultura é feita diariamente por um período de até 96 horas. Para confirmação dos resultados, as diluições não turvadas dos agentes-teste também são plaqueadas em meio AN semissólido, utilizando para tanto 3 repetições (placas de Petri), sendo a avaliação do crescimento feita até 72 horas de incubação. Os antibióticos empregados nesse teste são aqueles que mostrarem seletividade aos isolados, de acordo com os resultados obtidos no antibiograma (Tabela 2).

Tabela 2. Concentração bactericida mínima inibitória (CBMI) dos antibióticos ampicilina (Amp), cloranfenicol (Cloran), eritromicina (Erit), estreptomicina (Estrep), rifampicina (Rifamp) e tetraciclina (Tetrac) para diferentes estirpes bacterianas isoladas de batata sob micropropagação.

CBMI

(mg
L-1)

Ampicilina

Cloran-
fenicol

Eritro-
micina

Estrep-
tomicina

Rifampicina

Tetraciclina

B2

B3

B4A

B4B

B7A

B7B

B8A

B8B

B3

B8A

B2

B7A

B3

B4A

B4B

B7B

B8B

B2

B4A

B4B

B7A

B7B

B8A

B8B

0

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2

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+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

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+

4

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

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+

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+

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+

8

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+

+

+

+

+

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+

16

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+

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+

32

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+

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64

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128

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+

-

-

-

256

+

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+

+

-

-

-

+

+

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

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-

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-

512

-

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+

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+

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+

+

+

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+

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-

-

-

-

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-

1.024

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-

-

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-

-

-

-

-

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-

+ crescimento; - ausência de crescimento. B2: Enterobacteraceae; B3, B4A e B4B: Corynebacterium sp.; B7A: Enterobacteraceae; B7B: Acetobacteraceae; B8A: Xanthomonas sp.; B8B: Pseudomonas sp.

Fonte: adaptado de Pereira et al. (2003).

Avaliação da toxicidade de antibióticos no desenvolvimento in vitro de plantas

Assim como descrito anteriormente, para o controle microbiano in vitro não basta somente que os antibióticos sejam efetivos contra as bactérias contaminantes. Eles também devem ser atóxicos aos cultivos de maneira a permitir o normal desenvolvimento das plantas, uma vez fazendo parte do meio de cultura. Para tanto, experimentos de fitotoxicidade devem ser realizados na presença de um ou mais antibióticos no meio de cultura, antibióticos efetivos e selecionados nas provas de determinação da CBMI. Para tanto, recomenda-se que os ensaios devam utilizar concentrações acima e abaixo das concentrações obtidas nos testes da CBMI e um tratamento-testemunha para controle.

Antes de serem incorporados ao meio de cultura, os antibióticos a serem testados devem ser esterilizados a frio, por filtração, e adicionados ao meio de cultura quando este estiver em processo de resfriamento (de 40 °C a 50 °C). Após alguns dias de cultivo deve-se fazer a determinação da fitotoxicidade dos antibióticos em razão da sobrevivência e possíveis alterações morfológicas dos materiais em cultivo. Pereira et al. (2003) avaliou a fitotoxicidade dos antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina em 7 concentrações dos referidos antibióticos (0 mg L-1, 32 mg L-1, 64 mg L-1, 128 mg L-1, 256 mg L-1, 512 mg L-1 e 1.024 mg L-1) em meio líquido e semissólido durante a multiplicação de batata e verificou que a adição de ampicilina no meio de cultura até a concentração de 1.024 mg L-1 não afetou o desenvolvimento das plantas in vitro. No entanto, concluiu que a estreptomicina apresentou efeito fitotóxico mais pronunciado quando presente em meio de cultura líquido, e que os antibióticos tetraciclina e cloranfenicol não devem ser adicionados ao meio de cultura por períodos prolongados por causarem severos danos ao desenvolvimento in vitro do cultivo, mesmo em baixas concentrações (Figura 2).

Figura 2. Altura de brotações e taxa de multiplicação de batata em função de diferentes concentrações de antibióticos em meios de cultura de consistência semissólida e líquida, após 21 dias de cultivo.

Fonte: Pereira et al. (2003).

Estratégias de controle de fungos e leveduras por agentes químicos: testes de seleção de fungicidas e avaliação da fitotoxicidade aos cultivos

A adoção por métodos de seleção de tipos e concentrações de fungicidas visando ao controle de contaminações é ainda mais incipiente na área de cultura de tecidos de plantas que a de antibióticos. O que se observa é que as pesquisas reportadas até o presente momento utilizam em sua maioria o fungicida benomyl para o controle de contaminantes (HALDEMAN et al., 1987; SANTANA et al., 2003), havendo poucas informações acerca de outros compostos. Contudo, nos últimos anos, o interesse por novos produtos e de amplo espectro de ação tem sido evidente, visando não apenas ao controle de contaminação, mas também aos efeitos benéficos da utilização desses compostos no crescimento e desenvolvimento das plantas in vitro (COLOMBO et al., 2004; NAGY et al., 2005; ODA et al., 2003; WATT et al., 1996).

Assim como para os antibióticos, um fungicida para ser usado nas diferentes fases do cultivo in vitro deve satisfazer a alguns requisitos, como ser tóxico ao fungo alvo e não ao explante em uso, mesmo em concentrações altas; ser estável e de fácil obtenção; oferecer menor risco ao operador; ter boa solubilidade; não ser afetado pelo pH e pelo meio de cultivo; possuir amplo espectro de ação; ser passível de combinação; apresentar chances reduzidas de resistência; e ser de baixo custo (SANTANA et al., 2003). Satisfeitas algumas dessas considerações, procede-se à realização da seleção de fungicidas in vitro. Para tanto, utiliza-se de métodos rápidos e práticos, também conhecidos por bioensaios, nos quais se avaliam os diferentes princípios ativos para cada fungo em questão, suas concentrações adequadas, e, por fim, verificam-se os efeitos dessas concentrações sobre os explantes in vitro.

Dentre os fungicidas já utilizados em culturas in vitro, tem-se o benomyl (SANTANA et al., 2003), miconazole (TYNAN et al., 1993), chlorothalonil (COLOMBO et al., 2004; ODA et al., 2003), azoxystrobin, cabendazime, fededazole e imazil (SHIELDS et al., 1984); (SALGADO et al., 2001; SATO et al., 2004). No entanto, tem-se verificado efeitos fitotóxicos da utilização de alguns desses fungicidas em alguns casos, o que enfatiza a importância de estudos acerca de concentrações ótimas a cada cultura em estudo. Segundo George (1993), a ocorrência da toxidez de plantas a determinadas substâncias químicas depende geralmente de cada espécie e do tipo de explante em cultivo.

Um antimicrobiano sintético que tem sido bastante utilizado em cultura de células e tecidos vegetais é o Plant Preservative Mixture (PPM™), um biocida de largo espectro de ação, estável quando autoclavado e que pode ser aplicado para prevenir ou reduzir efetivamente a contaminação microbiana em cultivos in vitro. Acrescenta-se o fato de que, quando adicionado em concentrações adequadas, não prejudica a germinação in vitro de sementes, proliferação e regeneração de calos. Atua impedindo a germinação de ambos esporos de bactérias e fungos, por destruir as células destes, e, em altas concentrações, pode eliminar contaminações endógenas dos explantes.

No caso de leveduras, George (1993) reporta a utilização do chlotrinazole em cultura de meristema de macieira, além de outros como o iminooctodine, ampfotericin B e nystatin, sendo estes dois últimos atóxicos quando usados para cultivo in vitro dessa espécie. Estudo recente realizado por Nagy et al. (2005) recomendou os seguintes fungicidas para o controle da levedura Rhodotorula slooffiae em cultura de tecidos de macieira: ProClinw 300, mancozeb, thiabendazole, nitrato de prata e mancozeb + zoxamid.

Na Tabela 3 estão relacionados alguns fungos cuja ocorrência em cultivos in vitro já foi reportada pela pesquisa em cultura de tecidos de plantas.

Tabela 3. Contaminantes fúngicos reportados pela pesquisa durante o cultivo in vitro de algumas espécies de plantas.

Fungo

Espécie vegetal

Referência

Alternaria tenuis

Dendrophoma sp.

Dothiorella sp.

Collectotrichum sp.

Meristemas de Camellia sinensis e C. japonica

Haldeman et al. (1987)

Actinomycete

Macieira

Hennerty et al. (1988)

Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Meristemas de banana (cv. Maçã)

Carneiro et al. (2000)

Cladosporium sp.

Alternaria sp.

Aspergillus sp.

Curvularia sp.

Drechslera sp.

Fusarium sp.

Helminthosporium sp.

Rhizopus sp.

Explantes nodais de Psidium guajava L.

Ramírez et al. (2000)

Alternaria tenius

Aspergillus niger

Aspergillus fumigatus

Fusarium culmorum

Sementes de Telfaria occidentalis e Hibiscus cannabinus

Odutayo et al. (2004)

Etapas do processo de seleção de fungicidas in vitro

Obtenção do isolado

De modo geral, os isolados são obtidos de material naturalmente infectado, podendo ser de folhas, ramos e raízes. Para tanto, porções do tecido infectado são cortadas, desinfestadas superficialmente, divididas em fragmentos menores e plaqueadas em meio de cultura adequado a cada espécie de fungo. Em geral, os meios mais utilizados para cultura de fungos são o Batata Dextrose Ágar (BDA), Yeast Potato Dextrose (YEPD) e Malt Extract Agar (MEA). No caso específico da cultura de tecidos vegetais, o isolamento pode ser proveniente de contaminações ocorrentes ao longo do processo de estabelecimento e fases subsequentes do cultivo in vitro, como reportado por Shields et al. (1984), Ramírez-Villalobos et al. (2000) e Santana et al. (2003).

Depois de feito o plaqueamento, as placas são incubadas em câmara de crescimento à temperatura e ao fotoperíodo adequados até o surgimento da estrutura reprodutiva do fungo, cujo tempo irá depender da sua taxa de crescimento. Em seguida, procedem-se as repicagens e a transferência para o meio novo visando obter a cultura pura do isolado, para então dar prosseguimento às etapas de caracterização e identificação.

Ramírez et al. (2000), com o objetivo de isolar e identificar fungos contaminantes durante o estabelecimento in vitro de segmentos nodais de Psidium guajava L., realizaram inicialmente a coleta e desinfestação superficial dos explantes pela imersão em 8 g L-1 de benomyl + 300 mg L-1 de rifampicina por 30 minutos, seguido de 1 minuto em álcool 70% e 15 minutos em hipoclorito comercial a 50%, sendo finalmente o material vegetal submetido à tríplice lavagem em água destilada e autoclavada. Decorrido esse processo, os segmentos foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10 mL de meio de MS autoclavado, suplementado com vitaminas, 20 g L-1 de sacarose e solidificado com 7 g L-1 de ágar. As culturas foram mantidas sob obscuridade e 25 ºC. Passados 5 dias do estabelecimento in vitro, o crescimento dos fungos foi detectado, sendo estes cultivados em meio BDA adicionado de ácido láctico a 25% para obtenção da cultura pura dos fungos. Posteriormente, lâminas foram preparadas contendo cada isolado corado com azul de algodão até os testes de identificação. Metodologia semelhante foi empregada com sucesso por Odutayo et al. (2004) para isolamento e posterior identificação de fungos contaminantes em cultura de tecidos de Hibiscus cannabinus e Telfaria occidentalis.

Caracterização e identificação dos isolados

Esta etapa é fundamental para que se obtenha êxito durante a seleção dos tipos e concentrações de fungicidas mais adequados para o controle. A caracterização morfológica das estruturas reprodutivas de cada fungo é geralmente feita com auxílio de microscópio óptico, e a identificação dos gêneros realizada mediante o uso de chaves taxonômicas e por meio de consulta na literatura micológica especializada (BARNETT; HUNTER, 1972).

Fungos contaminantes durante o estabelecimento in vitro de segmentos nodais de Psidium guajava L. foram identificados por Ramírez et al. (2000). Por meio dessa metodologia, os seguintes gêneros de fungos contaminantes foram identificados: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium e Rhizopus. Destes, os fungos Cladosporium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp. e Curvularia sp. representaram 87,5% do total, sendo o gênero Cladosporium sp. o de maior ocorrência (36,25%). Já os gêneros Drechslera sp., Fusarium sp., Helminthosporium sp. e Rhizopus sp. representaram 2,5%. Utilizando os mesmos procedimentos, Odutayo et al. (2004) caracterizaram e identificaram os fungos Alternaria tenius, Aspergilus niger, Aspergilus fumigatus e Fusarium culmorum em cultura de tecidos das espécies Hibiscus cannabinus e Telfaria occidentalis.

Bioensaios para avaliação e seleção de fungicidas

A maioria das pesquisas sobre a seleção in vitro de fungicidas em cultura de tecidos vegetais adotam como metodologia a introdução direta de concentrações de fungicidas nos meios de cultivo contendo os explantes infectados (HALDEMAN et al., 1987; SANTANA et al., 2003), havendo ainda aquelas que inicialmente identificam o agente contaminante, realizam testes de micotoxicidade, para em seguida avaliar os efeitos sobre os explantes. Contudo, embora não exista na literatura um método padrão para o caso da cultura de tecidos vegetais, existem outras metodologias de seleção de fungicidas in vitro descritas pela pesquisa científica, as quais serão abordadas a seguir.

Método baseado na adição de compostos químicos diretamente no meio de cultura

Este método tem sido aplicado por alguns trabalhos na área de cultura de tecidos, apresentando, inclusive, bons resultados. Seus riscos estão relacionados a problemas de fitotoxidez aos explantes e perda de material vegetal, o que, no caso, pode limitar seu uso.

O método consiste na avaliação de diferentes concentrações, geralmente em mg L-1 ou g L-1 do ingrediente ativo do produto ou de sua formulação comercial, as quais são introduzidas ao meio de cultivo por meio de filtragem a frio em membrana milipore, antes ou após o processo de autoclavagem, o que irá depender da sensibilidade do ingrediente ativo em se degradar ou perder sua atividade nesse processo, visto que no caso do benomyl há relatos de degradação (HALDEMAN et al., 1987). Os fungicidas são, em geral, dissolvidos em água destilada e autoclavada ou mesmo em solventes como o Dimethylsulfoxide (DMSO) ou acetona. Em seguida, explantes são cultivados nas referidas concentrações do fungicida até que se possa observar o aparecimento ou não dos contaminantes. Além das observações dos contaminantes, costumam-se fazer inspeções acerca da ocorrência de anormalidades nos explantes, tipo necrose, oxidação e morte dos tecidos. Caso não haja contaminantes e as culturas se apresentem normais, procedem-se as sucessivas repicagens em meio fresco.

Santana et al. (2003) utilizaram a incorporação de fungicidas e antibióticos no meio de cultivo de segmentos foliares de Annona cauliflora, A. bahiensis e A. glabra visando à obtenção de culturas assépticas. Assim, verificaram que a adição ao meio WPM de 1 g L-1 do fungicida comercial benlate 500 possibilitou a total eliminação dos fungos contaminantes.

Imersão dos explantes em soluções contendo os fungicidas e posterior cultivo em meio de cultura

Inicialmente, as soluções contendo as concentrações requeridas dos fungicidas são preparadas, pela diluição em água ou algum tipo de solvente, filtradas ou autoclavadas, e então adicionadas ao meio de cultura, geralmente líquido, já autoclavado e apresentando temperatura de aproximadamente 45 ºC. Decorrido esse processo, os explantes são submetidos aos tratamentos por período determinado, geralmente sob rotação (shakers) e na presença de luz. Posteriormente, os explantes tratados e não tratados, testemunha ou controle, são transferidos para meio de cultura sólido, específico a cada espécie e explantes, ou mesmo cultivados sob ágar nutriente. Em seguida, os meios de cultura com os explantes são mantidos sob condições de temperatura e luminosidade controladas até as avaliações de ocorrência de contaminantes e possíveis respostas fitotóxicas dos explantes. Alguns autores costumam repetir os primeiros resultados durante novos cultivos e por períodos mais longos de tempo de cultivo, visto que algumas vezes aparecem contaminações latentes, o que aumenta a confiabilidade dos resultados.

Haldeman et al. (1987) utilizaram essa metodologia para controle de contaminações fúngicas e bacterianas em cultura de brotos meristemáticos de Camellia sinensis e C. japonica, combinando o fungicida benomyl (Benomyl) e o antibiótico rifampicina. De acordo com os resultados, a adição de 1 g L-1 a 4 g L-1 de benomyl associado a 10 mg L-1 de rifampicina controlou eficientemente (de 85% a 95%) os contaminantes, não tendo sido observados efeitos fitotóxicos dos tratamentos ao cultivo.

Empregando metodologia similar, Kritzinger et al. (1998) obtiveram bons resultados para a descontaminação de rizomas de Zantedeschia aethiopica. Para isso, realizaram um pré-tratamento dos rizomas numa mistura dos fungicidas comerciais Captana e Mancozeb, ambos a 5 g L-1, sob rotação e condições de escuro, em diferentes intervalos de tempo. Em seguida, os rizomas foram submetidos a desinfestação padrão e cultivados em meio de MS. Verificou-se cerca de 65% de descontaminação pelo tratamento de 24 horas de exposição à mistura.

Métodos baseados na inibição do crescimento micelial e conidial

1) Método empregado por Tynan et al. (1993): com o objetivo de avaliar a efetividade do biocida Miconazole (micotoxicidade) sobre 23 fungos associados à cultura de tecidos vegetais, os autores utilizaram-se de 40 omycetes, 11 deuteromycetes, 4 ascomycetes e 4 contaminantes comuns no ar encontrados em um laboratório de cultura de tecidos vegetais. Inicialmente, os fungos foram cultivados em meio constituído de extrato de batata 20% (w/v), 1% (w/v) de sacarose e 1,5% (w/v) de ágar bacteriológico, acrescido de 0 mg L-1, 5 mg L-1, 10 mg L-1, 15 mg L-1 e 20 mg L-1 do fungicida miconazole, dissolvido em dimethyl sulfoxide (DMSO) (40 mg mL-1) e adicionado ao meio de cultura após autoclavagem. Em seguida, os tratamentos foram distribuídos em placas de petri. Para cada concentração de miconazole, foram distribuídos no meio de cultivo 4 discos de 7 mm de diâmetro de cada colônia fúngica por placa de Petri. Depois disso, as culturas foram incubadas a 20 °C sob lâmpadas fluorescentes e 16 horas de luz. A resposta ao miconazole foi determinada por meio da medição do diâmetro do crescimento das hifas após 2 a 6 dias, dependendo da taxa de crescimento de cada fungo. Já o crescimento relativo (RG) para cada concentração de mionazole foi calculado pela seguinte expressão: RG = 100 (Wf - Wi)/Wi, em que Wi e Wf correspondiam às medidas iniciais e finais do crescimento das hifas.

2) Método proposto por Kimura et al. (2001): baseia-se na introdução de fungicidas no meio de cultura fundente, no qual se realizam medições do diâmetro do crescimento micelial, geralmente em dois sentidos, perpendiculares entre si. Em seguida, por meio de uma análise de regressão, obtém-se o ED50, concentração do ingrediente ativo capaz de inibir 50% do crescimento micelial do isolado, e a concentração mínima inibitória (CMI) dos fungicidas. A partir de então, realiza-se outro bioensaio de incorporação de fungicidas para avaliar a sensibilidade de conídios a fungicidas, adotando-se para isso o teste de diluição de fungicidas em água destilada mais a suspensão conidial (conídios mL-1) e a testemunha (apenas água destilada e suspensão conidial). Para avaliar a inibição da germinação, determina-se a porcentagem de conídios germinados, com base em 100 conídios avaliados. Por fim, avalia-se a erradicação do micélio, empregando-se, para isso, o teste de contato micelial com a calda antifungicida. Para tanto, desenvolve-se o crescimento micelial em meio de cultura, e, em seguida, submete-se o novo micélio desenvolvido na fina camada (película) do meio ao tratamento com determinada quantidade dos fungicidas, preparada em água destilada esterilizada. Depois de determinado tempo, descarta-se a suspensão do fungicida e retiram-se 5 discos de 7 mm de diâmetro da película micelial, os quais devem ser transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura apropriado. Posteriormente, conta-se o número de colônias originadas a partir dos discos de película micelial tratados.

3) Método proposto por Nogueira et al. (2002): inicialmente prepara-se uma suspensão de esporos, de concentração definida, por exemplo, 2x104 conídios mL-1, sob câmara de Neubauer (hemocitômetro) a partir de isolados monospóricos (cultura pura) do fungo a ser estudado, previamente obtidos de material infectado. Em seguida, com o auxílio de uma micropipeta, retira-se uma alíquota da suspensão de esporos (15 μL) e a transfere para cavidades de lâminas escavadas contendo uma quantidade pré-determinada da solução dos fungicidas (15 μL) a serem avaliados. Há também necessidade de se utilizar uma testemunha (padrão de germinação) constituída de um meio de cultura determinado, por exemplo, meio Kirchoff composto de 10% de sacarose, 1% de asparagina, 0,25% de sulfato de magnésio e 1% de fosfato monobásico de potássio (NAGURAJAN; SARASWATHI, 1971). Ao término dessa fase, procede a transferência das lâminas escavadas assepticamente para câmaras úmidas, por exemplo, placas de Petri de 15 cm contendo duas folhas de papel de filtro esterilizadas e umedecidas com água destilada e esterilizada, mantendo-as em câmara de crescimento no escuro e com temperatura controlada (25±1 °C). Decorrido o tempo de incubação, paralisa-se o processo de germinação com o uso de substâncias específicas, como o lactofenol + azul-de-amam, e em seguida fazem-se as observações das lâminas sob microscópio óptico para contagem e determinação do percentual de conídios germinados e do número total de conídios vivos.

4) Método proposto por Fischer (2003): este método consiste na diluição em série dos fungicidas e ajuste dos mesmos para concentrações de 0, 1, 10, 100 e 1.000 ppm de ingrediente ativo, os quais são em seguida adicionados ao meio de cultura fundente (45 ºC–50 ºC), com 20 mL vertido em cada placa de petri de 90 mm de diâmetro. Depois de resfriado o meio de cultura, um disco de 5 mm de diâmetro da colônia fúngica já purificada é transferido para placas de Petri. Em seguida, as culturas são mantidas sob condições ideais ao crescimento do fungo, por determinado período. A eficiência dos produtos é verificada pela aferição perpendicular dos diâmetros das colônias em milímetros, determinando-se assim a porcentagem de inibição (%I) dos referidos tratamentos em relação à testemunha, utilizando para isso a seguinte fórmula: (%I) = (DTest – Dtrat)/DTest x 100, onde DTest e DTrat são os diâmetros da testemunha e dos tratamentos.

Bioensaios para avaliação de fitotoxicidade dos fungicidas aos explantes

De maneira geral, as metodologias utilizadas para avaliação da fitotoxicidade se baseiam na incorporação ao meio de cultura de concentrações de fungicidas pré-definidas nos ensaios de micotoxicidade. No entanto, poucas são as publicações que descrevem a prevenção da contaminação utilizando fungicidas no meio nutritivo e os possíveis efeitos dessas substâncias sobre o desenvolvimento das plantas in vitro (SHIELDS et al., 1984). Acrescenta-se ainda que, das pesquisas já realizadas e reportadas até o presente momento, as informações são de modo geral insuficientes acerca dos reais mecanismos que controlam os efeitos dos fungicidas nos explantes in vitro.

Oda et al. (2003), avaliando o efeito tóxico de substâncias fungicidas e germicidas sobre o crescimento vegetativo e enraizamento de plantas da orquídea Oncidium varicosum, observaram que a adição do fungicida azoxystrobin em todas as concentrações avaliadas assim como também a introdução de alta dose de benomyl (0,8 g L-1) apresentaram efeitos letais para as plantas. Ainda segundo esses autores, na medida em que se aumentou a dosagem fungicida de benomyl, houve redução do número de raízes e do comprimento da maior raiz. Efeitos negativos do uso de fungicidas in vitro também foram relatados por Watt et al. (1996) que constataram que tanto o fungicida benomyl (0,5 g L-1 e 1,0 g L-1) quanto o chlorothalonil (0,25 g L-1 e 0,5 g L-1), quando adicionados ao meio de cultura, foram prejudiciais ao cultivo de Eucalyptus grandis, afetando de maneira significativa a sobrevivência dos explantes, além de inibir por completo a multiplicação e regeneração das plantas.

Já Niedz e Bausher (2002) obtiveram sucesso nos estabelecidos in vitro de brotos de Citrus sinensis oriundos de plantas da casa de vegetação (95% de descontaminação) pela adiação ao meio de cultura de 5 mL L-1 de PPM. Embora a adição de 20 mL L-1 de PPM tenha promovido maior controle dos índices de contaminação, os níveis de fitotoxidez foram severos aos explantes. Em outro experimento, esses autores verificaram que, apesar de a redução dos níveis de contaminação ter sido cerca de 2/3 com a exposição dos explantes a uma solução contendo 10 mL L-1 ou 20 mL L-1 de PPM, esse método causou elevada fitotoxidez sobre o crescimento de brotos. Com o objetivo de controlar a contaminação no estabelecimento in vitro de gemas apicais e laterais de Celtis sp., Sato et al. (2001) observaram que a adição de benomyl ao meio de cultivo, em concentrações de 100 mg L-1, 200 mg L-1, 300 mg L-1, 400 mg L-1 e 500 mg L-1, inibiu totalmente o desenvolvimento dos fungos, assim como também não apresentou fitotoxidez às gemas.

Leveduras em cultivos in vitro: metodologia para identificação e obtenção de culturas assépticas

Embora a contaminação por leveduras seja um problema importante na cultura de tecidos de plantas (LEIFERT et al., 1990), poucas são as pesquisas visando identificar as espécies causadoras da contaminação e, muito menos ainda, o desenvolvimento de métodos preventivos ou curativos. Nesse contexto, vários compostos têm sido descritos por sua atividade antimicótica contra uma ampla diversidade de fungos, muitos dos quais são potencialmente usados na eliminação de leveduras em cultura de tecidos (NAGY et al., 2005). Ressalta-se, entretanto, que de modo geral as plantas são mais sensíveis a efeitos fitotóxicos sob condições in vitro do que in vivo.

Em estudo recente, Nagy et al. (2005) identificaram, durante as etapas de micropropagação de macieira cv. Pinova, uma bactéria de vida livre de pigmentação rosa. Observações preliminares, baseadas em análises microscópicas, também sugeriram a presença de leveduras. Além disso, vários tratamentos de esterilização superficial dos explantes colocados em cultivo não possibilitaram a eliminação dos contaminantes. Assim, os autores realizaram um estudo para identificar e reverter essa limitação no cultivo in vitro da cv. Pinova de macieira. Para isso, utilizaram a seguinte metodologia abaixo descrita.

Material vegetal e fungicidas utilizados – Os explantes consistiram em brotos da cv. Pinova de macieira, obtidos de gemas axilares e brotos em ativo crescimento. Inicialmente, os brotos foram desinfestados superficialmente, e os meristemas excisados e inoculados em meio de cultura. Após 4 dias do estabelecimento, os meristemas livres de contaminações foram transferidos para meio fresco. No entanto, visando confirmar a eficiência do processo de desinfestação, os explantes foram colocados sobre meio BDA e avaliados quanto ao crescimento de microrganismos após incubação a 28 ºC por 7 dias. Contudo, com o objetivo de verificar a eficiência de compostos químicos sobre as possíveis contaminações e esclarecer sobre a ocorrência de leveduras, os seguintes produtos foram empregados: mancozeb, myclobutanil e mancozeb + zoxamid, triforine, benomyl, ProClinw 300 e PPM.

Obtenção dos isolados – Leveduras foram isoladas de brotos visivelmente contaminados, coletando pequenos segmentos caulinares (1 mm3) da parte basal dos brotos, que foram em seguida triturados em água destilada. Todos os isolamentos foram feitos pelo plaqueamento dos tecidos triturados sobre meio BDA, pH 5,6, contendo 100 mg L-1 de chloramphenicol e incubados a 25 ºC por 6 a 7 dias. Dezesseis colônias de leveduras individuais foram selecionadas ao acaso e subcultivadas por três vezes sobre meio BDA. Posteriormente, os isolados foram armazenados a -70 ºC em glicerol 15%. Culturas foram riscadas sobre meio BDA, incubadas por 3 a 4 dias a 25 ºC, e então transferidas para meio fresco de BDA e incubadas por 2 dias.

Caracterização das leveduras – A identificação foi realizada por meio de características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas de acordo com metodologia padrão empregada em taxonomia de leveduras (YARROW, 1998). O tipo de cepa de Rhodotorula glutinis PYCC 4177 (CBS 20) foi incluído em todas as observações como uma referência. Análises moleculares foram também conduzidas segundo protocolo de Sampaio et al. (2001) e usando os primers ITS5 (50 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) e LR6 (50 CGC CAG TTC TGC TTA CC).

Tratamento com fungicidas – A sensitividade das leveduras aos fungicidas foi determinada pelo crescimento dos isolados sobre meio de ágar de milho e MS, suplementado com os diferentes fungicidas. O ágar de milho (Difco) foi acrescido de 2% de glicose e 0,05% de ácido 2-morpholinoethanesulfonic (MES). Ambos os meios tiveram seu pH ajustado para 5,6 antes da autoclavagem. As soluções estoques de muitos dos fungicidas empregados foram preparadas em água destilada e rapidamente vertidas nas placas. Os fungicidas thiabendazole e miconazole foram dissolvidos em dimethyl sulfoxide (DMSO), e a concentração final de DMSO no meio foi 1%. Os fungicidas foram adicionados aos meios de cultivo após a autoclavagem, e quando estes apresentavam uma temperatura de 45 ºC. Após vertido nas placas, cerca de 15 μL da suspensão contendo as leveduras, aproximadamente 108 células mL-1, foi adicionada, e as culturas incubadas a 25 ºC por 14 dias.

Concentração mínima inibitória (MIC) – Foi determinada pela introdução de baixas concentrações dos fungicidas testados, nas quais não se observou o crescimento das leveduras após 14 dias. Já a concentração mínima fitotóxica (MPC) dos referidos fungicidas foi determinada em meio de MS usando valores determinados da MIC. Para isso, brotos jovens, de 10 mm a 15 mm de comprimento, foram incubados por 1 a 2 horas em solução contendo os fungicidas e então transferidos para meio de MS sólido contendo as mesmas concentrações dos fungicidas. A fitotoxicidade foi determinada visualmente pela observação de necroses, escurecimento, cloroses e variações morfológicas. Crescimento de leveduras nos tecidos cultivados foi observado por 14 dias. Em seguida, os explantes que não apresentavam contaminação visível foram removidos, transferidos para tubos de ensaio individuais contendo meio batata, acrescido de 2% de glicose, e incubados por um período adicional de 7 dias para determinar a presença de leveduras.

A prevenção e a descontaminação de tecidos de macieira foram conseguidas com sucesso pelo uso de mancozeb (15 mg L-1). Visando aumentar a eficiência na eliminação das leveduras dos tecidos, foram avaliadas diferentes combinações dos fungicidas, o que resultou em alta eficácia. Para isso, os autores imergiram brotos contaminados por 1 a 2 horas em meio líquido contendo metade da concentração dos sais de MS desprovido de açúcar e adicionado de 588 μM de nitrato de prata. Após o tratamento, os brotos foram cultivados em meio semissólido de MS contendo mancozeb (15 mg L-1) e thiabendazole (40 mg L-1). Após 14 dias do cultivo, 9 dos 30 brotos tratados apresentaram contaminação, sendo que os melhores fungicidas no controle da levedura Rhodotorula slooffiae, sem causar fitotoxicidade, foram o ProClinw 300®, mancozeb, thiabendazole e mancozeb + zoxamid.

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WATT, M. P.; BLAKEWAY, F. C.; GAUNTLETT, B. A. Effect of anti-fungal agents on in vitro cultures of Eucalyptus grandis. South Africa Journal of Forestry, Durban, n. 175, p. 23-27, 1996.

YARROW, D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. (Ed.). The yeasts, a taxonomic study. Amsterdam, NL: Elsevier Science, 1998. p. 77-100.

YEPES, M. L.; ALDWINCKLE, H. S. Micropropagation of thirteen Malus cultivars and rootstocks, and effect of antibiotic on proliferation. Plant Growth Regulation, Berlin, DE, v. 15, p. 55-67, 1994.

Capítulo 7
Estratégias de seleção e uso de extratos de plantas no controle microbiano in vitro

José Renato Stangarlin

Gilmar Franzener

Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada

Maria Eugênia da Silva Cruz

Introdução

Estima-se, atualmente, que apenas 20% da população mundial seja responsável pelo consumo de 85% dos medicamentos industrializados disponíveis no mercado. No Brasil, somente 20% da população consome 63% dos medicamentos disponíveis, enquanto que o restante encontra nos medicamentos de origem natural, especialmente nas plantas medicinais, a única fonte de recurso terapêutico (DI STASI, 1996a). Até o momento, ainda não se conhece quase nada sobre a composição química de 99,6% das plantas de nossa flora, estimadas entre 40 mil a 55 mil espécies (MING, 1996). Além disso, uma grande quantidade de compostos secundários das plantas medicinais já isolados e com estrutura química determinada ainda não foram estudados quanto suas atividades biológicas.

Os compostos secundários, compostos não vitais às plantas, mas com função de proteção contra pragas e doenças e atração de polinizadores, presentes em plantas medicinais, pertencem a várias classes distintas de substâncias químicas, como alcaloides, terpenos, lignanas, flavonoides, cumarinas, benzenoides, quinonas, xantonas, lactonas e esteroides, entre outras (DI STASI, 1996b). Quando esses compostos são extraídos das plantas por processos específicos, como a destilação por arraste de vapor de água, originam líquidos de consistência semelhante ao óleo, voláteis, dotados de aroma forte, quase sempre agradável, insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos, denominados de óleos essenciais (SILVA et al., 1995).

Compostos secundários de plantas medicinais estão distribuídos em um grande número de famílias botânicas, com muitos deles apresentando atividade antimicrobiana, como é o caso dos alcaloides, com origem biossintética a partir da via metabólica do ácido chiquímico (BENNETT; WALLSGROVE, 1994). Outros compostos podem ainda apresentar atividade anti-inflamatória, analgésica, inseticida, colérica e colagoga (CORREA JÚNIOR et al., 1994).

Na literatura é possível encontrar um grande número de trabalhos que utilizam as propriedades antimicrobianas dos compostos secundários de plantas medicinais para o controle de agentes fitopatogênicos (Tabela 1). Por meio desses trabalhos observam-se efeitos fungitóxicos (fungicida/fungistático) em experimentos realizados in vitro e in vivo, utilizando o extrato bruto aquoso, as tinturas ou extratos alcoólicos, o óleo essencial e os hidrolatos dessas plantas. Outra relação de plantas com atividade fungicida pode ser encontrada no trabalho de Duke (2002): Alpinia officinarum (Zingiberaceae), Anagallis arvensis (Primulaceae), Arctium lappa (Asteraceae), Arnebia nobilis (Boraginaceae), Artemisia capillaris (Asteraceae), Baphia nitida (Fabaceae), Carica papaya (Caricaceae), Carthamus tinctorius (Asteraceae), Carum carvi (Apiaceae), Carum copticum (Apiaceae), Cassia alata (Fabaceae), Chenopodium ambrosioides (Chenopodiaceae), Cinnamomum cassia (Lauraceae), Cinnamomum zeylanicum (Lauraceae), Citrus aurantium (Rutaceae), Coscinium fenestratum (Menispermaceae), Curcuma aromatica (Zingiberaceae), Cyrtandra auriculata (Gesneriaceae), Datura stramonium (Solanaceae), Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), Gynocardia odorata (Flacourtiaceae), Hedychium spicatum (Zingiberaceae), Hydrocotyle asiatica (Apiaceae), Impatiens balsamina (Balsaminaceae), Ipomoea batatas (Convolvulaceae), Lawsonia inermis (Lythraceae), Lindera sp. (Lauraceae), Lonicera japonica (Caprifoliaceae), Mangifera indica (Anacardiaceae), Mentha arvensis (Lamiaceae), Mesua ferrea (Clusiaceae), Morus alba (Moraceae), Musa paradisiaca (Musaceae), Nothosmyrnium japonicum (Apiaceae), Ocimum basilicum (Lamiaceae), Paeonia lactiflora (Paeoniaceae), Perilla frutescens (Lamiaceae), Phyllanthus emblica (Euphorbiaceae), Pimenta dioica (Myrtaceae), Pimpinella anisum (Apiaceae), Pinus longifolia (Pinaceae), Piper betel (Piperaceae), Piper nigrum (Piperaceae), Plumbago indica (Plumbaginaceae), Plumbago zeylanica (Plumbaginaceae), Plumeria acuminata (Apocynaceae), Plumeria alba (Apocynaceae), Plumeria rubra (Apocynaceae), Pogostemon benghalensis (Lamiaceae), Pogostemon pubescens (Lamiaceae), Pogostemon purpurascens (Lamiaceae), Pongamia pinnata (Fabaceae), Portulaca oleracea (Portulacaceae), Quercus sp. (Fagaceae), Raphanus sativus (Brassicaceae), Rhododendron canadensis (Ericaceae), Rosa indica (Rosaceae), Rungia repens (Acanthaceae), Sabal palmetto (Arecaceae), Santolina chamaecyparissus (Asteraceae), Sassafras albidum (Lauraceae), Satureja hortensis (Lamiaceae), Satureja montana (Lamiaceae), Saussurea lappa (Asteraceae), Seseli indicum (Apiaceae), Shorea harmandii (Dipterocarpaceae), Tabebuia rosea (Bignoniaceae), Tagetes minuta (Asteraceae), Tamarindus indica (Fabaceae), Terminalia belerica (Combretaceae), Terminalia chebula (Combretaceae), Thymus vulgaris (Lamiaceae), Tropaeolum majus (Tropaeolaceae), Tropaeolum minus (Tropaeolaceae), Tropaeolum peregrinum (Tropaeolaceae), Viola odorata (Violaceae), Viola pilosa (Violaceae), Vismia ferruginea (Clusiaceae), Vismia sp. (Clusiaceae), Withania somnifera (Solanaceae), Woodfordia fruticosa (Lythraceae), Xanthium strumarium (Asteraceae), Zanthoxylum armatum (Rutaceae) e Zanthoxylum oxyphyllum (Rutaceae).

Tabela 1. Atividade antimicrobiana in vitro de extratos aquosos e alcoólicos, hidrolatos e/ou óleos essenciais de plantas medicinais.

Planta medicinal

Microrganismo alvo

Referência

Eucalyptus citriodora

Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora sp., Alternaria alternata

Bonaldo et al. (1998a, 1998b, 1998c,1998d, 1999);

Schwan-Estrada et al. (1997, 1998)

Cymbopogon citratus

R. solani, S. rolfsii, Phytophthora sp.,

A. alternata, Colletotrichum graminicola, Fusarium solani f. sp. phaseoli, Sclerotinia sclerotiorum

Bonaldo et al. (1999);

Cruz et al. (1997, 1998);

Fagan et al. (1998a, 1998b, 1998c);

Tagami et al. (1998);

Valarini et al. (1994)

E. citriodora, C. citratus, Achillea millefolium, Ageratum conizoides

Didymela bryoniae

Fiori et al. (1998a, 1998b, 1998c, 2000)

Allium sativum

R. solani, Alternaria stevia, Phytophthora drechsleri f. sp. cajani, Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, S. sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Gibberella zeae, Cyllindrocladium clavatum, F. moniliforma var. subglutinans

Bianchi et al. (1997);

Bolkan e Ribeiro (1981);

Chalfoun e Carvalho (1987, 1991);

Gasparin et al. (1998);

Singh et al. (1979, 1992, 1990);

Tansey e Appleton (1975);

Tariq e Magee (1990)

Artemisia camphorata

R. solani, S. rolfsii, Phytophthora sp., A. alternata, C. graminicola, Bipolaris sorokiniana

Franzener et al. (2003); Soares et al. (1998a, 1998b, 1998c)

Ruta graveolens, Baccharis trimera,

Ocimun basilicum

R. solani, S. rolfsii, Phytophthora sp.,

A. alternata, C. graminicola

Bernardo et al. (1998, 1999)

Zingiber officinale

Erysiphe poligony

Singh et al. (1991)

Cymbopogon martinii,

C. oliveri, Trachyspermum ammi

Helminthosporium oryzae

Singh et al. (1980)

Capsicum annuum

Botrytis cinerea

Wilson et al. (1997)

Flueggea microcarpa

A. alternata, A. brassicae, A. carthami, F. oxysporum f.sp. ciceri, F. udum, Curvularia lunata

Prithiviraj et al. (1997)

Amaranthus spp., A. conyzoides, Lantana sp., Z. offinale

Phyllactinia corylea, Pseudocercospora mori, Cerotelium fici

Biswas et al. (1995)

Azadirachta indica, Chromolaena odorata

Phytophthora capsici

Anandaraj e Leela (1996)

Echinops echinatus

Alternaria tenuissima

Singh et al. (1988)

Ocimum adscendens

Aspergillus flavus, A. niger, Rhizopus sp.

Asthana et al. (1989)

Lantana indica

A. brassicae, A. brassicicola, A. carthami, C. lunata, F. udum

Verma et al. (1998)

Canscora decussata

F. oxysporum carthami

Ghosal et al. (1977)

Ocimum gratissimum, C. citratus

Phytophthora palmivora

Awuah (1994);

Fagan et al. (1999)

Xylopia aethiopica, Monodera myrstica, A. gratissimum

Ustilago maydis, C. lunata, Rhizopus sp. Ustilaginoidea virens

Awuah (1989)

Chenopodium ambrosioides

R. solani, S. rolfsii, Hemileia vastatrix, Uromyces appendiculatus

Kishore et al. (1989); Ferracini e Melo (1990); Schnepfleitner et al. (1996)

Lippia alba, C. ambrosioides

R. solani, C. gloeosporioides, H. vastatrix, U. appendiculatus

Dubey e Kishore (1987);

Santos e Pascholati (1996);

Schnepfleitner et al. (1996)

Lippia sidoides

Macrophomina phaseolina, C. gloeosporioides, F. oxysporum

Pessoa et al. (1996);

Schnepfleitner et al. (1996)

Taxus brevifolia

Phytophthora spp., Pythium spp.,
Aspergillus sp.,
Fusarium sp.

Wagner e Flores (1994)

Vernonia scorpioides

Penicillium citrinum, A. alutaceus

Freire et al. (1996)

Chamaecyparis pisifera v. plumosaa

Pyricularia oryzae

Kobayashi et al. (1987)

Glycine max, Cicer arietinum

P. digitatum,
A. ochraceus, F. culmorum

Krämer et al. (1984)

Eupatorium riparium

Colletotrichum gloeosporioides

Bandara et al. (1992)

Reynoutria sachalinensis

Sphaerotheca fuliginea

Daayf et al. (1995)

Hydrilla verticillata

F. culmorum

Hipskind et al. (1992)

Tagetes minuta, Vernonia comdensata, V. polyanthes

H. vastatrix, C. gloeosporioides, B. cinerea,
Trichoderma sp.

Catarino et al. (1990a, 1990b)

Piper aduncum

Crinipellis perniciosa

Bastos (1997)

Astronium urundeuva, Annacardium occidentale

A. niger, A. flavus, Fusarium spp., Rhizoctonia sp.

Coutinho et al. (1996)

Copaifera reticulata

F. moniliforme,
Alternaria spp.

Diniz et al. (1996)

Syzygium jambos

Puccinia psidii

Tessmann et al. (1991)

Quassia sp.,
Simaba cedron, Simaruba amara, Pteurocaulon balansae

F. moniliforme, R. solani, S. sclerotiorum

Sadi et al. (1990)

Bioensaios

Diversas metodologias têm sido propostas para verificar ou realizar o screening inicial de extratos vegetais com atividade antimicrobiana. Esterilizações desses extratos por calor úmido (autoclavagem) ou por métodos físicos (esterilização por filtração) antes de sua incorporação em meio de cultivo, bem como o efeito da adição de antioxidantes aos mesmos, têm sido observados.

Obtenção de extrato bruto aquoso

Na obtenção de extrato bruto (EB), folhas frescas das plantas medicinais são trituradas em água destilada, por 1 minuto, em liquidificador. Os homogeneizados são filtrados em gaze e em papel de filtro (retenção de partículas de 8 µm ou 11 µm), obtendo-se então os EBs. No caso de preparos de meio para cultivo de fungos, como meio BDA (batata-dextrose-ágar), o material vegetal pode ser triturado diretamente no caldo de batata, obtendo-se posteriormente diferentes concentrações a partir de diluições com o próprio caldo.

Obtenção de óleos essenciais e hidrolatos

Os óleos essenciais são obtidos por arraste com vapor de água, por exemplo, a partir de folhas secas ao ar. Os hidrolatos, ou águas destiladas, são produtos secundários à preparação dos óleos essenciais, possuem grande quantidade de princípios voláteis, como ácidos, aldeídos e aminas, e podem conter de 0,05 g a 0,2 g de óleo essencial por litro (TESKE; TRENTINI, 1997).

Obtenção de tinturas

A tintura vegetal, com 1/5 de seu peso em erva seca, é obtida por maceração das folhas (100 g) em álcool etílico 50o G.L. (400 mL) por 7 dias em geladeira. Posteriormente, a tintura etanólica é filtrada em gaze e em papel filtro até 11 µm. O álcool é removido da tintura por rotoevaporação a 75 oC sob vácuo, obtendo-se uma pasta escura da qual são preparadas diluições.

Atividade antifúngica

Germinação de esporos

Para o teste de inibição utilizando extratos, uma alíquota de 40 µL da suspensão de esporos (1 x 105 conídios mL-1) e outra de 40 µL dos extratos brutos aquosos, hidrolatos ou tinturas das plantas medicinais, esterilizados por autoclavagem a 120 oC e 1 atm por 1 hora, ou em filtros com 0,45 µm de diâmetro de poro, são colocadas juntas em lâmina de microscopia revestida por uma camada delgada de poliestireno (MERCURE et al., 1994), ou então por uma camada de ágar-água 1%. Para facilitar a filtração, os extratos das plantas podem ser centrifugados a 6.000 rpm para eliminação dos restos celulares. As lâminas recobertas por poliestireno são obtidas por sua imersão em solução contendo o polímero, uma placa de Petri de poliestireno com 90 mm de diâmetro, dissolvido em 50 mL de acetato de amila. No segundo caso, as lâminas recebem cerca de 1.000 µL de ágar-água 1% autoclavado. Essas lâminas são colocadas em câmara úmida, placas de Petri com papel de filtro umedecido com água destilada no fundo, e incubadas nas condições ambientais desejadas, conforme o microrganismo em estudo. As porcentagens de germinação de esporos e formação de apressórios são determinadas em média 20 horas após o início do experimento dependendo novamente do microrganismo em estudo, por meio do emprego de 100 µL de azul algodão de lactofenol por lâmina, para paralisar a germinação, e observação ao microscópio ótico. Podem ser considerados como germinados os esporos cujos comprimentos dos tubos germinativos forem iguais ou maiores ao menor diâmetro do esporo.

Outro procedimento que pode ser adotado para este tipo de ensaio é o uso de placas de teste Elisa (BONALDO et al., 2004; REGENTE et al., 1997). Cada pocinho da placa recebe 40 μL da suspensão de esporos e 40 μL da respectiva concentração do tratamento. Após o período adequado de incubação, dependendo da espécie fúngica, são determinados a porcentagem de esporos germinados e o tamanho médio dos tubos germinativos.

Em trabalhos envolvendo óleo essencial, 100 µL de cada tratamento e 100 µL de suspensão de esporos (105 conídios mL-1) são colocados na superfície de placas de Petri contendo ágar-água (1%), espalhados com alça de Drigalsky e incubados nas condições adequadas. A germinação dos esporos é determinada como mencionado anteriormente.

Crescimento micelial

Extrato aquoso, hidrolato ou tintura das plantas medicinais são incorporados em meio de cultivo BDA em diferentes concentrações e autoclavados a 120 oC e 1 atm por 20 minutos. Também podem ser esterilizados por filtração e incorporados no meio autoclavado e semifundente a 45 oC. Uma hora após o meio ter sido vertido em placas de Petri, um disco de 8 mm de diâmetro contendo micélio dos fungos com 14 dias de idade é repicado para o centro de cada placa, que é vedada com filme plástico e incubada nas condições desejadas. São realizadas medições diárias do diâmetro das colônias, em média 2 medidas diametralmente opostas, iniciando-se 24 horas após a instalação do experimento e perdurando até o momento em que as colônias fúngicas atinjam 2/3 da superfície do meio de cultura.

Óleos essenciais previamente esterilizados por filtração podem ser diluídos em metanol e adicionados em frascos de 50 mL contendo 10 mL de meio de cultura Saboraud, de forma a se obter diferentes concentrações. Os frascos-controle recebem a mesma dose de metanol puro utilizado em cada tratamento. Os frascos são selados com filme plástico e mantidos em agitação por tempo e temperatura apropriados. O micélio é obtido por filtração, e o peso seco determinado após secagem a 65 oC até peso constante.

Esporulação

Ao término do teste de inibição de crescimento micelial, é avaliada a esporulação de cada colônia. Para isso, é preparada uma suspensão de esporos pela adição de 10 mL de água destilada na placa, raspagem da colônia com bastão de vidro e filtragem em gaze, sendo determinado o número de esporos mL-1 em câmara de Neubauer ao microscópio óptico. Posteriormente é determinado o número de esporos produzidos por cm2 de cada colônia fúngica.

Atividade antibacteriana

Crescimento bacteriano

No caso de bactérias, 100 μL de suspensão bacteriana contendo 108 UFC mL-1 obtida de colônias jovens (de 24 horas a 48 horas de cultivo) são transferidos para tubos de ensaio contendo meio caldo nutriente com as respectivas concentrações de extrato, hidrolato, tintura ou óleo essencial. Após 48 horas de incubação sob agitação, é estimado o crescimento bacteriano pela determinação da absorbância a 580 nm em espectrofotômetro.

Antibiogramas

Outra forma de avaliação da atividade antibacteriana é por meio de bioautografia ou teste de difusão. Para tanto, suspensão de células bacterianas, com 24 horas de crescimento e ajustada para 1 x 108 UFC mL-1, é colocada sobre a superfície de um meio de cultura sólido e apropriado para a espécie em estudo. A suspensão bacteriana pode também ser adicionada ao meio semifundente a 45 oC – pour plate technique – imediatamente antes da sua deposição nas placas de Petri. Discos de papel de filtro de 6 mm de diâmetro e impregnados com 15 µL a 20 µL das soluções a serem testadas são colocados sobre a superfície do meio contendo o microrganismo. Após 18 horas a 24 horas de incubação sob temperatura apropriada, as placas podem ser observadas, avaliando-se o diâmetro de inibição ao redor de cada disco (NOSTRO et al., 2000).

Esses métodos podem também ser utilizados para estudos com fungos leveduriformes (SAWAYA et al., 2002).

Extratos de plantas medicinais

Artemisia camphorata

Com o objetivo de realizar o controle alternativo de Bipolaris sorokiniana em plantas de trigo, Franzener et al. (2003) utilizaram extrato aquoso (EA) de Artemisia camphorata (cânfora) em bioensaios. Utilizou-se EA em concentrações de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% e 50%, autoclavado ou não, com ou sem adição de antioxidante (Na2SO3 – 0,25%). Com relação aos dados in vitro, o extrato aquoso de cânfora a 50% causou inibição de 39% no crescimento micelial, sendo que a 10% já inibiu completamente a esporulação. O EA não autoclavado inibiu em 20% a germinação de esporos enquanto o EA autoclavado não causou inibição, indicando a presença de compostos fungitóxicos termolábeis. A incorporação de antioxidante ao EA favoreceu a inibição da germinação de esporos. Alguns desses dados podem ser observados nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2. Inibição in vitro do crescimento micelial e da esporulação de Bipolaris sorokiniana em função do tratamento com extrato bruto aquoso autoclavado de Artemisia camphorata (cânfora).

Tratamento

Inibição (%)

Crescimento micelial

Esporulação

Controle (BDA)

0

0

EA 1%

0

0

EA 5%

9

80

EA 10%

13

100

EA 15%

19

100

EA 20%

25

100

EA 25%

31

100

EA 50%

39

100

Tabela 3. Inibição in vitro da germinação de esporos de Bipolaris sorokiniana em função do tratamento com extrato bruto aquoso de Artemisia camphorata (cânfora), autoclavado ou não autoclavado, e contendo ou não antioxidante.

Tratamento

Inbição da germinação (%)

Com antioxidante(1)

Sem antioxidante(1)

Auto-
clavado

Não autoclavado

Auto-
clavado

Não autoclavado

Controle (H2O)

0

0 a(3)

0

0 a

EA 1%(2)

0

2 b

0

1 a

EA 15%(2)

0

14 c

0

6 b

EA 20%(2)

0

20 d

0

11 c

(1) Antioxidante: 0,25% de sulfito de sódio anidro (Na2SO3).

(2) Concentração do extrato bruto aquoso (EA) de A. camphorata.

(3) Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≥ 1%).

Para o controle alternativo em pós-colheita da antracnose da banana, foram realizados ensaios para avaliar o crescimento micelial e a esporulação in vitro do fungo Colletotrichum musae na presença de extratos da planta medicinal A. camphorata (cânfora), nas concentrações de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% e 25%. Os resultados indicaram inibição do crescimento micelial em 41% e da esporulação em 86% (Tabela 4) (CARRÉ et al., 2006).

Tabela 4. Crescimento micelial in vitro e esporulação de Colletotrichum musae em função do tratamento com extrato aquoso de Artemisia camphorata.

Tratamento

Crescimento micelial
(cm2)(1)

Esporulação
(1 x 104 esporos mL-1)

EA 1%

19,4

10,3

EA 5%

19,2

10,4

EA 10%

16,7

3,1

EA 15%

15,4

2,9

EA 20%

14,3

3,3

EA 25%

13,6

2,5

Controle(2)

22,9

38,1

(1) Valores da área de crescimento micelial e esporulação obtidos 6 dias após a repicagem do fungo.

(2) Controle: BDA + 0,25% de Na2SO3 (antioxidante).

Fonte: Carré et al. (2006).

Curcuma longa

A cúrcuma é uma planta da família Zingiberaceae, originária do Sudeste Asiático. O interesse econômico da cultura está baseado nos principais componentes qualitativos dos rizomas: corante curcumina e óleos essenciais (CECÍLIO FILHO, 1996).

Utilizada já desde a antiguidade na medicina e gastronomia do oriente, a cúrcuma vem se tornando importante atualmente no combate a vários problemas de saúde humana, podendo-se destacar alguns efeitos de seus componentes, como anti-inflamatório (ARAÚJO; LEON, 2001), antioxidante (LEAN; MOHAMED, 1999), atividade antiprotozoário (ARAÚJO et al., 1998, 1999), atividade antibacteriana (UECHI et al., 2000), atividade antifúngica (APISARIYAKUL et al., 1995) e atividade antinematoide (ARAÚJO; LEON, 2001). Outros trabalhos também relatam que a cúrcuma promove benefícios como a inibição do vírus da imunodeficiência humana Tipo-1 (MAZUMDER et al., 1995), além de possuir atividades antitumorígena, anticarcinogênica (LIN; LIN-SHIAU, 2001) e antimutagênica (ARAÚJO; LEON, 2001). As ações citadas estão ligadas a uma série de compostos produzidos pela planta, sendo sua maioria produtos do metabolismo secundário.

O uso de extrato de cúrcuma para o controle de fitopatógenos é relatado por Saju et al. (1998) que determinaram a atividade fungistática in vitro contra Colletrotricum gleosporioides, Sphaceloma cardamoni, Pestalotia palmarum, Rhizoctonia solani, Aspergillus sp. e Fusarium sp. Singh e Rai (2000) verificaram fungitoxicidade no extrato de cúrcuma in vitro contra Fusarium udum. Raja e Kurucheve (1998) obtiveram uma redução no crescimento in vitro de Macrophomina phaseolina com extrato de cúrcuma.

Controle de X. axonopodis pv. manihotis

Kuhn et al. (2006) avaliaram o controle in vitro de X. axonopodis pv. manihotis mediante o uso de extrato aquoso de quatro genótipos de cúrcuma provenientes de cultivos de Jaboticabal, SP, Mara Rosa, GO, Maringá, PR e Mercedes, PR. O extrato de cúrcuma causou inibição completa do crescimento da bactéria na concentração de 10% para o material proveniente de Mercedes, enquanto que para a cúrcuma de Jaboticabal houve controle total a 15%, e de Mara Rosa a 20% (Tabela 5). A cúrcuma proveniente de Maringá não inibiu completamente o crescimento em nenhuma das concentrações utilizadas.

Tabela 5. Crescimento de X. axonopodis pv. manihotis, expresso em unidades formadoras de colônias (106 UFC mL-1), em presença de diferentes concentrações do extrato bruto aquoso de quatro genótipos de C. longa (cúrcuma).

Genótipo

Concentração do extrato

0

1%

5%

10%

15%

20%

Mara Rosa

76,61 a (+)

68,00 ab(+)

37,20 a (+)

11,32 a (–)

14,27 a (–)

0,00 b (–)

Jaboticabal

76,54 a (+)

71,60 a (+)

23,87 b (+)

5,79 b (–)

0,00 c (–)

0,00 b (–)

Maringá

73,05 a (+)

72,97 a (+)

38,53 a (+)

14,45 a (–)

3,40 b (–)

0,40 a (–)

Mercedes

74,02 a (+)

62,06 b (+)

8,26 c (–)

0,00 c (–)

0,00 c (–)

0,00 b (–)

Testemunha(1)

16,42

Médias nas colunas, seguidas de letras distintas, indica diferença pelo teste de Tukey a 1%.

(+) Indica diferença significativa da testemunha, sendo superior a esta.

(–) Indica diferença significativa da testemunha, sendo inferior a esta.

(1)Testemunha: antibiótico (22,5 mg L-1 de oxitetraciclina + 225 mg L-1 de estreptomicina).

Fonte: Kuhn et al. (2006).

Controle de Alternaria solani

Balbi-Peña et al. (2006), com o objetivo de avaliar a atividade fungitóxica in vitro de extratos de cúrcuma e soluções de curcumina contra A. solani, utilizou extratos brutos aquosos (EB) de rizomas de cúrcuma, esterilizados por autoclavagem, nas concentrações de 1%, 5%, 10% e 20%, e de curcumina nas concentrações de 50 mg L-1, 100 mg L-1, 200 mg L-1 e 400 mg L-1. Esses extratos foram incorporados em meio BDA para avaliação do crescimento micelial e esporulação do fungo. Para avaliar o efeito da autoclavagem, foram testados extratos de cúrcuma a 10% e 15% esterilizados por filtração. Foi testado também o efeito dos extratos de cúrcuma autoclavados e não autoclavados e da curcumina na germinação de esporos in vitro. Os extratos de cúrcuma a 10% e 15% não autoclavados inibiram em 38% e 23%, respectivamente, o crescimento micelial, e 72% e 87%, respectivamente, a esporulação do fungo. Quando autoclavados não apresentaram inibição do crescimento micelial nem da germinação de esporos, e a inibição da esporulação foi menor, indicando a presença de compostos antimicrobianos termolábeis. O extrato não autoclavado na concentração de 5% inibiu em até 15% a germinação de esporos. A curcumina inibiu o crescimento micelial em 30% na maior concentração testada. Não foi verificado efeito da curcumina sobre a esporulação e sobre a germinação de esporos in vitro. Alguns desses resultados podem ser observados nas Tabelas 6 e 7.

Tabela 6. Efeito do extrato bruto de C. longa, esterilizado por filtração, sobre o crescimento micelial (CM) e a esporulação in vitro de A. solani.

Tratamento

Inibição de CM (1)
(%)

Inibição de esporulação (%)

Controle (apenas BDA)

0,c

0 b

Extrato bruto 10%

38,2 a

71,7 a

Extrato bruto 15%

23,2 b

87,1 a

CV (%)

21,4

18,1

(1) Médias na coluna seguidas da mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, em 5% de probabilidade.

Fonte: Balbi-Peña et al. (2006).

Tabela 7. Efeito de curcumina sobre o crescimento micelial (CM) in vitro de A. solani.

Tratamento

Inibição de CM
(%)

Inibição de CM descontando-se o efeito do etanol (%)

Controle 1(1)

0

0

Controle 2(2)

55,22

0

Curcumina 50 mg L-1

62,43

7,21

Curcumina 100 mg L-1

60,46

5,24

Curcumina 200 mg L-1

77,06

21,84

Curcumina 400 mg L-1

84,71

29,49

Equações de regressão

R2

57,889 + 0,0708x

0,8809

2,739 + 0,0706x

0,883

(1) Apenas BDA.

(2) BDA + 4% de etanol.

Fonte: Balbi-Peña et al. (2006).

A curcumina apresentou valores de EC50 estimados em 669,42 mg L-1 sobre o crescimento micelial de A. solani. Esses valores permitem classificá-la como uma substância química de pouca ação fungitóxica, pois, segundo os níveis de toxidez para fungos estabelecidos por Edgington et al. (1971), compostos com EC50 > 50 µg mL-1 podem ser considerados como pouco fungitóxicos.

Em relação à ação da curcumina sobre a esporulação in vitro, o único efeito verificado foi em virtude do etanol utilizado como solvente. Também não houve efeito da curcumina na germinação de esporos in vitro. Desse modo, a curcumina não estaria interferindo na etapa de infecção, ou seja, penetração do fungo na planta, podendo estar atuando por meio de outros mecanismos em etapas posteriores do ciclo das relações patógeno-hospedeiro, como na colonização.

Eucalyptus citriodora

Com o objetivo de verificar o potencial de E. citriodora no controle alternativo de antracnose em pepino, extrato aquoso (EA) dessa essência florestal, autoclavado ou não autoclavado, nas concentrações de 0%,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20% e 25% foi utilizado por Bonaldo et al. (2004) nos seguintes ensaios: indução de fitoalexinas em mesocótilos estiolados de sorgo e em cotilédones de soja; fungitoxicidade in vitro sobre conídios de Colletotrichum lagenarium; e indução de resistência local ou sistêmica em plantas de pepino. Água foi utilizada como tratamento-controle. Com relação aos ensaios antimicrobianos in vitro, houve inibição total na germinação de esporos e formação de apressórios de C. lagenarium em concentrações de 20% e 1% do EA autoclavado, respectivamente. Para o extrato não autoclavado, houve 75% de inibição da germinação de esporos em 25% do EA e inibição total da formação de apressórios em 15% do EA. Alguns desses resultados podem ser observados na Tabela 8.

Tabela 8. Médias estimadas da germinação de esporos e formação de apressórios de Colletotrichum lagenarium em diferentes concentrações de extrato aquoso autoclavado e não autoclavado de Eucalyptus citriodora.

Concentração (%)

Germinação (%)

Formação de apressórios (%)

Autoclavado

Não autoclavado

Autoclavado

Não autoclavado

0,1

99,0 a+

95,0 b+

30,3 a+

19,0 b–

1

98,0 a+

98,5 a+

0,0 b–

4,6 a–

5

6,1 b–

96,5 a+

0,3 b–

5,3 a–

10

4,0 b–

50,5 a–

0,0 b–

4,6 a–

15

1,9 b–

41,9 a–

0,0 a–

0,0 a–

20

0,5 b–

30,9 a–

0,0 a–

0,6 a–

25

0,0 b–

25,0 a–

0,0 a–

0,4 a–

Testemunhas

92

27

C.V. (%)

8,0

37,5

Médias seguidas da mesma letra na linha, por característica, não diferem entre si pelo teste F em nível de 10% de probabilidade.

Médias seguidas por (+) e por (-) diferem e são superiores e inferiores, respectivamente, da testemunha absoluta, em nível de 10% de probabilidade pelo teste t de Student.

Fonte: Bonaldo et al. (2004).

Zingiber officinale

O Z. officinale (gengibre), pertencente também à família Zingiberaceae, apresenta potencial de controle de fungos fitopatogênicos. Rodrigues et al. (1999) avaliaram o potencial fungitóxico do gengibre em Alternaria solani, A. alternata, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani e Colletotrichum graminicola. In vitro, verificou-se a inibição do crescimento micelial dos fungos pelos extratos brutos nas concentrações acima de 5% e pelos óleos essenciais nas alíquotas acima de 20 µL. Em casa de vegetação, estudou-se o efeito da irrigação do extrato bruto (caldo), água aromatizada e adição de resíduo sobre a emergência, altura das plantas e pesos úmido e seco de parte aérea e raiz de feijoeiro plantado em solo infestado com S. rolfsii. A irrigação com caldo e a cobertura morta proporcionaram plântulas com altura e pesos superiores à testemunha.

Ocimum gratissimum

O gênero Ocimum é formado por aproximadamente 30 espécies, das quais 16 são originárias da África, sendo cultivado com frequência na Europa e América por suas propriedades aromáticas e medicinais. Sua área de distribuição engloba regiões tropicais e subtropicais (ALBUQUERQUE; ANDRADE, 1998). No Brasil, a espécie O. gratissimum é também conhecida por alfavaca. O gênero é representado por duas espécies amplamente distribuídas em todo território brasileiro: a variedade O. gratissimum e a variedade O. macrophyllum, ambas apresentando notável variação, especialmente no que se refere à morfologia foliar (ALBUQUERQUE et al., 1998). O óleo essencial obtido dessa planta possui atividade antimicrobiana e anti-helmíntica, tendo grupos com grande potencial como fonte alternativa de geraniol para uso nas indústrias de perfume e aroma. No entanto, reconhecem-se três grupos químicos, baseados no principal constituinte do óleo essencial: eugenol, timol e citral. O estudo farmacognóstico dessa espécie evidenciou também a presença de aminas, esteroides e triterpenoides, fenóis, flavonoides, açúcares redutores, saponinas e quinonas (ALBUQUERQUE et al., 1998; GARCÍA et al., 1998), além de óleo essencial.

Rodrigues et al. (2006) estudaram o efeito do extrato bruto aquoso de O. gratissimum sobre o crescimento micelial de Bipolaris sorokiniana, isolado de sementes de trigo, nas concentrações de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% e 50% (m/v), sendo esterilizado por autoclavagem (Ebaa) a 121 °C por 20 minutos ou distribuído na superfície do BDA, com auxílio de alça de Drigalsky, após esterilização por filtração (Ebaf) em membrana com 0,2 µm de diâmetro de poro. O tratamento-controle consistiu de meio BDA. Nos tratamentos com Ebaa, ocorreu inibição do crescimento micelial em todas as concentrações testadas e, quando se utilizou o Ebaf, a maior inibição (30%) ocorreu apenas na concentração de 50% (Tabela 9). Com relação à esporulação, o Ebaa inibiu a produção de esporos a partir da concentração de 10%, e no Ebaf a esporulação foi sempre inferior à testemunha (controle).

Tabela 9. Inibição do crescimento micelial (%) e esporulação de B. sorokiniana em diferentes concentrações do extrato bruto de O. gratissimum (%) autoclavado e esterilizado por filtração em Millipore.

Tratamento

Inibição (%)

Crescimento micelial

Esporulação

Ebaa

Ebaf

Ebaa

Ebaf

Controle (BDA)

0

0

0

0

Extrato de O. gratissimum 1%

35

20

50

50

Extrato de O. gratissimum 5%

50

25

90

90

Extrato de O. gratissimum 10%

100

23

100

92

Extrato de O. gratissimum 15%

95

23

100

92

Extrato de O. gratissimum 20%

95

25

100

92

Extrato de O. gratissimum 50%

100

30

100

92

Ebaa - Extrato bruto aquoso autoclavado; Ebaf - Extrato bruto aquoso esterilizado por filtração.

Fonte: Rodrigues et al. (2006).

Rosmarinus officinalis e Lippia alba

Gasparin et al. (2000) utilizaram extrato bruto aquoso de L. alba, erva cidreira brasileira, e R. officinalis, alecrim, isoladamente ou em mistura nas concentrações de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% e 50%, esterilizado por autoclavagem para verificar o efeito sobre o crescimento micelial dos isolados de Colletotrichum graminicola, Alternaria alternata, Phytophthora sp., Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. O ensaio in vitro (Tabela 10) indicou que, em relação ao extrato bruto de alecrim, houve maior inibição na concentração de 50% para os isolados estudados, com exceção de A. alternata, em que a inibição foi maior nas concentrações de 10% a 15%. Com relação ao extrato bruto de erva cidreira, os fungos S. rolfsii, A. alternata e R. solani apresentaram inibição do crescimento micelial na concentração de 50%, o que não ocorreu com C. graminicola, para o qual os melhores resultados estavam nas concentrações acima de 10%, e de Phytophthora sp., em que a inibição ocorreu na concentração de 15%. Quando em presença da mistura dos extratos, os resultados obtidos mostraram que ocorreu inibição no crescimento micelial de C. graminicola, A. alternata e S. rolfsii na concentração de 50%, enquanto que para R. solani e Phytophthora sp. a inibição foi maior nas concentrações de 25% e 15%, respectivamente.

Tabela 10. Efeito dos extratos brutos das folhas de Lippia alba e de Rosmarinus officinalis, isoladamente ou em mistura, no crescimento micelial in vitro de fungos fitopatogênicos.

Planta medicinal

Concentração(1)

(%)

Inibição do crescimento micelial (%)(2)

C. graminicola

A. alternata

R. solani

S. rolfsii

Phytophthora

L. alba

1

20

0

20

0

0

5

75

0

28

0

12

10

85

0

35

8

12

15

85

8

35

8

98

20

85

5

35

10

42

25

85

5

35

12

42

50

88

10

55

55

22

R. officinalis

1

55

18

25

25

30

5

75

32

35

65

70

10

82

45

42

90

82

15

85

50

50

88

72

20

85

45

52

89

72

25

85

45

52

92

72

50

92

45

70

95

90

L. alba

+

R. officinalis

1

5

25

5

8

35

5

35

35

18

22

15

10

70

42

18

28

35

15

70

45

20

30

95

20

58

45

20

50

60

25

80

45

32

60

40

50

80

50

50

98

40

(1) Concentração: peso fresco/volume.

(2) Resultados obtidos após oito dias de avaliação.

Fonte: Gasparin et al. (2000).

Achillea millefolium e Artemisia absinthium

Rizzati et al. (2000) verificaram o efeito do extrato bruto aquoso de A. millefolium, mil-folhas, e de A. absinthium, losna, isolados ou em mistura, nas concentrações de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% e 50%, sobre o crescimento micelial in vitro dos fungos Alternaria sp. (isolado de folhas de cafeeiro), Alternaria alternata, A. steviae e A. solani. Na presença do extrato bruto de mil-folhas (Tabela 11), houve crescimento micelial de todos os isolados, sendo que A. solani apresentou crescimento igual ou superior à testemunha. O extrato bruto de losna não inibiu o crescimento micelial de Alternaria solani e de Alternaria sp. Em A. steviae, a maior inibição ocorreu na concentração de 50%. A. alternata apresentou uma redução no crescimento micelial em cerca de 20% em todas as concentrações testadas. Na mistura dos extratos, a inibição foi menor do que quando se utilizou os extratos separadamente, não havendo efeito inibitório no crescimento micelial de A. solani, enquanto que para os demais isolados a maior inibição foi em torno de 20% do crescimento micelial.

Tabela 11. Efeito dos extratos brutos das folhas de Achillea millefolium, mil-folhas, e de Artemisia absinthium, losna, isoladamente e em mistura, no crescimento micelial in vitro de Alternaria spp.

Planta medicinal

Concentração(1) (%)

Inibição do crescimento micelial (%)(2)

Alternaria sp.

A. alternata

A. steviae

A. millefolium

5

10

3,0

0

10

50

2,0

15

15

40

1,8

27

20

35

1,8

25

25

35

2,0

25

50

35

5,7

10

A. absinthium

5

0

25

4,5

10

0

25

2

15

0

25

8

20

0

20

5

25

0

18

15

50

0

20

18

A. millefolium

+

A. absinthium

5

5

2

0

10

5

3,5

0

15

12

15

15

20

8

3,5

2

25

20

8

0

50

20

20

18

(1) Concentração: peso fresco/volume.

(2) Resultados obtidos após oito dias de avaliação.

Fonte: Rizzati et al. (2000).

Outros exemplos

A seguir são apresentados exemplos em que várias plantas foram testadas conjuntamente.

Para controle de Pseudomonas syringae pv. lachrymans em pepino, Becker (2003) realizou ensaios preliminares in vitro, bem como tratamentos in vivo em área de cultivo orgânico e protegido. Foram testados os extratos aquosos das plantas medicinais alecrim (Rosmarinus officinalis), mil-folhas (Achillea millefolium), capim-limão (Cymbopogon citratus), carqueja (Baccharis trimera) e cavalinha (Equisetum sp.), os quais foram incorporados nas concentrações de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% e 30% em meio de cultura líquido e autoclavado. Os resultados podem ser observados na Tabela 12.

Tabela 12. Crescimento in vitro (x108 UFC mL-1) de P. syringae pv. lachrymans na presença de extratos brutos de plantas medicinais.

Planta medicinal

Concentração do EBA (%)(1)

5

10

15

20

25

30

Capim-limão

38,42 b(+)

20,84 b(+)

8,42 d(+)

0 e(–)

0 d(–)

0 d(–)

Mil-folhas

26,17 b(+)

64,48 a(+)

36,90 c(+)

55,29 c(+)

95,60 b(+)

105,76 b(+)

Alecrim

75,13 a(+)

76,02 a(+)

187,38 a(+)

251,85 a(+)

306,83 a(+)

285,45 a(+)

Cavalinha

26,41 b(+)

27,36 b(+)

29,39 c(+)

21,64 d(+)

23,25 c(+)

22,33 c(+)

Carqueja

__ (3)

15,24 b(+)

73,77 b(+)

162,52 b(+)

0 d(–)

0 d(–)

Testemunha(2)

1,53

Meio de cultura

49,00

C.V. (%)

14,85

(1) Concentração do extrato bruto aquoso das plantas medicinais em percentual.

(2) Testemunha: antibiótico Agrimicina (0,75 g mL-1).

(3) Não avaliado.

Médias na coluna seguidas de letras distintas indica diferença pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade; (+) e (-) indicam diferença significativa da testemunha com antibiótico, sendo superior ou inferior a esta, respectivamente.

Fonte: Becker (2003).

Stangarlin et al. (1999) realizaram trabalho com óleos essenciais obtidos de Baccharis trimera (carqueja), Ruta graveolens (arruda) e Ocimum basilicum (manjericão) envolvendo vários isolados de fungos fitopatogênicos. Houve 100% de inibição do crescimento micelial dos fungos testados em todas as alíquotas do óleo de manjericão. Em óleo de carqueja (Tabela 13), houve crescimento de todos os fungos até a alíquota de 100 µL e inibição de 100% para as demais alíquotas (500 µL e 1.000 µL). Em óleo de arruda, apenas A. alternata apresentou crescimento micelial até a alíquota de 40 µL (inibição de 74%), havendo inibição de 100% no crescimento nas demais alíquotas.

Tabela 13. Efeito in vitro do óleo essencial das plantas medicinais Baccharis trimera (carqueja) e Ruta graveolens (arruda) sobre o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Alternaria alternata e Phytophthora sp.

Planta medicinal

Alíquota (μL)

Inibição do crescimento micelial (%)(1)

R. solani

S. rolfsii

A. alternata

Phytophthora sp.

B. trimera

20

75

77

76

76

40

80

85

85

85

100

82

95

95

95

R. graveolens

20

100

100

45

100

40

100

100

74

100

(1) Avaliação realizada 3 dias após o início do experimento para R. solani e S. rolfsii, 4 dias após para Phytophthora sp. e 5 dias após para A. alternata. O valor de inibição é em relação ao diâmetro da colônia fúngica obtida no tratamento-controle.

Fonte: Stangarlin et al. (1999).

Röder (2003), com o objetivo de estudar um método alternativo, por meio do uso de diferentes produtos naturais, para o controle de Monilinia fructicola em pêssego e de Rhizopus nigricans em morango, em pós-colheita, utilizou os seguintes tratamentos: testemunha (sem controle), benomyl (60 g/100 mL água), biomassa cítrica e óleo de nim nas concentrações de 0,1%; 0,25% e 0,5% e extratos aquosos de alecrim (Rosmarinus officinalis) e arruda (Ruta graveolens) nas concentrações de 1%, 10% e 20%). Serão apresentados aqui apenas os dados do ensaio in vitro com M. fructicola (Tabela 14).

Tabela 14. Efeito de diferentes produtos naturais no crescimento micelial e na esporulação in vitro de Monilinia fructicola.

Tratamento

Ø da colônia
(cm)

Média de Ø colônia (cm)

Esporulação
(nº de conídios/
mL x 104)

Média de esporulação

Químico(1)

0,00

0,00 a(5)

0,00

0,00 b5

Testemunha(2)

9,00

9,00 d

0,83

0,83 a

Extrato de alecrim

1%

8,50

0,47

10%

9,00

7,91 d

0,67

0,38 a

20%

6,23

0,00

Extrato de arruda

1%

7,50

0,60

10%

3,83

4,83 c

0,83

0,53 a

20%

3,17

0,17

Ecolife(3)

0,1%

1,57

0,29

0,25%

0,57

0,71 a

0,17

0,15 b

0,50%

0,00

0,00

Nim(4)

0,1%

4,77

0,43

0,25%

2,98

3,48 b

0,53

0,51 a

0,50%

2,70

0,58

(1) Benomyl (60 g/100 L de água).

(2) Água destilada.

(3) Produto desenvolvido à base de biomassa cítrica, aditivado com ácidos orgânicos (produto comercial).

(4) Óleo concentrado de sementes de nim (produto comercial).

(5) Os tratamentos com letras maiúsculas iguais na coluna não diferem estatisticamente em 1% de probabilidade pelo teste de Tukey, quando se comparam as médias das concentrações dentro de cada tratamento.

Fonte: Röder (2003).

Tinturas de plantas medicinais

Mikania glomerata

Vigo-Schultz et al. (2006), com o objetivo de verificar o potencial de M. glomerata, guaco, no controle da podridão-negra em couve-flor causada por Xanthomonas campestris pv. campestris, utilizou tintura etanólica 50 oGL dessa planta medicinal nos seguintes ensaios: atividade antimicrobiana in vitro por meio do crescimento bacteriano em tubos de ensaio contendo 100 mg L-1, 250 mg L-1, 500 mg L-1 e 1.000 mg L-1 da tintura; indução de resistência local ou sistêmica em plantas de couve-flor com 25 dias de idade, cultivadas em vasos plásticos sob casa de vegetação, pela pulverização de tintura concomitantemente e 3 dias antes da inoculação com o patógeno (água e calda bordaleza foram utilizadas como controle); atividade de peroxidases em folhas tratadas e não tratadas de couve-flor com coletas concomitantemente, 24, 48 e 72 horas após pulverização da tintura nas plantas e também após pulverização-inoculação. Com relação aos ensaios in vitro (Figura 1), a tintura etanólica de guaco promoveu inibição no crescimento bacteriano a partir da concentração de 250 mg L-1. As concentrações de 500 mg L-1 e 1.000 mg L-1 inibiram em 24% e 38% o crescimento bacteriano em relação à testemunha.

Figura 1. Efeito da tintura etanólica de M. glomerata (guaco) sobre o crescimento in vitro de X. campestris pv. Campestris, expresso em unidades formadoras de colônia – UFC. Para o quadro inserido: testemunha = apenas meio de cultura; A 500 e A 1.000 = meio de cultura contendo 500 mg L-1 e 1.000 mg L-1 de etanol 50 ºGL, respectivamente. Letras maiúsculas distintas sobre as barras indicam diferença pelo teste de Tukey 5%.

Fonte: Vigo-Schultz et al. (2006).

Geranium caroliniarum

Ooshiro et al. (2004), com o objetivo de encontrar produtos naturais para o controle da bactéria Ralstonia solanacearum, testaram a tintura etanólica (70% de etanol) de tecidos frescos da parte aérea e de raízes de 14 plantas daninhas (Bidens pilosa, Artemisia campestris, Erechites hieracifolia, Geranium caroliniarum, Rumex japonicus, Alpinia speciosa, Alocasia odora, Plantago asiatica, Capsella bursa-pastoris, Solanum nigrum, Trifolium repens, Commelina communis, Anagalis arvensis e Oxalis corymbosa). Apenas a tintura de G. caroliniarum apresentou atividade antibacteriana. Os autores verificaram ainda que o composto antimicrobiano também podia ser extraído com água quente e que foi efetivo contra a bactéria mesmo em aplicações no solo. A incorporação no solo da parte aérea seca dessa planta em combinação com a solarização foi altamente efetiva para o controle da doença causada pela bactéria Ralstonia solanacearum em plantas de batata.

Hidrolatos de plantas medicinais

Atividade antifúngica

Stangarlin et al. (2005) realizaram trabalho com hidrolatos de citronela (Cymbopogon nardus), canela-de-veado (Helietta apiculata) e buva (Erigeron bonariensis) nas concentrações de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% e 25%, no controle de Alternaria brassicae. Os resultados indicaram que os hidrolatos de canela-de-veado e de buva, nas maiores concentrações, inibiram a germinação de esporos de A. brassicae (Tabela 15) e, sobretudo, o desenvolvimento dos tubos germinativos. Tal efeito se aproximou do obtido com o fungicida. O hidrolato de citronela não inibiu a germinação e promoveu sensível aumento no tamanho dos tubos germinativos. Somente o fungicida reduziu significativamente, em 19,4%, o crescimento micelial do fungo (Tabela 16). A esporulação foi afetada também pelos hidrolatos de canela-de-veado e buva, que promoveram redução de 21% e 18,5%, respectivamente.

Tabela 15. Porcentagem de inibição da germinação de esporos e do tamanho dos tubos germinativos de Alternaria brassicae em função do tratamento com diferentes concentrações, em porcentagem, dos hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), buva (Erigeron bonariensis) e citronela (Cymbopogon nardus), tendo como testemunhas água destilada e fungicida.

Tratamento

Inibição da germinação (%)

Inibição do crescimento dos tubos germináveis (%)

Canela

Buva

Citronela

Canela

Buva

Citronela

Hidrolato (%)

1

0

1

0

3,9

0

0

5

0,4

1,7

0

3,9

3,9

0

10

1,5

1,5

0

13,1

8,5

0

15

3,1

5,2

0

30,1

30,1

0

20

4,6

7,3

0

41,2

58,8

0

25

7,3

9,9

0

56,2

69,3

0

Fungicida(1)

11,2

73,8

Água

0

0

(1) Azoxystrobin (0,08 g i.a. L-1).

Fonte: Stangarlin et al. (2005).

Tabela 16. Porcentagem de inibição do crescimento micelial e da esporulação de Alternaria brassicae em função do tratamento com diferentes concentrações, em porcentagem, dos hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), buva (Erigeron bonariensis) e citronela (Cymbopogon nardus), tendo como testemunhas água destilada e fungicida.

Tratamento

Inibição do crescimento micelial (%)

Inibição da esporulação (%)

Canela

Buva

Citronela

Canela

Buva

Citronela

Hidrolato (%)

1

0

0

0

0

0

0

5

0

0

0

0

0

0

10

0

0

0

6,9

3

0

15

0

0

0

9,9

9

0

20

0

1,4

0

12

16,8

2,2

25

0

2,8

0

21

18,5

5,1

Fungicida(1)

19,4

84

Água

0

0

(1) Azoxystrobin (0,08 g i.a. L-1).

Fonte: Stangarlin et al. (2005).

Sornberger et al. (2004), trabalhando com hidrolatos de canela-de-veado, jaboriti e guabiju, verificaram que todos os hidrolatos, quando usados sem diluição, reduziram drasticamente a porcentagem de germinação (Figura 2), com maior efeito da canela-de-veado que a 25% promoveu redução e a 100% inibiu completamente a germinação. O tamanho dos tubos germinativos seguiu a mesma tendência (Figura 3), com maior efeito dos hidrolatos na redução do crescimento de 77,8, 91 e 100 para canela-de-veado; 38,9, 78,2 e 94,4 para jaboriti e 52,1, 82 e 94,4 para guabiju, respectivamente, e em concentrações de 25%, 50% e 100%. O tratamento com fungicida pouco afetou a porcentagem de germinação de esporos, porém promoveu redução de 82,5% no tamanho dos tubos germinativos em relação à testemunha água.

Figura 2. Porcentagem de germinação de esporos de Pseudocercospora vitis em função do tratamento com diferentes concentrações, em porcentagem, de hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), jaboriti (Myrtaceae) e guabiju (Myrcianthes pugens), tendo como testemunhas água destilada e o fungicida Azoxystrobin (100 mg i.a. L-1).

Fonte: Sornberger et al. (2004).

Figura 3. Tamanho dos tubos germinativos de esporos de Pseudocercospora vitis em função do tratamento com diferentes concentrações, em porcentagem, de hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), jaboriti (Myrtaceae) e guabiju (Myrcianthes pugens), tendo como testemunhas água destilada e o fungicida Azoxystrobin (100 mg i.a. L-1).

Fonte: Sornberger et al. (2004).

Pazuch et al. (2005), estudando a atividade do hidrolato de carqueja sobre a germinação de esporos dos fungos fitopatogênicos Pseudocercospora vitis e Cercospora kaki, observaram que os dois fungos apresentaram comportamento semelhante, sendo que apenas o tratamento com fungicida reduziu a porcentagem de germinação (Figura 4). Esses resultados mostram que compostos antifúngicos a esses patógenos são inexistentes ou presentes em baixas concentrações no hidrolato de carqueja.

Figura 4. Porcentagem de germinação de esporos de Pseudocercospora vitis e Cercospora kaki em função do tratamento com diferentes concentrações do hidrolato de carqueja (em porcentagem), tendo como testemunhas água destilada e o fungicida (Fug) Azoxystrobin (0,08 g i.a. L-1).

Fonte: Pazuch et al. (2005).

Esses resultados são melhor compreendidos na Figura 5, que relaciona a concentração de hidrolato com o tamanho dos tubos germinativos. Observa-se que o fungicida também inibiu o desenvolvimento dos tubos germinativos para ambos os fungos, porém, ao contrário do esperado, a adição do hidrolato de carqueja não inibiu, mas estimulou o crescimento dos mesmos. Compostos antifúngicos podem até estar presentes no hidrolato de carqueja, porém em concentrações muito baixas. O aumento no tamanho dos tubos germinativos provavelmente deve-se a outras substâncias presentes no hidrolato que podem ser utilizadas como nutrientes por tais fungos, porémessa característica depende da espécie da planta da qual é extraído o hidrolato, uma vez que Sornberger et al. (2004) e Lozano et al. (2000) relatam maior atividade antifúngica para alguns hidrolatos e menor ou inexistente atividade para outros. Stangarlin et al. (1999), trabalhando com óleo essencial e extrato bruto de carqueja, obtiveram inibição de 100% do crescimento micelial de vários fungos fitopatogênicos em placas de Petri contendo 500 µL e 1.000 µL de óleo, porém apenas inibição parcial na presença do extrato bruto. Isso indica que, possivelmente, compostos antifúngicos de carqueja tendem a se concentrar no óleo essencial e poucos estarão presentes no hidrolato.

Figura 5. Tamanho dos tubos germinativos de esporos de Pseudocercospora vitis e Cercospora kaki em função do tratamento com diferentes concentrações do hidrolato de carqueja (em porcentagem), tendo como testemunhas água destilada e o fungicida (Fug) Azoxystrobin (0,08 g i.a. L-1).

Fonte: Pazuch et al. (2005).

Atividade antibacteriana

A atividade antibacteriana de diferentes hidrolatos foi estudada por Pazuch et al. (2005). Os resultados obtidos mostram que os três hidrolatos testados foram capazes de inibir o crescimento da bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Tabela 17), porém maior atividade foi apresentada pelo hidrolato de citronela que, na concentração de 25%, reduziu em quase 30% o crescimento da bactéria. Assim, embora Stangarlin et al. (2005) tenham obtido baixa atividade antifúngica para o hidrolato de citronela, este pode ser importante por seu efeito antibacteriano.

Tabela 17. Porcentagem de inibição do crescimento da bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris em função do tratamento, em porcentagem, com hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), buva (Erigeron bonariensis) e citronela (Cymbopogon nardus), tendo como testemunhas o meio caldo nutriente e antibiótico.

Tratamento

Inibição do crescimento bacteriano (%)

Canela-de-veado

Buva

Citronela

Hidrolato (%)

1

0

4,6

5,6

5

0,5

4,8

9,7

10

0,6

6,5

15,2

15

8,8

6,6

16,6

20

11,6

9,7

16,4

25

14,9

14,6

29,8

Caldo nutriente

0

97,7

Antibiótico(1)

(1) Oxitetraciclina (0,03 g i.a. L-1).

Fonte: Pazuch et al. (2005).

Os resultados da atividade antibacteriana obtidos por Pazuch et al. (2005) são apresentados na Figura 6. Observa-se que houve a tendência de inibição do crescimento bacteriano com o aumento da concentração do hidrolato, porém grande inibição ocorreu apenas a partir da concentração de 75%. Esses resultados evidenciam a presença de compostos antibacterianos no hidrolato de carqueja, embora seu efeito tenha sido inferior ao da oxitetraciclina. Avancini et al. (2000), estudando o efeito antimicrobiano do decocto da planta da carqueja, atribuíram o mesmo efeito bactericida sobre algumas bactérias, porém apenas em concentrações próximas a 100%.

Figura 6. Crescimento da bactéria Xanthomonas campestris pv. passiflorae e Bacillus subtilis em função do tratamento com diferentes concentrações do hidrolato de carqueja (em porcentagem), tendo como testemunhas o meio caldo nutriente (CN) e oxitetraciclina (Ox) (0,03 g i.a. L-1).

Fonte: Pazuch et al. (2005).

Óleos essenciais

Alguns exemplos do uso de óleos essenciais para controle in vitro de fungos e bactérias já foram apresentados conjuntamente com aqueles com os extratos de plantas medicinais. A seguir são apresentados outros exemplos.

Atividade antimicrobiana

Velluti et al. (2004) realizaram trabalho in vitro para verificar o potencial de 37 óleos essenciais em inibir o crescimento micelial de Fusarium verticillioides, F. proliferatum e F. graminearum, isolados de grãos de milho, visando encontrar produtos que possam ser utilizados na preservação de grãos estocados. Esses trabalhos foram realizados em combinação com diferentes condições de atividade de água (de 0,95 a 0,995) e temperatura (de 20 oC a 30 oC). Óleo de folhas de cinamomo, capim-limão, Eugenia sp., orégano e palmarosa, em concentrações de 500 µg mL-1 a 1.000 µg mL-1, proporcionou inibição das 3 espécies de fungos, independentemente das condições de temperatura e atividade de água.

Ranasinghe et al. (2002) estudaram o efeito fungitóxico de óleo essencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) e de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum) no controle de Colletotrichum musae, agente causal da antracnose, e de Lasiodiplodia theobromae, e de C. musae e Fusarium proliferatum, agentes causais da podridão-da-coroa, fitopatógenos de pós-colheita em banana. Para isso, alíquotas de uma solução estoque a 50% – óleo essencial: etanol – foram adicionadas ao meio de cultura líquido SMKY. Discos de micélio de cada um dos isolados foram repicados para erlenmeyers permanecendo incubados por 7 dias. Após esse período, o micélio foi recolhido por filtração, obtendo-se a massa seca e calculado a porcentagem de inibição do crescimento micelial. A concentração mínima letal (CML) foi determinada transferindo-se discos de micélio de cada um dos isolados para meio BDA. Os resultados obtidos indicam efeito fungitóxico e fungistático sobre os fitopatógenos testados (Tabela 18).

Tabela 18. Concentração mínima inibitória (CMI) e concentração mínima letal (CML) de óleos essenciais contra fitopatógenos causadores de antracnose e podridão-da-coroa em banana.

Óleo testado (v/v)

Fitopatógeno

CMI (%)

CML (%)

Cravo-da-índia

Colletotrichum musae

0,04

0,065

Lasiodiplodia theobromae

0,045

0,06

Fusarium proliferatum

0,05

0,1

Casca de canela

C. musae

0,03

0,04

L. theobromae

0,035

0,045

F. proliferatum

0,05

0,08

Folha de canela

C. musae

0,05

0,07

L. theobromae

0,06

0,08

F. proliferatum

0,05

0,11

Benomyl

C. musae

0,7

0,9

L. theobromae

0,9

1,0

F. proliferatum

1,0

1,2

Fonte: Ranasinghe et al. (2002).

Trabalho semelhante foi realizado por Caccioni et al. (1998) para verificar o efeito de componentes voláteis dos óleos essenciais obtidos de várias espécies de citros (Citrus sinensis, C. aurantium, C. paradisi, C. sinensis x Poncirus trifoliata e C. limon) no controle de Penicillium digitatum e P. italicum. Monoterpenos, outros que não o limoneno, e sesquiterpenos foram os principais responsáveis pela inibição do crescimento dos fungos. Os ensaios foram realizados com concentrações dos óleos variando de 250 mg L-1 a 5.000 mg L-1 (ppm). Os valores de ED50, ou seja, concentração para inibir em 50% o crescimento micelial, foram de forma geral maiores para P. italicum, com valores em torno de 3.500 ppm, em relação a P. digitatum, com valores em torno de 1.500 ppm.

Outros exemplos com óleos essenciais podem ainda ser encontrados principalmente em trabalhos nas áreas de alimentos e saúde, como em Mishra e Dubey (1994) contra fungos em alimentos armazenados; Chao et al. (2000) contra fungos, bactérias e vírus; Demirci et al. (2001) contra bactérias como Escherichia coli, Staphyloccocus e Salmonella; Prashar et al. (2003) com o óleo de Cymbopogon martinii contra Saccharomyces cerevisiae; Benkeblia (2004) com óleos de três tipos de cebola (verde, amarela e vermelha) e de alho contra Salmonella sp., Staphyloccocus aureus, Aspergillus niger, Penicillium cyclopium e Fusarium oxysporum; Setzer et al. (2004) com o óleo de Artemisia douglasiana contra Bacillus cereus, S. Aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e A. niger; Sokmen et al. (2004) com óleo de Thymus spathulifolius contra 40 microrganismos incluindo fungos e bactérias; e Yu et al. (2004) com óleo de Scutellaria barbata contra S. aureus.

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Capítulo 8
Princípios de vírus em plantas

Fernando Javier Sanhueza Salas

Alexandre Levi Rodrigues Chaves

Marcos César Gonçalves

Marcelo Eiras

Maria Mércia Barradas

Introdução

A virologia teve início em 1882, quando Adolf Mayer, professor de Botânica da Universidade de Heidelberg, Alemanha, descreveu uma doença em fumo, caracterizada por mosaico nas folhas. O sintoma podia ser transmitido para plantas sadias por atrito com a seiva da planta doente. Esse sintoma foi observado também por Dimitri Iwanowski, um botânico russo, em plantações de fumo na Ucrânia e na Bessarábia. Iwanowski demonstrou, em 1892, que o princípio causador da doença permanecia ativo mesmo após passar por um filtro que retinha bactérias e o designou como entidade produtora de toxina. Martinus W. Beijerinck, microbiologista holandês, discípulo de Mayer, repetiu os trabalhos de Iwanowski e demonstrou que o agente causador do mosaico multiplicava-se nos tecidos vegetais e, portanto, não poderia ser uma toxina. Beijerinck, em 1898, empregou a expressão contagium vivum fluidum para denominar o agente.

A palavra vírus, de origem latina, significa veneno. Por volta de 1890, o termo era empregado para designar vários agentes infecciosos, incluindo bactérias e outros microrganismos ainda não identificados. Quando se observou que alguns agentes causadores de doenças podiam atravessar filtros apropriados para reter bactérias, eles foram denominados vírus filtráveis. Tal denominação foi também empregada para agentes de doenças em animais, por exemplo, febre aftosa, raiva e varíola. Gradualmente, nas primeiras décadas do século 20, o termo vírus passou a ser empregado para um grupo distinto de agentes patogênicos submicroscópicos. Em 1921, já se considerava o agente causador do mosaico-do-fumo um vírus. Muitos bioquímicos começaram a tentar purificar e cristalizar tal agente, que passou a ser denominado de vírus-do-mosaico-do-fumo (tobacco mosaic virus, TMV). Em 1935, o americano Wendell Meredith Stanley conseguiu isolar e cristalizar a proteína do TMV. No ano seguinte, os pesquisadores ingleses Bawden e Pirie demonstraram que uma preparação purificada de TMV continha ácido nucleico, além de proteína. No final da década de 1930, já havia diversos trabalhos publicados em que se demonstrava que vírus de plantas eram constituídos de nucleoproteínas. Métodos físicos, acessíveis nessa época, indicavam morfologia alongada para o TMV e esférica para outros vírus, porém somente com o advento da microscopia eletrônica de transmissão, no final da década de 1940, os cientistas puderam finalmente observar a morfologia das diferentes partículas virais.

Como a partícula do TMV possui apenas 5% de ácido ribonucleico (RNA), considerava-se que tal componente era menos importante. Todavia, em 1956, experimentos conduzidos independentemente em Tübingen (Gierer e Schramm) e na Califórnia (Fraenkel-Conrat) evidenciaram que o RNA isolado do TMV podia causar infecção. Tais resultados, complementados por outros obtidos com vírus de bactérias (bacteriófagos), mostrando que apenas o ácido nucleico penetrava nas bactérias, chamaram atenção para o real significado dos ácidos nucleicos dos vírus. Hoje, admite-se que os experimentos relacionados ao TMV constituíram a base não somente para o início da virologia de plantas e de animais, mas também para as pesquisas fundamentais nas áreas de biologia molecular e genética (HULL, 2002).

O que são vírus?

Os vírus podem ser definidos como partículas submicroscópicas, com tamanho que varia de 20 nm a 3.000 nm, constituídas de um único tipo de ácido nucleico (RNA, ácido ribonucleico ou DNA, ácido desoxirribonucleico), envolto por subunidades proteicas idênticas (capa proteica, CP); alguns vírus apresentam envoltório lipídico proveniente das membranas da própria célula. São denominados de parasitas obrigatórios por replicarem-se exclusivamente em células vivas utilizando a maquinaria celular para a sua transcrição, tradução, montagem, movimento e em alguns casos para a transmissão por vetores. Apresentam diferentes morfologias, como isométrica (membros da família Bromoviridae), alongada e flexuosa (família Potyviridae), alongada e rígida (gênero Tobamovirus), e de morfologia complexa (Bunyaviridae e Rhabdoviridae).

Taxonomia

A moderna taxonomia agrupa os vírus em diferentes famílias (terminação viridae), gêneros (terminação virus), espécies e isolados. A classificação é formalizada pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), que é subdividido em subcomitês que reúnem os principais pesquisadores especialistas em cada grupo de vírus. Os aspectos relativos à morfologia das partículas, composição e organização genômica, comportamento biológico como círculo de hospedeiros, tipos de transmissão na natureza, entre outros, são utilizados na classificação. Os vírus de plantas apresentam partículas com morfologia variada e podem ser constituídos de RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita simples (ssDNA) ou DNA de fita dupla (dsDNA). Os ácidos nucleicos dos vírus podem ser de polaridade positiva (+), sendo diretamente traduzidos pela maquinaria celular, ou de polaridade negativa (-), que necessitam ser previamente transcritos para depois serem traduzidos (REGENMORTEL et al., 2000).

Sintomas

Os vírus podem induzir alterações ou anormalidades visíveis nas plantas. São os chamados sintomas da doença. Quando há replicação de partículas virais, porém nenhum sintoma pode ser observado, a infecção é denominada latente. A expressão dos sintomas depende de vários fatores, entre eles: isolado do vírus; tipo e variedade da espécie hospedeira; idade e estágio de desenvolvimento e fisiologia da planta hospedeira; duração da infecção; presença de outros vírus ou de outros patógenos; condições do ambiente. Um mesmo vírus pode infectar diferentes plantas, produzindo sintomas específicos em cada uma. O sintoma, portanto, é um reflexo da resposta da hospedeira à infecção. Os vírus são transportados célula a célula e atingem o floema, de onde são transportados para todos os tecidos da planta, ocasionando uma infecção denominada sistêmica; mesmo assim, regiões meristemáticas de caules e raízes podem permanecer livres de vírus. Há casos em que os vírus ficam limitados a poucas células, circundadas ao ponto de entrada na planta, produzindo uma infecção local, que normalmente está relacionada com uma reação de hipersensibilidade.

Os sintomas podem ser externos e internos. Os sintomas externos, na maioria das vezes, são facilmente observados, pois consistem de alterações na forma e na coloração de folhas, flores, caules, frutos e raízes, além de anormalidades no crescimento. Sintomas internos também são produzidos frequentemente, mas só podem ser observados por microscopia de luz ou eletrônica. Os principais sintomas externos descritos nas folhas são: mosaico, mosqueado, amarelecimento, manchas anelares, faixas-das-nervuras, clareamento e necrose de nervuras, manchas cloróticas e/ou necróticas, pontos cloróticos e/ou necróticos. Dos sintomas gerais, normalmente associados a infecções virais, podem ser destacados o mosaico nas folhas e a redução de crescimento das plantas (nanismo). Alguns sintomas externos causados por vírus podem ser observados na Figura 1. É importante assinalar que os sintomas mencionados nem sempre são provocados por vírus. Deficiência mineral e senescência podem causar amarelecimento foliar, e outros patógenos como fitoplasmas também podem induzir nanismo e amarelecimento.

Figura 1. Sintomas induzidos por diferentes vírus em plantas hospedeiras: A) Sida sp. infectada naturalmente por Begomovirus, apresentando sintomas de mosaico-dourado; B) Chenopodium amaranticolor com sintomas de pontos cloróticos causados pelo Turnip mosaic virus (TuMV); C) Nicotiana tabacum (fumo) inoculada com Potato virus Y (PVY), apresentando sintoma de mosaico; D) Cana-de-açúcar infectada com o Sugarcane mosaic virus (SCMV) apresentando mosaico nas folhas; E) Sonchus asper com sintomas de mosaico e clareamento de nervuras induzidos pelo Lettuce mosaic virus (LMV); F) Folha de Armoracia rusticana (raiz-forte) com anéis cloróticos induzidos pelo TuMV; G) Folha de Lactuca sativa (alface) apresentando espessamento das nervuras induzido pela coinfecção do Lettuce big-vein associated virus (LBVaV) e Mirafiori lettuce virus (MiLV).

Fotos: Fernando Javier Sanhueza Salas

Os sintomas internos são alterações ultraestruturais induzidas pela presença do vírus na célula. Podem ser observados corpos de inclusão, cristais, anormalidades nas organelas, como mal formação dos cloroplastos, formação de vesículas, etc. Vale lembrar que até mesmo alguns sintomas internos, como corpos de inclusão e presença de cristais, não são efeitos exclusivos dos vírus, pois algumas plantas os possuem, normalmente.

Transmissão de vírus de plantas

Como os vírus são parasitas obrigatórios e frequentemente levam as hospedeiras à morte, a permanência de tais agentes na natureza depende da sua disseminação de planta a planta e da sua introdução em células vivas. Os organismos que, pelo seu processo natural de alimentação, estão envolvidos no transporte de vírus de uma planta doente para uma sadia são chamados de vetores. A transmissão por vetores envolve interações biológicas específicas e não aleatórias entre planta, vírus e vetor. As principais formas de transmissão dos fitovírus são listadas e comentadas a seguir.

Transmissão mecânica

A transmissão mecânica por contato pode se dar no caso de plantas com infecção sistêmica, quando o vírus invade a maioria dos tecidos e está presente nas células epidérmicas, inclusive nos pelos de folhas e caules. Com o atrito produzido pelo vento, por exemplo, pêlos e células, normalmente epidérmicas, podem se romper, e, dessa forma, partículas virais entram em contato com células também injuriadas de plantas sadias, ocorrendo a transmissão. Um grande número de partículas virais necessita ser transferido para que a infecção possa acontecer, mas há evidências de que tal forma de transmissão é responsável pela intensificação de determinadas doenças virais em culturas, assim como ocorre na cultura de tomate com o vírus-do-mosaico-do-fumo (TMV), ou em batata com a disseminação do PVS por meio de contato entre plantas infectadas e sadias (FRANC; BANTTARI, 1996).

A transmissão mecânica eventual também pode ocorrer por meio de animais que podem carregar partículas virais na sua pelagem ou penas e levá-las para plantas sadias, quando invadem culturas; o processo é semelhante ao descrito acima. Alguns insetos – besouros e gafanhotos – também podem transmitir vírus mecanicamente. A transmissão mecânica pelo homem está relacionada aos tratos culturais, pois alguns vírus, TMV e PVX – Potato virus X, por exemplo, mantêm sua infectividade quando as partículas são retidas nas roupas e nos instrumentos agrícolas (BROADBENT; FLETCHER, 1963).

Em laboratórios de fitovirologia, a transmissão mecânica é empregada experimentalmente como um dos primeiros passos para se estabelecer a etiologia da doença. Extratos preparados a partir de plantas com suspeita de infecção viral,folhas, preferencialmente, são friccionados sobre folhas de plantas-teste. A fim de facilitar a entrada das partículas virais nas células, pode-se adicionar ao inóculo um abrasivo, por exemplo, carborundum. A inoculação pode ser feita diretamente com o dedo ou utilizando um chumaço de gaze ou pincel. O resultado da inoculação mecânica depende de fatores como: (i) a concentração e estabilidade do vírus no inóculo; (ii) tipo, idade e condições fisiológicas da hospedeira; e (iii) condições ambientais pré e pós-inoculação.

Transmissão por órgãos de propagação vegetativa

Em plantas que se reproduzem por órgãos de propagação vegetativa, como tubérculos, bulbos, rizomas, colmos e estolões, muitos vírus que causam infecções sistêmicas podem ser transmitidos. É o caso clássico das tulipas variegadas, quando infectadas por espécies do gênero Potyvirus. Como as tulipas se reproduzem por bulbos, a doença se perpetua, e, neste caso particular, como o sintoma causado pela infecção viral tornava as flores mais bonitas, havia maior procura por plantas infectadas, com consequente valorização do produto. Porém isso é uma exceção à regra, pois, na agricultura mundial, os exemplos são de danos causados pela infecção viral em virtude da propagação vegetativa de material infectado. Podem-se citar as culturas do morango, da banana, do alho, da cana-de-açúcar, da batatinha, etc. No caso específico da batata (Solanum tuberosum), os cultivos sucessivos de tubérculos provenientes de batata-semente, associados à constante presença de afídeos vetores, resultam no acúmulo de vírus causando a degenerescência e consequente quebra de produção (DANIELS et al., 2002).

Transmissão por enxertia e por Cuscuta

A enxertia é um processo bastante utilizado na agricultura, porém tem sido uma via importante na transmissão de vírus e consequente disseminação de doenças virais, principalmente em frutíferas (macieira, pessegueiro, videira, citros) e ornamentais (roseira). A transmissão se dá pela união dos tecidos do enxerto com a parte da planta que recebe o enxerto (cavalo), sendo que qualquer uma das partes que estiver infectada servirá como fonte de vírus. Em laboratórios de fitovirologia, costuma-se utilizar a enxertia para a transmissão de vírus que apresentam dificuldades de transmissão mecânica, como alguns membros da família Geminiviridae.

A transmissão por Cuscuta, conhecida vulgarmente como cipó-chumbo, e em inglês dodder, considerada um tipo de transmissão por enxertia, ocorre na natureza e é também utilizada experimentalmente. Essa planta parasita funciona como uma ponte, ligando o sistema vascular de duas plantas de mesma espécie ou de espécies diferentes. Se houver infecção sistêmica em uma das plantas, o vírus poderá ser transmitido para a outra (BOS, 1978).

Transmissão por sementes e pólen

Embora diversos vírus sejam transmitidos por sementes, a porcentagem de transmissão geralmente é baixa. É necessário que o patógeno seja capaz de invadir o embrião para que a plântula resultante apresente infecção; nem sempre isso ocorre, pois depende, entre outros fatores, do vírus, da planta, das condições fisiológicas da hospedeira no momento da infecção, da presença de substâncias inibidoras do vírus na semente. Há alguns exemplos de vírus transmitidos por sementes, como o Lettuce mosaic virus (LMV) em alface, o Bean yellow mosaic virus (BYMV) em ervilha (10%–30%) e o CMV em caupi (4%–28%). Vale a pena ressaltar que o LMV em alface, com taxa de infecção de sementes acima de 0,1%, pode acometer até 100% da produção no campo por causa da ação de diferentes espécies de afídeos envolvidos na transmissão (GROGAN, 1980). Alguns vírus que apresentam elevada estabilidade, como o TMV, podem se aderir à superfície externa das sementes e, portanto, serem transmitidos quando da germinação destas (HULL, 2002).

Quanto à transmissão por pólen, há poucos casos relatados. Pode-se citar o exemplo de espécies de Ilarvirus transmitidos por tripes (HULL, 2002).

Transmissão por vetores

Os principais vetores dos fitovírus são, pela ordem, artrópodes, nematoides e fungos. Artrópodes (insetos e ácaros) transmitem vírus na parte aérea das plantas; nematoides e fungos, na parte subterrânea – larvas de alguns besouros vetores, que se alimentam de raízes, podem também ser responsáveis pela disseminação de vírus. Os insetos constituem o maior e o mais importante grupo de vetores. Alguns insetos transmitem vírus ao transportar partículas virais aderidas à superfície externa do corpo (transmissão mecânica eventual, já referida). O real papel dos vetores na disseminação dos vírus envolve complexas inter-relações planta-vírus-vetor (NAULT, 1997). As ordens Homoptera, Thysanoptera e Coleoptera são as mais importantes. Em Homoptera, encontra-se um grande número de vetores de vírus dentro das famílias: Aphididae (afídeos ou pulgões), Aleyroididae (moscas brancas) e Cicadellidae (cigarrinhas). Na ordem Thysanoptera, destacam-se os tripes; e na Coleoptera, os besouros (COSTA, 1998).

Todos os insetos vetores são fitófagos, sendo na sua maioria do tipo sugador. Adquirem as partículas virais quando sugam a seiva, ou o conteúdo celular, das plantas infectadas e transmitem os vírus ao se alimentarem em outras plantas. Os coleópteros, entretanto, são mastigadores e regurgitam as partículas virais na superfície foliar. Os tripes, por sua vez, têm hábito alimentar do tipo raspador-sugador.

Costa (1998) deixa evidente a importância dos afídeos, que constituem o grupo mais numeroso de vetores, principalmente as espécies dos gêneros Myzus e Aphis. Com relação a vetores não afídeos, podem ser citados o ácaro Brevipalpus phoenicis, vetor do vírus da leprose dos citros; a mosca branca, vetor de geminivírus; espécies de cigarrinhas (Dalbulus spp.) e coleópteros, principalmente os crisomelídeos Cerotoma arcuata e Diabrotica speciosa. Nos últimos anos, outras espécies de coleópteros, como Epitrix fallada e Epicauta atomaria, tem sido descritas como vetores experimentais de fitovírus (ALEXANDRE et al., 2000; BARRADAS, 1994; SALAS; BARRADAS, 1990).

Os nematoides vetores estão incluídos nas famílias Longidoridae (gêneros Longidorus, Paralongidorus e Xiphinema) e Trichodoridae (Trichodorus e Paratrichodorus). Os 3 primeiros gêneros transmitem vírus de partículas isométricas, com aproximadamente 28 nm de diâmetro, e genoma constituído de 2 moléculas de RNA. Tais vírus, que já foram previamente denominados nepovírus, atualmente pertencem à família Comoviridae. Um exemplo é o Tobacco ringspot virus (TRSV), transmitido por diferentes espécies de Xiphinema. Os nematoides da família Trichodoridae transmitem espécies do gênero Tobravirus (COSTA, 1999).

Nault (1997) divide os tipos de transmissão, interação vírus-vetor, em três formas distintas: (i) vírus carregados no estomodeu (primeira porção do trato digestivo dos insetos), que são subdivididos em transmissão não persistente (Carlavirus e Potyvirus) e semipersistente (Caulimovirus e Closterovirus); (ii) vírus circulativos (Luteovirus e Closterovirus); e (iii) vírus propagativos (Cytorhabdovirus e Nucleorhabdovirus). Estes dois últimos têm a característica de persistência no vetor em razão de diversas interações com o inseto, sendo de grande importância agronômica e epidemiológica, pois conseguem levar os vírus a longas distâncias.

Epidemiologia de vírus de plantas

A epidemiologia pode ser definida como a dinâmica da doença entre as populações de hospedeiros. Os estudos e análises da epidemiologia dos vírus em plantas seguem, de uma maneira geral, seis etapas: (i) definir os problemas em termos quantitativos, avaliando possíveis valores de produção e os obtidos no momento; (ii) quantificar a condição e a taxa de infecção da doença, variáveis no pato-sistema, para determinar o efeito da hospedeira, patógeno e a população do vetor na taxa de disseminação do patógeno; (iii) identificar as mais efetivas estratégias reais de controle; (iv) avaliar o desenvolvimento e quantificar o impacto das táticas de manejo específico ou integrado na dinâmica da doença de acordo com as estratégias propostas para o controle; (v) integrar as táticas de manejo e reavaliar os impactos epidemiológicos na dinâmica do pato-sistema; (vi) avaliar os riscos econômicos e ambientais para implementar os programas de manejo integrado (NUTTER JUNIOR, 1999).

Dispersão

Entre os fatores que influenciam os processos de dispersão, o padrão e a própria extensão da infecção viral, podem-se citar a origem da fonte de inóculo, localizado externa ou internamente à cultura, e o potencial de inóculo disponível. A natureza e os hábitos do vetor também são fatores importantes na disseminação dos fitovírus. Moreno et al. (2004) observaram que em cultivos de alface, na região central da Espanha, as espécies de afídeos que colonizavam a cultura não eram as responsáveis pelas epidemias de LMV. Outras espécies de afídeos migratórios além das plantas hospedeiras da vegetação espontânea, reservatórios naturais de vírus, respondiam pela epidemia.

Vale mencionar que o tipo de associação com o inseto vetor também é importante na dispersão da doença. Vírus propagativos, por exemplo, os membros do gênero Tospovirus, têm a característica de persistência no vetor, sendo de grande importância epidemiológica, pois os tripes, isto é, insetos vetores dos tospovírus, retêm as partículas dos vírus por mais tempo sem perder a capacidade de inoculação (NAULT, 1997). A fase em que os insetos colonizam e são mais ativos, em relação ao estádio fenológico da planta, e as condições climáticas também influenciam na dispersão. Alguns atributos de um bom vetor de vírus são: mobilidade (alcançar longas distâncias); comportamento alimentar (não danificar as células das hospedeiras); polifagia (alimentar-se de diversas hospedeiras); e ser estrategista, que significa possuir uma alta taxa de reprodução, alta fecundidade, ciclo curto, serem colonizadores e multivoltinos (possuir diversas populações em um curto espaço de tempo).

Plantas da vegetação espontânea e sua importância epidemiológica

Inúmeros fitovírus se perpetuam em plantas da vegetação espontânea, que servem de reservatório para doenças de etiologia viral em culturas de importância econômica. Tresh (1980) caracterizou três focos iniciais de infecção: (i) a dispersão ocorre a partir de plantas infectadas situadas no interior da cultura; (ii) as plantas infectadas situam-se em regiões adjacentes à cultura; (iii) as plantas-fonte encontram-se em áreas distantes ou remotas à cultura. O total e a área de dispersão de um foco de infecção resultam no gradiente desta infecção. O maior ou menor gradiente de infecção sempre está associado ao tipo de inseto vetor, à mobilidade e abundância de seus insetos vetores e ao tipo de associação vírus-vetor (vírus carregados no estomodeu, vírus circulativos ou vírus propagativos). Um gradiente baixo de infecção resulta de áreas de dispersão que se encontram a grandes distâncias e vetores com pouca mobilidade (NAULT, 1997; WALKEY, 1985).

Segundo Chaves et al. (2003), plantas da vegetação espontânea caracterizam-se por seu desenvolvimento em lugares inóspitos, o que favorece a perpetuação dentro da cultura ou em regiões próximas às áreas de cultivo comercial, desempenhando um importante papel na epidemiologia dos fitovírus.

Há poucos trabalhos envolvendo o estudo de plantas da vegetação espontânea e sua relação com a epidemiologia de fitovírus. Recentemente, a espécie Erigeron bonariensis (Asteracea da vegetação espontânea) foi descrita como hospedeira do LMV, no Brasil. Essa planta encontra-se amplamente disseminada nas regiões Sul e Sudeste e pertence à mesma família botânica da alface, atuando como reservatório natural do LMV no campo e servindo de fonte de inóculo do vírus para outras culturas de asteráceas (CHAVES et al., 2003). Em um trabalho de epidemiologia molecular, realizado para a caracterização de isolados de CMV, no Brasil, Eiras et al. (2004) encontraram elevada similaridade entre as sequências da capa proteica de isolados de CMV de bananeira e de Commelina sp., uma espécie de planta da vegetação espontânea frequentemente associada aos cultivos de bananeira no Vale do Ribeira, SP. Esse resultado confirmou que essa espécie atua como reservatório de vírus em condições naturais e serve como fonte de inóculo do CMV.

Dispersão de focos de infecção remotos

Este tipo de disseminação é realizado por insetos vetores que possuem uma alta capacidade de vôo (mobilidade) e hábito migratório, como pulgões, moscas-brancas e cigarrinhas. A associação biológica com os fitovírus envolvidos é muito importante, principamente quando se trata de transmissão propagativa. Outra possibilidade para esse tipo de disseminação pode ser decorrente da introdução de material contaminado, sementes ou órgãos de propagação vegetativa.

O comportamento de alguns vetores pode definir a distância e a intensidade da infecção, onde se relacionam distâncias e alturas dos principais grupos de insetos-vetores. Os afídeos respondem a diferentes comprimentos de onda, dependendo do seu estágio de desenvolvimento, o grau de densidade da população, a adequação da planta hospedeira e outras condições do meio, tais como a temperatura e a velocidade do vento. Quando isso ocorre e outras condições são favoráveis (vento, umidade, precipitação e temperatura), os afídeos entram em fase migratória. Nessa fase, os pulgões são atraídos pelos comprimentos de onda longos, característicos do solo e das plantas (CHAPMAN et al., 1981; GIBSON; RICE, 1989).

Dispersão a partir de fontes de infecção de culturas adjacentes

A disseminação e a distribuição dos fitovírus em uma região ou dentro de um cultivo determinado estão intrinsecamente relacionadas com o comportamento populacional do vetor e com seu movimento, seja este individual ou coletivo. No caso de dispersão de vírus por tripes, observa-se que o deslocamento dos indivíduos adultos a longas distâncias só é possível de forma passiva, pois esses insetos são transportados juntamente com o material vegetal. No entanto, quando a dispersão se dá dentro da cultura, os voos costumam ser curtos e ativos, ocorrendo em períodos menores e em distâncias que variam de 6 m a 50 m (PLASENCIA; SÁNCHEZ, 1999), como pode ser observado na Figura 2.

Figura 2. Campo de produção de escarola (Cichorium endivia) em Igaratá, SP, com infecção causada pelo Tomato chlorotic spot virus – TCSV, Tospovirus. Nota-se, à esquerda, dispersão inicial; e, à direita, dispersão com a distribuição uniforme das plantas infectadas, característica da transmissão por tripes.

Fotos: Fernando Javier Sanhueza Salas

Técnicas imunológicas utilizadas na detecção de fitovírus

O diagnóstico de vírus de plantas tem sido, ao longo dos anos, incrementado com a utilização de técnicas mais sensíveis e seguras. Dentre essas técnicas, destacam-se as sorológicas, baseadas nos processos imunológicos, principalmente pela sua versatilidade e baixo custo.

Os métodos imunológicos baseiam-se na reação específica entre um antígeno e um anticorpo. O anticorpo é uma imunoglobulina produzida por animais de sangue quente em resposta a substâncias estranhas, denominadas de antígenos. O sangue de animais imunizados com um determinado antígeno conterá anticorpos que reagirão especificamente com sítios presentes na estrututa do antígeno, denominados determinantes antigênicos. De forma exemplificada, a produção de anticorpos específicos destinados à detecção sorológica de fitovírus é feita a partir da imunização, por meio de injeções intramusculares ou subcutâneas do vírus purificado, principalmente em coelhos, ratos e galinhas (REGENMORTEL, 1982).

Testes sorológicos e a evolução na detecção dos fitovírus

Inicialmente, as técnicas sorológicas baseavam-se na observação da precipitação direta em meio líquido dos antígenos em mistura com os anticorpos específicos acondicionados em tubos. Essa técnica, na época, era sustentada pela teoria simplista do látice em que uma única molécula do anticorpo ligava-se a duas moléculas do antígeno, simultaneamente, favorecendo a precipitação. Muitos anos depois, Regenmortel (1982) descreveu dois mecanismos que melhor explicavam a precipitação: o primeiro relacionado com a formação de um complexo antígeno-anticorpo, e o segundo em que uma forte reação hidrofóbica é observada, na qual o precipitado torna-se insolúvel sob certas condições de pH.

Ouchterlony (1948) introduziu a dupla difusão em ágar (meio semissólido), técnica que ainda hoje é utilizada para detecção e determinação das relações sorológicas entre vírus. Nessa técnica, antígenos e anticorpos se difundem em um gel de ágar e, quando se encontram em proporções ótimas para reagir, formam linhas de precipitação constituídas pelos complexos antígeno-anticorpo. Essas linhas atuam como barreiras imunoespecíficas permitindo apenas a difusão de antígenos e anticorpos não relacionados. Quando vários antígenos reagem com o soro contendo anticorpos específicos, a formação de uma linha contínua de precipitação indica a identidade entre os antígenos, enquanto que a formação de um esporão ou porção que se destaca da linha principal de precipitação caracteriza a existência de relação sorológica, mas não identidade.

Outra variação dos testes sorológicos utilizando meio semissólido é a difusão simples (ALMEIDA; LIMA, 2001). O princípio é o mesmo aplicado à técnica de dupla difusão; porém, nesse teste, o anticorpo é incorporado diretamente ao meio de ágar no momento de sua preparação e antes da solidificação em concentrações pré-determinadas. Os antígenos são depositados em orifícios feitos no ágar solidificado, e, caso haja reação com o anticorpo, observa-se a formação de anéis de precipitação em torno do orifício.

Em muitas situações, em razão da baixa concentração do vírus no tecido vegetal, as técnicas de dupla difusão não são suficientemente sensíveis. Novos métodos foram desenvolvidos, nas últimas décadas, para a detecção de proteínas por meio de imunoensaios, o que proporcionou um grande avanço nas técnicas sorológicas utilizando anticorpos marcados (HULL, 2002).

Os anticorpos podem ser marcados com substâncias fluorescentes, isótopos radioativos e enzimas que, respectivamente, são utilizados nas técnicas de imunofluorescência, radioimunoensaios e ensaios imunoenzimáticos. A imunofluorescência e radioimunoensaios permitem a detecção do antígeno in situ, ou seja, na própria célula onde ocorrem os processos biológicos de infecção, replicação e translocação dos vírus. Na imunofluorescência, protoplastos ou cortes de tecido foliar infectado são submetidos ao contato direto com anticorpos específicos contra o vírus, previamente conjugado com marcadores como o isotiocianato de fluoresceína. Essa técnica permite diagnosticar vírus por meio da localização intracelular, como também estudar a sua distribuição citológica e histológica (SEQUEIRA, 1992).

É possível combinar a especificidade das reações sorológicas à microscopia eletrônica de tansmissão, técnica conhecida como imunomicroscopia eletrônica (DERRICK, 1973). Essa técnica consiste em recobrir uma tela de suporte de cobre com extrato de planta, juntamente com um antissoro específico, que permite a observação de uma maior concentração de partículas virais.

Ensaios imunoenzimáticos

Os ensaios imunoenzimáticos como Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) (CLARK; ADAMS, 1977) e suas variantes são os mais utilizados, tanto para pesquisa como na detecção e diagnóstico de fitovírus. A técnica de Elisa é a que mais se destaca, não somente por se basear em reações enzimáticas, mas também por permitir a análise de diversas amostras simultaneamente, apresentar alta sensibilidade, facilidade na preparação dos reagentes, rapidez e reprodutibilidade dos resultados. Em virtude da sua sensibilidade, é possível identificar uma proteína específica presente em uma amostra com uma população de outras proteínas. Isso permite a detecção de uma proteína codificada por um gene exógeno, no caso a proteína de origem viral, em uma planta infectada. Nesse caso, utiliza-se como base sólida uma placa de microtitulação feita de polyestireno constituída de 96 orifícios cujas paredes apresentam afinidade ao anticorpo e às reações imunoenzimáticas. O princípio básico consiste na utilização de uma enzima, que normalmente na fitovirologia é a fosfatase alcalina, conjugada ao anticorpo ou imunoglobulina. Esse conjugado reage com um substrato incolor, que nesse caso é o p-nitrophenylfosfato dissódico, originando uma coloração específica que permite evidenciar a presença ou ausência do antígeno. As leituras de absorbância para cada orifício são feitas em um colorímetro. Dependendo da enzima utilizada para produzir o conjugado, utiliza-se um comprimento de onda específico no aparelho. No caso da fosfatase alcalina, as leituras de absorbância são feitas a 405 nm, porém outras enzimas podem ser utilizadas para confecção do conjugado. No caso da peroxidase, por exemplo, que utiliza o substrato o-fenileno diamino, as leituras de absorbância são feitas a 492 nm (BRASILEIRO; CARNEIRO, 1998). Os valores da absorbância são proporcionais à quantidade de substrato transformado e, portanto, à quantidade de conjugado enzima-anticorpo que se fixou ao vírus, possibilitando quantificar a proteína viral. Normalmente, uma amostra é considerada positiva quando os seus valores médios de absorbância forem de 2,5 a 3,0 vezes superiores aos valores médios do controle negativo, constituído por uma amostra da mesma espécie de planta analisada, porém certificadamente sadia.

Existem diferentes variantes do teste de Elisa, e, usualmente, na virologia vegetal, as técnicas denominadas como Elisa-direto (DAS-Elisa – Double Antybody Sandwich-Elisa) e o Elisa-indireto são as mais utilizadas para a identificação de espécies e até mesmo de subgrupos de fitovírus. No DAS-Elisa, utiliza-se uma imunoglobulina específica para a proteína de interesse, normalmente a capa proteica viral, produzida a partir da imunização de cobaias com vírus purificado e uma enzima conjugada, frequentemente a fosfatase alcalina, ambos produzidos na mesma cobaia (CLARK; ADAMS, 1977). Embora seja amplamente utilizado, o Elisa-direto pode apresentar limitações como as observadas por Koening e Paul (1982) que, ao estudar as relações sorológicas entre diferentes isolados de vírus de um mesmo gênero, verificaram que os conjugados preparados com anticorpos específicos para um determinado vírus podem não reagir com estirpes próximas desse mesmo vírus. Em razão desta inespecificidade do anticorpo, desenvolveu-se uma variação do teste, denominado Elisa-indireto, assim designado por utilizar duas imunoglobulinas, uma para reconhecer o antígeno (vírus) e outra denominada anti-imunoglobulina produzida em outra cobaia para reconhecer e reagir com a primeira imunoglobulina. Essa metodologia permitiu que se detectassem estirpes de determinadas espécies de vírus que apresentavam maiores divergências entre si (TORRANCE, 1980).

Outra variante do teste de Elisa é o Dot immuno binding assay (Diba), também denominado de dot-Elisa, no qual a placa de microtitulação é substituída por uma membrana de nylon ou nitrocelulose. Nessa técnica, o antígeno é depositado diretamente sobre a membrana, e, como no Elisa, as etapas seguintes constituem no reconhecimento dos antígenos pelo anticorpo específico e na sua detecção pela conjugação direta a uma enzima, ou o uso de um anticorpo marcado. A revelação da reação é feita por quimioluminescência ou por colorimetria (BANTTARYI; GOODWIN, 1985).

É importante ressaltar que as técnicas sorológicas constituem uma ferramenta de grande valor na fitopatologia, pois são imprescindíveis no diagnóstico e na detecção de fitopatógenos, em qualquer programa de produção e certificação de sementes, bulbos, tubérculos e explantes obtidos por meio de micropropagação. Dessa maneira, elas permitem que seja evitada a disseminação de vírus e, consequentemente, auxiliam no controle de diversas doenças de etiologia viral.

Métodos de detecção empregando técnicas de biologia molecular

A ausência de vírus em material propagativo vegetal consiste em uma das premissas básicas na implantação de qualquer cultura agrícola. Uma vez presentes nas matrizes, esses agentes serão prontamente perpetuados nas suas progênies, e não existem medidas de controle efetivas no campo, exceto a eliminação e remoção de plantas infectadas. Além disso, a possibilidade de infecções secundárias é iminente pela presença de insetos vetores no campo, com o material infectado servindo como fonte de inóculo. Por esse motivo, o principal método de controle de viroses envolve o princípio da exclusão desses organismos antes do comércio de material propagativo e da implantação da cultura. Nesse contexto estão incluídos a certificação dos propágulos e o intercâmbio de germoplasma sadio, mediante procedimentos quarentenários.

No caso da cultura de células e tecidos vegetais, após o emprego das técnicas de limpeza clonal, é necessária a avaliação rápida e eficiente dos clones quanto à sua sanidade. Contudo, muitas vezes, a detecção nesse material é dificultada, seja pela baixa concentração do vírus, seja pelo emprego de testes laboriosos e com resposta demorada, como o uso de plantas indicadoras. As técnicas moleculares oferecem excelentes alternativas nesses casos, como será apresentado a seguir.

Conforme abordado previamente, os métodos mais comumente empregados na detecção de fitovírus envolvem testes biológicos (transmissão mecânica, enxertia e por vetores) e sorológicos (principalmente Elisa e suas variações). Apesar dos resultados obtidos com essas técnicas, existem algumas dificuldades comumente apontadas: (i) as biológicas normalmente são trabalhosas e demandam longos períodos de tempo para expressão de sintomas, além da necessidade de espaço físico como casas de vegetação e infraestrutura básica para a manutenção de plantas sadias e insetos vetores; (ii) as técnicas sorológicas, por sua vez, visam à detecção de proteínas e muitas vezes não alcançam o nível de sensibilidade exigido para a detecção do vírus.

O rápido desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, baseadas nas propriedades dos ácidos nucleicos, proporcionou um grande avanço na identificação e detecção de fitopatógenos, particularmente vírus, viroides e fitoplasmas, cobrindo as lacunas inerentes às técnicas biológicas e sorológicas. A mais notável contribuição se deu com o advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR), que permite a síntese de várias cópias, de regiões ou de todo o genoma viral. Essas técnicas têm sido empregadas para diagnóstico em laboratórios de virologia vegetal, destacando-se a hibridização de ácidos nucleicos e a PCR e suas variações (RT-PCR, PCR em tempo real, IC-PCR, etc.), apresentando versatilidade e possibilitando a análise de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo.

Hibridização dot-blot

As técnicas de hibridização de ácidos nucleicos se baseiam na complementariedade entre a sequência a se detectar (alvo) e uma sequência complementar à sequência alvo, porém marcada (sonda). Essas técnicas têm sido utilizadas para o desenvolvimento de diferentes estratégias de diagnóstico de vírus e viroides com elevada sensibilidade e especificidade. A técnica de hibridização dot-blot, em particular, permite que se analise um grande número de amostras de maneira fácil, rápida e a baixo custo (EIRAS et al., 1998). Owens e Diener (1981) publicaram pela primeira vez um método para o diagnóstico de viroides baseado na hibridização dot-blot de ácidos nucleicos com sondas marcadas radioativamente, e, dois anos mais tarde, Maule et al. (1983) empregaram a mesma técnica para a detecção de vírus de plantas. A partir de então, uma série de trabalhos abordando diferentes estratégias para detecção de vírus e viroides por hibridização dot-blot foram publicados (PALLÁS et al., 1998).

Na técnica de dot-blot, preparações de ácidos nucleicos purificados ou mesmo extratos de tecidos de plantas são adicionados a suportes sólidos, normalmente membranas de náilon, fixados e colocados em contato com a sonda marcada (hibridização). As sondas, que são moléculas de DNA ou de RNA (riboprobes), podem ser marcadas com isótopos radioativos, que, apesar de serem mais fáceis e práticos de serem sintetizados, implicam na manipulação de radioatividade. Sondas marcadas com moléculas não radioativas também podem ser empregadas, como biotina ou digoxigenina (PALLÁS et al., 1998).

A especificidade do método é determinada em função de alguns fatores: (i) estringência, ou seja, condições (temperatura e concentração de sais) de realização da hibridização. Quanto mais alta for a temperatura e quanto menor a concentração de sais, maior será a estringência; (ii) a região genômica (alvo) para qual a sonda foi desenhada, outro fator importante que determina a especificidade do método. Assim, regiões específicas do genoma de um vírus podem ser escolhidas para que uma determinada sonda hibridize somente com determinados isolados. Uma outra possibilidade é a de selecionar uma região do genoma que seja conservada entre espécies distintas de vírus de um mesmo gênero, ou de gêneros de uma mesma família, permitindo que vários alvos sejam detectados por uma mesma sonda (EIRAS et al., 2001). Além disso, várias sondas diferentes podem ser empregadas em um mesmo ensaio de hibridização, permitindo a detecção de alvos distintos (PALACIO-BIELSA et al., 1999). Recentemente, foi desenvolvida uma sonda polivalente, denominada polyprobe, que corresponde a um transcrito de uma construção quimérica de várias sequências de vírus distintos, que permite a detecção de até seis vírus diferentes em um mesmo ensaio (HERRANZ et al., 2005).

Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR)

A técnica de PCR foi desenvolvida no final da década de 1980 (MULLIS et al., 1986; SAIKI et al., 1988) e rapidamente adotada na detecção de fitopatógenos. A técnica é baseada na amplificação do ácido nucleico (DNA) do patógeno, ou de porções da sequência de interesse, limitada por dois oligonucleotídeos, denominados primers, utilizados em reações catalisadas por uma enzima (DNA polimerase). A PCR é altamente sensível, rápida e versátil, permitindo a utilização de variantes que se adequam às diferentes situações de diagnóstico.

Um ciclo de amplificação por PCR consiste basicamente em desnaturar a dupla fita da molécula de DNA analisada, na presença dos primers e dNTPs; hibridizar ou anelar os primers com as sequências complementares das duas fitas; e sintetizar o DNA (extensão pela DNA polimerase). O produto de cada ciclo (n) de baixa e alta temperatura é dobrado, de maneira que um aumento exponencial dos produtos é obtido em função do número de ciclos utilizados (2n). A temperatura de desnaturação normalmente situa-se em torno de 94 oC, por 30 a 60 segundos, e a temperatura e o tempo para anelamento dos primers dependem do seu tamanho, concentração e composição de bases (EIRAS et al., 1998). A amplificação é realizada à temperatura ótima para atividade da DNA polimerase, indicada pelo fabricante.

Para detecção de vírus conhecidos há um grande número de primers para PCR descritos na literatura. Porém, para o desenho de novos primers, é útil a consulta a bancos de dados de sequências genéticas, como o GenBank, da National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou o European Molecular Biology Laboratory (EMBL). A região genômica escolhida é, normalmente, conservada entre as diferentes espécies de um gênero de vírus, usualmente com tamanho que pode variar de 15 a 30 nucleotídeos e com um conteúdo de G/C de aproximadamente 50%, com temperatura de desnaturação (Tm) entre 55 oC e 65 oC. O tamanho dos primers, quando possível, pode ser aumentado para reduzir a probabilidade de geração de falsos positivos, como a amplificação de sequências inespecíficas ou de sequências similares de vírus não relacionados. Existem vários programas e páginas na internet que podem auxiliar no desenho dos primers, como o DNA Star e o OligoCalculator, da Universidade de Pittsburgg, evitando a escolha de sequências com estruturas secundárias, complementaridade entre primers, além da determinação da porcentagem de G/C e Tm. O desenho de primers com base em sequências altamente conservadas é recomendado para a detecção de todos os isolados ou mesmo de espécies de um vírus. O desenho de primers degenerados, ou seja, derivados do alinhamento de diversas estirpes ou isolados virais, porém contendo mais de um nucleotídeo possível em determinadas posições, também pode ser utilizado para amplificar as estirpes ou mesmo espécies de um gênero, como demonstrado para potyvirus (LANGEVELD et al., 1991) e luteovirus (ROBERTSON et al., 1991).

A preparação do material utilizado no laboratório e obtenção dos extratos de plantas são pontos-chave nas reações de PCR. A fim de evitar contaminações, os reagentes e as pipetas devem ser mantidos longe do contato com material vegetal e outros tipos de amostras, que podem estar contaminados com o DNA alvo. A presença de substâncias inibidoras em alguns tecidos de plantas, como polissacarídeos e compostos fenólicos, pode prejudicar a atividade das enzimas usadas, porém seus efeitos podem ser amenizados com a utilização de inibidores e absorventes de contaminantes, além de colunas que se ligam diferencialmente a RNAs virais (CANDRESSE et al., 1998). Por esses motivos, é fundamental a utilização de um controle positivo, para assegurar que a reação não está sendo inibida por compostos presentes no extrato vegetal, e de um controle negativo, ou seja, uma amostra com todos os reagentes, exceto o DNA alvo, para certificar-se de que os reagentes não estão contaminados com DNA viral. As amostras para amplificação por PCR são previamente submetidas à extração de ácidos nucleicos totais, utilizando métodos e protocolos variados, de acordo com o material de origem. Os principais métodos utilizados baseiam-se na extração com solventes orgânicos, como fenol/clorofórmio ou isotiocianato de guanidina para lise celular e inativação de enzimas degradantes de ácidos nucleicos. Alguns kits comerciais combinam esses métodos com colunas de cromatografia, o que pode facilitar e otimizar a obtenção de material com maior pureza. Há também a possibilidade de se utilizar extrato de tecidos vegetais diretamente em uma reaçao de PCR, sendo que a eficiência da reação dependerá de fatores como presença de inibidores da DNA polimerase e ação de nucleases que podem degradar os ácidos nucleicos (EIRAS et al., 1998).

Os produtos resultantes da amplificação por PCR normalmente são visualizados e analisados em gel de agarose corado com brometo de etídeo sob luz ultravioleta (Figura 3).

Figura 3. Análise eletroforética dos produtos de RT-PCR a partir de RNAs totais extraídos de cana-de-açúcar e milho com oligonucleotídeos específicos para detecção do Sugarcane mosaic virus (SCMV), amplificando um fragmento de 890 pb. Colunas 1 e 2: amostras de cana-de-açúcar provenientes do campo; colunas 3 e 4: amostras de milho provenientes do campo; coluna 5: cana infectada com o SCMV, controle positivo; coluna 6: cana sadia, controle negativo; coluna 7: marcador de DNA 100 bp.

Fonte: adaptado de Gonçalves et al. (2007).

Foto: Marcos César Gonçalves

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

A grande maioria dos vírus de plantas apresenta o genoma constituído de RNA fita simples, ssRNA (REGENMORTEL et al., 2000). Por esse motivo, para amplificação do seu genoma faz-se necessária a síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA) ao RNA genômico viral. O cDNA é sintetizado por uma transcriptase reversa, que utiliza o RNA alvo como molde para retrotranscrição. Após a obtenção do cDNA, realiza-se a reação de PCR. Essa adaptação da técnica de PCR foi denominada Reverse Transcription-PCR (RT-PCR).

Para a síntese do cDNA, são necessários a enzima transcrip-tase reversa, deoxinucleotídeos, um inibidor de RNAses e um primer de DNA complementar ao RNA alvo. Para vírus com a extremidade 3’ do genoma poliadenilada, como os membros da família Potyviridae (SHUKLA et al., 1994), pode-se utilizar um primer oligonucleotídeo de base T (oligo-dT) para obtenção do cDNA. As transcriptases reversas mais utilizadas nas reações de RT-PCR são as do Avian myeloblastosis vírus (AMV) e do Moloney murine leukemia vírus (MmLV). A AMV-RT é indicada para síntese de moléculas de cDNA curtas, enquanto a MmLV-RT é adequada para a síntese de moléculas de cDNA mais longas.

PCR em tempo real (real-time PCR)

A possibilidade de detecção e visualização dos produtos da PCR enquanto a amplificação progride tornou-se uma realidade com o advento da real-time PCR. Enquanto a PCR tradicional baseia-se na detecção por eletroforese do DNA amplificado ao final da reação, na presença de brometo de etídeo sob luz ultravioleta, essa técnica possibilita uma visão ampla da cinética da reação de PCR e consequentemente o monitoramento do acúmulo de produtos em tempo real. A técnica tem se mostrado útil, além de apresentar uma boa efetividade na razão custo-benefício, quando implantada em laboratórios com larga escala de análises (MARTELL et al., 1999). No Brasil, o uso da real-time PCR na detecção de fitopatógenos ainda se mostra incipiente, porém com grande potencial de expansão. Uma vez que a tecnologia é nova, o custo atual por teste é relativamente alto, porém tende a tornar-se um método de detecção amplamente empregado em razão da sua capacidade de detectar genes virais específicos em tempo real.

O monitoramento da formação dos produtos da amplificação em tempo real tornou-se possível com o uso de moléculas fluorogênicas para marcação de sondas de oligonucleotídeos. As duas sondas mais usadas no diagnóstico de vírus vegetais por real-time PCR são as molecular beacons (EUN; WONG, 2000; GONÇALVES et al., 2002; KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002); e TaqMan (MUMFORD et al., 2000). A manipulação pós-amplificação dos produtos de PCR é desnecessária, portanto as análises ocorrem em sistemas fechados, minimizando riscos de contaminação e facilitando o exame detalhado do desenvolvimento da reação (MACKAY et al., 2002). Essa tecnologia requereu o desenvolvimento de uma plataforma para excitar e detectar a emissão de fluorescência ao mesmo tempo em que realiza os ciclos termais para amplificação. Até recentemente, os aparelhos mais usados eram dispendiosos, porém, com a rápida popularização da técnica, a maioria dos fabricantes já comercializa uma plataforma para excitação e detecção das sondas fluorescentes acoplada aos termocicladores tradicionais.

Molecular beacons

Molecular beacons são sondas oligonucleotídicas que podem evidenciar a presença de ácidos nucleicos específicos em soluções homogêneas. Elas são particularmente úteis em situações em que não é possível ou desejável isolar os híbridos formados entre a sonda e a sequência alvo de um excesso de sondas de hibridização, tal como em monitoramento em tempo real de reações em cadeia da polimerase (PCR) em tubos selados, ou na detecção de RNAs dentro de células vivas (TYAGI; KRAMER, 1996). Essas sondas moleculares consistem em uma molécula de DNA de fita simples (ssDNA) com uma estrutura em forma de grampo, stem-loop ou hairpin. Essa conformação permite que a extremidade 5’, marcada com um fluoróforo (FAM, fluoresceína), e a extremidade 3’, marcada com um extintor de fluorescência ou quencher (Dabcyl), estejam, à temperatura semelhante a de amplificação, espacialmente próximas o suficiente para que a fluorescência emitida seja extinta pelo quencher. Após a hibridização com a sequência alvo, formando uma rígida estrutura de dupla hélice, a sonda assume uma conformação tal que o fluoróforo encontra-se distante o suficiente do quencher, de maneira que ocorra emissão de fluorescência. Essas sondas oferecem ainda a possibilidade de serem aplicadas para detectar alvos múltiplos, utilizando-se para tal uma gama de fluoróforos com diferentes cores (TYAGI et al., 1998). Dabcyl, um cromóforo não fluorescente, serve como um extintor universal para qualquer fluoróforo em molecular beacons. Em razão da sua forma de presilha, o reconhecimento dos alvos por essas sondas é tão específico que diferenças de apenas um simples nucleotídeo podem ser prontamente detectadas.

Molecular beacons e nasba

As molecular beacons, além serem usadas para detectar os produtos da amplificação por PCR, podem ser usadas em combinação com a amplificação isotérmica de RNA pela técnica Nucleic Acid Sequence Based Amplification (Nasba) (KIEVITS et al., 1991). O uso combinado dessa técnica com molecular beacons recebeu o nome de AmpliDet RNA (LEONE et al., 1998). Nasba é uma tecnologia com amplo potencial para aplicação na amplificação e detecção de RNAs virais (LEONE et al., 1997, 1998). Em comparação com outros sistemas de amplificação de ácidos nucleicos, tal como PCR, esse método, além de ser isotérmico, estende sua aplicação do diagnóstico viral à indicação de atividades biológicas, tal como expressão gênica e viabilidade celular. O principal produto de amplificação é um RNA de fita simples (ssRNA), embora pequenas quantidades de híbridos RNA:DNA e DNA dupla fita (dsDNA) também possam ser sintetizados (KIEVITS et al., 1991). A reação em Nasba é baseada no uso de primers para amplificação específica de RNA com a atividade simultânea das enzimas transcriptase reversa do AMV (AMV-RT), RNase H e T7 RNA polimerase à temperatura constante de 41 oC e sem a necessidade da adição de reagentes intermediários. Um dos primers específicos utilizados contém a sequência terminal 3’ complementar a sequência do RNA alvo a ser amplificado e a sequência terminal 5’ de um promotor que é reconhecido pela T7 RNA polimerase. Por sua vez, o segundo primer contém uma sequência que é complementar à fita de cDNA do primeiro primer. As enzimas e primers operam de maneira a amplificar a sequência nucleotídica alvo exponencialmente (SOOKNANAN; MALEK, 1995). Alguns exemplos do uso de molecular beacons com Nasba para detecção de vírus vegetais constituem as culturas de batata (KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002) de frutíferas (KLERKS et al., 2001b) e cana-de-açúcar (GONÇALVES et al., 2002).

TaqMan

A detecção de produtos de PCR também pode ser feita pelo uso de uma sonda oligonucleotídica fluorescente denominada TaqMan, desenhada para hibridizar em uma determinada região entre os sítios de anelamento dos primers usados para amplificação. A sonda é marcada na extremidade 5’ com um repórter emissor de fluorescência e na extremidade 3’ com um extintor de fluorescência, e atua em combinação com a atividade exonuclease 5’ da Taq polimerase. Enquanto a sonda está intacta, a fluorescência emitida pelo repórter é absorvida pelo extintor. Durante a amplificação, a sonda é clivada pela atividade 5’ → 3’ da exonuclease removendo o fluoróforo, resultando na emissão de fluorescência correspondente à quantidade de produto amplificado a cada ciclo. Alguns exemplos do uso de TaqMan para detecção de vírus de plantas constituem frutíferas (MARBOT et al., 2003), cana-de-açúcar (KORIMBOCUS et al., 2002) e batata (MUMFORD et al., 2000).

Outras variações da RT-PCR

Variações de RT-PCR podem ser empregadas para casos específicos, como one-step RT-PCR, multiplex-PCR, nested-PCR e immunocapture-PCR. Na one-step RT-PCR, RT-PCR realizado em um único passo, todos os reagentes para transcrição reversa e amplificação são combinados em um único tubo, sendo realizada inicialmente a síntese de cDNA e, a seguir, os múltiplos ciclos da PCR. A combinação da técnica com a real-time PCR pode ser feita, reduzindo o tempo de manipulação e contaminações cruzadas entre as amostras (KLERKS et al., 2001c). A nested-PCR pode ser empregada para detecção específica de vírus presentes em concentrações muito baixas. Um par de primers externos é utilizado para primeira amplificação, e um segundo par de primers é desenhado para hibridizar internamente ao produto amplificado inicialmente. Dessa maneira, um segundo turno de ciclos de PCR é realizado para amplificar especificamente o segmento alvo (DOVAS; KITIS, 2003). A multiplex-PCR é utilizada para a detecção simultânea de mais de um vírus em plantas com suspeita de infecções mistas, em uma única reação de PCR. A técnica requer o uso de múltiplos pares de primers, especificamente desenhados para amplificar diferentes alvos na reação. Os produtos das amplificações podem ser distinguidos pelo seu tamanho por eletroforese (DOVAS; KITIS, 2003), ou ainda com múltiplas sondas fluorescentes, em combinação com real-time PCR (KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002). A imunocaptura de partículas virais seguida de PCR (immunocapture-PCR, IC-PCR) consiste na sensibilização do microtubo utilizado para PCR com um antissoro, incubação das amostras com o antígeno (vírus) e a posterior adição dos reagentes para a amplificação. A técnica também pode ser usada em combinação com sondas fluorogênicas (SCHOEN et al., 1997).

Controle de vírus de plantas

Para um controle eficiente das fitoviroses, pressupõe-se que o vírus tenha sido identificado corretamente e que haja um bom conhecimento da epidemiologia do vírus, isto é, de que forma se comporta o vírus em relação aos seus hospedeiros, vetores e fontes de infecção em determinados ambientes e como se dá a incidência da doença. As únicas soluções práticas, até o momento, consistem em controlar as viroses indiretamente interferindo com os fatores ecológicos e protegendo as culturas da infecção ou, pelo menos, reduzindo seus efeitos. A grande maioria dos organismos fitopatogênicos, em especial fungos, são controlados por defensivos agrícolas apropriados, porém esses métodos não podem ser utilizados no controle de fitoviroses, porque os vírus dependem diretamente do metabolismo das plantas hospedeiras. As fitoviroses não possuem formas de controle após o início do processo de infecção; portanto, as medidas devem ser preventivas e preferencialmente iniciando-se antes do plantio e estendendo-se até o fim do ciclo de produção.

Algumas medidas preventivas de controle que são amplamente empregadas estão relacionadas a seguir.

Medidas de controle dirigidas às fontes de vírus

Prevenção de fontes de infecção

Diversos fitovírus podem, além de ser transmitidos por insetos, ser propagados por sementes ou material de propagação vegetativa, sendo de suma importância que esse material tenha uma boa procedência e que possivelmente seja certificado.

Eliminação de focos de infecção

Deve-se promover a erradicação de plantas invasoras e outras hospedeiras alternativas, tanto dos vírus como de seus vetores, assim como das plantas infectadas.

Rotação de culturas

Esta medida consiste no plantio sucessivo de culturas diferentes no mesmo terreno. Esse método, além de trazer benefícios agronômicos, se mostra eficaz principalmente contra as pragas que possuem plantas hospedeiras específicas. Essa prática perdeu a popularidade a partir do momento que se intensificou a monocultura.

Medidas de controle dirigidas ao vetor

O controle dos insetos vetores propriamente dito pode envolver vários métodos.

Isolamento das plantas

A proteção da planta contra os insetos pode ser feita utilizando métodos culturais e técnicas agrícolas apropriadas, tais como o isolamento dos cultivos em regiões de baixa incidência de vetores, ou produção em casas de vegetação, telados ou plasticultura (DÍAZ et al., 2004). O isolamento pode ser feito com plantas-barreira, geralmente empregando-se espécies botânicas não preferidas pelos insetos vetores e que possuam altura suficiente.

Controle químico

Muitas vezes o controle químico pode ser eficaz contra a propagação de vírus transmitidos de forma circulativa, em razão dos longos períodos de alimentação necessários para a aquisição e para inoculação. Esse tipo de controle é inadequado em sistemas que envolvem a transmissão do tipo não persistente e não circulativa, em que o ciclo de transmissão, por ser muito curto, impede a ação eficiente dos inseticidas.

Uso de óleos

Em razão da ineficiência de alguns produtos no controle de vírus com característica de transmissão do tipo não persistente, os óleos minerais ou vegetais são empregados para inibir a transmissão. O óleo age modificando o comportamento de picada de prova e a alimentação, fases do processo de transmissão em que as partículas virais são inoculadas.

Uso de semioquímicos e repelentes

Estas substâncias, como o feromônio de alarme – (E)β-farnesene, liberado quando os pulgões são predados, podem ser empregadas em misturas ou isoladamente, modificando o comportamento dos insetos (GIBSON; PICKET, 1983). Outras substâncias também já foram empregadas como fagodeterrentes, sendo a mais conhecida a espécie Azaridachta indica ou neem. No Brasil, a substância mais utilizada é a derivada da erva de Santa Bárbara, visando ao controle da mosca-branca, quando aplicada em extrato (CHAPMAN et al., 1981).

Emprego de barreiras ópticas

Casas de vegetação do tipo túnel, cobertas com polietileno, material que absorve os raios ultravioletas, reduzem sensivelmente o ataque de diversas pragas e a infecção por vírus, quando comparadas com as casas de vegetação cobertas com plástico normal (COSTA et al., 2002).

Superfícies refletoras

Os afídeos e as moscas-brancas são atraídos por algumas cores e repelidos por outras. Baseado nesse princípio, alguns pesquisadores desenvolveram trabalhos mediante o emprego de superfícies repelentes e pulverizações de materiais refletores.

Armadilhas amarelas

O emprego de armadilhas amarelas com óleo ou polietileno adesivo é amplamente empregado no controle de insetos vetores, obtendo-se um maior sucesso no caso das moscas-brancas. Esse tipo de armadilha pode ser empregado como indicador do momento de pulverização na cultura, auxiliando na tomada de decisão para as medidas de controle (COHEN; MARCO, 1973).

Além dessas medidas de controle visando especificamente ao ataque de insetos vetores, podem ser desenvolvidas as que visem ao manejo da cultura hospedeira com o intuito de reduzir o número de insetos, tais como as mudanças de características de plantio (densidade de plantio e distância entre linhas); assincronia fenológica (atraso ou adianto na época de plantio); proteção cruzada (emprego de plantas previamente infectadas com estirpes fracas do vírus); utilização de plantas resistentes; e finalmente plantas transgênicas.

Medidas dirigidas à cultura

Uso de variedades resistentes

O principal método de controle de fitovírus é a utilização de variedades resistentes, seja por melhoramento genético clássico ou transgenia. O uso de variedades resistentes é a maneira mais econômica e efetiva para o controle das viroses, pois há redução dos gastos com outras medidas, como o controle dos vetores e tratos culturais. Além disso, reduzem problemas ambientais graças ao menor número de aplicações de produtos químicos, além de diminuir a possibilidade do desenvolvimento de resistência dos vetores aos inseticidas. Cultivares resistentes são normalmente desenvolvidas para o controle de vírus transmitidos por vetores de difícil e oneroso controle, tais como os tospovírus e geminivírus em tomate, transmitidos respectivamente por tripes e mosca-branca e PVY e PLRV por afídeos em batata (SALAS et al., 2004). No entanto, esse processo possui alguns impedimentos, como a demora na obtenção dessas variedades e a possibilidade da quebra de resistência. Os métodos tradicionais de melhoramento de plantas, nos últimos anos, vêm sendo complementados com as técnicas moleculares de manipulação genética (transgenia), que consistem na utilização de porções genômicas virais para obtenção de resistência genética, seja mediada pela proteína expressa ou pelo RNA transcrito. Como exemplo, pode-se citar a transformação de plantas de mamoeiro com o gene da capa proteica do Papaya ringspot virus, PRSV (Potyvirus), para a resistência ao próprio vírus em campo (SOUZA JUNIOR et al., 2005).

Quimioterapia

A utilização de substâncias quimioterápicas para os fitovírus (antifitovirais) ainda hoje é tratada de forma empírica, porém alguns experimentos já foram realizados demonstrando que substâncias sintéticas ou naturais, com propriedades químicas inteiramente diversas, são capazes de inibir os fitovírus. Os primeiros compostos utilizados foram as bases análogas de pirinas e pirimidinas, conhecidas como antimetabólitos. Outras substâncias com princípios de inibição da infecção viral, de origem natural ou sintética, foram empregadas, como extratos de plantas, caseína do leite, aminoácidos, íons metabólicos e detergentes corantes. Para serem utilizadas, essas substâncias devem apresentar atividade antiviral estável e permanente, serem produzidas em larga escala a preços acessíveis, terem amplo limite de tolerância a resíduos e efeitos colaterais não prejudiciais à produção e à qualidade do produto, além de neutralidade ecológica. Os métodos de aplicação mais adotados a partir de substâncias quimioterápicas são a pulverização do produto diluído em água e associado a um agente espalhante adesivo, no caso de culturas instaladas no campo. Já sob condições laboratoriais, essas substâncias são incorporadas ao meio de cultura, de consistência sólida ou líquida, com vistas a obtenção de plantas livres de vírus, a partir da cultura de tecidos (HUDSON, 1990).

Termoterapia

A termoterapia é uma das medidas curativas mais conhecidas e aplicadas em fitovirologia, pelos resultados positivos que oferece. Essa técnica consiste no emprego do calor para livrar plantas ou partes da planta de determinados vírus. Seu principio básico reside na diferença entre a planta hospedeira e o vírus na tolerância às altas temperaturas, ou seja, o coeficiente de inativação térmica da hospedeira excederia a do vírus causando, assim, a destruição das atividades químicas essenciais aos vírus e plantas hospedeiras, mas estas seriam aptas a se recuperarem dos danos ocasionados. A eliminação dos vírus nos tecidos das plantas in vitro ocorre por causa da inativação da partícula viral pela degradação, paralisação ou diminuição da translocação do vírus na planta e paralisação ou diminuição da replicação viral. A termoterapia tem sido aplicada na enxertia de gemas de planta infectada em porta enxertos imunes, enxertia de tubérculos infectados em tubérculos de variedades imunes, inativação em condições de campo e principalmente em explantes de plantas infectadas para desenvolvimento em meio de cultura (GROUT, 1990). A identificação do(s) vírus presente(s) no material a ser submetido à termoterapia é fator primordial, pois, para cada espécie ou gênero de vírus, diferentes temperaturas devem ser utilizadas. Como exemplo, pode-se citar o aumento da eficiência da recuperação de plantas de alho produzidas em meio de cultura (CONCI; NOME, 1991). É de conhecimento que o alho é acometido por um complexo viral constituído de diferentes espécies de Potyvirus e de um Carlavirus. Por esse motivo, as matrizes são submetidas a temperaturas que variam de 30 °C a 49 oC por períodos de 4 a 6 semanas ou mais, dependendo do vírus a ser eliminado. Após esse tratamento, o explante é excisado e cultivado in vitro (TORRES et al., 1998).

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Capítulo 9
Contaminações microbianas em biorreatores

João Batista Teixeira

Introdução

A contaminação bacteriana e fúngica constitui um problema sério em todos os tipos de cultivo in vitro, seja em cultivos em meio gelificado ou em meio líquido (GEORGE, 1993). Pode-se afirmar, a grosso modo, que existem três formas de contaminação que podem afetar o material em cultivo durante uma ou mais fases do processo de micropropagação: contaminação superficial, contaminação endofítica e contaminação de origem ambiental (GEORGE, 1993; LONG et al., 1988).

Contaminação superficial

Este tipo de contaminação refere-se àqueles microrganismos presentes na superfície do material vegetal a ser utilizado como fonte de explantes. Após a germinação no solo, durante o processo de desenvolvimento, fungos e bactérias vão se depositando na superfície da planta, o que representa um processo natural de colonização de novos nichos pelos microrganismos. Essa contaminação ocorre mais intensamente nas superfícies expostas, como haste caulinar, folhas, flores abertas, superfície da raiz, etc. Locais mais protegidos, como interior das gemas, das flores fechadas e dos frutos, tendem a estar livres de contaminantes.

Durante o processo de desinfestação visando ao estabelecimento de culturas in vitro, esses contaminantes são eliminados, desde que a solução desinfestante atinja todos os nichos onde possam estar presentes as bactérias, fungos e seus esporos. O completo molhamento da superfície dos órgãos vegetais pode ser conduzido com a adição de substâncias redutoras da tensão superficial da água e/ou pela exposição ao vácuo dos tecidos imersos em agentes desinfestantes, para eliminação de bolhas de ar, que são o principal problema durante esse processo.

Geralmente, o uso de fungicidas e antibióticos durante o processo de desinfestação não surte nenhum efeito e deve ser preterido em função de outros tratamentos ou cuidados mais eficazes. Um procedimento que tem apresentado excelentes resultados em nosso laboratório é o cultivo em casa de vegetação das plantas matrizes, sob alguns cuidados especiais. Por exemplo, a irrigação é conduzida exclusivamente na base da planta, evitando ao máximo o molhamento da folhagem e dos pontos de crescimento. Isto associado a uma adequada adubação e controle de pragas e doenças têm permitido um excelente resultado em termos de eficiência no estabelecimento dos explantes in vitro, no que diz respeito à ausência de contaminação. Da mesma forma, desaconselha-se o tratamento das matrizes com antibióticos e fungicidas, a não ser em casos específicos em que esse procedimento se justifique.

O cultivo das matrizes em casa de vegetação pode, entretanto, criar alguns problemas, principalmente no controle de algumas pragas como cochonilhas e ácaros, dependendo da espécie e da região de cultivo.

Contaminação endofítica

Além da contaminação superficial, que é constituída pelos mais diferentes tipos de bactérias e fungos, existe um outro tipo que é a contaminação endofítica (LEIFERT; WAITES, 1990). Como o próprio nome indica, este é um tipo de contaminação presente no interior da planta, quer seja nos feixes vasculares, floema e xilema, ou nos espaços intercelulares.

Existem vários grupos de microrganismos endofíticos, tais como os fungos, bactérias, micoplasmas, virus e viroides (GEORGE, 1993). Muitos desses microrganismos são patogênicos, enquanto outros não o são, podendo até mesmo apresentar efeitos benéficos à planta hospedeira (DOLE; WILKINS, 1988; GEORGE, 1993).

Os vírus, viroides e micoplasmas, embora possam representar problemas para o estabelecimento da cultura in vitro, são muito pouco estudados nesse tipo de culturas, e, em geral, apenas os vírus recebem uma atenção maior, já que podem interferir com maior frequência no crescimento da planta em condições de campo. Dessa forma, em condições in vitro, apenas os fungos e bactérias são considerados problemas prioritários em termos de contaminação.

Os sintomas causados pelos organismos patogênicos são mais facilmente identificados no momento da coleta do material vegetal, e assim é possível escolher os órgãos ou tecidos pouco afetados. Por outro lado, os organismos não patogênicos passam despercebidos e são de difícil eliminação visual no momento da coleta, só aparecendo mais tarde durante o cultivo in vitro. Felizmente, esse tipo de contaminação é menos comum e está associado a certos tipos de planta (DEBERGH; MAENE, 1984).

Tratamentos com antibióticos e fungicidas da planta matriz resulta em pouco ou nenhum benefício. Assim, tentativas de eliminar a contaminação endofítica pode ser feita por meio da adição de antibióticos e fungicidas apropriados. Entretanto, vários autores (FALKINER, 1990; GEORGE, 1993) afirmam que raramente é possível a limpeza completa pela adição de antibióticos e fungicidas de uma cultura contaminada. Além do mais, o uso dessas substâncias deve atender algumas condições, por exemplo, ter ação sistêmica e não afetar o crescimento do tecido. Falkiner (1990) listou, pelo menos, dez características que um antibiótico ou fungicida deve apresentar para poder ser utilizado in vitro com segurança.

Alguns órgãos vegetais, como as raízes, são mais contaminados do que outros, embora em alguns casos toda a planta possa estar tomada por microrganismos endofíticos. Em nosso laboratório, a presença de organismos endofíticos se restringiu a bactérias, embora se saiba que fungos possam igualmente estar presentes no tecido vegetal sem causar nenhum distúrbio metabólico que possa ser identificado visualmente, como a mudança de coloração dos tecidos.

Contaminação ambiental

Um terceiro tipo de contaminação é aquela derivada do ambiente. Em princípio, toda contaminação é de origem ambiental, mas preferimos denominar de contaminação ambiental apenas aquela contaminação proveniente do ambiente, seja durante a desinfestação, durante o cultivo ou durante os procedimentos de subcultivo e renovação do meio de cultura.

A recontaminação do explante é uma ameaça constante, e todo cuidado é pouco no sentido de minimizar a perda de culturas por esse motivo.

Todo o ambiente do laboratório está contaminado, com exceção do interior dos frascos onde estão as culturas e o ar da capela de fluxo laminar. Assim, a recontaminação constitui uma das maiores causas de perdas de culturas por contaminação principalmente do tipo bacteriana. A recontaminação fúngica é muito menos frequente e denota falta de experiência ou desleixo durante os procedimentos de subcultivo e transferência dos explantes para frascos novos.

Aspectos gerais da contaminação

O uso de meio líquido pode levar a uma maior perda de culturas por contaminação, uma vez que o ambiente nesse meio facilita a dispersão dos contaminantes, sejam eles fungos ou bactérias, ao passo que em meio gelificado o esporo de fungos ou bactérias pode se restringir a um ponto na superfície do meio, ser identificado, e a cultura salva pela transferência para meio novo.

A contaminação fúngica, seja de origem externa, endofítica ou ambiental, em geral é facilmente identificada após alguns dias de cultivo, já a contaminação bacteriana é mais sutil e demora de alguns dias a algumas semanas para poder ser identificada. A contaminação com leveduras não é facilmente detectável, a não ser pelo odor de substância fermentada que exala do meio de cultura contaminado (GEORGE, 1993). Há, igualmente, uma discreta mudança de turbidez do meio de cultura.

Como o meio de cultura utilizado para o explante vegetal muitas vezes não é adequado para o crescimento de algum grupo de bactérias, o crescimento destas fica restrito ao explante e é de difícil identificação visual ou, para o caso de meio líquido, cresce lentamente com mudança gradual na turbidez do meio de cultura. Assim, cuidados especiais devem ser tomados para identificar e eliminar essas culturas contaminadas (BRADBURY, 1988).

É muito comum conferir ao primeiro sinal de contaminação persistente o nome de contaminação endofítica. Muitas vezes, os problemas estão relacionados muito mais a procedimentos inadequados de desinfestação do que mesmo da presença de contaminantes de origem endofítica, a qual felizmente não é tão frequente e depende em grande parte do tipo de material vegetal e espécie de planta utilizada (DEBERGH; MAENE, 1984).

Quando se pretende eliminar as bactérias via adição de antibióticos, o meio de cultura deve, em geral, ser mais pobre, inclusive com um menor teor de sacarose e sem adição de caseína ou qualquer outra fonte de aminoácidos. Dessa forma, desfavorecendo o crescimento da bactéria, é possível melhorar a eficiência do antibiótico. Entretanto, de acordo com George (1993), a eliminação completa de contaminantes da cultura in vitro via tratamento com antibióticos é raramente bem sucedida.

Contaminação em biorreator

Com o desenvolvimento de equipamentos denominados biorreatores para cultivo de células, embriões e gemas utilizando meio líquido e frascos com volumes variando de meio litro a algumas dezenas de litros, um dos problemas que surgiram foi o da contaminação. O problema tornou-se mais evidenciado porque a perda de um tubo de ensaio ou um frasco tipo maionese de 250 mL resulta na perda de uma ou algumas mudas, já a perda de um frasco de biorreator pode ser de algumas dezenas ou mesmo centenas de mudas.

Um outro aspecto diz respeito ao tamanho e à manipulação dos frascos. Um tubo de ensaio ou um frasco tipo maionese de 250 mL é facilmente esterilizado em autoclave e manipulado com segurança no interior da capela de fluxo laminar. Bocas estreitas também contribuem para uma menor taxa de recontaminação das culturas. Já os frascos de biorreatores com alguns litros ou mesmo dezenas de litros são muito mais difíceis de serem esterilizados e manipulados na capela de fluxo laminar, o que pode, caso não se tomem os devidos cuidados, resultar num aumento expressivo da taxa de recontaminação.

Contaminação em biorreator de imersão temporária

Em princípio, não existe diferença entre a taxa de recontaminação em biorreator de imersão permanente ou temporária. Ambos os equipamentos são de manipulação relativamente difícil, o que, se não se tomarem os devidos cuidados, a recontaminação comprometerá todos os frascos.

Como trabalhamos no desenvolvimento de protótipos de biorreator de imersão temporária visando à micropropagação, vamos nos ater mais especificamente a esse modelo de equipamento.

Foram desenvolvidos até o momento quatro protótipos de biorreator de imersão temporária como podem ser vistos pela Figura 1. Os modelos apresentam o mesmo fundamento básico, que pode ser resumido no uso de frascos gêmeos, conectados entre si, sendo um frasco para cultivo do explante e outro para o meio de cultura. A intervalos de tempo preestabelecidos, de acordo com a programação dos temporizadores, o meio de cultura é automaticamente transferido de um frasco para outro, retornando em seguida para o frasco anterior de modo a estabelecer a imersão do material em cultivo. Os protótipos A, B e C apresentam basicamente a mesma configuração, com a diferença de que, para o modelo C, a iluminação é feita de baixo para cima, além de constituir um modelo mais compacto. No entanto, o modelo D, um protótipo para uso em escala industrial, apresenta uma construção bem diferente, sendo constituído de uma estante com 5 prateleiras, sendo 8 pares de frascos em cada prateleira. Além do mais, o volume de cada frasco é de 5 L e faz uso de frascos descartáveis ao contrário dos frascos dos protótipos anteriores, nos quais se utilizam frascos de vidro autoclaváveis de, no máximo, 2 L.

Figura 1. Protótipos de biorreatores desenvolvidos pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. A) Modelo de 4 pares de frascos; B) Modelo de 12 pares de frascos, com 3 unidades de controle independentes; C) Modelo de 4 pares de frascos, com iluminação de baixo para cima; D) Modelo industrial de 80 pares de frascos.

Fotos: João Batista Teixeira

Procedimentos no que se refere à contaminação e recontaminação

Para todos os protótipos, o meio de cultura é esterilizado via autoclavagem. Cuidados gerais devem ser tomados para a autoclavagem do meio de cultura. Inicialmente, estoques velhos de reagentes não devem ser usados, uma vez que podem conter esporos de bactérias que podem resistir à autoclavagem. Durante o processo de autoclavagem, deve-se cuidar para não superlotar o equipamento e impedir a circulação de vapor, o que pode criar bolsões de ar no interior da autoclave onde a temperatura não atingirá os 121 ºC necessários à esterilização. Além do mais, ao final do período de 20 minutos sob temperatura máxima, não se deve abrir demasiadamente a válvula de liberação de vapor da autoclave. Esse procedimento acelera o resfriamento e pode comprometer o processo de esterilização. Abertura parcial da válvula só pode ser feita em ambientes com temperaturas muito altas, acima de 30 ºC, de modo que a temperatura da autoclave decresça adequadamente evitando a degradação do meio de cultura por exposição prolongada a altas temperaturas.

Além do meio de cultura, são autoclavadas as mangueiras e filtros de ar, devidamente embalados em sacos plásticos de PVC antes de serem levados para a autoclave. Os frascos de 5 L do modelo D são esterilizados por radiação gama por empresas especializadas e chegam ao laboratório embalados em sacos plásticos duplos, prontos para o uso.

Além desses cuidados, alguns procedimentos são utilizados para minimizar a contaminação e recontaminação dos explantes durante o cultivo nos frascos de biorreator, que podem ser resumidos nos seguintes: a) preparo do explante inicial e uso de caseína hidrolisada; b) procedimentos na capela de fluxo laminar; c) características do laboratório em termos de construção e limpeza.

Preparo do explante inicial e uso de caseína hidrolisada

Um dos cuidados básicos refere-se ao preparo do explante inicial a ser introduzido nos frascos do biorreator. Os procedimentos dependem da espécie em cultivo, mas, em geral, seguem os mesmos passos. O estoque inicial das culturas in vitro é subcultivado para meio líquido em camada fina, de 0,5 cm a 1,5 cm, contendo de 250 mg L-1 a 500 mg L-1 de caseína. A presença de caseína é benéfica para o crescimento do explante, embora também o seja para os possíveis contaminantes, principalmente bactérias, que são mais frequentes nessa fase. Assim, o aparecimento da contaminação por turvamento do meio é mais rápida e mais intensa. Além do mais, a presença de caseína reduz a precipitação de alguns componentes do meio básico, muito comum após a autoclavagem, o que, às vezes, pode dificultar a identificação de mudança na turbidez do meio por causa de contaminantes. Em seguida, os frascos que apresentarem algum tipo de turvação do meio são eliminados. Dependendo da espécie, os explantes podem ficar nesse meio por até quatro semanas, tempo suficiente para que possíveis contaminantes possam crescer e alterar a coloração e transparência do meio.

Procedimentos na capela de fluxo laminar

Como não poderia deixar de ser, a manipulação em capela de fluxo laminar constitui a fase em que ocorre o maior índice de recontaminação. Isso não é exclusividade do uso de biorreatores, mas ocorre com qualquer espécie e qualquer tipo de frasco e meio de cultura.

No caso do biorreator, os frascos são montados e inoculados dentro da capela, o que requer duas pessoas para manipular o protótipo D. Para os outros protótipos, uma pessoa pode, satisfatoriamente e com segurança, manipular os frascos, seja para montagem, inoculação ou troca do meio de cultura.

No momento da montagem, a chance de recontaminação é pequena, já que os frascos do modelo D encontram-se protegidos em sacos plásticos duplos, sendo o primeiro eliminado antes de ser conduzido para a capela e o segundo já no interior da capela, o que confere total segurança ao procedimento. Durante a inoculação, os frascos contendo os explantes são limpos externamente com álcool a 70% de modo a reduzir ao máximo poeira, fungos e esporos de bactérias.

O diâmetro da boca do frasco de 5 L do modelo D é de aproximadamente 4 cm, o que minimiza os riscos de recontaminação durante a inoculação e troca do meio de cultura. Além do mais, apenas um frasco é aberto em ambos os procedimentos, isto é, tanto na inoculação quanto na troca de meio.

Características do laboratório em termos de construção e limpeza

O laboratório de micropropagação deve ser devidamente planejado no que diz respeito a possíveis fontes de contaminação microbiológica. A proximidade de fontes de poeira e exposição a ventos fortes pode contribuir para uma indesejável taxa de recontaminação das culturas. Correntes de ar, seja de origem externa ou interna como a dos aparelhos de ar condicionado, comprometem o trabalho de assepsia e acarretam altas taxas de contaminação e recontaminação. Além disso, fonte de umidade interna pode propiciar o crescimento de fungos, cujos esporos vão se espalhar pelo laboratório. É desnecessário ressaltar que culturas descartadas e contaminadas devem ser imediatamente autoclavadas, e os frascos lavados e secados rapidamente.

O laboratório deve ter o mínimo de poeira em circulação, o que constitui fonte de contaminantes fúngicos principalmente. Muitas vezes, o uso de aparelhos insufladores de ar estéril é a melhor medida para reduzir o índice de recontaminação no laboratório. O piso e as paredes devem ser revestidas preferencialmente de cerâmica, de tal forma a permitir uma limpeza cuidadosa com a frequência necessária.

Da mesma forma, a circulação de pessoas no interior do laboratório deve se restringir ao pessoal absolutamente necessário à condução dos trabalhos. Deve-se limitar ao estritamente imprescindível as visitas de terceiros. Mesmo assim, o visitante deve usar calçados adequados fornecidos pelo laboratório, além de um guarda-pó. Alguns locais como sala de transferência não devem, em hipótese alguma, receber visitas.

Uma das maiores ameaças a um laboratório de micropropagação é o que diz respeito à proliferação de àcaros, os quais penetram os frascos de cultivo, deixando rastros facilmente visíveis de contaminação, tanto fúngica quanto bacteriana (BLAKE, 1988). A população de ácaros no laboratório deve ser mantida ao mínimo possível, por meio de tratamentos com produtos à base de formol, formaldeído ou cloreto de benzalcônio. Acaricidas específicos só são utilizados em casos extremamente raros, já que são produtos altamente tóxicos. Todas as medidas devem ser tomadas para que a infestação de ácaros não saia fora de controle, caso contrário, todas as culturas devem ser autoclavadas, e a sala de cultura passar por um tratamento rigoroso, até mesmo com a aplicação de acaricidas específicos caso o tratamento convencional não seja suficiente.

Outros modelos de biorreator

Para outros modelos de biorreator (TEIXEIRA, 2002), os cuidados para prevenir a contaminação e recontaminação dos frascos basicamente são os mesmos, embora particularidades devam ser levadas em consideração dependendo do modelo de equipamento a ser utilizado.

Conclusões gerais

A contaminação no laboratório de micropropagação é uma ameaça constante e qualquer descuido poderá ser devastador. Por isso, devem-se utilizar procedimentos de assepsia adequados capazes de manter a taxa de recontaminação em níveis aceitáveis, nunca superiores a 5%. Além disso, é importante notar que:

• Contaminações frequentes com fungos, principalmente aqueles comuns de ambiente, denotam desleixo ou baixa qualificação profissional.

• A recontaminação em biorreatores pode ser maior, caso não se tomem os devidos cuidados.

• Há necessidade de se adotar uma metodologia de trabalho adequada ao uso de cada modelo de biorreator, sobretudo nas fases de preparo do inóculo e da manipulação em capela de fluxo laminar.

• A contaminação bacteriana requer um constante monitoramento, e há necessidade de um aprofundamento do conhecimento de cada tipo de bactéria, sobretudo daquelas de crescimento lento ou quase imperceptível, mas que pode afetar a cultura ao longo de semanas ou mesmo meses.

• A recontaminação de culturas assépticas é um dos principais fatores de perdas em laboratórios de micropropagação, o que ocorre por vários fatores, mas a principal causa advém da inadequada manipulação das culturas em capela de fluxo laminar.

• A taxa de contaminação tanto bacteriana quanto fúngica pode ser mantida em níveis satisfatórios, mesmo com o uso de biorreatores, desde que os procedimentos sejam adequados.

Referências

BLAKE, J. Mites and thrips as bacterial and fungal vector between plant tissue cultures. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 163-166, 1988.

BRADBURY, J. F. Identification of cultivable bacteria from plants and plant tissue cultures by use of simple classical methods. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 27-37, 1988.

DEBERGH, P.; MAENE, L. Pathological and physiological problems related to the in vitro culture of plants. Parasitica, [S.l.], v. 40, p. 69-75, 1984.

DOLE, J.; WILKINS, H. A graft-transmissible factor in Euphorbia pulcherrima causing permanente changes in branching and other morphological characteristics. Acta HortiCulture, Leuven, v. 226, p. 283-288, 1988.

FALKINER, F. R. The criteria for shoosing an antibiotic for control of bacteria in plant tissue culture. Newsletter: International Association of Plant Tissue Culture, Calgary, v. 60, p. 12-23, 1990.

GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture. 2nd ed. Edington: Excegetic, 1993. v. 1.

LEIFERT, C.; WAITES, W. M. Contaminants of plant tissue cultures. Newsletter: International Association of Plant Tissue Culture, Calgary, v. 60, p. 2-13, 1990.

LONG, R. D.; CURTIN, T. F.; CASSELLS, A. C. An investigation of the effects of bacterial contamination on potato nodal cultures. Acta HortiCulture, Leuven, v. 225, p. 83-91, 1988.

TEIXEIRA, J. B. Biorreatores. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento, Uberlândia, v. 4, n. 24, p. 36-41, 2002.

Capítulo 10
Intercâmbio de germoplasma: marcos regulatórios, diagnóstico e medidas de erradicação e controle de pragas e contaminantes exóticos

Vera Lúcia de Almeida Marinho

Abi Soares dos Anjos Marques

Introdução

O Brasil é detentor de cerca de 20% da biodiversidade mundial. Entretanto, a maioria dos produtos que fazem parte da alimentação dos brasileiros, como o arroz, o feijão, o trigo e o milho, são de origem exótica. A introdução de germoplasma vegetal no País se caracteriza como um processo dinâmico, utilizado para a obtenção de variedades mais produtivas, resistentes a pragas e adaptadas às nossas condições climáticas. Isso permitiu que, nas últimas décadas, o País passasse da condição de importador para exportador de diversos produtos, como soja, milho, ervilha, noz-moscada, canela, pimenta-do-reino, forrageiras, espécies florestais, frutíferas e hortaliças. No entanto, a introdução não controlada de germoplasma vegetal pode facilitar a entrada de pragas no País (MARINHO et al., 2003).

No Brasil, são inúmeros os exemplos de introdução de pragas exóticas que provocaram e em alguns casos ainda provocam sérios danos à agricultura. Podemos citar o exemplo do caso da introdução do fungo Diaporthe phaseolorum (Cke. & Ell) Sacc. f. sp. meridionalis Morgan-Jones, agente causal do cancro-da-haste-da-soja. Esse fungo, identificado pela primeira vez em 1989, causou sérios danos à cultura da soja, com perdas estimadas em até 100%. Atualmente essa doença está parcialmente controlada graças ao desenvolvimento de variedades resistentes. O mesmo não aconteceu com o nematoide do cisto-da-soja, Heterodera glycines Ichinohe, introduzido no País em 1992, e que até hoje representa uma ameaça para a cultura da soja (MARINHO et al., 2003). Outro exemplo recente de praga exótica no Brasil é a do fungo Mycosphaerella fijiensis. Em 1998, uma severa epidemia de sigatoka-negra, causada por essa espécie de fungo, foi constatada em diversas cultivares de banana, no Estado do Amazonas. Essa doença é responsável por perdas de até 100% da cultura na ausência de medidas de controle (CORDEIRO et al., 1998).

Para assegurar um movimento seguro de plantas, a introdução de germoplasma vegetal deve-se basear numa regulamentação fitossanitária eficaz para minimizar o risco da introdução de pragas exóticas no País.

Legislação fitossanitária

A primeira lei relativa à quarentena de plantas foi promulgada na França em 1660, mas somente em 1881 o primeiro acordo internacional sobre fitossanidade foi firmado na Europa, com a finalidade de prevenir a introdução de Phylloxera vitifoliae (Hemíptera: Phylloxeridae) em videira. No Brasil, o início das atividades dos serviços oficiais fitossanitários data de 1909, quando foi criado o Serviço de Inspeção, de Estatística e de Defesa Agrícola, mas somente em 1934 o Regulamento de Defesa Sanitária Vegetal foi publicado no Diário Oficial - Decreto nº 24.114 de 12 de abril de 1934 (BRASIL, 1934). Esse regulamento ainda está em vigor nos dias de hoje e ampliou largamente as atribuições do serviço de inspeção sanitária.

Em maio de 1977, a Portaria Nº 224 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) autorizou a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen) a executar o intercâmbio e a quarentena de germoplasma vegetal destinado à pesquisa. Em 2002, o Laboratório de Quarentena Vegetal do Cenargen foi credenciado pelo Mapa como Estação Quarentenária nível 1, ou seja, “Estação quarentenária com capacidade de detectar e identificar pragas quarentenárias em nível de espécie e que dispõe de instalações adequadas e especialistas renomados nas áreas de virologia, acarologia, nematologia, micologia, bacteriologia, entomologia e plantas invasoras” (BRASIL, 1999).

No que se refere à exportação de vegetais para o comércio, as normas para processamento das importações de sementes e mudas estão estabelecidas na Instrução normativa n° 50 de 29 de dezembro de 2006 (BRASIL, 2006).

No âmbito internacional, o Brasil é signatário da Convenção Internacional de Proteção de Vegetais, realizada em 1951, em Roma, pela Food and Agriculture Organization (FAO), e atualizada em 1997 durante 29ª sessão da Convenção. Essa convenção estipula que os governos devem cooperar entre si por meio de organizações regionais de proteção dos vegetais. Para isso, os países se organizaram em grupos geograficamente próximos para conceber e colocar em prática medidas fitossanitárias de quarentena de plantas no que concerne ao comércio e à pesquisa. As primeiras organizações regionais criadas com esse objetivo foram a European and Mediterranean Plant Protection Organization (Eppo), formada pelos países da Comunidade Europeia, e a North American Plant Protection Organization (Nappo), cujos países membros são os Estados Unidos, o Canadá e o México.

Em 1989, o Brasil, a Argentina, o Paraguai e o Uruguai – países componentes do Mercosul – e o Chile constituíram o Comite de Sanidad Vegetal del Cono Sur (Cosave) com o objetivo de estabelecer regulamentos fitossanitários para o intercâmbio seguro de material vegetal entre esses países. Os acordos comerciais entre esses países e a Organização Mundial do Comércio (OMC) garantem a livre circulação de bens, mas exigem uma nova política fitossanitária baseada em uma análise precisa dos riscos de entrada de pragas e não na proibição geral da entrada de alguns produtos vegetais. O intercâmbio de produtos vegetais entre os países do Mercosul é submetido a regulamentações específicas aprovadas pelo Cosave.

Intercâmbio de germoplasma vegetal

A Embrapa coordena o Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuária (SNPA), que inclui as unidades da Embrapa, as Universidades e as empresas estaduais de pesquisa. Os pedidos de importação de germoplasma das unidades da Embrapa devem ser encaminhados diretamente ao Cenargen/Laboratório de Quarentena Vegetal (LQV), que toma as providências cabíveis junto a Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Mapa. Os requerimentos de importação de germoplasma dos demais órgãos de pesquisa deverão ser enviados diretamente à Superintendência Federal de Agricultura (SFA) do estado correspondente, que os encaminhará à SDA, e esta solicitará um parecer técnico do Cenargen antes de emitir a Permissão de Importação. Os procedimentos posteriores à chegada do germoplasma ao País cabem à DFA, e a quarentena é realizada pelo Cenargen ou por outro órgão de quarentena credenciado pelo Mapa.

Os pedidos de importação de organismos para controle biológico e outros afins, destinados à pesquisa das unidades da Embrapa, devem ser enviados à Embrapa Meio Ambiente que, por sua vez, os encaminhará à SDA /Mapa para obter a permissão de importação.

O Mapa é o órgão fiscalizador da introdução de vegetais junto às alfândegas de portos, aeroportos e correios. Cada estado possui um representante oficial do Mapa na SFA, juntamente com o Ministério da Fazenda (Alfândega da Receita Federal). Para a importação de produtos vegetais para pesquisa, a única exigência requerida do fornecedor do material é o Certificado Fitossanitário expedido pelo país exportador. Quando concedida a Permissão de Importação pela SDA, o Cenargen envia à instituição doadora o pedido de solicitação do material juntamente com a etiqueta de importação. O material, ao chegar ao aeroporto, porto ou correio, é inspecionado pela SFA, que examina as suas condições sanitárias e a documentação e prescreve a quarentena de pós-entrada em alguma instituição credenciada pelo Mapa (MARQUES; MARINHO, 2007).

Desde 1976, o Cenargen vem realizando o intercâmbio e a quarentena do germoplasma destinado à pesquisa, tendo sido intercambiados até novembro de 2007 um total de 526.680 acessos de germoplasma, 391.048 de importação, 58.927 de exportação e 76.705 acessos referentes ao trânsito interno.

As restrições impostas pelas leis brasileiras, quanto ao envio de material vegetal nativo, são em relação ao atendimento das solicitações recebidas dos nossos parceiros internacionais, diminuindo significativamente a quantidade de germoplasma exportado.

O trânsito interno do germoplasma atendeu principalmente a movimentação de material genético destinado à Colbase, aumentando a quantidade e diversidade de acessos armazenados.

Como exemplo, as Figuras 1, 2, 3 e 4 mostram o fluxo de germoplasma vegetal, países importadores e exportadores de germoplasma vegetal, quantidade de germoplasma intercambiado, assim como produtos mais importados e exportados pelo Brasil de 2004 a 2007.

Figura 1. Comparação entre importação e exportação de germoplasma vegetal realizada pelo Serviço de Intercâmbio de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 2. Intercâmbio de Germoplasma Vegetal. 2 A: países que mais receberam germoplasma enviado pelo Brasil (exportação); 2 B: países que mais enviaram germoplasma para o Brasil (introdução).

Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 3. Número de acessos de germoplasma vegetal intercambiado no período de 2004 a 2007.

Fonte: Marinho et al. (2007).

Figura 4. Principais produtos importados (4 A), exportados (4 B) e trânsito interno (4 C) pelo Serviço de Intercâmbio de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia no período de 2004 a 2007.

Fonte: Marinho et al. (2007).

Dentre as instituições internacionais que mais enviaram germoplasma para o Brasil destacam-se: o Centro Internacional para o Melhoramento de Milho e Trigo (Cimmyt), tanto da sua sede no México, quanto das unidades no Uruguai e Colômbia; o Centro Internacional para Agricultura Tropical (Ciat), na Colômbia; o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (Usda), o Centro Internacional da Batata (Cip) no Peru, o Instituto Internacional para a Pesquisa de Arroz (Irri) nas Filipinas e o Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (Csiro) na Austrália. No Brasil, as instituições que receberam maior quantidade de germoplasma do exterior foram: a Embrapa (várias Unidades), o Instituto Agronômico do Paraná (Iapar), a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S.A. (Epagri), a Universidade Estadual Paulista (Unesp) e a Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz (Esalq).

No Cenargen, todas as informações sobre o germoplasma recebido são conferidas pelo curador dos respectivos produtos e registradas no Sistema Brasileiro de Informação de Recursos Genéticos (Sibrargen).

Quarentena de germoplasma vegetal

A palavra quarentena é derivada do latim quadraginata que significa quarenta. Em italiano, essa palavra foi originalmente aplicada para o período de 40 dias de isolamento requerido para que um navio, incluindo seus passageiros e carga, permanecesse ancorado em um porto de chegada quando proveniente de um país onde ocorressem doenças epidêmicas. Provavelmente, a primeira quarentena foi imposta em Veneza, Itália, em 1374, quando viajantes suspeitos de ter contraído a peste bubônica foram banidos. Quarentena vegetal, literalmente, significa o isolamento de plantas por 40 dias, período de incubação para o aparecimento e detecção de sintomas de doenças. Na verdade, esse procedimento constitui apenas uma fração das diversas ações que são utilizadas em um programa de exclusão de organismos indesejáveis (KAHAN, 1989).

As medidas de quarentena aplicadas aos produtos vegetais podem ser de exclusão ou de erradicação. Em caso de exclusão, os riscos de entrada dos agentes patogênicos são minimizados pelo controle da sua ausência no material vegetal antes da importação. Ao contrário, a erradicação autoriza a aplicação de tratamentos térmicos, químicos, biológicos ou de limpeza por meio de cultura de tecido quando o vegetal já está dentro do país importador (KAHAN, 1989).

Por definição, uma praga quarentenária é um organismo de risco econômico potencial para a área posta em perigo e onde ainda não está presente, ou, se está, não se encontra amplamente distribuída e está oficialmente controlada. Considera-se praga quarentenária A1 aquelas não presentes no país, porém com características de serem potenciais causadoras de importantes danos econômicos se introduzidas. Pragas quarentenárias A2 são aquelas de importância econômica potencial, já presentes no País, porém não se encontram amplamente distribuídas e possuem programa oficial de controle.

Para decidir quais espécies são de importância quarentenária, para o país ou região, várias informações devem ser consideradas. É necessário avaliar o potencial das espécies exóticas em causar prejuízos no país em questão. Esse processo é o componente preliminar da Análise de Risco de Pragas (ARP).

Métodos de diagnósticos, erradicação e medidas de controle de pragas

O Laboratório de Quarentena da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia analisa todo o germoplasma vegetal que entra no País para pesquisa. Esse procedimento visa minimizar a possibilidade de entrada de numerosas pragas de importância quarentenária e econômica para o País.

A detecção de um agente patogênico, por exemplo, dentro do quadro de um procedimento de certificação ou de quarentena, exige prioritariamente que a sensibilidade da técnica adotada permita evidenciar uma infecção latente em plantas que não apresentam sintomas. A identificação requer a utilização de técnicas que apresentem níveis de especificidade suficientes para caracterizar o agente causal com uma precisão adaptada ao problema encontrado (MARINHO, 2001).

Os progressos na área de biologia permitiram o aparecimento de inúmeras técnicas possibilitando a caracterização de moléculas imunogênicas, em particular as proteínas ou as sequências de ácidos nucleicos. Esses métodos abrem novas perspectivas dentro do diagnóstico de fitopatógenos e apresentam desenvolvimentos constantes (MARINHO, 2001).

O Laboratório de Quarentena Vegetal conta com seis unidades de pesquisa especializadas: entomologia, acarologia, micologia, virologia, nematologia e bacteriologia. Cada unidade possui estrutura e metodologias próprias para detecção, identificação, caracterização e erradicação dessas pragas.

Unidades de acarologia e entomologia

Destina-se à detecção, identificação e erradicação de insetos e ácaros em todo germoplasma intercambiado.

O germoplasma vegetal é examinado diretamente no interior de armadilhas luminosas, utilizando-se refletor e/ou microscópio estereoscópio para a detecção de insetos e/ou ácaros, sempre procurando por ovos, formas imaturas e/ou adultos no material, ou vestígios – perfurações, excreções ou teias (OLIVEIRA et al., 1999).

Para detecção de espécies de ácaros, as sementes são mantidas em temperatura ambiente, peneiradas, e os resíduos depositados em placa de Petri. Essa placa é colocada dentro de outra maior contendo álcool 70% para evitar o escape dos ácaros. Os resíduos do peneiramento das sementes são examinados ao microscópio estereoscópio (NÁVIA et al., 1999).

Também são procuradas sementes contaminantes, ou seja, sementes de plantas invasoras, que não fazem parte do material vegetal solicitado.

Tratamento para controle e erradicação de insetos e ácaros

Semente: todo germoplasma importado, exportado ou em trânsito no país sob a forma de sementes é fumigado com fosfeto de alumínio a 56% (fosfina) por um período de 72 horas quando a umidade relativa está acima de 50% e a temperatura no local acima de 20 ºC. Em ambientes, com temperatura e umidade relativa abaixo desses valores, o período de exposição é de 96 horas. O tratamento é realizado dentro de tambores e em sala hermeticamente fechados, com as embalagens das sementes perfuradas com estilete para facilitar a penetração do gás.

Material de propagação vegetativa: estacas, bulbos, rizomas e outras formas de propagação vegetativa intercambiados são submetidos a tratamento químico que consiste na imersão do material, por 15 minutos, em calda contendo inseticida e acaricida (NÁVIA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 1999).

Unidade de micologia

Esta unidade destina-se à detecção, identificação e erradicação de fungos fitopatogênicos em germoplasma vegetal importado. Para tanto, utiliza várias metodologias de análise, de acordo com o tipo de material recebido. Na Figura 5, exemplo de interceptação de fungo exótico em germoplasma de batata, importado da França, introduzido no Brasil para melhoramento genético (MENDES et al., 2006).

Figura 5. Tubérculo de batata (Solanum tuberosum) infectado por Phoma exigua var. foveata, fungo exótico ao Brasil, mostrando sintomas externos e internos de podridão.

Fotos: Vera Marinho

As amostras de sementes ou de material de propagação vegetativa, ao chegar ao laboratório, são examinadas diretamente ao microscópio estereoscópio para a observação de sintomas de descoloração do tecido, lesões necróticas ou presença de estruturas fúngicas. Essas sementes e/ou os fragmentos de material de propagação vegetativa são distribuídos em placas de Petri contendo meio de batata-dextrose-ágar (BDA) ou outro meio de cultura específico, após terem sido desinfetadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 0,2% por 2 minutos e lavadas por 2 vezes em água destilada estéril. As placas são incubadas à temperatura de 25 °C a 28 °C, sob luz fluorescente contínua, por 7 a 8 dias (ISTA, 1976). Outra metodologia utilizada consiste em colocar as sementes em caixas plásticas do tipo gerbox contendo 2 folhas de papel de filtro umedecidas em solução de hipoclorito de sódio a 0,2% e incubadas em câmara com fotoperíodo de 12 horas de luz NUV (Near Ultra Violet) e 12 horas de escuro, durante 7 a 8 dias para esporulação. Após esse período, as sementes são examinadas ao microscópio estereoscópio para observação de estruturas fúngicas, isolamento e posterior identificação do fungo (ISTA, 1976).

Identificação de fungos fitopatogênicos

A identificação é realizada por meio de observações das características morfológicas e fisiológicas desses fungos ao microscópio estereoscópio e de luz. A confirmação da ocorrência no Brasil dos fungos identificados no germoplasma importado é feita por consulta ao livro Fungos em Plantas no Brasil (MENDES et al., 1998) e a revistas especializadas sobre o assunto.

Teste de patogenicidade em quarentenário

São realizados testes de patogenicidade para fungos patogênicos de ocorrência no Brasil ou exóticos com o objetivo de verificar o grau de virulência ou de danos causados na planta hospedeira. A técnica consiste em fazer uma suspensão de 104 a 106 esporos/mL do fungo cultivado em meio de cultura BDA ou V8. Em seguida, a suspensão de esporos é inoculada em plântulas da mesma espécie vegetal da qual o fungo foi isolado e mantidas em câmara úmida até o surgimento dos sintomas. Procede-se, então, o isolamento do fungo das lesões para confirmação da sua patogenicidade (MENDES; FERREIRA, 1994).

Tratamento para controle/erradicação de fungos em germoplasma vegetal

As sementes contaminadas com fungos exóticos ou que já são de ocorrência no País são tratadas quimicamente com fungicidas específicos de contato e/ou sistêmicos. Após o tratamento, a eficiência do mesmo é avaliada com a reanálise do material (ISTA, 1976). O material é enviado ao destinatário quando confirmada a erradicação da praga. Quando o tratamento químico não elimina a praga exótica, recomenda-se o emprego da técnica de cultura de tecidos. Nesse caso, a eficiência do método na erradicação do patógeno é de 100%.

Unidade de virologia

Destina-se à detecção, identificação e erradicação de vírus, viroides e fitoplasmas em germoplasma vegetal importado. De maneira geral, o diagnóstico da infecção viral em vegetais repousa sobre: a) detecção do agente patogênico por enxertia ou inoculação mecânica de plantas indicadoras (métodos biológicos); b) colocação em evidência de moléculas imunogênicas sintetizadas pelo agente patogênico (métodos imunológicos); c) revelação da sequência de ácidos nucleicos específicos ao genoma do agente patogênico (métodos moleculares) (MARINHO, 2001). Vários métodos são utilizados na detecção e identificação de vírus e viroides, dependendo do material recebido. Dos mais utilizados para o diagnóstico destacam-se os métodos que seguem.

Observação de sintomas em plântulas

As sementes são semeadas em caixas com solo esterilizado e mantidas em casa de vegetação para observação de sintomas típicos causados por vírus ou viroides (mosaico, deformação foliar, super brotamento, estrias, epinastia, clorose, etc.) em plântulas. Caso sejam observados alguns desses sintomas, procede-se a coleta de material para a execução de testes específicos (Figura 6).

Figura 6. Plantio em quarentenário para observação de sintomas em plântulas.

Foto: Vera Marinho

Inoculação mecânica em plantas hospedeiras

Folhas de plântulas apresentando sintoma são coletadas, trituradas em tampão fosfato (diluição 1/10) e o suco distribuído sobre as folhas das plantas indicadoras previamente pulverizadas com uma fina camada de carborundum. A inoculação é realizada com o dedo ou cotonete. Após a inoculação, as plantas são lavadas com água corrente para retirar o excesso de carborundum. Espera-se em torno de 7 dias para o aparecimento de lesões locais, e 14 dias para o aparecimento de sintomas sistêmicos.

Microscopia eletrônica (ME)

Duas técnicas são utilizadas para observar a presença de partículas de vírus em uma planta infectada. São elas:

(i) Leaf-dip (KITAJIMA, 1965) – Folhas mostrando sintomas de vírus são cortadas em pequenos pedaços e colocadas em uma gota de 1% de silicotungstato de sódio ou de acetato de uranila, ambas substâncias utilizadas para contraste em ME. Sobre a gota com o material triturado, coloca-se uma telinha de cobre, específica para ME, e deixa-se por 2 minutos. A telinha é retirada do líquido e, após remover o excesso de líquido da mesma, pode-se então examiná-la ao microscópio eletrônico.

(ii) Secções ultrafinas (KARNOVSKY, 1965) – Pedaços pequenos de tecido vegetal (folhas, caule, raízes, etc.), provenientes de plantas infectadas, são fixados em 2% de glutaraldeído/paraformaldeído em tampão cacodilato de sódio (0.02 M, pH 7,2) por uma noite. Após lavagem do material em tampão cacodilato, os fragmentos são pós-fixados em tetróxido de ósmio (1% em tampão cacodilato 0.05 M) por 2 horas. Em seguida, os fragmentos são lavados com água destilada e colocados em acetato de uranila (0,5% solução) por uma noite. Desidratam-se os fragmentos em acetona 50%, 70%, 90% (uma vez) e 100% (3 vezes). No passo seguinte, o material é colocado em uma mistura de resina/acetona (1:1) por 4 horas, e em resina pura por 1 noite. A polimerização é feita em um molde de silicone a 70 ºC por 72 horas. Secções ultrafinas (50 nm) são realizadas utilizando-se ultramicrótomo e coradas com acetato de uranila (3%) por 20 minutos e em citrato de chumbo por 10 minutos. As secções ultrafinas são montadas em telinha de cobre e observadas ao microscópio eletrônico (Figura 7).

Figura 7. Micrografias eletrônicas de partículas de vírus alongados e esféricos e de inclusões causadas por Potyvirus.

Fotos: Vera Marinho

DAS-Elisa (SALAZAR, 1982)

É o teste imunológico utilizado para a detecção e identificação do vírus associado aos sintomas observados. Coloca-se nos orifícios de uma placa de poliestireno, própria para o teste de Elisa, IgG específico (antissoro) para o vírus a ser testado. Incuba-se a placa por 3 horas a 37 °C. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, os orifícios são cobertos com as amostras a serem testadas (antígenos) e mantidas em geladeira (4 ºC) por 1 noite. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, os orifícios são cobertos com uma solução de conjugado (anticorpo + enzima), e as placas incubadas por 3 a 4 horas a 37 °C ou à temperatura ambiente por 5 horas. Após 4 lavagens da placa, de 3 minutos cada, com tampão PBS, um substrato da enzima é adicionado em cada orifício, e a placa é deixada à temperatura ambiente. Depois de 1 hora, uma primeira leitura é realizada.

Polymerase Chain Reaction (PCR) e Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

São testes moleculares usados para aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico. Suspeitando-se, por meio dos sintomas nas plantas após plantio das sementes e levantamento bibliográfico, da praga que está infectando o material vegetal analisado, extrai-se DNA ou RNA total dessas plantas e utiliza-se esse ácido nucleico como modelo para a detecção, como é o caso da grande maioria dos vírus de plantas e dos viroides. A reação PCR deve ser precedida de uma transcrição inversa do RNA viral (RT) em DNA complementar (cDNA). O ciclo da reação PCR, compreendendo as etapas de desnaturação, hibridização e alongamento do DNA, é repetido de 30 a 60 vezes. Após o término da reação PCR, o produto de amplificação é revelado em gel de agarose 1%, corado com brometo de etidium e observado sob luz ultravioleta (HADIDI et al., 1993; HALPER; HILLMAN, 1996).

Métodos para erradicação de vírus e viroides

Não existe tratamento químico que erradique vírus e viroides em plantas infectadas. Para a erradicação de vírus, submete-se o material infectado à termoterapia e/ou cultura de meristema. No caso de infecção por viroides, a limpeza do material só poderia ser eficiente utilizando-se crioterapia seguida de cultura de meristema. Esse procedimento ainda não é utilizado em quarentena.

Unidade de nematologia

Destina-se à detecção, à identificação e à erradicação de nematoides fitoparasitas em germoplasma vegetal importado, sendo utilizadas várias metodologias dependendo do tipo de material recebido.

Descascamento manual

Para amostra com pequena quantidade de sementes, principalmente aquelas que apresentam glumas e glumelas, como Panicum ou sementes de arroz, as partes externas das sementes são separadas do embrião e do endosperma, colocadas em água, por no mínimo 2 horas, e examinadas ao microscópio estereos-cópico para detecção de nematoides e posterior identificação (TENENTE et al., 1994).

Trituração

As sementes podem ser trituradas diretamente ou após a pré-imersão em água destilada durante 16 a 18 horas. Em ambos os casos a trituração das sementes em liquidificador deve ser de 20 a 30 segundos. A quantidade de água deve cobrir as sementes antes de triturá-las. Essa técnica não é recomendada para todo tipo de sementes, pois sementes de leguminosas, após a trituração, não podem ficar imersas, devem ser imediatamente passadas por peneiras e lavadas em água corrente. Nesse caso, como há fermentação, os nematoides ficam paralisados ou morrem por falta de oxigenação, não sendo possível recuperá-los (ZUCKERMAN et al., 1990).

Peneiramento

Utiliza-se um conjunto de peneiras de porosidade diferentes, de acordo com o material a ser usado nas extrações (solo, raiz, ou sementes) e da espécie de nematoide a ser recuperado. As peneiras comumente utilizadas são de porosidade de 0,149 mm (100 mesh); 0,074 mm (200 mesh); 0,037 mm (400 mesh) e 0,027 mm (500 mesh). O material em extração é lavado sobre uma ou mais peneiras, com água corrente, e recolhido em um becker seguido da observação em microscópio estereoscópio (ZUCKERMAN et al., 1990). Esse método é usado em combinação com outras técnicas de extração – trituração, bandeja, funil de Baermann – para melhor visualização dos nematoides em microscópio.

Unidade de bacteriologia

Destina-se à detecção, à identificação e à erradicação de bactérias fitopatogênicas em germoplasma vegetal importado. As bactérias fitopatogênicas são procariotos capazes de causar doenças em plantas e podem ser divididas em fastidiosas e não fastidiosas. Geralmente, as bactérias fastidiosas são estudadas por meio de microscopia de transmissão ou de testes moleculares, já que não podem ser cultivadas facilmente. Nessa categoria estão incluídos espiroplasmas, fitoplasmas e liberobactérias limitados ao floema. Estão incluídas também as bactérias limitadas ao xilema, como Xylella fastidiosa, causadora da clorose-variegada-dos-citrus (CVC). As principais bactérias fitopatogênicas não fastidiosas pertencem a 11 espécies: Erwinia, Pantoea, Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Xanthomonas, Xylophilus, Agrobacterium, Clavibacter e Curtobacterium (BRADBURY, 1986; HOLT, 1993; LELLIOTT; STEAD, 1987; SCHAAD et al., 2001).

Estes patógenos podem estar associados a sementes, materiais de propagação vegetativa, restos de cultura, solos, nematoides e insetos. A análise oficial de materiais provenientes de países estrangeiros, num sistema de quarentena, visa detectar a presença de bacterioses ainda não registradas na região ou país onde os materiais são introduzidos (MARQUES et al., 1994).

As taxas de infecção bacteriana em lotes de sementes são frequentemente baixas, variando de menos de 0,01% a 1%, o que dificulta sua detecção (SAMSON et al., 1999). Essa detecção é realizada por diferentes técnicas: (i) isolamento e cultivo do patógeno in vitro; (ii) microscopia ótica e eletrônica; (iii) sorologia; (iv) inoculação em plantas suscetíveis; e (v) uso de técnicas moleculares. A identificação do organismo isolado utiliza igualmente essas técnicas, além de testes bioquímicos (SCHAAD et al., 2001). A análise bacteriológica de sementes é feita por amostragem por meio de dois métodos: o plaqueamento do lavado de grãos em meio de cultura geral ou semisseletivo, se disponível, seguido da repicagem e identificação das bactérias isoladas, do plantio das amostras em solo esterilizado e da observação das plantas, anotando-se a presença de sintomas (MARQUES et al., 1995).

Variações desse método visando à detecção mais eficiente de patógenos específicos também são utilizadas, como a germinação de sementes de arroz em papel toalha para detecção de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e pv. oryzicola (MEW; MISRA, 1994). Quando o germoplasma é introduzido na forma de estacas, bulbos, rizomas ou tubérculos, o material é plantado em quarentenário e observado quanto à presença de sintomas.

Todo material que apresentar sintomas de infecção bacteriológica é processado em laboratório visando ao isolamento do organismo patogênico em meio de cultura (GARDAN; LUISETTI, 1987). Quando há crescimento de colônias bacterianas, as mesmas são analisadas com respeito à sua morfologia, à fisiologia e aos caracteres nutricionais e de patogenicidade, visando à sua identificação, que pode ser complementada por testes imunológicos como Elisa, imunodifusão e imunofluorescência. Métodos moleculares, como reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização de sondas de ácidos nucleicos, estão sendo desenvolvidos e testados para serem complementados na rotina de inspeção (CROWTHER, 1995).

Referências

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BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução normativa, n° 16 de 29 de dezembro de 1999. Aprova as normas para cadastramento e credenciamento de estações quarentenárias para vegetais, partes de vegetais e organismos vivos. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 30 dez. 1999, seção 1, p. 33.

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Glossário

Ácido desoxirribonucleico (DNA): portador da informação genética; um tipo de ácido nucleico que ocorre nas células, contendo ácido fosfórico, D-2-desoxirribose, adenina, guanina, citosina e timina.

Ácido nucleico: uma classe de moléculas constituída por nucleotídeos complexos; os tipos são ácido desoxirribonucleicos (DNA) e ácido ribonucleico (RNA).

Ácido ribonucleico (RNA): ácido nucleico que existe no citoplasma e no nucléolo contendo ácido fosfórico, D-ribose, adenina, guanina, citosina e uracila.

Aclimatização: processo de adaptação da planta às condições ambientais, após sua remoção da condição in vitro, antes do transplante para o local definitivo.

Adventício: órgão vegetal formado em posição diferente daquela onde se origina no curso normal de desenvolvimento. Por exemplo, raiz formada em um segmento de caule ou diferenciação de uma gema a partir da raiz.

Ágar ou agente solidificante: produto vegetal extraído de algas marinhas vermelhas (Rhodophyceae), usado para solidificar o meio de cultura.

Agente antimicrobiano: agente químico ou biológico que destrói ou inibe o crescimento.

Água deionizada, demineralizada ou destilada: água livre de certas impurezas, particularmente sais e diversos íons.

Aminoglicosídio: antibiótico que se liga diretamente à subunidade 30S do ribossoma, impedindo a síntese proteica em organismos suscetíveis. Estes compostos são bactericidas quando usados em concentrações altas, e bacteriostáticos quando em concentrações baixas. Exemplos de aminoglicosídios incluem a canamicina, gentamicina, neomicina, estreptomicina, entre outros.

Ampicilina: antibiótico pertencente ao grupo das penicilinas que inibe a biossíntese de mucoproteína da parede celular dos organismos susceptíveis.

Amplo espectro: efetivo contra muitos organismos.

Anfipático: composto que contém um grupo polar ou ionizado em uma das extremidades da molécula e uma região apolar na outra extremidade.

Antera: parte dos estames onde estão os sacos polínicos.

Antibacteriano: definição de agentes que matam ou previnem o crescimento de bactérias.

Antibiótico: substância solúvel que inibe o crescimento de outros microrganismos. Dentre os antibióticos, há as penicilinas, as cefalosporinas, os aminoglicosídios, as tetraciclinas, etc.

Anticorpo monoclonal: anticorpo produzido por um clone de células geneticamente idênticas derivadas de uma única célula produtora de anticorpos denominada hibridoma. O anticorpo é homogêneo e específico para um único epitopo.

Antioxidantes: produtos químicos que evitam a oxidação.

Ápice caulinar: porção terminal (de 0,5 mm a 2 mm) de um broto composta pelo domo meristemático (de 0,01 mm a 0,3 mm) acompanhado de primórdios foliares e tecidos adjacentes da haste.

Assepsia: na cultura in vitro, significa ausência de qualquer microrganismo.

Autoclavagem: esterilização por vapor d’água em temperatura de 121 ºC, por um período de 10 a 30 minutos, dependendo do material.

Autotróficas: plantas ou outros organismos capazes de sintetizar suas próprias substâncias orgânicas, a partir de componentes inorgânicos simples, mediante fotossíntese ou quimiossíntese.

Auxinas: classe de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou funcionalmente relacionados ao hormônio natural AIA (ácido indolacético), que causam alongamento celular, dominância apical, enraizamento e outros fenômenos. As auxinas mais usadas em cultura de tecidos vegetais são ANA (ácido naftalenoacético), 2,4 D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e AIB (ácido indolbutírico).

Axênico: desprovido de qualquer microrganismo, seja vírus, viroides, micoplasma, fungos, bactérias ou outros organismos considerados estranhos à cultura. Ver estéril.

Bactéria: grupo diverso e ubiquitário de microrganismos procarióticos unicelulares.

Bactericida: agente que destrói as bactérias.

Bacteriostático: agente ou substância capaz de inibir o crescimento de bactérias.

Biorreator: recipiente onde ocorre uma reação biológica, em geral, fermentação ou biotransformação. Local onde células de espécies vegetais são mantidas em suspensão, para a produção de compostos úteis ao homem, e, mais recentementes, equipamentos em que são conduzidos cultivos de explantes específicos, tendo como finalidade a produção de mudas em larga escala.

Biorreator de imersão temporária: biorreator no qual o explante é submetido à imersão periódica no meio de cultura, durante alguns minutos por dia, o que é suficiente para permitir uma boa nutrição do material em cultivo. Durante o período de imersão, há também renovação do ar no interior dos frascos.

Calo: aglomerado de células não organizadas, irregularmente diferenciadas, que se multiplicam desordenadamente e se desenvolvem a partir de tecidos vegetais, normalmente em resposta a injúrias químicas ou físicas.

Canamicina (sulfato de): antibiótico da classe dos aminoglicosídios, produzido por cepas de Streptomyces Kanamycetius. É uma substância polibásica, termoestável, hidrossolúvel constituída de dois aminoaçúcares. Apresenta atividade antibacteriana contra muitas espécies aeróbicas gram-positivas e gram-negativas. Age interferindo na síntese proteica em células bacterianas, ligando-se à subunidade 30S do ribossoma, sintetizando peptídios incorretos na cadeia proteica e causando morte das células bacterianas.

Caramelização: açúcar queimado em ponto vítreo.

Carbenicilina: penicilina semissintética com largo espectro ativo contra ampla variedade de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Caseína hidrolisada: proteína purificada do leite e submetida à hidrólise ácida ou enzimática.

Catalase: enzima que transforma o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.

Cefalosporina: classe de antibióticos que tem ação bactericida ou bacteriostática, dependendo da suscetibilidade do microrganismo. É mais eficiente em microrganismos em divisão celular ativa que em células em repouso. Atua como inibidor da biossíntese da parede celular.

Citocininas: classe de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou funcionalmente relacionados ao hormônio natural zeatina. Causa divisão celular, diferenciação celular e de brotos, quebra de dominância apical e outros fenômenos. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos vegetais são: cinetina, BAP (benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina).

Clonagem: ato de se obter novas culturas por meio de subcultivos, ou de inserir um gene específico ou uma sequência de DNA em uma molécula vetora.

Clone: população de plantas oriundas de um único indivíduo por propagação vegetativa, ou população de células oriundas por mitose de uma única célula isolada, ou população de células ou organismos de genótipo idêntico.

Cloraminas: compostos orgânicos contendo cloro, utilizados como desinfestantes.

Cloranfenicol: antibiótico originalmente obtido de Streptomyces venezuelae, que inibe a síntese proteica em bactéria ao ligar-se à subunidade 50S do ribossoma em organismos suscetíveis. Tem ação contra organismos gram-positivos e gram-negativos.

Colchicina: alcaloide que interfere na organização das fibras do fuso, impedindo a sua formação e a consequência disjunção dos cromossomos-filhos. A aplicação dessa substância em células meióticas pode resultar em duplicação cromossômica.

Contaminação: entrada de organismos indesejáveis em algum material ou objeto.

Contaminação endofítica: contaminação que se encontra presente no interior dos tecidos da planta doadora de explantes, seja nos feixes vasculares ou nos espaços intercelulares.

Corinebactérias: microrganismos do gênero Corynebacterium, que é constituído de células pleomórficas, gram-positivas, imóveis e não esporuladas. As corinebactérias podem se apresentar individualmente, em pares ou paliçadas, e sob as formas cocoides, bacilares, e filamentosas.

Cotilédone: folha embrionária, que é única nas monocotiledôneas, dupla nas dicotiledôneas, ou numerosa nas gimnospermas, podendo conter reservas.

Cultura em suspensão: cultura de células individuais, agregadas ou tecidas em meio líquido, frequentemente sob agitação para fornecer aeração adequada.

Desinfecção: processo em que se utiliza uma substância química para destruir microrganismos patogênicos. Eliminação de microrganismos localizados internamente nos tecidos ou órgãos.

Desinfestação: eliminação das células vegetativas de microrganismos, dotados de potencial patogênico, de materiais ou ambientes inanimados. Eliminação de microrganismos localizados à superfície do tecido ou órgão, utilizando-se soluções desinfestantes, tais como hipoclorito de sódio ou cálcio, álcool, cloreto de mercúrio, etc.

Desnaturação: modificação, por ação física ou química, da estrutura de uma substância orgânica, especialmente uma proteína.

Detergente: agente sintético de limpeza, contendo substâncias tensioativas que não precipitam em água.

Dominância apical: supressão do crescimento das gemas laterais pela gema apical.

Dormência: condição em que o crescimento é suspenso ou reduzido por controle endógeno, mesmo quando as condições ambientais são favoráveis. Ocorre em órgãos de reserva (bulbos e tubérculos), em gemas e em sementes, entre outros órgãos vegetais.

Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay): técnica de diagnóstico sorológico que utiliza um anticorpo ligado quimicamente a uma enzima. Também denominado de EIE (enzima imunoensaio).

Embriogênese: processo de iniciação e desenvolvimento de um embrião que pode ser sexual (embrião zigótico, embriogênese propriamente dita) ou assexual (embrião somático, embriogênese somática).

Endofítico: organismo dentro do tecido vegetal.

Endógeno: produzido ou originado no interior.

Enzima: catalisador orgânico produzido por um ser vivo.

Epiderme: superfície externa da pele.

Epífita: diz-se da planta que se fixa sobre outra, sem parasitá-la.

Epifítico: organismo vivendo na superfície do tecido vegetal.

Espiroplasmas: ver fitoplasma.

Esporo: organela de resistência formada por certos microrganismos.

Esporulação: processo de formação de esporos.

Estéril: isento de qualquer forma de vida. Ver axênico.

Esterilização: consiste na eliminação de todos os microrganismos; normalmente efetuada por autoclavagem.

Estreptomicina: antibiótico da classe dos aminoglicosídios. Age interferindo com a síntese proteica em células bacterianas, ligando-se à subunidade 30S do ribossoma, causando erro na leitura do código genético; formando sequências de peptídios incorretas na cadeia proteica e causando a morte das células bacterianas. Antibiótico obtido de Streptomyces griseus, de ação contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Excisão: remoção de parte da planta ou órgão por meio de um corte ou cisão.

Explante: segmento de tecido ou órgão vegetal retirado do seu sítio natural original e utilizado para iniciar uma cultura in vitro.

Exsudato: material mais ou menos fluido encontrado em lesões ou tecido inflamado.

Fastidiosos: organismos procarióticos que têm requerimentos nutricionais e de crescimento específicos.

Fermentação: processo que resulta na formação de álcoois ou ácidos orgânicos, é característica das infusões de matéria vegetal e é uma consequência da degradação de carboidratos, geralmente os compostos orgânicos predominantes no material vegetal.

Filtros bacteriológicos: tipo especial de filtro por meio do qual as bactérias não podem passar.

Fitopatógeno: organismo que produz enfermidade nas plantas.

Fitoplasmas: juntamente com os espiroplasmas e micoplasmas formam a classe dos Molicutes. Organismos procarióticos desprovidos de parede celular e que compartem outras características citológicas e moleculares incomuns. Embora superficialmente similares à forma-L das bactérias, os molicutes são taxonomicamente distintos.

Flambagem: ato de esterilizar ferramentas ou certos tipos de explantes mergulhando-os primeiramente em álcool e depois expondo-os rapidamente na chama.

Fluxo laminar: fluxo sem turbulência (ar esterilizado).

Forma-L: bactérias que perderam total ou parcialmente a parede celular.

Formalina: solução aquosa de formaldeído de 37% a 40%.

Frutificação: nome dado ao estágio de reprodução dos fungos, em que os corpos de frutificação ou propágulos, originados pela diferenciação do micélio aéreo (, passam então a constituir o micélio reprodutivo.

Gema: unidade de propagação unicelular ou pluricelular em organismos vegetais.

Genótipo: conjunto particular de genes presentes em células de organismos; constituição genética de um organismo.

Gentamicina: antibiótico pertencente à classe dos aminoglicosídios. Age interferindo com a síntese proteica em células bacterianas, ligando-se à subunidade 30S do ribossoma, causando erro na leitura do código genético e formando sequências de peptídios incorretas na cadeia proteica,causando a morte das células bacterianas.

Germicida: um agente capaz de matar germes, geralmente microrganismos patogênicos.

Germoplasma: variabilidade total disponível para uma espécie.

Glicose: carboidrato classificado como monossacarídeo (hexose), utilizado como fonte de energia por muitos microrganismos; também denominado dextrose ou açúcar de uva.

Heterotrófico: organismo incapaz de produzir hidratos de carbono a partir de água e dióxido de carbono. Esses compostos devem ser fornecidos ao organismo para sua sobrevivência.

Hibridização: processo de produção de híbridos, isto é, produto de cepas geneticamente diferentes.

Hidrofílico: característica de substâncias que interagem com água.

Hidrofóbico: característica de substâncias que repelem a água e que interagem entre si, gerando um ambiente ou fase não aquosa.

Hidrólise: quebra de ligações químicas entre moléculas por meio da intervenção de uma molécula de água.

Hifa: filamento de micélio.

Hipocloritos: compostos contendo cloro utilizados como desinfestantes e agentes sanificantes.

In vitro: em vidro ou sob condições de laboratório, em meio de cultura, em condições assépticas.

In vivo: refere-se a fenômenos que ocorrem nas células ou organismos vivos.

Incubação: em microbiologia, significa manutenção de culturas de microrganismos em condições (especialmente temperatura) favoráveis para o seu crescimento.

Indexação: processo de detecção de patógenos em plantas ou culturas, visando à identificação de plantas sadias.

Infecção: condição patológica em razão do crescimento de microrganismos em um hospedeiro.

Inoculação: introdução da bactéria, fungo, parte da planta ou célu-las animais em meio nutritivo, para o estabelecimento da cultura.

Íon: átomo ou grupo de átomos que ganham ou perdem elétrons e adquirem uma carga elétrica líquida.

Latência: estado de inatividade entre um estímulo, como a infecção de uma planta por um patógeno, e a resposta por ele provocada no hospedeiro, sem apresentação de sintomas. Sementes que não germinam durante o estado de repouso, ou seja, dormente, mas capaz de se desenvolverem sob certas condições.

Leveduras: fungos que se apresentam, usual e predominantemente, sob forma unicelular. Diferem das algas, pois não efetuam a fotossíntese. Possuem uma parede celular rígida e se distinguem facilmente das bactérias em virtude das suas dimensões maiores e de suas propriedades morfológicas.

Lux: unidade de medida da luz incidente que ilumina uma superfície de 1 m2 situada a 1 m da fonte de irradiação.

Meios de cultura: substâncias utilizadas para fornecer nutrientes para o crescimento e multiplicação de microrganismos.

Meristema: grupo de células vegetais não diferenciadas, que se dividem ativamente. Os meristemas podem ser apicais (extremidades de brotos e raízes), laterais (câmbio vascular, casca) e intercalares (região nodal e base das folhas jovens).

Micoplasma: organismo procarioto causador de doenças em plantas; é o menor microrganismo de vida livre com ribossomas, DNA e RNA.

Micropropagação: refere-se às técnicas para propagação de plantas in vitro, incluindo cultura de ápices caulinares e segmentos nodais, embriogênese somática e formação de gemas adventícias em explantes.

Microrganismo: qualquer organismo de dimensões microscópicas.

Molicutes: menores organismos celulares capazes de se autorreplicar, têm de 0,3 µm a 1,2 µm de diâmetro e genoma de 108 a 109 daltons. Não possuem parede celular (do inglês: moll = macio; cute = pele), embora tenham, como precursores, bactérias gram-positivas constituídas de parede celular.

Ooze: massa de células bacterianas misturadas com fluidos do hospedeiro.

Oxidação: escurecimento de tecidos cortados que resulta da reação de compostos fenólicos, liberados ao meio, com o oxigênio.

P/V – Peso/Volume: indica a concentração de um composto sólido em água. Exemplo: sacarose 3%, significa 30 g/1.000 mL.

Patogênico: organismo capaz de produzir doença.

Penicilina: antibiótico; substância que atua contra microrganismos pela inibição da síntese da parede celular durante o processo de divisão celular ativa.

Peptona: proteína parcialmente hidrolisada.

Plântula: planta que começa a desenvolver-se na germinação da semente; planta recém-nascida.

Plasmodesmatas: conexão entre dois protoplastos de células adjacentes por um canal formado na parede celular, facilitando a comunicação e o transporte entre células vizinhas. Em resposta a mudanças ambientais, fisiológicas ou no desenvolvimento, a permeabilidade dos plasmodesmatas pode aumentar ou diminuir o transporte simplástico entre células.

Polimerização: reação em que duas ou mais moléculas menores se combinam, formando outras maiores que contêm os mesmos elementos na mesma proporção que as pequenas.

Processos metabólicos: série de etapas na transformação química de moléculas orgânicas.

Própolis: substâncias resinosas segregada pelas abelhas e usadas para vedar frestas.

Proteína: classe de compostos nitrogenados orgânicos e com-plexos formados por um número muito grande de aminoácidos, unidos por meio de ligação peptídica.

Protoplasto: célula desprovida da parede celular.

Pseudomonas: gênero (Pseudomonas) de bactérias que compreende mais de 100 espécies. São bastonetes curtos e gram-negativos. Pode ser encontrado em distintos ambientes, tais como solo, água e tecidos de animais e plantas.

Quimioterapia: tratamento de uma doença pelo uso de substâncias químicas.

Radiação gama: radiação eletromagnética de comprimento de onda de 10-10 m a 10-14 m, produzida por cobalto radiativo.

Recultivo: ato de transferir toda uma cultura para novo meio.

Regeneração: formação de novas partes a partir de tecidos derivados in vitro; em particular, formação de plantas completas a partir de calos ou órgãos em cultura.

Rejuvenescimento: reversão da fase adulta para a juvenil.

Repicagem: subdivisão de uma cultura em vários novos explantes, os quais são transferidos para um novo meio.

Ribossomo: unidade estrutural citoplasmática constituída por RNA e proteínas; é o local da síntese de proteínas.

Rifamicina: antibiótico da classe dos miscelâneos. Age reprimindo a iniciação da cadeia para a síntese de RNA em células bacterianas susceptíveis, pela inibição do DNA-dependente da polimerase de RNA. É efetivo contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.

RNA mensageiro: substância intermediária que passa informações do DNA da região nuclear para os ribossomos no citoplasma.

RNA polimerase: enzima que sintetiza mRNA a partir do DNA.

Saprófitos: microrganismos que obtêm o alimento de que necessitam a partir de organismos mortos ou de substâncias orgânicas em decomposição (do grego sapros = pútrido; phyton = planta).

Senescência: degradação celular culminando com a morte das células.

Sinergismo: capacidade de dois ou mais organismos realizarem modificações, geralmente químicas, que nenhum deles pode efetuar separadamente.

Sistêmico: relativo a todo organismo, em vez de a uma só parte.

Sonda de DNA: fragmento de DNA de sequência ou origem conhecidas, que se marca de forma que possa ser reconhecido posteriormente. A marcação pode consistir em um marcador isotópico, como fosfato radioativo, ou um composto químico que possa atuar como ponto de união para um marcador de afinidade.

Sorologia: estudo in vitro da interação envolvendo um ou mais de um dos constituintes do soro.

Strain: forma distinta de um organismo ou vírus dentro de uma espécie, diferindo biologicamente, fisicamente ou quimicamente de outras formas da espécie.

Subcultivo: subdivisão de material já estabelecido in vitro, para meio fresco.

Subcultura: ato de transferir uma porção de cultura para um novo meio.

Substâncias apolares: compostos que ionizam e não têm grupo polar; pouco solúveis em água.

Surfactante: composto solúvel que reduz a tensão superficial de um líquido ou reduz a tensão interfacial entre dois líquidos ou um líquido e um sólido.

Tensão superficial: força que atua na superfície de um líquido na tentativa de reduzir a área superficial.

Termoestável: relativamente resistente ao aquecimento; resis-tente à temperatura de 100 °C.

Termolábil: sensível à destruição por temperaturas inferiores a 100 °C.

Termoterapia: tratamento com temperaturas elevadas, objetivando principalmente a desativação de vírus.

Tetraciclinas: classe de antibióticos de largo espectro que inibe a síntese de proteínas.

Transferência: ato de transferir toda uma cultura para um meio novo.

Tripes: denominação usual para os insetos da ordem Thysanoptera (do grego, thysanos = franja e ptero = asa).

Ultravioleta: radiações eletromagnéticas que têm um comprimento de onda de cerca de 3.900 Å a 2.000 Å.

Umectante: ato ou efeito de umedecer com substância que se dilui.

V/V – Volume/Volume: indica a concentração de um composto líquido.

Vetor: portador, hospedeiro intermediário; diz-se de animal que transporta um agente infeccioso e o transmite de um hospedeiro a outro. Hospedeiro intermediário de agentes infecciosos.

Viroides: menores patógenos de plantas, constituídos de uma molécula circular de RNA unifilamentar com, aproximadamente, 270 a 380 nucleotídeos. São diferenciados do vírus pelo tamanho do seu genoma e pela ausência da capa proteica. São replicados diretamente, sem que ocorra a integração no genoma do hospedeiro.

Virulência: grau ou medida de patogenicidade; capacidade relativa de causar doença.

Virulento: altamente patogênico; que tem a capacidade de causar doença severa.

Vírus: agente patogênico composto de uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos (DNA ou RNA), normalmente encapsidadas por uma capa proteica ou de lipoproteína com capacidade de se autorreplicar apenas no interior de uma célula de hospedeiro adequado. Nessas células, a replicação viral é dependente da maquinaria sintética de proteínas da célula, requer materiais da célula, não ocorrendo fissão binária, localiza-se em sítios não separados dos conteúdos da célula e continuamente sofre várias mudanças relacionadas ao ácido nucleico.

Xantomonas: gênero de (Xanthomonas) bactérias fitopatogênicas (crescem quase exclusivamente em plantas), gram-negativas, em forma de rod. A presença de flagelos permite que se movam através do tecido vegetal infectado.

Zeatina: hormônio vegetal pertencente à classe das citocininas, de ocorrência natural, especialmente em grãos imaturos de milho.