Capítulo 8
Princípios de vírus em plantas
Fernando Javier Sanhueza Salas
Alexandre Levi Rodrigues Chaves
Marcos César Gonçalves
Marcelo Eiras
Maria Mércia Barradas
Introdução
A virologia teve início em 1882, quando Adolf Mayer, professor de Botânica da Universidade de Heidelberg, Alemanha, descreveu uma doença em fumo, caracterizada por mosaico nas folhas. O sintoma podia ser transmitido para plantas sadias por atrito com a seiva da planta doente. Esse sintoma foi observado também por Dimitri Iwanowski, um botânico russo, em plantações de fumo na Ucrânia e na Bessarábia. Iwanowski demonstrou, em 1892, que o princípio causador da doença permanecia ativo mesmo após passar por um filtro que retinha bactérias e o designou como entidade produtora de toxina. Martinus W. Beijerinck, microbiologista holandês, discípulo de Mayer, repetiu os trabalhos de Iwanowski e demonstrou que o agente causador do mosaico multiplicava-se nos tecidos vegetais e, portanto, não poderia ser uma toxina. Beijerinck, em 1898, empregou a expressão contagium vivum fluidum para denominar o agente.
A palavra vírus, de origem latina, significa veneno. Por volta de 1890, o termo era empregado para designar vários agentes infecciosos, incluindo bactérias e outros microrganismos ainda não identificados. Quando se observou que alguns agentes causadores de doenças podiam atravessar filtros apropriados para reter bactérias, eles foram denominados vírus filtráveis. Tal denominação foi também empregada para agentes de doenças em animais, por exemplo, febre aftosa, raiva e varíola. Gradualmente, nas primeiras décadas do século 20, o termo vírus passou a ser empregado para um grupo distinto de agentes patogênicos submicroscópicos. Em 1921, já se considerava o agente causador do mosaico-do-fumo um vírus. Muitos bioquímicos começaram a tentar purificar e cristalizar tal agente, que passou a ser denominado de vírus-do-mosaico-do-fumo (tobacco mosaic virus, TMV). Em 1935, o americano Wendell Meredith Stanley conseguiu isolar e cristalizar a proteína do TMV. No ano seguinte, os pesquisadores ingleses Bawden e Pirie demonstraram que uma preparação purificada de TMV continha ácido nucleico, além de proteína. No final da década de 1930, já havia diversos trabalhos publicados em que se demonstrava que vírus de plantas eram constituídos de nucleoproteínas. Métodos físicos, acessíveis nessa época, indicavam morfologia alongada para o TMV e esférica para outros vírus, porém somente com o advento da microscopia eletrônica de transmissão, no final da década de 1940, os cientistas puderam finalmente observar a morfologia das diferentes partículas virais.
Como a partícula do TMV possui apenas 5% de ácido ribonucleico (RNA), considerava-se que tal componente era menos importante. Todavia, em 1956, experimentos conduzidos independentemente em Tübingen (Gierer e Schramm) e na Califórnia (Fraenkel-Conrat) evidenciaram que o RNA isolado do TMV podia causar infecção. Tais resultados, complementados por outros obtidos com vírus de bactérias (bacteriófagos), mostrando que apenas o ácido nucleico penetrava nas bactérias, chamaram atenção para o real significado dos ácidos nucleicos dos vírus. Hoje, admite-se que os experimentos relacionados ao TMV constituíram a base não somente para o início da virologia de plantas e de animais, mas também para as pesquisas fundamentais nas áreas de biologia molecular e genética (HULL, 2002).
O que são vírus?
Os vírus podem ser definidos como partículas submicroscópicas, com tamanho que varia de 20 nm a 3.000 nm, constituídas de um único tipo de ácido nucleico (RNA, ácido ribonucleico ou DNA, ácido desoxirribonucleico), envolto por subunidades proteicas idênticas (capa proteica, CP); alguns vírus apresentam envoltório lipídico proveniente das membranas da própria célula. São denominados de parasitas obrigatórios por replicarem-se exclusivamente em células vivas utilizando a maquinaria celular para a sua transcrição, tradução, montagem, movimento e em alguns casos para a transmissão por vetores. Apresentam diferentes morfologias, como isométrica (membros da família Bromoviridae), alongada e flexuosa (família Potyviridae), alongada e rígida (gênero Tobamovirus), e de morfologia complexa (Bunyaviridae e Rhabdoviridae).
Taxonomia
A moderna taxonomia agrupa os vírus em diferentes famílias (terminação viridae), gêneros (terminação virus), espécies e isolados. A classificação é formalizada pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), que é subdividido em subcomitês que reúnem os principais pesquisadores especialistas em cada grupo de vírus. Os aspectos relativos à morfologia das partículas, composição e organização genômica, comportamento biológico como círculo de hospedeiros, tipos de transmissão na natureza, entre outros, são utilizados na classificação. Os vírus de plantas apresentam partículas com morfologia variada e podem ser constituídos de RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), DNA de fita simples (ssDNA) ou DNA de fita dupla (dsDNA). Os ácidos nucleicos dos vírus podem ser de polaridade positiva (+), sendo diretamente traduzidos pela maquinaria celular, ou de polaridade negativa (-), que necessitam ser previamente transcritos para depois serem traduzidos (REGENMORTEL et al., 2000).
Sintomas
Os vírus podem induzir alterações ou anormalidades visíveis nas plantas. São os chamados sintomas da doença. Quando há replicação de partículas virais, porém nenhum sintoma pode ser observado, a infecção é denominada latente. A expressão dos sintomas depende de vários fatores, entre eles: isolado do vírus; tipo e variedade da espécie hospedeira; idade e estágio de desenvolvimento e fisiologia da planta hospedeira; duração da infecção; presença de outros vírus ou de outros patógenos; condições do ambiente. Um mesmo vírus pode infectar diferentes plantas, produzindo sintomas específicos em cada uma. O sintoma, portanto, é um reflexo da resposta da hospedeira à infecção. Os vírus são transportados célula a célula e atingem o floema, de onde são transportados para todos os tecidos da planta, ocasionando uma infecção denominada sistêmica; mesmo assim, regiões meristemáticas de caules e raízes podem permanecer livres de vírus. Há casos em que os vírus ficam limitados a poucas células, circundadas ao ponto de entrada na planta, produzindo uma infecção local, que normalmente está relacionada com uma reação de hipersensibilidade.
Os sintomas podem ser externos e internos. Os sintomas externos, na maioria das vezes, são facilmente observados, pois consistem de alterações na forma e na coloração de folhas, flores, caules, frutos e raízes, além de anormalidades no crescimento. Sintomas internos também são produzidos frequentemente, mas só podem ser observados por microscopia de luz ou eletrônica. Os principais sintomas externos descritos nas folhas são: mosaico, mosqueado, amarelecimento, manchas anelares, faixas-das-nervuras, clareamento e necrose de nervuras, manchas cloróticas e/ou necróticas, pontos cloróticos e/ou necróticos. Dos sintomas gerais, normalmente associados a infecções virais, podem ser destacados o mosaico nas folhas e a redução de crescimento das plantas (nanismo). Alguns sintomas externos causados por vírus podem ser observados na Figura 1. É importante assinalar que os sintomas mencionados nem sempre são provocados por vírus. Deficiência mineral e senescência podem causar amarelecimento foliar, e outros patógenos como fitoplasmas também podem induzir nanismo e amarelecimento.

Figura 1. Sintomas induzidos por diferentes vírus em plantas hospedeiras: A) Sida sp. infectada naturalmente por Begomovirus, apresentando sintomas de mosaico-dourado; B) Chenopodium amaranticolor com sintomas de pontos cloróticos causados pelo Turnip mosaic virus (TuMV); C) Nicotiana tabacum (fumo) inoculada com Potato virus Y (PVY), apresentando sintoma de mosaico; D) Cana-de-açúcar infectada com o Sugarcane mosaic virus (SCMV) apresentando mosaico nas folhas; E) Sonchus asper com sintomas de mosaico e clareamento de nervuras induzidos pelo Lettuce mosaic virus (LMV); F) Folha de Armoracia rusticana (raiz-forte) com anéis cloróticos induzidos pelo TuMV; G) Folha de Lactuca sativa (alface) apresentando espessamento das nervuras induzido pela coinfecção do Lettuce big-vein associated virus (LBVaV) e Mirafiori lettuce virus (MiLV).
Fotos: Fernando Javier Sanhueza Salas
Os sintomas internos são alterações ultraestruturais induzidas pela presença do vírus na célula. Podem ser observados corpos de inclusão, cristais, anormalidades nas organelas, como mal formação dos cloroplastos, formação de vesículas, etc. Vale lembrar que até mesmo alguns sintomas internos, como corpos de inclusão e presença de cristais, não são efeitos exclusivos dos vírus, pois algumas plantas os possuem, normalmente.
Transmissão de vírus de plantas
Como os vírus são parasitas obrigatórios e frequentemente levam as hospedeiras à morte, a permanência de tais agentes na natureza depende da sua disseminação de planta a planta e da sua introdução em células vivas. Os organismos que, pelo seu processo natural de alimentação, estão envolvidos no transporte de vírus de uma planta doente para uma sadia são chamados de vetores. A transmissão por vetores envolve interações biológicas específicas e não aleatórias entre planta, vírus e vetor. As principais formas de transmissão dos fitovírus são listadas e comentadas a seguir.
Transmissão mecânica
A transmissão mecânica por contato pode se dar no caso de plantas com infecção sistêmica, quando o vírus invade a maioria dos tecidos e está presente nas células epidérmicas, inclusive nos pelos de folhas e caules. Com o atrito produzido pelo vento, por exemplo, pêlos e células, normalmente epidérmicas, podem se romper, e, dessa forma, partículas virais entram em contato com células também injuriadas de plantas sadias, ocorrendo a transmissão. Um grande número de partículas virais necessita ser transferido para que a infecção possa acontecer, mas há evidências de que tal forma de transmissão é responsável pela intensificação de determinadas doenças virais em culturas, assim como ocorre na cultura de tomate com o vírus-do-mosaico-do-fumo (TMV), ou em batata com a disseminação do PVS por meio de contato entre plantas infectadas e sadias (FRANC; BANTTARI, 1996).
A transmissão mecânica eventual também pode ocorrer por meio de animais que podem carregar partículas virais na sua pelagem ou penas e levá-las para plantas sadias, quando invadem culturas; o processo é semelhante ao descrito acima. Alguns insetos – besouros e gafanhotos – também podem transmitir vírus mecanicamente. A transmissão mecânica pelo homem está relacionada aos tratos culturais, pois alguns vírus, TMV e PVX – Potato virus X, por exemplo, mantêm sua infectividade quando as partículas são retidas nas roupas e nos instrumentos agrícolas (BROADBENT; FLETCHER, 1963).
Em laboratórios de fitovirologia, a transmissão mecânica é empregada experimentalmente como um dos primeiros passos para se estabelecer a etiologia da doença. Extratos preparados a partir de plantas com suspeita de infecção viral,folhas, preferencialmente, são friccionados sobre folhas de plantas-teste. A fim de facilitar a entrada das partículas virais nas células, pode-se adicionar ao inóculo um abrasivo, por exemplo, carborundum. A inoculação pode ser feita diretamente com o dedo ou utilizando um chumaço de gaze ou pincel. O resultado da inoculação mecânica depende de fatores como: (i) a concentração e estabilidade do vírus no inóculo; (ii) tipo, idade e condições fisiológicas da hospedeira; e (iii) condições ambientais pré e pós-inoculação.
Transmissão por órgãos de propagação vegetativa
Em plantas que se reproduzem por órgãos de propagação vegetativa, como tubérculos, bulbos, rizomas, colmos e estolões, muitos vírus que causam infecções sistêmicas podem ser transmitidos. É o caso clássico das tulipas variegadas, quando infectadas por espécies do gênero Potyvirus. Como as tulipas se reproduzem por bulbos, a doença se perpetua, e, neste caso particular, como o sintoma causado pela infecção viral tornava as flores mais bonitas, havia maior procura por plantas infectadas, com consequente valorização do produto. Porém isso é uma exceção à regra, pois, na agricultura mundial, os exemplos são de danos causados pela infecção viral em virtude da propagação vegetativa de material infectado. Podem-se citar as culturas do morango, da banana, do alho, da cana-de-açúcar, da batatinha, etc. No caso específico da batata (Solanum tuberosum), os cultivos sucessivos de tubérculos provenientes de batata-semente, associados à constante presença de afídeos vetores, resultam no acúmulo de vírus causando a degenerescência e consequente quebra de produção (DANIELS et al., 2002).
Transmissão por enxertia e por Cuscuta
A enxertia é um processo bastante utilizado na agricultura, porém tem sido uma via importante na transmissão de vírus e consequente disseminação de doenças virais, principalmente em frutíferas (macieira, pessegueiro, videira, citros) e ornamentais (roseira). A transmissão se dá pela união dos tecidos do enxerto com a parte da planta que recebe o enxerto (cavalo), sendo que qualquer uma das partes que estiver infectada servirá como fonte de vírus. Em laboratórios de fitovirologia, costuma-se utilizar a enxertia para a transmissão de vírus que apresentam dificuldades de transmissão mecânica, como alguns membros da família Geminiviridae.
A transmissão por Cuscuta, conhecida vulgarmente como cipó-chumbo, e em inglês dodder, considerada um tipo de transmissão por enxertia, ocorre na natureza e é também utilizada experimentalmente. Essa planta parasita funciona como uma ponte, ligando o sistema vascular de duas plantas de mesma espécie ou de espécies diferentes. Se houver infecção sistêmica em uma das plantas, o vírus poderá ser transmitido para a outra (BOS, 1978).
Transmissão por sementes e pólen
Embora diversos vírus sejam transmitidos por sementes, a porcentagem de transmissão geralmente é baixa. É necessário que o patógeno seja capaz de invadir o embrião para que a plântula resultante apresente infecção; nem sempre isso ocorre, pois depende, entre outros fatores, do vírus, da planta, das condições fisiológicas da hospedeira no momento da infecção, da presença de substâncias inibidoras do vírus na semente. Há alguns exemplos de vírus transmitidos por sementes, como o Lettuce mosaic virus (LMV) em alface, o Bean yellow mosaic virus (BYMV) em ervilha (10%–30%) e o CMV em caupi (4%–28%). Vale a pena ressaltar que o LMV em alface, com taxa de infecção de sementes acima de 0,1%, pode acometer até 100% da produção no campo por causa da ação de diferentes espécies de afídeos envolvidos na transmissão (GROGAN, 1980). Alguns vírus que apresentam elevada estabilidade, como o TMV, podem se aderir à superfície externa das sementes e, portanto, serem transmitidos quando da germinação destas (HULL, 2002).
Quanto à transmissão por pólen, há poucos casos relatados. Pode-se citar o exemplo de espécies de Ilarvirus transmitidos por tripes (HULL, 2002).
Transmissão por vetores
Os principais vetores dos fitovírus são, pela ordem, artrópodes, nematoides e fungos. Artrópodes (insetos e ácaros) transmitem vírus na parte aérea das plantas; nematoides e fungos, na parte subterrânea – larvas de alguns besouros vetores, que se alimentam de raízes, podem também ser responsáveis pela disseminação de vírus. Os insetos constituem o maior e o mais importante grupo de vetores. Alguns insetos transmitem vírus ao transportar partículas virais aderidas à superfície externa do corpo (transmissão mecânica eventual, já referida). O real papel dos vetores na disseminação dos vírus envolve complexas inter-relações planta-vírus-vetor (NAULT, 1997). As ordens Homoptera, Thysanoptera e Coleoptera são as mais importantes. Em Homoptera, encontra-se um grande número de vetores de vírus dentro das famílias: Aphididae (afídeos ou pulgões), Aleyroididae (moscas brancas) e Cicadellidae (cigarrinhas). Na ordem Thysanoptera, destacam-se os tripes; e na Coleoptera, os besouros (COSTA, 1998).
Todos os insetos vetores são fitófagos, sendo na sua maioria do tipo sugador. Adquirem as partículas virais quando sugam a seiva, ou o conteúdo celular, das plantas infectadas e transmitem os vírus ao se alimentarem em outras plantas. Os coleópteros, entretanto, são mastigadores e regurgitam as partículas virais na superfície foliar. Os tripes, por sua vez, têm hábito alimentar do tipo raspador-sugador.
Costa (1998) deixa evidente a importância dos afídeos, que constituem o grupo mais numeroso de vetores, principalmente as espécies dos gêneros Myzus e Aphis. Com relação a vetores não afídeos, podem ser citados o ácaro Brevipalpus phoenicis, vetor do vírus da leprose dos citros; a mosca branca, vetor de geminivírus; espécies de cigarrinhas (Dalbulus spp.) e coleópteros, principalmente os crisomelídeos Cerotoma arcuata e Diabrotica speciosa. Nos últimos anos, outras espécies de coleópteros, como Epitrix fallada e Epicauta atomaria, tem sido descritas como vetores experimentais de fitovírus (ALEXANDRE et al., 2000; BARRADAS, 1994; SALAS; BARRADAS, 1990).
Os nematoides vetores estão incluídos nas famílias Longidoridae (gêneros Longidorus, Paralongidorus e Xiphinema) e Trichodoridae (Trichodorus e Paratrichodorus). Os 3 primeiros gêneros transmitem vírus de partículas isométricas, com aproximadamente 28 nm de diâmetro, e genoma constituído de 2 moléculas de RNA. Tais vírus, que já foram previamente denominados nepovírus, atualmente pertencem à família Comoviridae. Um exemplo é o Tobacco ringspot virus (TRSV), transmitido por diferentes espécies de Xiphinema. Os nematoides da família Trichodoridae transmitem espécies do gênero Tobravirus (COSTA, 1999).
Nault (1997) divide os tipos de transmissão, interação vírus-vetor, em três formas distintas: (i) vírus carregados no estomodeu (primeira porção do trato digestivo dos insetos), que são subdivididos em transmissão não persistente (Carlavirus e Potyvirus) e semipersistente (Caulimovirus e Closterovirus); (ii) vírus circulativos (Luteovirus e Closterovirus); e (iii) vírus propagativos (Cytorhabdovirus e Nucleorhabdovirus). Estes dois últimos têm a característica de persistência no vetor em razão de diversas interações com o inseto, sendo de grande importância agronômica e epidemiológica, pois conseguem levar os vírus a longas distâncias.
Epidemiologia de vírus de plantas
A epidemiologia pode ser definida como a dinâmica da doença entre as populações de hospedeiros. Os estudos e análises da epidemiologia dos vírus em plantas seguem, de uma maneira geral, seis etapas: (i) definir os problemas em termos quantitativos, avaliando possíveis valores de produção e os obtidos no momento; (ii) quantificar a condição e a taxa de infecção da doença, variáveis no pato-sistema, para determinar o efeito da hospedeira, patógeno e a população do vetor na taxa de disseminação do patógeno; (iii) identificar as mais efetivas estratégias reais de controle; (iv) avaliar o desenvolvimento e quantificar o impacto das táticas de manejo específico ou integrado na dinâmica da doença de acordo com as estratégias propostas para o controle; (v) integrar as táticas de manejo e reavaliar os impactos epidemiológicos na dinâmica do pato-sistema; (vi) avaliar os riscos econômicos e ambientais para implementar os programas de manejo integrado (NUTTER JUNIOR, 1999).
Dispersão
Entre os fatores que influenciam os processos de dispersão, o padrão e a própria extensão da infecção viral, podem-se citar a origem da fonte de inóculo, localizado externa ou internamente à cultura, e o potencial de inóculo disponível. A natureza e os hábitos do vetor também são fatores importantes na disseminação dos fitovírus. Moreno et al. (2004) observaram que em cultivos de alface, na região central da Espanha, as espécies de afídeos que colonizavam a cultura não eram as responsáveis pelas epidemias de LMV. Outras espécies de afídeos migratórios além das plantas hospedeiras da vegetação espontânea, reservatórios naturais de vírus, respondiam pela epidemia.
Vale mencionar que o tipo de associação com o inseto vetor também é importante na dispersão da doença. Vírus propagativos, por exemplo, os membros do gênero Tospovirus, têm a característica de persistência no vetor, sendo de grande importância epidemiológica, pois os tripes, isto é, insetos vetores dos tospovírus, retêm as partículas dos vírus por mais tempo sem perder a capacidade de inoculação (NAULT, 1997). A fase em que os insetos colonizam e são mais ativos, em relação ao estádio fenológico da planta, e as condições climáticas também influenciam na dispersão. Alguns atributos de um bom vetor de vírus são: mobilidade (alcançar longas distâncias); comportamento alimentar (não danificar as células das hospedeiras); polifagia (alimentar-se de diversas hospedeiras); e ser estrategista, que significa possuir uma alta taxa de reprodução, alta fecundidade, ciclo curto, serem colonizadores e multivoltinos (possuir diversas populações em um curto espaço de tempo).
Plantas da vegetação espontânea e sua importância epidemiológica
Inúmeros fitovírus se perpetuam em plantas da vegetação espontânea, que servem de reservatório para doenças de etiologia viral em culturas de importância econômica. Tresh (1980) caracterizou três focos iniciais de infecção: (i) a dispersão ocorre a partir de plantas infectadas situadas no interior da cultura; (ii) as plantas infectadas situam-se em regiões adjacentes à cultura; (iii) as plantas-fonte encontram-se em áreas distantes ou remotas à cultura. O total e a área de dispersão de um foco de infecção resultam no gradiente desta infecção. O maior ou menor gradiente de infecção sempre está associado ao tipo de inseto vetor, à mobilidade e abundância de seus insetos vetores e ao tipo de associação vírus-vetor (vírus carregados no estomodeu, vírus circulativos ou vírus propagativos). Um gradiente baixo de infecção resulta de áreas de dispersão que se encontram a grandes distâncias e vetores com pouca mobilidade (NAULT, 1997; WALKEY, 1985).
Segundo Chaves et al. (2003), plantas da vegetação espontânea caracterizam-se por seu desenvolvimento em lugares inóspitos, o que favorece a perpetuação dentro da cultura ou em regiões próximas às áreas de cultivo comercial, desempenhando um importante papel na epidemiologia dos fitovírus.
Há poucos trabalhos envolvendo o estudo de plantas da vegetação espontânea e sua relação com a epidemiologia de fitovírus. Recentemente, a espécie Erigeron bonariensis (Asteracea da vegetação espontânea) foi descrita como hospedeira do LMV, no Brasil. Essa planta encontra-se amplamente disseminada nas regiões Sul e Sudeste e pertence à mesma família botânica da alface, atuando como reservatório natural do LMV no campo e servindo de fonte de inóculo do vírus para outras culturas de asteráceas (CHAVES et al., 2003). Em um trabalho de epidemiologia molecular, realizado para a caracterização de isolados de CMV, no Brasil, Eiras et al. (2004) encontraram elevada similaridade entre as sequências da capa proteica de isolados de CMV de bananeira e de Commelina sp., uma espécie de planta da vegetação espontânea frequentemente associada aos cultivos de bananeira no Vale do Ribeira, SP. Esse resultado confirmou que essa espécie atua como reservatório de vírus em condições naturais e serve como fonte de inóculo do CMV.
Dispersão de focos de infecção remotos
Este tipo de disseminação é realizado por insetos vetores que possuem uma alta capacidade de vôo (mobilidade) e hábito migratório, como pulgões, moscas-brancas e cigarrinhas. A associação biológica com os fitovírus envolvidos é muito importante, principamente quando se trata de transmissão propagativa. Outra possibilidade para esse tipo de disseminação pode ser decorrente da introdução de material contaminado, sementes ou órgãos de propagação vegetativa.
O comportamento de alguns vetores pode definir a distância e a intensidade da infecção, onde se relacionam distâncias e alturas dos principais grupos de insetos-vetores. Os afídeos respondem a diferentes comprimentos de onda, dependendo do seu estágio de desenvolvimento, o grau de densidade da população, a adequação da planta hospedeira e outras condições do meio, tais como a temperatura e a velocidade do vento. Quando isso ocorre e outras condições são favoráveis (vento, umidade, precipitação e temperatura), os afídeos entram em fase migratória. Nessa fase, os pulgões são atraídos pelos comprimentos de onda longos, característicos do solo e das plantas (CHAPMAN et al., 1981; GIBSON; RICE, 1989).
Dispersão a partir de fontes de infecção de culturas adjacentes
A disseminação e a distribuição dos fitovírus em uma região ou dentro de um cultivo determinado estão intrinsecamente relacionadas com o comportamento populacional do vetor e com seu movimento, seja este individual ou coletivo. No caso de dispersão de vírus por tripes, observa-se que o deslocamento dos indivíduos adultos a longas distâncias só é possível de forma passiva, pois esses insetos são transportados juntamente com o material vegetal. No entanto, quando a dispersão se dá dentro da cultura, os voos costumam ser curtos e ativos, ocorrendo em períodos menores e em distâncias que variam de 6 m a 50 m (PLASENCIA; SÁNCHEZ, 1999), como pode ser observado na Figura 2.

Figura 2. Campo de produção de escarola (Cichorium endivia) em Igaratá, SP, com infecção causada pelo Tomato chlorotic spot virus – TCSV, Tospovirus. Nota-se, à esquerda, dispersão inicial; e, à direita, dispersão com a distribuição uniforme das plantas infectadas, característica da transmissão por tripes.
Fotos: Fernando Javier Sanhueza Salas
Técnicas imunológicas utilizadas na detecção de fitovírus
O diagnóstico de vírus de plantas tem sido, ao longo dos anos, incrementado com a utilização de técnicas mais sensíveis e seguras. Dentre essas técnicas, destacam-se as sorológicas, baseadas nos processos imunológicos, principalmente pela sua versatilidade e baixo custo.
Os métodos imunológicos baseiam-se na reação específica entre um antígeno e um anticorpo. O anticorpo é uma imunoglobulina produzida por animais de sangue quente em resposta a substâncias estranhas, denominadas de antígenos. O sangue de animais imunizados com um determinado antígeno conterá anticorpos que reagirão especificamente com sítios presentes na estrututa do antígeno, denominados determinantes antigênicos. De forma exemplificada, a produção de anticorpos específicos destinados à detecção sorológica de fitovírus é feita a partir da imunização, por meio de injeções intramusculares ou subcutâneas do vírus purificado, principalmente em coelhos, ratos e galinhas (REGENMORTEL, 1982).
Testes sorológicos e a evolução na detecção dos fitovírus
Inicialmente, as técnicas sorológicas baseavam-se na observação da precipitação direta em meio líquido dos antígenos em mistura com os anticorpos específicos acondicionados em tubos. Essa técnica, na época, era sustentada pela teoria simplista do látice em que uma única molécula do anticorpo ligava-se a duas moléculas do antígeno, simultaneamente, favorecendo a precipitação. Muitos anos depois, Regenmortel (1982) descreveu dois mecanismos que melhor explicavam a precipitação: o primeiro relacionado com a formação de um complexo antígeno-anticorpo, e o segundo em que uma forte reação hidrofóbica é observada, na qual o precipitado torna-se insolúvel sob certas condições de pH.
Ouchterlony (1948) introduziu a dupla difusão em ágar (meio semissólido), técnica que ainda hoje é utilizada para detecção e determinação das relações sorológicas entre vírus. Nessa técnica, antígenos e anticorpos se difundem em um gel de ágar e, quando se encontram em proporções ótimas para reagir, formam linhas de precipitação constituídas pelos complexos antígeno-anticorpo. Essas linhas atuam como barreiras imunoespecíficas permitindo apenas a difusão de antígenos e anticorpos não relacionados. Quando vários antígenos reagem com o soro contendo anticorpos específicos, a formação de uma linha contínua de precipitação indica a identidade entre os antígenos, enquanto que a formação de um esporão ou porção que se destaca da linha principal de precipitação caracteriza a existência de relação sorológica, mas não identidade.
Outra variação dos testes sorológicos utilizando meio semissólido é a difusão simples (ALMEIDA; LIMA, 2001). O princípio é o mesmo aplicado à técnica de dupla difusão; porém, nesse teste, o anticorpo é incorporado diretamente ao meio de ágar no momento de sua preparação e antes da solidificação em concentrações pré-determinadas. Os antígenos são depositados em orifícios feitos no ágar solidificado, e, caso haja reação com o anticorpo, observa-se a formação de anéis de precipitação em torno do orifício.
Em muitas situações, em razão da baixa concentração do vírus no tecido vegetal, as técnicas de dupla difusão não são suficientemente sensíveis. Novos métodos foram desenvolvidos, nas últimas décadas, para a detecção de proteínas por meio de imunoensaios, o que proporcionou um grande avanço nas técnicas sorológicas utilizando anticorpos marcados (HULL, 2002).
Os anticorpos podem ser marcados com substâncias fluorescentes, isótopos radioativos e enzimas que, respectivamente, são utilizados nas técnicas de imunofluorescência, radioimunoensaios e ensaios imunoenzimáticos. A imunofluorescência e radioimunoensaios permitem a detecção do antígeno in situ, ou seja, na própria célula onde ocorrem os processos biológicos de infecção, replicação e translocação dos vírus. Na imunofluorescência, protoplastos ou cortes de tecido foliar infectado são submetidos ao contato direto com anticorpos específicos contra o vírus, previamente conjugado com marcadores como o isotiocianato de fluoresceína. Essa técnica permite diagnosticar vírus por meio da localização intracelular, como também estudar a sua distribuição citológica e histológica (SEQUEIRA, 1992).
É possível combinar a especificidade das reações sorológicas à microscopia eletrônica de tansmissão, técnica conhecida como imunomicroscopia eletrônica (DERRICK, 1973). Essa técnica consiste em recobrir uma tela de suporte de cobre com extrato de planta, juntamente com um antissoro específico, que permite a observação de uma maior concentração de partículas virais.
Ensaios imunoenzimáticos
Os ensaios imunoenzimáticos como Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) (CLARK; ADAMS, 1977) e suas variantes são os mais utilizados, tanto para pesquisa como na detecção e diagnóstico de fitovírus. A técnica de Elisa é a que mais se destaca, não somente por se basear em reações enzimáticas, mas também por permitir a análise de diversas amostras simultaneamente, apresentar alta sensibilidade, facilidade na preparação dos reagentes, rapidez e reprodutibilidade dos resultados. Em virtude da sua sensibilidade, é possível identificar uma proteína específica presente em uma amostra com uma população de outras proteínas. Isso permite a detecção de uma proteína codificada por um gene exógeno, no caso a proteína de origem viral, em uma planta infectada. Nesse caso, utiliza-se como base sólida uma placa de microtitulação feita de polyestireno constituída de 96 orifícios cujas paredes apresentam afinidade ao anticorpo e às reações imunoenzimáticas. O princípio básico consiste na utilização de uma enzima, que normalmente na fitovirologia é a fosfatase alcalina, conjugada ao anticorpo ou imunoglobulina. Esse conjugado reage com um substrato incolor, que nesse caso é o p-nitrophenylfosfato dissódico, originando uma coloração específica que permite evidenciar a presença ou ausência do antígeno. As leituras de absorbância para cada orifício são feitas em um colorímetro. Dependendo da enzima utilizada para produzir o conjugado, utiliza-se um comprimento de onda específico no aparelho. No caso da fosfatase alcalina, as leituras de absorbância são feitas a 405 nm, porém outras enzimas podem ser utilizadas para confecção do conjugado. No caso da peroxidase, por exemplo, que utiliza o substrato o-fenileno diamino, as leituras de absorbância são feitas a 492 nm (BRASILEIRO; CARNEIRO, 1998). Os valores da absorbância são proporcionais à quantidade de substrato transformado e, portanto, à quantidade de conjugado enzima-anticorpo que se fixou ao vírus, possibilitando quantificar a proteína viral. Normalmente, uma amostra é considerada positiva quando os seus valores médios de absorbância forem de 2,5 a 3,0 vezes superiores aos valores médios do controle negativo, constituído por uma amostra da mesma espécie de planta analisada, porém certificadamente sadia.
Existem diferentes variantes do teste de Elisa, e, usualmente, na virologia vegetal, as técnicas denominadas como Elisa-direto (DAS-Elisa – Double Antybody Sandwich-Elisa) e o Elisa-indireto são as mais utilizadas para a identificação de espécies e até mesmo de subgrupos de fitovírus. No DAS-Elisa, utiliza-se uma imunoglobulina específica para a proteína de interesse, normalmente a capa proteica viral, produzida a partir da imunização de cobaias com vírus purificado e uma enzima conjugada, frequentemente a fosfatase alcalina, ambos produzidos na mesma cobaia (CLARK; ADAMS, 1977). Embora seja amplamente utilizado, o Elisa-direto pode apresentar limitações como as observadas por Koening e Paul (1982) que, ao estudar as relações sorológicas entre diferentes isolados de vírus de um mesmo gênero, verificaram que os conjugados preparados com anticorpos específicos para um determinado vírus podem não reagir com estirpes próximas desse mesmo vírus. Em razão desta inespecificidade do anticorpo, desenvolveu-se uma variação do teste, denominado Elisa-indireto, assim designado por utilizar duas imunoglobulinas, uma para reconhecer o antígeno (vírus) e outra denominada anti-imunoglobulina produzida em outra cobaia para reconhecer e reagir com a primeira imunoglobulina. Essa metodologia permitiu que se detectassem estirpes de determinadas espécies de vírus que apresentavam maiores divergências entre si (TORRANCE, 1980).
Outra variante do teste de Elisa é o Dot immuno binding assay (Diba), também denominado de dot-Elisa, no qual a placa de microtitulação é substituída por uma membrana de nylon ou nitrocelulose. Nessa técnica, o antígeno é depositado diretamente sobre a membrana, e, como no Elisa, as etapas seguintes constituem no reconhecimento dos antígenos pelo anticorpo específico e na sua detecção pela conjugação direta a uma enzima, ou o uso de um anticorpo marcado. A revelação da reação é feita por quimioluminescência ou por colorimetria (BANTTARYI; GOODWIN, 1985).
É importante ressaltar que as técnicas sorológicas constituem uma ferramenta de grande valor na fitopatologia, pois são imprescindíveis no diagnóstico e na detecção de fitopatógenos, em qualquer programa de produção e certificação de sementes, bulbos, tubérculos e explantes obtidos por meio de micropropagação. Dessa maneira, elas permitem que seja evitada a disseminação de vírus e, consequentemente, auxiliam no controle de diversas doenças de etiologia viral.
Métodos de detecção empregando técnicas de biologia molecular
A ausência de vírus em material propagativo vegetal consiste em uma das premissas básicas na implantação de qualquer cultura agrícola. Uma vez presentes nas matrizes, esses agentes serão prontamente perpetuados nas suas progênies, e não existem medidas de controle efetivas no campo, exceto a eliminação e remoção de plantas infectadas. Além disso, a possibilidade de infecções secundárias é iminente pela presença de insetos vetores no campo, com o material infectado servindo como fonte de inóculo. Por esse motivo, o principal método de controle de viroses envolve o princípio da exclusão desses organismos antes do comércio de material propagativo e da implantação da cultura. Nesse contexto estão incluídos a certificação dos propágulos e o intercâmbio de germoplasma sadio, mediante procedimentos quarentenários.
No caso da cultura de células e tecidos vegetais, após o emprego das técnicas de limpeza clonal, é necessária a avaliação rápida e eficiente dos clones quanto à sua sanidade. Contudo, muitas vezes, a detecção nesse material é dificultada, seja pela baixa concentração do vírus, seja pelo emprego de testes laboriosos e com resposta demorada, como o uso de plantas indicadoras. As técnicas moleculares oferecem excelentes alternativas nesses casos, como será apresentado a seguir.
Conforme abordado previamente, os métodos mais comumente empregados na detecção de fitovírus envolvem testes biológicos (transmissão mecânica, enxertia e por vetores) e sorológicos (principalmente Elisa e suas variações). Apesar dos resultados obtidos com essas técnicas, existem algumas dificuldades comumente apontadas: (i) as biológicas normalmente são trabalhosas e demandam longos períodos de tempo para expressão de sintomas, além da necessidade de espaço físico como casas de vegetação e infraestrutura básica para a manutenção de plantas sadias e insetos vetores; (ii) as técnicas sorológicas, por sua vez, visam à detecção de proteínas e muitas vezes não alcançam o nível de sensibilidade exigido para a detecção do vírus.
O rápido desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, baseadas nas propriedades dos ácidos nucleicos, proporcionou um grande avanço na identificação e detecção de fitopatógenos, particularmente vírus, viroides e fitoplasmas, cobrindo as lacunas inerentes às técnicas biológicas e sorológicas. A mais notável contribuição se deu com o advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR), que permite a síntese de várias cópias, de regiões ou de todo o genoma viral. Essas técnicas têm sido empregadas para diagnóstico em laboratórios de virologia vegetal, destacando-se a hibridização de ácidos nucleicos e a PCR e suas variações (RT-PCR, PCR em tempo real, IC-PCR, etc.), apresentando versatilidade e possibilitando a análise de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo.
Hibridização dot-blot
As técnicas de hibridização de ácidos nucleicos se baseiam na complementariedade entre a sequência a se detectar (alvo) e uma sequência complementar à sequência alvo, porém marcada (sonda). Essas técnicas têm sido utilizadas para o desenvolvimento de diferentes estratégias de diagnóstico de vírus e viroides com elevada sensibilidade e especificidade. A técnica de hibridização dot-blot, em particular, permite que se analise um grande número de amostras de maneira fácil, rápida e a baixo custo (EIRAS et al., 1998). Owens e Diener (1981) publicaram pela primeira vez um método para o diagnóstico de viroides baseado na hibridização dot-blot de ácidos nucleicos com sondas marcadas radioativamente, e, dois anos mais tarde, Maule et al. (1983) empregaram a mesma técnica para a detecção de vírus de plantas. A partir de então, uma série de trabalhos abordando diferentes estratégias para detecção de vírus e viroides por hibridização dot-blot foram publicados (PALLÁS et al., 1998).
Na técnica de dot-blot, preparações de ácidos nucleicos purificados ou mesmo extratos de tecidos de plantas são adicionados a suportes sólidos, normalmente membranas de náilon, fixados e colocados em contato com a sonda marcada (hibridização). As sondas, que são moléculas de DNA ou de RNA (riboprobes), podem ser marcadas com isótopos radioativos, que, apesar de serem mais fáceis e práticos de serem sintetizados, implicam na manipulação de radioatividade. Sondas marcadas com moléculas não radioativas também podem ser empregadas, como biotina ou digoxigenina (PALLÁS et al., 1998).
A especificidade do método é determinada em função de alguns fatores: (i) estringência, ou seja, condições (temperatura e concentração de sais) de realização da hibridização. Quanto mais alta for a temperatura e quanto menor a concentração de sais, maior será a estringência; (ii) a região genômica (alvo) para qual a sonda foi desenhada, outro fator importante que determina a especificidade do método. Assim, regiões específicas do genoma de um vírus podem ser escolhidas para que uma determinada sonda hibridize somente com determinados isolados. Uma outra possibilidade é a de selecionar uma região do genoma que seja conservada entre espécies distintas de vírus de um mesmo gênero, ou de gêneros de uma mesma família, permitindo que vários alvos sejam detectados por uma mesma sonda (EIRAS et al., 2001). Além disso, várias sondas diferentes podem ser empregadas em um mesmo ensaio de hibridização, permitindo a detecção de alvos distintos (PALACIO-BIELSA et al., 1999). Recentemente, foi desenvolvida uma sonda polivalente, denominada polyprobe, que corresponde a um transcrito de uma construção quimérica de várias sequências de vírus distintos, que permite a detecção de até seis vírus diferentes em um mesmo ensaio (HERRANZ et al., 2005).
Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR)
A técnica de PCR foi desenvolvida no final da década de 1980 (MULLIS et al., 1986; SAIKI et al., 1988) e rapidamente adotada na detecção de fitopatógenos. A técnica é baseada na amplificação do ácido nucleico (DNA) do patógeno, ou de porções da sequência de interesse, limitada por dois oligonucleotídeos, denominados primers, utilizados em reações catalisadas por uma enzima (DNA polimerase). A PCR é altamente sensível, rápida e versátil, permitindo a utilização de variantes que se adequam às diferentes situações de diagnóstico.
Um ciclo de amplificação por PCR consiste basicamente em desnaturar a dupla fita da molécula de DNA analisada, na presença dos primers e dNTPs; hibridizar ou anelar os primers com as sequências complementares das duas fitas; e sintetizar o DNA (extensão pela DNA polimerase). O produto de cada ciclo (n) de baixa e alta temperatura é dobrado, de maneira que um aumento exponencial dos produtos é obtido em função do número de ciclos utilizados (2n). A temperatura de desnaturação normalmente situa-se em torno de 94 oC, por 30 a 60 segundos, e a temperatura e o tempo para anelamento dos primers dependem do seu tamanho, concentração e composição de bases (EIRAS et al., 1998). A amplificação é realizada à temperatura ótima para atividade da DNA polimerase, indicada pelo fabricante.
Para detecção de vírus conhecidos há um grande número de primers para PCR descritos na literatura. Porém, para o desenho de novos primers, é útil a consulta a bancos de dados de sequências genéticas, como o GenBank, da National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou o European Molecular Biology Laboratory (EMBL). A região genômica escolhida é, normalmente, conservada entre as diferentes espécies de um gênero de vírus, usualmente com tamanho que pode variar de 15 a 30 nucleotídeos e com um conteúdo de G/C de aproximadamente 50%, com temperatura de desnaturação (Tm) entre 55 oC e 65 oC. O tamanho dos primers, quando possível, pode ser aumentado para reduzir a probabilidade de geração de falsos positivos, como a amplificação de sequências inespecíficas ou de sequências similares de vírus não relacionados. Existem vários programas e páginas na internet que podem auxiliar no desenho dos primers, como o DNA Star e o OligoCalculator, da Universidade de Pittsburgg, evitando a escolha de sequências com estruturas secundárias, complementaridade entre primers, além da determinação da porcentagem de G/C e Tm. O desenho de primers com base em sequências altamente conservadas é recomendado para a detecção de todos os isolados ou mesmo de espécies de um vírus. O desenho de primers degenerados, ou seja, derivados do alinhamento de diversas estirpes ou isolados virais, porém contendo mais de um nucleotídeo possível em determinadas posições, também pode ser utilizado para amplificar as estirpes ou mesmo espécies de um gênero, como demonstrado para potyvirus (LANGEVELD et al., 1991) e luteovirus (ROBERTSON et al., 1991).
A preparação do material utilizado no laboratório e obtenção dos extratos de plantas são pontos-chave nas reações de PCR. A fim de evitar contaminações, os reagentes e as pipetas devem ser mantidos longe do contato com material vegetal e outros tipos de amostras, que podem estar contaminados com o DNA alvo. A presença de substâncias inibidoras em alguns tecidos de plantas, como polissacarídeos e compostos fenólicos, pode prejudicar a atividade das enzimas usadas, porém seus efeitos podem ser amenizados com a utilização de inibidores e absorventes de contaminantes, além de colunas que se ligam diferencialmente a RNAs virais (CANDRESSE et al., 1998). Por esses motivos, é fundamental a utilização de um controle positivo, para assegurar que a reação não está sendo inibida por compostos presentes no extrato vegetal, e de um controle negativo, ou seja, uma amostra com todos os reagentes, exceto o DNA alvo, para certificar-se de que os reagentes não estão contaminados com DNA viral. As amostras para amplificação por PCR são previamente submetidas à extração de ácidos nucleicos totais, utilizando métodos e protocolos variados, de acordo com o material de origem. Os principais métodos utilizados baseiam-se na extração com solventes orgânicos, como fenol/clorofórmio ou isotiocianato de guanidina para lise celular e inativação de enzimas degradantes de ácidos nucleicos. Alguns kits comerciais combinam esses métodos com colunas de cromatografia, o que pode facilitar e otimizar a obtenção de material com maior pureza. Há também a possibilidade de se utilizar extrato de tecidos vegetais diretamente em uma reaçao de PCR, sendo que a eficiência da reação dependerá de fatores como presença de inibidores da DNA polimerase e ação de nucleases que podem degradar os ácidos nucleicos (EIRAS et al., 1998).
Os produtos resultantes da amplificação por PCR normalmente são visualizados e analisados em gel de agarose corado com brometo de etídeo sob luz ultravioleta (Figura 3).

Figura 3. Análise eletroforética dos produtos de RT-PCR a partir de RNAs totais extraídos de cana-de-açúcar e milho com oligonucleotídeos específicos para detecção do Sugarcane mosaic virus (SCMV), amplificando um fragmento de 890 pb. Colunas 1 e 2: amostras de cana-de-açúcar provenientes do campo; colunas 3 e 4: amostras de milho provenientes do campo; coluna 5: cana infectada com o SCMV, controle positivo; coluna 6: cana sadia, controle negativo; coluna 7: marcador de DNA 100 bp.
Fonte: adaptado de Gonçalves et al. (2007).
Foto: Marcos César Gonçalves
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
A grande maioria dos vírus de plantas apresenta o genoma constituído de RNA fita simples, ssRNA (REGENMORTEL et al., 2000). Por esse motivo, para amplificação do seu genoma faz-se necessária a síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA) ao RNA genômico viral. O cDNA é sintetizado por uma transcriptase reversa, que utiliza o RNA alvo como molde para retrotranscrição. Após a obtenção do cDNA, realiza-se a reação de PCR. Essa adaptação da técnica de PCR foi denominada Reverse Transcription-PCR (RT-PCR).
Para a síntese do cDNA, são necessários a enzima transcrip-tase reversa, deoxinucleotídeos, um inibidor de RNAses e um primer de DNA complementar ao RNA alvo. Para vírus com a extremidade 3’ do genoma poliadenilada, como os membros da família Potyviridae (SHUKLA et al., 1994), pode-se utilizar um primer oligonucleotídeo de base T (oligo-dT) para obtenção do cDNA. As transcriptases reversas mais utilizadas nas reações de RT-PCR são as do Avian myeloblastosis vírus (AMV) e do Moloney murine leukemia vírus (MmLV). A AMV-RT é indicada para síntese de moléculas de cDNA curtas, enquanto a MmLV-RT é adequada para a síntese de moléculas de cDNA mais longas.
PCR em tempo real (real-time PCR)
A possibilidade de detecção e visualização dos produtos da PCR enquanto a amplificação progride tornou-se uma realidade com o advento da real-time PCR. Enquanto a PCR tradicional baseia-se na detecção por eletroforese do DNA amplificado ao final da reação, na presença de brometo de etídeo sob luz ultravioleta, essa técnica possibilita uma visão ampla da cinética da reação de PCR e consequentemente o monitoramento do acúmulo de produtos em tempo real. A técnica tem se mostrado útil, além de apresentar uma boa efetividade na razão custo-benefício, quando implantada em laboratórios com larga escala de análises (MARTELL et al., 1999). No Brasil, o uso da real-time PCR na detecção de fitopatógenos ainda se mostra incipiente, porém com grande potencial de expansão. Uma vez que a tecnologia é nova, o custo atual por teste é relativamente alto, porém tende a tornar-se um método de detecção amplamente empregado em razão da sua capacidade de detectar genes virais específicos em tempo real.
O monitoramento da formação dos produtos da amplificação em tempo real tornou-se possível com o uso de moléculas fluorogênicas para marcação de sondas de oligonucleotídeos. As duas sondas mais usadas no diagnóstico de vírus vegetais por real-time PCR são as molecular beacons (EUN; WONG, 2000; GONÇALVES et al., 2002; KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002); e TaqMan (MUMFORD et al., 2000). A manipulação pós-amplificação dos produtos de PCR é desnecessária, portanto as análises ocorrem em sistemas fechados, minimizando riscos de contaminação e facilitando o exame detalhado do desenvolvimento da reação (MACKAY et al., 2002). Essa tecnologia requereu o desenvolvimento de uma plataforma para excitar e detectar a emissão de fluorescência ao mesmo tempo em que realiza os ciclos termais para amplificação. Até recentemente, os aparelhos mais usados eram dispendiosos, porém, com a rápida popularização da técnica, a maioria dos fabricantes já comercializa uma plataforma para excitação e detecção das sondas fluorescentes acoplada aos termocicladores tradicionais.
Molecular beacons
Molecular beacons são sondas oligonucleotídicas que podem evidenciar a presença de ácidos nucleicos específicos em soluções homogêneas. Elas são particularmente úteis em situações em que não é possível ou desejável isolar os híbridos formados entre a sonda e a sequência alvo de um excesso de sondas de hibridização, tal como em monitoramento em tempo real de reações em cadeia da polimerase (PCR) em tubos selados, ou na detecção de RNAs dentro de células vivas (TYAGI; KRAMER, 1996). Essas sondas moleculares consistem em uma molécula de DNA de fita simples (ssDNA) com uma estrutura em forma de grampo, stem-loop ou hairpin. Essa conformação permite que a extremidade 5’, marcada com um fluoróforo (FAM, fluoresceína), e a extremidade 3’, marcada com um extintor de fluorescência ou quencher (Dabcyl), estejam, à temperatura semelhante a de amplificação, espacialmente próximas o suficiente para que a fluorescência emitida seja extinta pelo quencher. Após a hibridização com a sequência alvo, formando uma rígida estrutura de dupla hélice, a sonda assume uma conformação tal que o fluoróforo encontra-se distante o suficiente do quencher, de maneira que ocorra emissão de fluorescência. Essas sondas oferecem ainda a possibilidade de serem aplicadas para detectar alvos múltiplos, utilizando-se para tal uma gama de fluoróforos com diferentes cores (TYAGI et al., 1998). Dabcyl, um cromóforo não fluorescente, serve como um extintor universal para qualquer fluoróforo em molecular beacons. Em razão da sua forma de presilha, o reconhecimento dos alvos por essas sondas é tão específico que diferenças de apenas um simples nucleotídeo podem ser prontamente detectadas.
Molecular beacons e nasba
As molecular beacons, além serem usadas para detectar os produtos da amplificação por PCR, podem ser usadas em combinação com a amplificação isotérmica de RNA pela técnica Nucleic Acid Sequence Based Amplification (Nasba) (KIEVITS et al., 1991). O uso combinado dessa técnica com molecular beacons recebeu o nome de AmpliDet RNA (LEONE et al., 1998). Nasba é uma tecnologia com amplo potencial para aplicação na amplificação e detecção de RNAs virais (LEONE et al., 1997, 1998). Em comparação com outros sistemas de amplificação de ácidos nucleicos, tal como PCR, esse método, além de ser isotérmico, estende sua aplicação do diagnóstico viral à indicação de atividades biológicas, tal como expressão gênica e viabilidade celular. O principal produto de amplificação é um RNA de fita simples (ssRNA), embora pequenas quantidades de híbridos RNA:DNA e DNA dupla fita (dsDNA) também possam ser sintetizados (KIEVITS et al., 1991). A reação em Nasba é baseada no uso de primers para amplificação específica de RNA com a atividade simultânea das enzimas transcriptase reversa do AMV (AMV-RT), RNase H e T7 RNA polimerase à temperatura constante de 41 oC e sem a necessidade da adição de reagentes intermediários. Um dos primers específicos utilizados contém a sequência terminal 3’ complementar a sequência do RNA alvo a ser amplificado e a sequência terminal 5’ de um promotor que é reconhecido pela T7 RNA polimerase. Por sua vez, o segundo primer contém uma sequência que é complementar à fita de cDNA do primeiro primer. As enzimas e primers operam de maneira a amplificar a sequência nucleotídica alvo exponencialmente (SOOKNANAN; MALEK, 1995). Alguns exemplos do uso de molecular beacons com Nasba para detecção de vírus vegetais constituem as culturas de batata (KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002) de frutíferas (KLERKS et al., 2001b) e cana-de-açúcar (GONÇALVES et al., 2002).
TaqMan
A detecção de produtos de PCR também pode ser feita pelo uso de uma sonda oligonucleotídica fluorescente denominada TaqMan, desenhada para hibridizar em uma determinada região entre os sítios de anelamento dos primers usados para amplificação. A sonda é marcada na extremidade 5’ com um repórter emissor de fluorescência e na extremidade 3’ com um extintor de fluorescência, e atua em combinação com a atividade exonuclease 5’ da Taq polimerase. Enquanto a sonda está intacta, a fluorescência emitida pelo repórter é absorvida pelo extintor. Durante a amplificação, a sonda é clivada pela atividade 5’ → 3’ da exonuclease removendo o fluoróforo, resultando na emissão de fluorescência correspondente à quantidade de produto amplificado a cada ciclo. Alguns exemplos do uso de TaqMan para detecção de vírus de plantas constituem frutíferas (MARBOT et al., 2003), cana-de-açúcar (KORIMBOCUS et al., 2002) e batata (MUMFORD et al., 2000).
Outras variações da RT-PCR
Variações de RT-PCR podem ser empregadas para casos específicos, como one-step RT-PCR, multiplex-PCR, nested-PCR e immunocapture-PCR. Na one-step RT-PCR, RT-PCR realizado em um único passo, todos os reagentes para transcrição reversa e amplificação são combinados em um único tubo, sendo realizada inicialmente a síntese de cDNA e, a seguir, os múltiplos ciclos da PCR. A combinação da técnica com a real-time PCR pode ser feita, reduzindo o tempo de manipulação e contaminações cruzadas entre as amostras (KLERKS et al., 2001c). A nested-PCR pode ser empregada para detecção específica de vírus presentes em concentrações muito baixas. Um par de primers externos é utilizado para primeira amplificação, e um segundo par de primers é desenhado para hibridizar internamente ao produto amplificado inicialmente. Dessa maneira, um segundo turno de ciclos de PCR é realizado para amplificar especificamente o segmento alvo (DOVAS; KITIS, 2003). A multiplex-PCR é utilizada para a detecção simultânea de mais de um vírus em plantas com suspeita de infecções mistas, em uma única reação de PCR. A técnica requer o uso de múltiplos pares de primers, especificamente desenhados para amplificar diferentes alvos na reação. Os produtos das amplificações podem ser distinguidos pelo seu tamanho por eletroforese (DOVAS; KITIS, 2003), ou ainda com múltiplas sondas fluorescentes, em combinação com real-time PCR (KLERKS et al., 2001a; SZEMES et al., 2002). A imunocaptura de partículas virais seguida de PCR (immunocapture-PCR, IC-PCR) consiste na sensibilização do microtubo utilizado para PCR com um antissoro, incubação das amostras com o antígeno (vírus) e a posterior adição dos reagentes para a amplificação. A técnica também pode ser usada em combinação com sondas fluorogênicas (SCHOEN et al., 1997).
Controle de vírus de plantas
Para um controle eficiente das fitoviroses, pressupõe-se que o vírus tenha sido identificado corretamente e que haja um bom conhecimento da epidemiologia do vírus, isto é, de que forma se comporta o vírus em relação aos seus hospedeiros, vetores e fontes de infecção em determinados ambientes e como se dá a incidência da doença. As únicas soluções práticas, até o momento, consistem em controlar as viroses indiretamente interferindo com os fatores ecológicos e protegendo as culturas da infecção ou, pelo menos, reduzindo seus efeitos. A grande maioria dos organismos fitopatogênicos, em especial fungos, são controlados por defensivos agrícolas apropriados, porém esses métodos não podem ser utilizados no controle de fitoviroses, porque os vírus dependem diretamente do metabolismo das plantas hospedeiras. As fitoviroses não possuem formas de controle após o início do processo de infecção; portanto, as medidas devem ser preventivas e preferencialmente iniciando-se antes do plantio e estendendo-se até o fim do ciclo de produção.
Algumas medidas preventivas de controle que são amplamente empregadas estão relacionadas a seguir.
Medidas de controle dirigidas às fontes de vírus
Prevenção de fontes de infecção
Diversos fitovírus podem, além de ser transmitidos por insetos, ser propagados por sementes ou material de propagação vegetativa, sendo de suma importância que esse material tenha uma boa procedência e que possivelmente seja certificado.
Eliminação de focos de infecção
Deve-se promover a erradicação de plantas invasoras e outras hospedeiras alternativas, tanto dos vírus como de seus vetores, assim como das plantas infectadas.
Rotação de culturas
Esta medida consiste no plantio sucessivo de culturas diferentes no mesmo terreno. Esse método, além de trazer benefícios agronômicos, se mostra eficaz principalmente contra as pragas que possuem plantas hospedeiras específicas. Essa prática perdeu a popularidade a partir do momento que se intensificou a monocultura.
Medidas de controle dirigidas ao vetor
O controle dos insetos vetores propriamente dito pode envolver vários métodos.
Isolamento das plantas
A proteção da planta contra os insetos pode ser feita utilizando métodos culturais e técnicas agrícolas apropriadas, tais como o isolamento dos cultivos em regiões de baixa incidência de vetores, ou produção em casas de vegetação, telados ou plasticultura (DÍAZ et al., 2004). O isolamento pode ser feito com plantas-barreira, geralmente empregando-se espécies botânicas não preferidas pelos insetos vetores e que possuam altura suficiente.
Controle químico
Muitas vezes o controle químico pode ser eficaz contra a propagação de vírus transmitidos de forma circulativa, em razão dos longos períodos de alimentação necessários para a aquisição e para inoculação. Esse tipo de controle é inadequado em sistemas que envolvem a transmissão do tipo não persistente e não circulativa, em que o ciclo de transmissão, por ser muito curto, impede a ação eficiente dos inseticidas.
Uso de óleos
Em razão da ineficiência de alguns produtos no controle de vírus com característica de transmissão do tipo não persistente, os óleos minerais ou vegetais são empregados para inibir a transmissão. O óleo age modificando o comportamento de picada de prova e a alimentação, fases do processo de transmissão em que as partículas virais são inoculadas.
Uso de semioquímicos e repelentes
Estas substâncias, como o feromônio de alarme – (E)β-farnesene, liberado quando os pulgões são predados, podem ser empregadas em misturas ou isoladamente, modificando o comportamento dos insetos (GIBSON; PICKET, 1983). Outras substâncias também já foram empregadas como fagodeterrentes, sendo a mais conhecida a espécie Azaridachta indica ou neem. No Brasil, a substância mais utilizada é a derivada da erva de Santa Bárbara, visando ao controle da mosca-branca, quando aplicada em extrato (CHAPMAN et al., 1981).
Emprego de barreiras ópticas
Casas de vegetação do tipo túnel, cobertas com polietileno, material que absorve os raios ultravioletas, reduzem sensivelmente o ataque de diversas pragas e a infecção por vírus, quando comparadas com as casas de vegetação cobertas com plástico normal (COSTA et al., 2002).
Superfícies refletoras
Os afídeos e as moscas-brancas são atraídos por algumas cores e repelidos por outras. Baseado nesse princípio, alguns pesquisadores desenvolveram trabalhos mediante o emprego de superfícies repelentes e pulverizações de materiais refletores.
Armadilhas amarelas
O emprego de armadilhas amarelas com óleo ou polietileno adesivo é amplamente empregado no controle de insetos vetores, obtendo-se um maior sucesso no caso das moscas-brancas. Esse tipo de armadilha pode ser empregado como indicador do momento de pulverização na cultura, auxiliando na tomada de decisão para as medidas de controle (COHEN; MARCO, 1973).
Além dessas medidas de controle visando especificamente ao ataque de insetos vetores, podem ser desenvolvidas as que visem ao manejo da cultura hospedeira com o intuito de reduzir o número de insetos, tais como as mudanças de características de plantio (densidade de plantio e distância entre linhas); assincronia fenológica (atraso ou adianto na época de plantio); proteção cruzada (emprego de plantas previamente infectadas com estirpes fracas do vírus); utilização de plantas resistentes; e finalmente plantas transgênicas.
Medidas dirigidas à cultura
Uso de variedades resistentes
O principal método de controle de fitovírus é a utilização de variedades resistentes, seja por melhoramento genético clássico ou transgenia. O uso de variedades resistentes é a maneira mais econômica e efetiva para o controle das viroses, pois há redução dos gastos com outras medidas, como o controle dos vetores e tratos culturais. Além disso, reduzem problemas ambientais graças ao menor número de aplicações de produtos químicos, além de diminuir a possibilidade do desenvolvimento de resistência dos vetores aos inseticidas. Cultivares resistentes são normalmente desenvolvidas para o controle de vírus transmitidos por vetores de difícil e oneroso controle, tais como os tospovírus e geminivírus em tomate, transmitidos respectivamente por tripes e mosca-branca e PVY e PLRV por afídeos em batata (SALAS et al., 2004). No entanto, esse processo possui alguns impedimentos, como a demora na obtenção dessas variedades e a possibilidade da quebra de resistência. Os métodos tradicionais de melhoramento de plantas, nos últimos anos, vêm sendo complementados com as técnicas moleculares de manipulação genética (transgenia), que consistem na utilização de porções genômicas virais para obtenção de resistência genética, seja mediada pela proteína expressa ou pelo RNA transcrito. Como exemplo, pode-se citar a transformação de plantas de mamoeiro com o gene da capa proteica do Papaya ringspot virus, PRSV (Potyvirus), para a resistência ao próprio vírus em campo (SOUZA JUNIOR et al., 2005).
Quimioterapia
A utilização de substâncias quimioterápicas para os fitovírus (antifitovirais) ainda hoje é tratada de forma empírica, porém alguns experimentos já foram realizados demonstrando que substâncias sintéticas ou naturais, com propriedades químicas inteiramente diversas, são capazes de inibir os fitovírus. Os primeiros compostos utilizados foram as bases análogas de pirinas e pirimidinas, conhecidas como antimetabólitos. Outras substâncias com princípios de inibição da infecção viral, de origem natural ou sintética, foram empregadas, como extratos de plantas, caseína do leite, aminoácidos, íons metabólicos e detergentes corantes. Para serem utilizadas, essas substâncias devem apresentar atividade antiviral estável e permanente, serem produzidas em larga escala a preços acessíveis, terem amplo limite de tolerância a resíduos e efeitos colaterais não prejudiciais à produção e à qualidade do produto, além de neutralidade ecológica. Os métodos de aplicação mais adotados a partir de substâncias quimioterápicas são a pulverização do produto diluído em água e associado a um agente espalhante adesivo, no caso de culturas instaladas no campo. Já sob condições laboratoriais, essas substâncias são incorporadas ao meio de cultura, de consistência sólida ou líquida, com vistas a obtenção de plantas livres de vírus, a partir da cultura de tecidos (HUDSON, 1990).
Termoterapia
A termoterapia é uma das medidas curativas mais conhecidas e aplicadas em fitovirologia, pelos resultados positivos que oferece. Essa técnica consiste no emprego do calor para livrar plantas ou partes da planta de determinados vírus. Seu principio básico reside na diferença entre a planta hospedeira e o vírus na tolerância às altas temperaturas, ou seja, o coeficiente de inativação térmica da hospedeira excederia a do vírus causando, assim, a destruição das atividades químicas essenciais aos vírus e plantas hospedeiras, mas estas seriam aptas a se recuperarem dos danos ocasionados. A eliminação dos vírus nos tecidos das plantas in vitro ocorre por causa da inativação da partícula viral pela degradação, paralisação ou diminuição da translocação do vírus na planta e paralisação ou diminuição da replicação viral. A termoterapia tem sido aplicada na enxertia de gemas de planta infectada em porta enxertos imunes, enxertia de tubérculos infectados em tubérculos de variedades imunes, inativação em condições de campo e principalmente em explantes de plantas infectadas para desenvolvimento em meio de cultura (GROUT, 1990). A identificação do(s) vírus presente(s) no material a ser submetido à termoterapia é fator primordial, pois, para cada espécie ou gênero de vírus, diferentes temperaturas devem ser utilizadas. Como exemplo, pode-se citar o aumento da eficiência da recuperação de plantas de alho produzidas em meio de cultura (CONCI; NOME, 1991). É de conhecimento que o alho é acometido por um complexo viral constituído de diferentes espécies de Potyvirus e de um Carlavirus. Por esse motivo, as matrizes são submetidas a temperaturas que variam de 30 °C a 49 oC por períodos de 4 a 6 semanas ou mais, dependendo do vírus a ser eliminado. Após esse tratamento, o explante é excisado e cultivado in vitro (TORRES et al., 1998).
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