Capítulo 2
Prevenção de contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas

Moacir Pasqual

Leonardo Ferreira Dutra

Aparecida Gomes de Araujo

Alba Regina Pereira

Introdução

Contaminações são um dos mais sérios problemas da cultura de células e tecidos de plantas (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Inúmeros trabalhos e revisões têm sido feitos com relação a este assunto, destacando-se os realizados por Leifert (LEIFERT et al., 1989a, 1989b, 1990, 1991a, 1991b, 1992, 1994a, 1994b, 1994c; LEIFERT; WAITES, 1992; LEIFERT; WOODWARD, 1998) e Cassells (CASSELLS, 1988, 1991, 2000; CASSELLS et al., 1988).

Cassells (2001) relata que a principal questão para a maioria que trabalha com micropropagação é, possivelmente, o controle da contaminação no laboratório que é estimada em 10%, em média, mas pode resultar na perda completa de toda a produção.

A assepsia de explantes e esterilização do meio de cultura, vidraria e ambiente de inoculação são condições imprescindíveis em trabalhos de cultura de tecidos vegetais. Qualquer microrga­nismo que entrar em contato com o meio terá condições de se desenvolver e, como consequência, inviabilizará a cultura.

Há relatos da presença de microrganismos endofíticos em tecidos vegetais em um grande número de espécies de plantas. Fungos, leveduras e bactérias têm sido isolados com maior frequência, e sua presença pode ser identificada logo no início do cultivo. Entretanto, maiores problemas normalmente estão relacionados com contaminações bacterianas, especialmente aquelas que permanecem latentes in vitro, ou seja, não apresentam crescimento visível no meio, nem sintomas nos tecidos nos primeiros subcultivos.

Contaminações podem ocorrer: 1) durante o estabelecimento da cultura, provavelmente causadas por ineficientes desinfestações superficiais do explante; 2) após o estabelecimento in vitro, causadas por microrganismos endógenos ou microrganismos que foram introduzidos durante a inoculação e/ou subcultivos; 3) após longo período de armazenamento pós-esterilização. Contaminantes podem ser introduzidos com o explante, durante as manipulações no laboratório e/ou por vetores (BERGER et al., 1994; LEIFERT et al., 1991a, 1994a).

Bactérias gram-negativas, como Pseudomonas, Erwinia e Agrobacterium spp., são usualmente encontradas quando o proce­dimento de desinfestação inicial é ineficiente (LEIFERT; CASSELLS, 2001). Já a presença de espécies gram-positivas indica ineficiente esterilização do meio (Bacillus spp.) ou inade­quado treinamento dos operadores em técnicas de assepsia (Staphylococcus spp.). Fungos e leveduras podem ser introduzidos com o explante e/ou durante os estágios in vitro (DANBY et al., 1994 citados por LEIFERT; CASSELLS, 2001).

Para Leggatt et al. (1988), além da principal fonte de contaminação, uma inadequada esterilização, é possível que contaminantes microbianos sejam introduzidos na cultura com o explante como componente de uma microflora sistêmica natural, a qual sobreviveu à desinfestação superficial.

Tipos de contaminação

A lista de microrganismos descritos como contaminantes em plantas de cultura de tecidos incluem bactérias, fungos, leveduras, vírus, ácaros, tripes e formigas (BLAKE, 1988).

Bactérias

As bactérias constituem o mais comum e problemático tipo de contaminação por microrganismos em cultura de tecidos, porque podem ser sistêmicas e sua detecção muitas vezes é difícil. Numerosos gêneros estão associados com desenvolvimento de plantas in vivo, incluindo os listados a seguir. Os gêneros destacados são encontrados frequentemente em cultura de células in vitro, causando sérios problemas: Acinetobacter, Acetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azotomonas, Bacillus, Bordetella, Cellulomonas, Chromobacterium, Citrobacte, Clavibacter, Cloostridium, Corynebac­terium, Curtobacterium, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Klebsiella, Kurthia, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Oerskovia, Propionobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus, Xanthomonas.

Embora alguns gêneros de bactérias possam ser patogênicos, muitos são encontrados no solo como saprófitas, ou nas plantas como flora epífita. No entanto, podem interferir no crescimento in vitro e conduzir a cultura de plantas à morte. Para detectar com precisão a contaminação superficial remanescente, ou contamina­ção endógena por bactérias, é necessário cultivar explantes em um ou mais meios de cultura que permitam rápido crescimento de microrganismos.

Culturas contaminadas por bactérias apresentam o meio com aspecto turvo. Brotos de algumas plantas desenvolvem pontuações marrons em suas folhas ou na base, onde após serem analisadas sob microscópio, são encontradas contaminações bacterianas (GEORGE, 1993).

Algumas bactérias não se multiplicam ou se multiplicam lentamente em meio de cultura de plantas não formando, portanto, colônias visíveis. Contaminações bacterianas no meio de cultura são mais bem visualizadas por meio de ligeira inclinação dos recipientes.

Embora muitos laboratórios usem somente métodos visuais para detectar a contaminação das culturas, este não é o mais adequado. De acordo com Leifert et al. (1989a), o crescimento visível de contaminantes específicos pode ser reduzido no meio de cultura. Alguns contaminantes, como Methylobacteria, têm estreitas relações bioquímicas com plantas e não crescem independentemente destas. Além disso, segundo Holland e Polacco (1994) e Knauss (1976), bactérias, fungos e outros contaminantes frequentemente persistem como endofíticos em culturas de plantas que visualmente parecem livres de contaminantes.

Na Tabela 1 são relacionados alguns gêneros de bactérias e os gêneros de plantas aos quais estão associados.

Tabela 1. Espécies de bactérias gram-positivas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Gênero/espécie da bactéria

Gênero da planta

Actinomyces spp.

Malus

Bacillus spp.

Gerbera, Hevea, Pteris, Malus, Viola

Bacillus circulans

Begonia, Fragaria, Primula

Bacillus cereus

Fragaria, Begonia

Bacillus polymyxa

Gerbera

Bacillus pumilus

Astibe, Cotinus, Pulmonaria, Primula

Bacillus subtilis

Astilbe, Cotinus, Malus, Hemerocallis

Bordetella branchiseptica

Hevea

Coryneforms

Fragaria, Geranium

Staphylococcus spp.

Hemerocallis, Paeony

Micrococcus varians/roseus

Dephinium, Hosta

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Bactérias têm tradicionalmente sido reveladas por uma sé­rie de testes morfológicos e fisiológicos, os quais podem ser suplementados com análises químicas como sorologia e outros usando cromatografia gasosa (STEAD, 1988). Os testes para bac­térias específicas, por exemplo, aquelas conhecidas por causarem doenças em plantas, podem ser identificadas usando o teste Elisa (enzime-lynked imunosorbent assay), anticorpos monoclonais, técnicas de hibridação de DNA, dentre outros (LEIFERT et al., 1989b). A identificação de 293 estirpes de bactérias por 2 labo­ratórios comerciais de micropropagação revelou que 26% eram Staphylococcus, 19% Pseudomonas, 13% Bacillus, 12% Enterobacter ou Erwinia, 11% Lactobacillus, 3% Agrobacterium e 3% espécies de Acinetobacter (LEIFERT et al., 1994a).

Algumas bactérias fitopatogênicas, por exemplo Agrobac­terium tumefaciens e Erwinia carotovora, produziram sintomas similares in vivo e in vitro. Na Tabela 2 são relacionadas algumas espécies de bactérias gram-negativas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Tabela 2. Espécies de bactérias gram-negativas isoladas como contaminantes de cultura de células e tecidos.

Gênero/espécie da bactéria

Gênero da planta

Acinetobacter calcoaceticus

Fragaria, Astilbe

Alcaliges denitrificans

Iris

Agrobacterium radiobacter

Hevea, Paeony, Gerbera

Enterobacter/Erwinia

Coffea, Fragaria, Gerbera, Prunus

Erwinia carotovora

Iris, Saxifraga, Pteris

Klebsiella oxytoca

Delphinium

Flavobacterium spp.

Fragaria, Gerbera, Hosta

Pseudomonas cepacia

Hevea, Hosta

Pseudomonas putida

Hevea, Gerbera

Xanthomonas spp.

Prunus

Hyphomicrobium spp.

Datura

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Em trabalho realizado por Leifert et al. (1991a), das 240 bactérias isoladas em 12 meses de cultivo de 12 diferentes espécies de plantas, 75% foram gram-positivas e apenas 25% gram-negativas (Tabela 3). Mais da metade das bactérias isoladas foram Staphylococcus, Micrococcus ou espécies de Lactobacillus, as quais são geralmente habitantes da pele ou outros tecidos de humanos e outros animais. Esses mesmos autores citam que as contaminações encontradas em diferentes laboratórios são decorrentes de diversos organismos e/ou fontes, e, assim, distintos métodos para prevenção ou tratamento de contaminações podem ser necessários.

Tabela 3. Contaminações bacterianas isoladas em micropropagação de plantas em dois laboratórios de cultura de tecidos.

Espécie de planta

Tempo de cultivo in vitro dos explantes

1 mês

Mais de 12 meses

No de estirpes

Identificação

No de estirpes

Identificação

Astilbe

1

B. subtilis

1

A. calcoaceticus

1

M. kristinae

Arunchus

4

B. pumilus

Choisya

3

Agrobacterium radiobacter

21

S. saprophyticus

2

Achromobacter group VD

2

S. epidermidis

2

P. paucimobilis

1

E. aglomerans/Erwinia

1

P. luteola/paucimobilis

1

Micrococcus spp.

Cotinus

5

B. subtilis

3

B. pumilus

Delphnium

2

P. fluorescens

25

P. maltophila

3

K. oxytoca

6

P. paucimobilis

1

A. calcoaceticus

2

L. aciddophilus

1

B. subtilis

3

S. epidermidis

3

S. warneri

2

Staphilicoccus spp.

1

M. varians/roseus

3

Micrococcus spp.

P. paucimobilis

29

L. plantarum

Rhanella aquatillis

24

Coryneforms

11

S. epidermidis

6

E. cloacae

4

M. kristinae

2

Staphilococcus spp.

1

B. subtilis

1

Erwinia/
E. agglomerans

7

Erwinia/E. agglomerans

Hosta

2

P. fluorescens

4

M. kristinae

1

P. paucimobilis

1

M. varians/roseus

11

Micrococcus spp.

6

S. epidermidis

3

A. calcoaceticus

3

S. warneri ou S. capitis

1

S. intermedius/epidermidis

2

P. cepacia ou P. luteola

1

P. paucimobilis

1

Flavobacterium spp.

Iris

7

Erwinia carotovora

2

E. cloacae

1

R. aquatillis

1

Alcaligenes denitrificans

1

Serratia plymuthica

1

P. fluorescens

Paeony

5

Agrobacterium radiobacter

2

P. maltophilia

2

S. capitis

1

S. warneri

1

Staphilococcus spp.

1

Micrococcus spp.

1

P. diminuta

Pulmonaria

4

B. pumilis

3

Enterobacter spp.

Thalictrum

Gerbera

7

P. fluorescens/putida

2

A. calcoaceticus

2

Erwinia/
E. agglomerans

2

Agrobacterium radiobacter

1

Flavobacterium spp.

Viola

1

P. fluorescens

8

B. subtilis

1

Erwinia/
E. agglomerans

6

Bacillus spp.

1

Afrobacterium radiobacter

1

Flavobacterium spp.

Primula

6

B. circulans

2

B. pumilus

Total

58

240

Fonte: adaptado de Leifert et al. (1991a).

Os contaminantes endógenos não podem ser eliminados por tratamentos superficiais. Pierik (1988) cita Bacillus licheniformis ou B. subtilis como frequentes causas de infecções ocultas. As conta­minações latentes não revelam imediatamente sua presença visível no material de propagação ou no meio de cultivo. A bactéria pode necessitar de condições de adaptação in vitro, ou pode não estar apta a multiplicar-se até a cultura ser transferida para meio favorável para seu crescimento.

Frequentemente infecções latentes podem ser identificadas apenas após a cultura ter sido mantida por vários meses. No entanto, durante esse tempo, podem ter ocorrido transferências para muitos frascos durante os subcultivos, contribuindo dessa forma para a ocorrência de novas contaminações. Por exemplo, a contaminação pode não se mostrar no meio utilizado para proliferação e alongamento de brotos, mas pode aparecer no meio de enraizamento (BOXUS; TERZI, 1987).

Em trabalho cujo objetivo era investigar e identificar fontes de contaminação microbiana de cultura de tecidos de plantas em laboratórios da Nigéria, Odutayo et al. (2007) encontraram 19 contaminantes microbianos, sendo 11 bactérias e 8 fungos. As paredes e prateleiras dos laboratórios acumularam muitos contaminantes e o ar do interior dos laboratórios foi associado com todos os contaminantes encontrados.

Fungos

Os fungos são definidos como organismos aclorofilados, eucarióticos, que geralmente se reproduzem sexuada e assexua­damente por esporos, e cujas estruturas somáticas, ramificadas, normalmente filamentosas, são circuncidadas por parede celular (ALEXOPOULOS et al., 1996). São organismos heterotróficos, necessitando de compostos orgânicos, por exemplo, a glicose, como fonte de carbono e energia. Contaminações fúngicas são facilmente visualizadas em virtude da intensa frutificação dos fungos in vitro.

São os patógenos de plantas mais comuns e habitantes saprófitas no solo. Muitos gêneros de fungos estão associados com plantas, mas esses especialmente notificados como contaminantes em cultura de tecidos incluem espécies de Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Candida, Cladosporium, Curvularia, Chyptococcus, Fusarium, Microsprium, Neurospora, Penicillium, Phialophora, Rhizopus, Rhodotorula dentre outros.

O cultivo in vitro de explantes pequenos usados para iniciar as culturas poderá resultar em contaminações fúngicas logo após estarem aparentemente estabelecidas. Infestações fúngicas geral­mente resultam na morte do explante, mas algumas vezes a proteção da cultura pode ser obtida e o crescimento do material cultivado pode continuar. Hörner et al. (2000a), em trabalho visando identificar os agentes contaminantes em explantes micropropagados de erva-mate (Ilex paraguariensis), constataram a presença dos gêneros Alternaria sp. e Colletotrichum sp. como contaminantes fúngicos. Todos os explantes contaminados com fungos morreram e, embora tenha ocorrido contaminação por bactérias, estas não foram limi­tantes ao desenvolvimento dos explantes. Ainda, de acordo com estes autores, os fungos causam maiores danos em relação às bactérias, pois impedem o desenvolvimento dos explantes e matam-nos, enquanto as bactérias raramente o fazem.

Em trabalho visando avaliar e identificar os fungos contami­nantes no estabelecimento in vitro de goiabeira (Psidium guajava), Ramírez-Villalobos et al. (2000) constataram que houve 100% de contaminação das culturas, sendo que os gêneros Cladosporium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp. e Curvularia sp. foram responsáveis por 87,50% dos explantes contaminados, enquanto os fungos Drechslera sp., Fusarium sp., Helminthosporium sp. e Rhizopus sp., por 12%.

O fungo Acremonium coenophialum não ocasionou a morte da cultura de calos de Festuca arundinacea, mas causou uma diferente característica no hábito de crescimento (CONGER; MCDANIEL, 1983). A cultura de calos demonstra ser um método rápido de proteção contra infestações, principalmente naquelas em que os sintomas visualizados na planta adulta, ou os contaminantes detectados por microscopia ou teste Elisa. Os fungos podem crescer como saprófitas no meio de cultura de tecidos, e então o crescimento de hifas pode aparecer no meio ou no explante ou em ambos. O patógeno de plantas Alternaria brassicae pode crescer em cultura de calos de Brassica de forma imperceptível, mas o fungo cresce no meio de cultura como saprófita. Muitos fungos e leveduras contaminantes crescem bem no meio onde estão as plântulas e até mesmo na ausência destas (ENJALRIC et al., 1988).

Leveduras

Leveduras são fungos não filamentosos que habitam a super­fície externa de plantas. Embora se suspeitasse que elas poderiam contaminar a cultura de células, sua existência in vitro raramente tem sido admitida. Um mau cheiro quando o frasco com a cultura é aberto é um indício de sua presença (GEORGE, 1993). Torulopsis foi isolado por Boxus e Terzi (1987) quando propagavam diversas espécies em grande quantidade; seis leveduras foram observadas no cultivo de brotos de plantas ornamentais (LEGGATT et al., 1988).

As leveduras Candida e Rhodotorula podem criar um am­biente totalmente desfavorável para o crescimento de plântulas. A contaminação por leveduras resulta na morte dos explantes den­tro de um a três subcultivos após sua introdução in vitro (LEIFERT; WAITES, 1990).

Vírus

Há uma variável concentração de vírus nas células de plantas intactas. Muitas viroses não são transmitidas por sementes, e os órgãos reprodutivos não são infectados. Em particular, brotos apicais e meristemas de raízes são passíveis de contaminação muito baixa ou podem, no entanto, serem livres de vírus. Já White (1934) havia notado que o vírus do mosaico do fumo ocorria na ponta das raízes de plantas infectadas de tomate e persistiam na cultura de raízes estabelecidas in vitro.

Mesmo quando os explantes são contaminados durante a excisão, a infecção pode desaparecer em algumas ou todas as células dos tecidos no início de cultivo. O porquê disso ainda não está bem claro. De acordo com George (1993), essa erradicação pode ser em virtude de algumas hipóteses:

• Associação da injúria celular causada por excisão do explan­te e crescimento do meristema.

• Multiplicação rápida do explante, onde o volume celular aumenta de maneira extremamente rápida, fazendo com que a replicação do vírus não acompanhe o crescimento do vegetal. Isso poderia explicar porque as culturas livres de vírus têm melhores resultados por usarem pequenos meristemas apicais com dimensão aproximada de 0,1 mm de comprimento.

• Componentes do meio de cultura podem inibir a replicação de vírus, onde certos aminoácidos e substâncias regulado­ras, particularmente auxinas e citocininas, têm sido mencio­nadas como responsáveis.

Para ocorrer infecção viral sistêmica, os vírus têm de ter acesso ao sistema vascular da planta. Há várias evidências a favor da hipótese de que o floema funcione como veículo para o transporte do vírus a longas distâncias, enquanto que o transporte célula a célula ocorra via plasmodesmatas (GILBERTSON; LUCAS, 1996).

Provavelmente, todas as espécies propagadas vegetativamen­te estão infectadas com um ou mais vírus, principalmente os latentes que são difíceis de serem detectados pela sintomatologia visual. Esses patógenos são transmitidos e acumulados em clonagens e/ou plantios sucessivos e se manifestam na planta infectada pela redução do vigor e produtividade das culturas.

Ácaros e tripes

Poucos ácaros e tripes em cultura de tecidos vegetais são identificados. Muitas espécies, como Sideroptes graminis, Stemeotorfomemus palidus ou Trhips tabaci, são conhecidas por serem habitantes ou pragas de plantas in vivo, enquanto outros como Tyrophagus putrescentiae podem estar presentes tanto in vivo como in vitro.

Os ácaros são organismos reconhecidos por terem, ao redor de seu corpo, um único segmento e, usualmente, quatro pares de patas. São pragas muito pequenas (menores que 1 mm de comprimento), que se encontram em todos os ambientes, podendo ser levados pela poeira, insetos e animais (incluindo os humanos). Algumas espécies de ácaros são encontradas na alimentação humana, enquanto outros são parasitas ou saprófitas nos animais.

Normalmente causam pequeno dano para a vida das plântu­las; entretanto, levam esporos de fungos e bactérias em seus corpos, entrando na cultura de plantas, sendo fonte de múltiplas contaminações. Frequentemente, a primeira indicação perceptível de sua ocorrência é a presença de fungos no crescimento das culturas. Ácaros que não introduzem fungos, mas apenas bactérias, muito dificilmente são identificados. Em ambos os casos, os ácaros podem ser transferidos frasco a frasco durante os subcultivos do material de propagação.

Os tripes são insetos também muito pequenos (menores que 1 mm de comprimento) e são os mais comuns no crescimento de plantas in vitro. Em geral habitam os brotos apicais de plântulas, causando o amolecimento dos tecidos, e se alimentam da seiva que é exsudada. Os tripes colocam seus ovos apenas abaixo da epiderme das plantas, e uma das causas da contaminação pode ser o estabelecimento de culturas com explantes contaminados.

Como os tripes são insetos muito pequenos, dificilmente são detectados nas culturas infectadas por eles. Reustle et al. (1988) observaram que, na infecção das culturas, as folhas de videira adquiriram brilho metálico na superfície. As espécies de tripes que são reportadas como contaminantes na literatura pertencem aos gêneros Thrips, Allothrips e Frankliniella.

Formigas

As formigas são insetos pequenos que estão presentes em diversos locais, trazendo problemas semelhantes aos provocados pelos tripes e ácaros, ou seja, podem contaminar o ambiente do laboratório com esporos de microrganismos.

Efeito da contaminação microbiana no cultivo in vitro

O elevado grau de contaminação e a localização sistêmica de microrganismos são responsáveis, em alguns casos, pelo insucesso da implantação de culturas in vitro. A contaminação tem prejudicado inclusive a condução de experimentos em função do reduzido número de explantes obtidos (PASQUAL, 2001a). Algumas estratégias, como experimentos com seedlings para conseguir informações que serão utilizadas na propagação vegetativa da planta matriz e maior número de subculturas de material adulto, têm sido adotadas. A contaminação em laboratórios de cultura de tecidos é dependente da espécie de planta a ser trabalhada, das condições ambientais locais, do treinamento dos técnicos e das medidas de assepsia seguidas na rotina laboratorial. É difícil obter com precisão o nível de contaminação em um laboratório que produz em grande escala, em virtude de razões comerciais. No entanto, geralmente os laboratórios admitem que as perdas por contaminações sejam elevadas (GEORGE, 1993).

As perdas podem ser advindas de contaminações na etapa de seleção do explante e sua introdução in vitro, bem como do uso de sistemas precários de autoclavagem. Nas etapas seguintes, perdas também podem ocorrer em função de indevidos procedimentos de subcultivos, como falta de assepsia por parte do manipulador. Após as contaminações estarem estabelecidas in vitro e atingirem grande parte do material vegetal, as perdas podem ser muito elevadas, em alguns casos onerando excessivamente o custo de produção.

Os microrganismos competem com os explantes em espaço, carboidratos (fonte de energia), nutrientes e outros compostos, podendo também liberar no meio de cultivo substâncias tóxicas prejudiciais ao crescimento do material vegetal in vitro. Alguns fungos e leveduras reduzem o pH do meio (< 3), onde ocorre fermentação dos carboidratos, produzindo substâncias fitotóxicas e liberando compostos como etanol e ácido lático.

Esterilização

A esterilização é um procedimento mediante o qual qualquer material torna-se completamente livre de microrganismos contami­nantes (fungos, bactérias, leveduras, vírus e micoplasmas).

Segundo Pierik (1990), a esterilização pode ser feita dos seguintes modos: destruição física dos microrganismos por meio de ar seco e quente, vapor ou irradiação (luz ultravioleta ou radiação gama); destruição química dos microrganismos, usando compostos esterilizantes (óxido de etileno, álcool, hipoclorito de cálcio ou sódio, etc.) ou antibióticos; eliminação física dos microrganismos por filtração ou lavagem.

A esterilização está relacionada geralmente ao processo de destruição dos microrganismos mediante métodos físicos, enquanto a desinfecção e a desinfestação se referem ao emprego de métodos químicos.

Esterilização de vidrarias

As vidrarias que serão utilizadas no preparo dos meios de cul­tura devem, após a lavagem, serem secas ao ar, sobre papel de filtro ou papel absorvente e/ou colocadas em estufa com temperatura regulada de 30 oC a 40 oC e depois guardadas em local protegido, a fim de evitar a deposição de poeira (LAMEIRA et al., 2000).

Estufas a seco são utilizadas para esterilizar vidrarias (placas de Petri, erlenmeyer, Becker, e outros) e instrumentos (pinças, cabos de bisturi, estiletes, e outros). A vidraria a ser esterilizada deve ser envolvida por papel alumínio ou de embrulho e os instrumentos em caixas de alumínio ou tubos com tampa. Geralmente, a temperatura de 150 oC por um período de 3 a 4 horas é suficiente. As vidrarias também podem ser esterilizadas por meio da autoclavagem a 121 oC e pressão 1,05 kg cm-2 por 20 minutos. Outra forma de esterilização mencionada na literatura é a utilização de calor úmido. O emprego de calor úmido requer que os materiais sejam imersos em água à temperatura de 100 ºC de 30 a 60 minutos por três dias consecutivos e devem ser mantidos de preferência em incubadora entre uma exposição e outra (MONTARROYOS, 2000).

A limpeza de frascos e tubos de ensaio consiste na retirada de meio de cultura, lavagem em água corrente e imersão em solução com detergente comercial, por no máximo 24 horas. Após este período, com o auxílio de esponjas e escovas de nylon, o material é lavado e enxaguado em água até remover todo o detergente e, por fim, enxaguado em água destilada e colocado para secar (LAMEIRA et al., 2000). Os detergentes empregados na lavagem devem ser de fácil remoção. Em alguns casos, faz-se necessário o emprego de soluções limpadoras, como o ácido crômico.

Recipientes com meio contaminado devem ser autoclavados durante 20 minutos a 121 ºC, visando à eliminação dos micror­ganismos antes da abertura dos recipientes, evitando assim a disseminação dos patógenos para o ambiente.

Esterilização dos meios de cultura

A esterilização dos meios nutritivos geralmente acontece em autoclave, menos frequentemente por filtração e raramente por irradiação (PIERIK, 1990).

Autoclave – utilizada para esterilização de meios de cultura, vidrarias, água e outros materiais. Este equipamento é regulado para trabalhar a uma pressão de 1,05 kg cm-2, o que resulta numa temperatura de 121 oC, e pode ser do tipo horizontal ou vertical. O meio preparado pode ser autoclavado em vários lotes de pequenos volumes ou em poucos lotes com volumes maiores. Os meios de cultura de tecidos são geralmente autoclavados a 121 °C por 20 a 30 minutos (PASQUAL, 2001b). Na Tabela 4 constam tempos e temperaturas de autoclavagem indicados para diferentes volumes de meios.

Tabela 4. Tempos e temperaturas de autoclavagem indicados para diferentes volumes de meios.

Volume de meio de cultura (mL)

Tempo e temperatura de autoclavagem

20–50

20 minutos a 121 oC

50–500

25 minutos a 121 oC

500–5.000

35 minutos a 121 oC

Fonte: Pasqual (2001a).

As vantagens da autoclave são velocidade, simplicidade, destruição adicional de vírus e não adsorção (como acontece na esterilização por filtração). As desvantagens são mudanças no pH, algumas reações químicas podem acontecer, levando a uma perda de atividade dos componentes dos meios (PIERIK, 1990). Alguns compostos orgânicos são degradados pelo calor, principalmente aminoácidos, vitaminas e alguns reguladores de crescimento, tais como ácido giberélico e ácido abscísico, colchicina, zeatina, ácido pantotênico, antibióticos, extratos vegetais e enzimas (PASQUAL, 2001b; PIERIK, 1990).

Outras reações também ocorrem durante a autoclavagem, como as entre açúcares e aminoácidos (caramelização) e a hidrólise de sacarose. Essas reações se intensificam com o aumento do tempo de autoclavagem. Assim, é aconselhável manter os meios na autoclave pelo mínimo de tempo necessário para completar a esterilização (CALDAS et al., 1998).

Segundo Pierik (1990), na autoclavagem o pH dos meios diminui de 0,3 a 0,5 unidades; a uma temperatura muito alta há caramelização dos açúcares, podendo produzir toxicidade; um processo muito longo pode conduzir à precipitação de sais e despolimerização do ágar, e as substâncias voláteis podem ser destruídas. Embora a autoclavagem seja o método comum de esterilização de vidraria, meios de cultura e instrumentos, ela torna-se dispendiosa em função do custo do equipamento e do consumo de energia.

Nesse sentido, uma alternativa ao processo de autoclavagem seria a esterilização em forno micro-ondas, possibilidade proposta por Teixeira et al. (2005a, 2005b). Entretanto, os autores comentam sobre a baixa eficiência deste como único método de esterilização. Por outro lado, a eficiência dessa técnica já foi relatada na destruição de bactérias (LATIMER; MATSEN, 1977; ROSASPINA et al., 1993), fungos (KELLER et al., 1988) e esterilização de recipientes plásticos para meio de cultura (SANBORN et al., 1982). Já Tisserat et al. (1992) relatam que, para meios líquidos, esse método não apresenta eficiência total, em virtude da ebulição e do transbordamento do líquido, antes de sua completa esterilização.

Teixeira et al. (2005a), avaliando a possibilidade de combinar várias diluições de hipoclorito de sódio (NaOCl) como esterilizante químico no meio de cultura e posterior esterilização deste em forno micro-ondas, observaram, em um primeiro ensaio, que todas as diluições de NaOCl testadas proporcionaram esterilização completa do meio de cultura, embora tenha ocorrido redução constante do pH (2,8; 2,4; 2,3 e 2,1), respectivamente para as diluições de 0,2%; 0,3%; 0,4% e 0,5% de cloro ativo, além da consequente capacidade de solidificação do ágar. Em outro ensaio, em que as diluições de NaOCl foram menores (0,24%; 0,30%; 0,36% e 0,42%), a redução do pH foi pequena, e o meio de cultura solidificou-se normalmente em todos os tratamentos. Obteve-se esterilização de até 93,3% nas diluições de 0,36% e 0,42% de NaOCl.

Em outro trabalho, estudando-se o uso do forno de micro-ondas na esterilização de frasco de cultura contendo meio de cultura líquido, Teixeira et al. (2005b) verificaram variação de 16% de esterilização, quando o meio de cultura foi previamente inoculado com bactérias não identificadas e preparado com água de torneira, a 87% em meio de cultura sem contaminantes e água deionizada. As melhores taxas de desinfestação foram obtidas quando o meio de cultura foi preparado com água previamente ozonizada (80%); água deionizada, autoclavada e adicionada de 30% de peróxido de hidrogênio/água oxigenada (H2O2) a 100% e água deionizada, autoclavada e adicionada de 0,5% de NaOCl (100%).

Teixeira et al. (2006) avaliaram a esterilização do meio de cultura adicionado de NaOCl e o comportamento de abacaxizeiro cv Smooth cayenne (Ananas comosus) in vitro e registraram que as concentrações foram efetivas, não constatando contaminações a partir de 0,0003% de NaOCl. Os autores ainda relataram efeito benéfico do NaOCl adicionado ao meio de cultura, no crescimento e multiplicação do abacaxizeiro. Resposta benéfica do NaOCl também foi observada em um híbrido de Eucalyptus dunnii x E. benthamii por Brondani et al. (2007), onde maior valor médio do comprimento das brotações foi obtido com 1,27% de cloro ativo na desinfestação dos explantes.

Em trabalho cujo objetivo era comparar o emprego de hipoclo­rito de sódio e a autoclavagem para esterilização de meios de cultura de tecidos vegetais de Pfaffia glomerata, Eucalyptus pellita, Ananas comosus e Sequoia sempervirens, Ribeiro (2006) concluiu que concentrações superiores a 0,003% de cloro ativo total em meios de cultura semissólidos, submetidos a tratamento de fusão do agente gelificante em forno de micro-ondas, asseguram total esterilização do meio nutritivo. Resultado semelhante foi obtido para meios líquidos, entretanto sem a utilização do forno de micro-ondas. Concentrações entre 0,005% e 0,007% de cloro ativo total no meio de cultura de Eucalyptus pellita estimulam a formação de ramos com maiores comprimentos médios, embora em menor número do que em meio autoclavado; concentrações entre 0,0003% e 0,0005% de cloro ativo total no meio de cultura de Ananas comosus estimulam a formação de maior número de brotações e maior peso de biomassa fresca; concentrações entre 0,003% e 0,004% de cloro ativo total no meio de cultura de Sequoia sempervirens induzem a formação de brotações em maior número, porém com menor comprimento do que em meio autoclavado.

Esterilização a frio vários reguladores de crescimento podem ser desnaturados por autoclavagem. O grau de degradação de algumas auxinas e citocininas é leve e pode ser ignorado em micropropagação de rotina. Embora alguma degradação das auxinas AIA e AIB tenha sido detectada em meios autoclavados, é possível compensar a perda de atividade, aumentando a concentração destes no meio. Algumas citocininas e auxinas comumente utilizadas são consideradas como sendo termoestáveis. Alguns pesquisadores consideram vantajosa a esterilização por filtro do AIA (ácido indolacético) e cinetina. Harvais (1982 citado por PASQUAL, 2001a), constatou que citocininas e auxinas eram mais ativas em promover a germinação e o crescimento de plântulas de orquídea se fossem esterilizadas em filtros de membrana ao invés de autoclavadas.

No caso do ácido giberélico é sabido que não deve ser autoclavado, pois é hidrolisado por aquecimento em solução e pode se tornar inativo (perda de 90% da reatividade), segundo Pierik (1990). Entretanto, alguns pesquisadores não descreveram perdas significativas de atividade, necessitando assim de pesquisas mais aprofundadas (PASQUAL, 2001a).

Na esterilização por filtração, as soluções, meios líquidos, e outros, atravessam um filtro de membrana, sendo retidas todas as partículas, microrganismos e vírus que são maiores que o diâmetro do poro correspondente do filtro. A vantagem desse método é que as substâncias termolábeis, que se decompõem durante a autoclavagem, podem atravessar o filtro sem sofrer qualquer modificação. As desvantagens podem ser: adsorção de substâncias no filtro, às vezes alguns vírus podem atravessá-lo, o procedimento consome mais tempo e não é tão simples como a autoclave (PIERIK, 1990).

É recomendado um filtro de nitrato ou acetato celulose, com um diâmetro de poro de 0,22 μm. Primeiro os meios são autoclavados em um frasco sem a substância; depois com o meio ainda líquido (aproximadamente de 45 °C a 50 °C), a substância, com ajuda de uma seringa hipodérmica mais um filtro de membrana, é injetada no meio de cultura. Essa operação é feita na câmara de fluxo laminar. A mistura (meio + substância) é distribuída em tubos de ensaio previamente esterilizados. Também é possível filtrar um meio nutri­tivo já completo, contendo a substância (PIERIK, 1990). Obviamente os componentes do filtro (filtro, agulha, etc.) devem ser esterilizados antes do uso, por meio da autoclave, ou com álcool 96%.

Irradiação – a esterilização de meios nutritivos por irradiação com raios gama quase não é usada em cultivo de tecidos, pois é muito cara se comparada com o procedimento habitual, por autoclavagem. Além disso, a esterilização realizada em autoclave é tão efetiva quanto à esterilização por raios gama, e o crescimento vegetal que se obtém é significativamente menor nos meios esterilizados dessa forma.

Na esterilização de tubos, caixas ou outros recipientes de plástico, onde o uso da autoclave é impossível, quase sempre é usada a esterilização por meio de raios gama. Os meios esterilizados em autoclave são distribuídos nos recipientes estéreis, na câmara de fluxo laminar (PIERIK, 1990).

Estocagem do meio e materiais após a esterilização

A área destinada à estocagem do meio de cultura bem como os materiais autoclavados chama-se sala de transferência, e a mesma deve ser higiênica e livre de microrganismos.

Os meios nutritivos, como também qualquer outro material esterilizado, devem ser armazenados em armários ou caixas metálicas que tenham sido previamente desinfestados com álcool 96% (PIERIK, 1990). O meio de cultivo, depois de esterilizado, deve ser utilizado o mais rápido possível para evitar prováveis contaminações.

Sala de inoculação ou de transferência

Um nível elevado de assepsia é condição obrigatória em qualquer situação, já que fungos e bactérias encontram no meio nutritivo utilizado ambiente apropriado para se desenvolverem rapidamente. Para evitar isso, as culturas são mantidas em recipientes fechados após serem previamente esterilizados. Algumas espécies necessitam de que haja trocas gasosas do interior com o exterior dos recipientes, o que se consegue, normalmente, por meio de um pequeno espaço livre deixado entre a tampa e o recipiente, por onde podem penetrar insetos e também os microrganismos do ar. Isso pode acontecer também durante a introdução dos explantes nos frascos e quando são feitas as transferências do material em um recipiente para um outro contendo meio de cultura novo. Daí surge a importância de um ambiente com características apropriadas, bem como de equipamentos e normas de trabalho que possibilitem a criação de um ambiente externo ao redor do recipiente com elevado nível de assepsia. Essa necessidade torna-se mais importante à medida que aumenta o tamanho do laboratório, pois, com maior demanda das atividades, cresce também o risco de contaminação. Deve-se também limitar a circulação de pessoas nas áreas que exigem maior assepsia.

Além dessas observações, é importante que se façam limpezas frequentes da sala de inoculação usando produtos sanitários para evitar insetos e ácaros. Os técnicos responsáveis pela manipulação de plântulas in vitro devem higienizar os antebraços e mãos com álcool 70% e retirar todo tipo de material pessoal, como anéis, colares, e prender os cabelos, quando necessário.

Câmara de fluxo laminar

A câmara de fluxo laminar é um equipamento que força a passagem do ar por meio de um filtro bacteriológico, de modo que seja criado um ambiente estéril com pressão positiva, evitando a entrada de ar externo contaminado. Após borrifar álcool a 70% na câmara, deve-se, com auxílio de uma gaze, espalhar o álcool para que ocorra perfeita descontaminação. Dependendo da região, como em locais de alta umidade relativa, é aconselhável repetir a operação por mais uma vez. É importante ressaltar que em todas as etapas antes da inoculação do material vegetal é de crucial importância uma assepsia criteriosa, visto que após os microrganismos se instalarem in vitro, o controle torna-se oneroso podendo o laboratório ou biofábrica ter grandes prejuízos.

Portanto, após a câmara de fluxo laminar estar desinfestada, os frascos ou tubos com o material vegetal, bem como todos os utensílios, devem ser borrifados com álcool 70% para depois serem colocados no interior da câmara.

Quando a câmara de fluxo possui luz ultravioleta (germicida), esta deve ser ligada 15 minutos antes de iniciar os trabalhos, devendo tomar cuidado para evitar lesões nos olhos e pele. Durante o período em que a luz estiver ligada, deve-se evitar entrar na sala de manipulação. Além da câmara de fluxo laminar, a área de manipulação asséptica deve possuir esterilizadores de esfera de vidro, bicos de Bunsen ou lamparinas para a esterilização dos instrumentos durante o trabalho. Essa sala deve ser mantida sempre fechada e com entrada restrita (LAMEIRA et al., 2000).

Quanto mais próximo da saída de ar da câmara, mais certificada está a qualidade do ar. Alguns autores mencionam que os primeiros 10% da câmara, de fora para dentro, embora desinfestados, podem contaminar os utensílios. Portanto recomenda-se colocar os materiais o mais dentro possível da câmara.

O uso de máscaras é obrigatório, visto que a respiração pode liberar vírus e outros contaminantes. Pinças e bisturis devem ser flambados em álcool 95% constantemente. Embora alguns autores relatem que a chama produzida pelo álcool não seja muito quente, o uso do aparelho esterilizador se mostra eficiente, principalmente em locais de alta umidade relativa. Diversos laboratórios mantêm as fitas de parafilme acopladas dentro da câmara de fluxo laminar para selar os frascos e tubos de ensaio com a finalidade de reduzir o risco de contaminação.

Sempre que se retirar as mãos da câmara, ao retorná-las deve-se borrifar novamente álcool 70% nas mãos e antebraços. Além disso, deve-se manter o corpo corretamente apoiado na cadeira, evitando introduzir a cabeça dentro da câmara.

Em trabalho cujo objetivo era avaliar e caracterizar os níveis de contaminação microbiana em diferentes ambientes de um laboratório de cultura de tecidos, Oliveira et al. (2007) verificaram que a câmara de fluxo laminar ligada constitui-se em ambiente completamente asséptico. Em contrapartida, as maiores taxas de contaminação fúngica foram observadas na sala de preparo de material vegetal e nas salas de lavagem e de preparo de meio. Já maiores taxas de contaminação bacteriana foram observadas na sala de preparo de meio de cultura.

De acordo com Dantas et al. (2002a), a avaliação periódica da eficiência das câmaras de fluxo laminar e troca de filtros dentro dos prazos de validade devem ser realizadas. Esses cuidados são importantes para garantia de efetividade do equipamento.

Sala de crescimento

É o local destinado à permanência das culturas após a inoculação. As condições de temperatura, umidade e luminosidade são controladas, e as condições de assepsia devem ser rigorosa­mente mantidas. Estas condições podem ser obtidas por meio de salas aclimatizadas, controlando-se a temperatura com ar condicionado e fornecimento de luz por lâmpadas fluorescentes brancas-frias (comum) e/ou grow-lux (especial). O sistema de refrigeração precisa controlar a temperatura para que permaneça entre 30 °C e 15 °C. Essa sala deve possuir estantes metálicas para apoio dos frascos, onde são instaladas lâmpadas na parte inferior da prateleira, distanciadas de 40 cm a 50 cm entre si.

Dependendo do mecanismo de regeneração da planta e da espécie, em alguns casos é necessária a incubação de culturas no escuro, por meio do uso de câmara do tipo Biosystem Organized Development (BOD), ou de salas aclimatizadas na ausência de luz, além das culturas de células em suspensão, que deve ser feita sob agitação. Os agitadores devem estar instalados dentro da sala climatizada.

É expressamente proibida a entrada de pessoas estranhas a esse local, ficando restrita apenas aos técnicos e funcionários do laboratório. Todos esses cuidados são empregados, visto que as vestimentas das pessoas podem levar esporos de microrganismos, ácaros e insetos e contaminar a sala.

Descarte de material senescente e contaminado

Todo material contaminado e senescente deve ser conduzido para uma sala denominada sala de descarte, onde o material é novamente autoclavado a 121 ºC por 20 minutos para que os recipientes possam ser abertos e lavados.

Alimentação no laboratório

O laboratório é um ambiente asséptico, e resíduos de alimen­tos como bolachas, pães e outros são iscas para o surgimento de insetos que trazem consigo esporos de microrganismos. A proibição estende-se aos cigarros e a bebidas em geral.

Os laboratórios, de maneira geral, possuem procedimentos considerados padrões e que necessitam ser seguidos para um bom andamento das atividades. Existem referências que abrangem amplamente esse assunto (BARKER, 2002; HIRATA; MANCINI FILHO, 2002).

Limpeza nos compartimentos do laboratório

Todas as repartições do laboratório devem ser bem organi­zadas. Deve-se evitar entulhos, o que favorece acomodação de insetos e ácaros, e realizar limpezas e desinfestações constantes. Muitos laboratórios realizam fumigação no laboratório, anualmente, para certificar-se da assepsia.

Permanência no laboratório

Muitos laboratórios comerciais adotam como critério o uso de únicas vestimentas para os técnicos e funcionários. Assim, ao chegarem, se dirigem ao vestuário e colocam a roupa e calçados destinados ao uso diário no laboratório. Esse procedimento evita a entrada de contaminações por esporos, ácaros e insetos. Posteriormente, as mãos e antebraços são lavados com sabão bactericida. Os operadores, ao se dirigirem para a sala de cresci­mento, passam antes por um local chamado pedilúvio, onde os sapatos são desinfestados em cal e outros germicidas.

Flambagem dos instrumentos

A flambagem dos instrumentos (bisturis e pinças) de uso no laboratório tem a única finalidade de eliminar o álcool, responsável pela desinfestação. O álcool 95% é usado para flambagem, já o álcool 70% é usado para pulverizar mãos e mesa da câmara.

Todos os instrumentos são flambados após imersão em etanol absoluto e devem ser utilizados somente quando estiverem frios. Para evitar o uso de instrumentos ainda quentes, é interessante utilizar mais de um conjunto de instrumentos. Lâminas limpas, livres de resíduos e oxidações são indispensáveis (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Muito tempo de exposição ao fogo da lamparina ou bico de Bunsen durante a flambagem pode destemperar os instrumentos.

A troca frequente do álcool de flambagem e dos respectivos recipientes é uma das medidas preventivas tomadas durante as repicagens para se evitar a contaminação.

Uma alternativa ao uso da flambagem é a utilização de esterilizador elétrico para instrumentos de laboratório, como pinças, agulhas, espátulas, alças e outros. É manuseado no interior de câmaras de fluxo laminar e elimina riscos decorrentes da queima de combustíveis líquidos (GLP ou outros) no laboratório. Conectado à rede de alimentação elétrica, atinge até 800 °C e o instrumento a ser esterilizado poderá ser retirado alguns segundos após sua introdução na câmara de esterilização.

Cuidados especiais com a planta matriz

Plantas matrizes ou plantas-mãe são aquelas destinadas a fornecer os explantes primários, que serão estabelecidos no cultivo in vitro. Em virtude da grande influência das características destas plantas sobre o estabelecimento e o crescimento in vitro, é muito importante considerar alguns aspectos, incluindo a sua condição fisiológica, qualidade genética e fitossanitária.

A condição fitossanitária da planta matriz é de grande valor, pois determinará a facilidade em descontaminar o explante durante o isolamento. Apesar de se realizar uma desinfestação dos explantes, diversos microrganismos de natureza endógena não são expostos aos agentes desinfestantes e devem ser controlados já na planta matriz (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Frequentemente plantas matrizes são rejeitadas por apresentarem doenças, sejam elas causadas por fungos, bactérias, vírus ou outros organismos. Tais problemas fitossanitários afetam não somente a introdução do material in vitro como também a qualidade final da muda (PASQUAL, 2001b).

Seleção de explantes

Os melhores explantes são obtidos a partir de plantas matrizes sadias, vigorosas, isentas de qualquer tipo de estresse e em pleno crescimento vegetativo. A planta matriz selecionada para fornecer os explantes deve estar nutricionalmente equilibrada, pois favorece seu crescimento vegetativo e facilita a retirada do material propagativo. Nos casos específicos de adubações de plantas matrizes, devem-se fazer análises tanto do solo como de folhas para obtenção de melhores resultados (PASQUAL, 2001b).

Ao proceder a retirada de explantes da planta matriz e conduzi-los ao laboratório, faz-se necessário avaliar o estado fitossanitário da planta, eliminando, assim, partes vegetais ou plantas inteiras com sintomas de doenças e/ou ataque de pragas.

Conforme Grattapaglia e Machado (1998), a retirada de explantes deve ser feita de preferência a partir de brotações novas que são formadas durante a fase ativa de crescimento da planta, após o final do período de dormência, durante os meses mais quentes do ano (primavera e verão). Essa recomendação está de acordo com os resultados obtidos por Mroginski et al. (1997) e Bernasconi et al. (1998) com erva-mate. Os autores relataram que os melhores resultados de estabelecimento foram obtidos com explantes coletados nas épocas mais quentes do ano no hemisfério sul (janeiro, fevereiro e março), e que nos meses mais frios (julho e agosto) a taxa de estabelecimento foi nula.

Em contrapartida, resultado divergente foi obtido também com erva-mate por Rosa et al. (2006), em que o mês de agosto (inverno) foi o mais adequado para extração e estabelecimento de segmentos nodais com uma taxa de 57% de indivíduos sadios. Hörner et al. (2000a), testando os meses de março, abril e setembro para inoculação de explantes de erva-mate, constataram que em abril obtiveram-se maior porcentagem de explantes não contaminados. Buzkan et al. (1997) testaram a primavera, o verão e o outono para coleta de gemas terminais e axilares de cerejeira doce (Prunus fruticosa x Prunus avium), visando ao isolamento de meristemas, e verificaram que a contaminação bacteriana foi maior em explantes coletados no verão.

Geralmente são utilizados explantes coletados de regiões meristemáticas juvenis. Diversas práticas horticulturais são adotadas para se obter brotações juvenis ou promover o rejuvenescimento de tecidos adultos (FRANCLET, 1987). A mais comum é a poda drástica, quebrando a dominância apical e estimulando o desenvolvimento das gemas, que ainda mantêm a condição juvenil, na porção inferior da planta mais próxima da raiz.

Durante a coleta dos materiais que darão origem aos explan­tes, deve ser mantido o maior nível de assepsia possível, utilizando-se instrumentos limpos ou até esterilizados, como tesouras, pinças, bisturis.

No caso de plantas doentes, deve-se procurar coletar explan­tes de tamanho bem reduzido. A dificuldade maior nessa etapa reside em se obter material vegetal descontaminado, sem, no entanto, conduzi-lo à morte quando isolado (PASQUAL, 2001b).

Manutenção no campo

Quando a planta é mantida em ambiente externo, fica exposta a todo tipo de intempéries e insetos que provocam ferimentos, permitindo a entrada de microrganismos patogênicos.

O tratamento com fungicidas, bactericidas e inseticidas é uma das técnicas mais utilizadas no condicionamento de plantas matrizes, pois permite a redução da carga de patógenos sobre a planta e, futuramente, sobre os explantes, diminuindo a contaminação quando do estabelecimento in vitro. Recomendam-se aplicações quinzenais de fungicidas sistêmicos, de amplo espectro, principalmente nos dias anteriores à coleta do explante. Têm sido bastante eficaz, para determinadas espécies, pulverizações com o fungicida mais inseticida granulado sistêmico à base de disulfoton mais triadimenol de acordo com a recomendação do fabricante.

Em trabalho de Hörner et al. (2000b), mudas de erva-mate, de um ano de idade, mantidas em viveiro, foram pré-tratadas com cinco pulverizações alternadas, em intervalos quinzenais, de mancozeb (2 g L-1) e benomyl (1 g L-1). Decorridos 20 dias da última pulverização, segmentos nodais foram coletados, desinfestados com álcool 70% e hipoclorito de sódio por 15 minutos e inoculados em meio de cultura contendo combinações de benomyl (0 mg L-1, 1 mg L-1, 5 mg L-1 e 10 mg L-1) e rifampicina (0 mg L-1, 10 mg L-1, 25 mg L-1 e 50 mg L-1). Os autores concluíram que os pré-tratamentos foram eficientes no controle das contaminações, pois não houve diferença entre as combinações de fungicida e bactericida adicionados ao meio de cultura.

Erig e Fortes (2002), visando ao estabelecimento in vitro de pereira (Pyrus spp.), pulverizaram plantas matrizes mantidas no campo com o antibiótico Agrimicina (Oxitetraciclina e Sulfato de Estreptomicina) e o fungicida Dithane (Mancozeb) 10 dias antes da coleta dos explantes. Durante o cultivo, os autores constataram contaminações bacterianas de 45,7% em gemas e 18,8% em meristemas, enquanto a contaminação fúngica chegou até 11,5%. Também constataram diferenças de contaminação bacteriana entre cultivares, com 17,7%, 13,5% e 5,1% para Garber, Smith e Carrick, respectivamente.

Plantas matrizes de pereira conduzidas no campo e pulveri­zadas de maneira intercalada a cada dois dias, duas semanas antes da coleta dos ramos, com benomyl (1 mg L-1) e Agrimicina (2,4 mg L-1), forneceram gemas e meristemas para introdução in vitro (DANTAS et al., 2002b). As contaminações foram nulas em algumas cultivares quando utilizaram meristemas, chegando no máximo a 3,3%, enquanto que percentuais de 73,5% a 95,7% de contaminação ocorreram quando os explantes foram gemas.

Em extenso trabalho, Pence (2005) coletou 85 espécies de área tropical e 49 de área temperada, visando comparar os sítios de coleta e a necessidade da utilização de agentes antimicrobianos nos subsequentes níveis de contaminação nas culturas. Os percentuais de contaminação dos explantes coletados em área temperada foram menores do que em área tropical; entretanto, os fungos de áreas tropicais foram, de maneira geral, mais responsivos à adição do Benlate do que os fungos de explantes coletados em áreas temperadas. A adição do fungicida Benlate e dos antibióticos Cefotaxima e Vancomicina, em determinados explantes, reduziram a contaminação.

Por outro lado, Ramírez-Villalobos et al. (2002), embora tendo coletado explantes de matrizes de Annona muricata conduzidas no campo e sem nenhum tratamento fitossanitário, obtiveram altas taxas de estabelecimento quando a desinfestação foi realizada com hipoclorito de sódio a 1% por 5 ou 10 minutos.

Outra prática indicada para planta matriz em campo, assim como em casa de vegetação, é a poda, que facilita o controle fitossanitário, pois permite a retirada de ramos atacados por pragas e doenças.

A nutrição mineral adequada da planta matriz é de fundamen­tal importância, pois diminui as chances de ataques de pragas e doenças. Recomenda-se fazer análise de solo e análise foliar e corrigir as deficiências nutricionais da planta matriz quando necessário.

Explantes extraídos de plantas mais novas apresentam menores índices de contaminação (PASQUAL, 2001b). Porém, quando as plantas são mais velhas, faz-se uso de podas para proporcionar o rejuvenescimento da planta e pode-se fazer uma cobertura desses ramos podados com sacos plásticos ou papel impermeabilizado, recuperando, em seguida, brotações novas que se desenvolveram dentro do ambiente protegido.

Manutenção em casa de vegetação

A manutenção da planta matriz em ambiente mais limpo, co­mo uma casa de vegetação ou câmara de crescimento, é uma forma de reduzir ao máximo os estresses e a contaminação quando do estabelecimento in vitro, além de permitir a brotação mais intensa e, consequentemente, o aumento do rendimento de explantes por planta matriz.

A manutenção da planta matriz em casa de vegetação permite ainda o controle de insetos e microrganismos mediante a aplicação de fungicidas, inseticidas e bactericidas. Têm sido bastante efi­cazes, em diversas espécies, irrigação e pulverização com soluções de agentes sistêmicos, como o benomyl (solução 0,2%) e terramicina (oxitetraciclina) com sulfato de estreptomicina (Agrimicina solução 0,1%), alternados com fungicidas não sistêmicos com princípios ativos diferentes (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

As aplicações de fungicidas, bactericidas e inseticidas devem seguir um cronograma bastante rígido, e a coleta de explantes deve ser realizada, preferencialmente, de 24 a 48 horas após a última aplicação do produto. O controle de ácaros e pulgões é muito importante, e inspeções constantes devem ser realizadas.

Recomenda-se utilizar casas de vegetação sem nebulização e sem irrigação por aspersão, pois esse tipo de irrigação aumenta a contaminação da planta matriz. A irrigação, nesse caso, deve ser feita direta e unicamente no substrato, mantendo a planta adequadamente irrigada.

A manutenção das plantas matrizes em substrato esterilizado (fumigado ou autoclavado), em vasos sem contato direto com o solo, de preferência sobre bancadas, é outra medida preventiva indicada para condicionamento dessas plantas.

Quando se trata de uma planta arbórea ou arbustiva em campo, utiliza-se a enxertia ou estaquia ou ainda qualquer outro método que permita trazer esse indivíduo para ambiente controlado (PASQUAL, 2001b).

De acordo com Mroginski et al. (1997), o êxito do estabeleci­mento in vitro dos explantes depende inicialmente da fonte de onde foram retirados. Explantes de erva-mate proveniente diretamente das plantas matrizes adultas conduzidas no campo, na sua totalidade oxidam ou são contaminados com bactérias e/ou fungos. Entretanto, quando os explantes são oriundos de matrizes cultivadas em casa de vegetação, obtidas do enraizamento de estacas, percentuais de brotação de 75% são obtidos. Tal comportamento foi comprovado em trabalhos anteriores (MROGINSKI et al., 1996; REY; MROGINSKI, 1988).

Em mamoeiro, as plantas doadoras de explantes são obtidas em condições de casa de vegetação, apresentando menor contaminação fúngica e bacteriana em relação àquelas cultivadas no campo (VIANNA et al., 1997). Uma taxa de 95% de contaminação microbiana foi observada em explantes de mamoeiro provenientes de plantas do campo, mesmo após a descontaminação (LITZ; CONOVER, 1977, 1978).

De plantas matrizes de mirtilo (Vaccinium ashei Reade) com 1,5 ano, mantidas em casa de vegetação, Silva et al. (2008) coletaram segmentos nodais de ramos herbáceos e lenhosos. Esses foram desinfestados por imersão em álcool 70% por 10 segundos e em hipoclorito de sódio a 2,5% adicionado de 2 gotas de Tween 20, durante 10 minutos, seguida de três lavagens com água autoclavada. Após a inoculação, os explantes permaneceram no escuro por sete dias e posteriormente levados para sala de crescimento. Os autores observaram que os explantes de ramos herbáceos apresentaram menor contaminação fúngica e bacteriana respectivamente (0,16% e 8,16%) do que as de ramos lenhosos (18,05% e 29,03%).

No estabelecimento in vitro de macieira, Erig e Schuch (2003) realizaram experimentos visando definir metodologia para o controle de contaminação. As plantas matrizes, das quais foram retiradas os explantes, foram mantidas em casa de vegetação e pulverizadas semanalmente com agrimicina (oxitetraciclina e sulfato de estreptomicina) e dithane (mancozeb) a 2,4 e 1,0 g L-1, respectivamente. Obtiveram-se altas percentagens de sobrevivência dos explantes em função da efetividade da desinfestação propor­cionada pelo hipoclorito de sódio.

Erig e Schuch (2005), em trabalho visando estabelecer in vitro o mirtilo cv. Flórida, coletaram segmentos nodais obtidos de brotações novas de mudas mantidas em casa de vegetação. As mudas foram pulverizadas semanalmente 45 dias antes da coleta das brotações com 2,4 g L-1 de agrimicina (oxitetraciclina e sulfato estreptomicina) e 0,7 g L-1 e 3 g L-1 dos fungicidas cercobin (tiofanato metílico) e kumulus (enxofre), respectivamente. Após coletados, os explantes foram desinfestados com álcool 70% e hipoclorito de sódio (2%–2,5%). A contaminação bacteriana dos explantes foi nula, enquanto a fúngica foi de apenas 1,36%, o que foi atribuído à manutenção das plantas matrizes em ambiente limpo e protegido e à sua pulverização prévia com antibiótico e fungicidas. Em contraste a este resultado, Gonzales et al. (2000) constataram a ocorrência de 50% de contaminação quando utilizaram explantes oriundos de brotações de plantas matrizes mantidas no campo.

Explantes de oliveira (Olea europaea), retirados de plantas matrizes mantidas em casa de vegetação e desinfestados conforme o protocolo padrão (álcool 70% por 30 segundos e hipoclorito de sódio a 2,5% do princípio ativo), tiveram contaminação bacteriana nula e fúngica de 1,66%. A manutenção das plantas em ambiente protegido e pulverizações com agrimicina (estreptomicina) a 2,4 g L-1 e cercobin (tiofanato metílico) a 0,7 g L-1 foram determi­nantes para o resultado encontrado (DONINI et al., 2008).

Horbach (2008), com o objetivo de estabelecer segmentos nodais de erva-mate in vitro, manteve mudas oriundas de cepas de plantas, com aproximadamente 10 anos de idade, em casa de vegetação. Antes da coleta dos explantes, as mudas foram submetidas à aplicação diária de Captan® (2 mL L-1) e Cercobin® (1,5 g L-1), durante 5 dias. Os explantes foram desinfestados com álcool 70% por 2 ou 4 minutos e NaOCl a 2% durante 15, 25 ou 35 minutos. A maior taxa de sobrevivência (42,5%) foi obtida com imersão dos explantes em álcool 70% por 4 minutos e em NaOCl por 25 minutos. Mesmo com a manutenção das mudas em ambiente protegido e tratamento com fungicidas, foram observadas médias de contaminação fúngica e bacteriana de 42,5% e 27,1%, respectivamente. Entretanto, a erva-mate é reconhecidamente uma espécie muito difícil de ser introduzida in vitro, não tendo, por isso, até o momento, nenhum protocolo de micropropagação estabelecido.

Desinfestação inicial de sementes e explantes

Os pré-tratamentos aplicados na planta matriz são de funda­mental importância nessa etapa de desinfestação de sementes e explantes, principalmente no que se refere aos microrganismos endógenos. Geralmente, na descontaminação dos tecidos, os mes­mos são levados à morte quando isolados, sendo a maior dificuldade nesta etapa.

Conforme Pasqual (2001b), para a desinfestação na fase de assepsia dos propágulos, que antecede a remoção dos explantes, deve-se tomar alguns cuidados:

– Remoção de partes atacadas: remoção de folhas e partes danificadas, eliminação de pelos (tecido muito pubescente é mais sujeito a contaminação).

– O material coletado, principalmente se for proveniente do campo, pode ser mantido em água corrente por algumas horas para lavagem superficial de partículas de poeira e outras fontes de contaminação superficial.

Quando o material a ser desinfestado apresenta superfícies muito irregulares, como reentrâncias em tegumentos de sementes ou grande quantidade de pêlos superficiais, algumas medidas podem ser tomadas para permitir uma completa exposição dos tecidos e a não formação de bolhas de ar ao longo do material. Durante a imersão nas soluções, pode-se promover a agitação com agitadores horizontais ou magnéticos.

Várias substâncias com ação germicida (Tabela 5) podem ser utilizadas para a desinfestação dos explantes. As mais comuns são o etanol e os compostos à base de cloro como o hipoclorito de sódio (0,5% a 2%) e de cálcio. Algumas gotas de detergente são comumente adicionadas às soluções à base de cloro para melhorar o contato destas com os tecidos. Um espalhante adesivo é utilizado, a exemplo do Tween 20 (1 gota/100 mL a 2 gotas/100 mL) que aumenta a penetração da solução no tecido. O uso de vácuo à solução aumenta a dilatação dos poros do propágulo, facilitando a penetração da solução desinfestante (PASQUAL, 2001b).

Tabela 5. Características de alguns desinfestantes utilizados na cultura de tecidos.

Desinfestante

Concentração (%)

Facilidade de remoção

Tempo (minutos)

Eficiência

Hipoclorito Ca

9–10

+++

5–30

Alta

Hipoclorito Na

0,5–2

+++

5–30

Alta

H2O2

10–12

+++++

5–15

Boa

Br2. H2O

1–2

+++

2–10

Alta

Nitrato Ag

1

+

5–30

Boa

HgCl2

1

+

2–30

Satisfatória

Fonte: Pasqual (2001a).

Protocolo para desinfestação de sementes e explantes

A persistente contaminação dos tecidos por bactérias é problema sério, considerando que tratamentos sucessivos com solução de hipoclorito de sódio ou outro desinfestante qualquer são mais prejudiciais ao tecido do que à bactéria. O processo de desinfestação deve ser realizado em câmara de fluxo laminar em condições assépticas, utilizando vidraria previamente esterilizada (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Após a desinfestação, se­guem-se a lavagens sucessivas com água destilada ou deionizada e autoclavada, geralmente de 3 a 5. A seguir, o explante é colocado no meio de cultura sendo levado posteriormente para sala de cres­cimento.

Podem-se utilizar fungicidas e antibióticos para controle de bactérias durante a desinfestação, ou incorporá-los ao meio nutritivo de isolamento (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Deve-se pro­curar um fungicida que apresente amplo espectro de ação e seja pouco tóxico às culturas nas concentrações necessárias para con­trolar fungos.

Sato et al. (2001), estudando metodologias de estabelecimento in vitro do Celtis sp., realizaram experimentos visando à redução de contaminação por microrganismos, mantendo segmentos nodais sob efeito de lavagens em água e gemas apicais e laterais tratadas com diferentes concentrações de Benlate®. As lavagens em água favoreceram a disseminação de fungos, enquanto o Benlate®, na concentração de 200 mg L-1, inibiu o crescimento de fungos sem causar fitotoxidez aos explantes. Santos et al. (2003), visando ao controle de contaminação bacteriana em Prunus sp. in vitro, utilizaram peróxido de hidrogênio (água oxigenada) em segmentos nodais. Explantes contaminados com bactérias foram tratados com solução de peróxido de hidrogênio nas concentrações 0%, 10%, 20% e 30%, durante 0, 5, 10 e 15 minutos. Em todas as avaliações o uso de solução a 30% de peróxido de hidrogênio por 5 minutos eliminou 100% da contaminação bacteriana.

Na otimização da micropropagação de Pfaffia tuberosa (ginseng brasileiro), Flores et al. (2006) inicialmente trataram brotos de plantas jovens mantidas em recipientes no laboratório com benomyl a 0,1%. Posteriormente, os brotos foram submetidos a uma sequência de seis etapas realizadas sucessivamente: 1) lavagem em água com detergente comercial (2 gotas 100 mL-1) durante 2 minutos; 2) imersão em solução de álcool 70% por 10 segundos; 3) imersão em solução de hipoclorito de sódio a 1% acrescido de detergente (2 gotas 100 mL-1) por 10 minutos; 4) três lavagens em água; 5) imersão em solução de bicloreto de mercúrio (HgCl2) a 0,1% por cinco minutos; 6) seis lavagens consecutivas em água. De acordo com os autores, a metodologia de desinfestação foi efetiva, em função da ausência de contaminações fúngicas ou bacterianas, embora 38,5% dos explantes tenham mostrado sintomas de toxidez na porção basal ou aérea, o que foi atribuído ao uso do HgCl2, sem, contudo, comprometer o desenvolvimento das plantas. Em contrapartida, Nicoloso et al. (2001) verificaram que a desinfestação de explantes de Pfaffia glomerata com solução de HgCl2 pode interferir no crescimento de brotos e raízes.

Nietsche et al. (2006) testaram dois protocolos de desinfes­tação em explantes de três cultivares de bananeira, um por imersão em solução de Carbendazim (Derosol p.a.) a 3,3% por 20 minutos, em álcool comercial (92,8%) por 1 minuto e agitação em solução de hipoclorito de sódio a 2% por 20 minutos. No outro procedimento, os explantes foram inicialmente lavados com água destilada adicionada de 2% de detergente, posteriormente imersos em solução de Derosol a 6,6% por 20 minutos, em álcool 70% por 5 minutos e hipoclorito de cálcio a 2% sob agitação por 25 minutos adicionado de três gotas de tween 20 L-1 de solução. Os autores constataram que não houve diferença significativa entre os dois procedimentos de desinfestação.

Em trabalho com estabelecimento in vitro de mamoeiro, constatou-se que a escarificação mecânica das sementes, seguida de imersão por 10 minutos em ácido sulfúrico (H2SO4), mais 10 minutos em solução de álcool 70% mais 23 gotas de tween 80, 20 minutos em hipoclorito de cálcio (CaOCl) a 20%, cinco lavagens com água estéril e armazenamento por 19 dias em freezer, proporcionou a menor taxa de contaminação (20,7%). Nos demais tratamentos, o percentual de contaminação variou de 46,6% a 100%. Borges et al. (2006) ressaltaram que a utilização de hipoclorito de cálcio, em detrimento do hipoclorito de sódio, diminuiu as taxas de contaminação e oxidação.

Sementes de jabuticabeira (Myrciaria spp.) foram eficiente­mente desinfestadas com 5% de NaOCl (PICOLOTTO et al., 2007). Segundo os autores, a contaminação fúngica é inversamente proporcional à concentração de NaOCl utilizada, entretanto, não interfere na contaminação bacteriana. Coutinho et al. (2000), estudando a efetividade do NaOCl contra alguns fungos transmitidos por sementes, observaram que a germinação de conídios foi inferior nas concentrações de 1%, 2% e 5% de NaOCl em relação à testemunha e à concentração de 0,5%.

Zaniolo e Zanette (2002), em trabalho visando estabelecer um protocolo de micropropagação de erva-mate, mantiveram mudas de dois anos em casa de vegetação, sob pulverizações semanais com benomyl a 2 g L-1. Dessas retiraram brotações que foram desinfestadas com NaOCl a 0,50% e 0,75% (5% de cloro livre) por 5, 10 ou 15 minutos. As menores taxas de contaminação fúngica (5,7%) e bacteriana (15,7) foram obtidas com a desinfestação dos explantes com 0,75% de NaOCl por 10 minutos. A manutenção das plantas matrizes em casa de vegetação e o tratamento destas com fungicida são alguns dos fatores que contribuíram para os resultados obtidos.

Trabalhando para desenvolver um procedimento eficiente para produção de mudas de bananeiras tetraploides (Musa sp. FHIA-01), Oliveira et al. (2001) desinfestaram os explantes retirados de plantas matrizes conduzidas no campo, com álcool comercial 90% por 2 minutos e hipoclorito de cálcio 6% por 30 minutos sob agitação. Observaram que as taxas de contaminação variaram de 1,07% a 22,32% e que a porcentagem de contaminação sofre redução à medida em que os explantes vão sendo subcultivados. Os autores consideraram elevada a taxa média de contaminação de 12,53% na micropropagação massal da bananeira.

Em mangueira, pesquisas foram desenvolvidas visando otimizar o estabelecimento in vitro (ANDRADE et al., 2005; CORDEIRO et al., 2002), observando-se percentuais de contaminação de 0% a 100%, variando em função de inúmeros fatores.

Quando sementes são utilizadas como explante inicial, normalmente as taxas de contaminação são praticamente nulas. Galvanese et al. (2007) não observaram contaminações na germi­nação in vitro de sementes de Aechmea blanchetiana, enquanto Pickens et al. (2003) obtiveram percentuais de descontaminação acima de 90% na germinação de sementes in vitro de Tillandsia eizii.

Donini et al. (2008), estudando a desinfestação de lâminas foliares em 14 espécies de aráceas ornamentais, verificaram que a concentração ideal de NaOCl é variável e depende do genótipo estudado, sendo que as concentrações entre 0,5% e 2,0% de cloro ativo são mais efetivas no combate à contaminação.

No estabelecimento in vitro de sementes de Physalis peruviana, Chaves et al. (2005), testando procedimentos de desinfes­tação com álcool, hipoclorito de sódio e de cálcio, isolados e em combinação, obtiveram taxas de contaminação praticamente nulas, à exceção da desinfestação com hipoclorito de cálcio utilizado isoladamente.

Para a desinfestação de explantes de eucalipto, Alfenas et al. (2004) recomendam a imersão em cloro ativo a 0,5% durante 20 minutos para segmentos nodais mais lignificados, e 0,3% durante 2 minutos para segmentos nodais mais tenros. Brondani (2008), visando determinar a melhor concentração de NaOCl para a assepsia de explantes de clones de Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii, utilizou segmentos nodais oriundos de minicepas conduzidas sob sistema semi-hidropônico e tratadas uma semana antes da coleta das brotações com Kumulus DF®. Após assepsia com álcool 70% por 15 segundos, os explantes foram tratados com 1,0%; 1,5% e 2,0% de NaOCl acrescido de tween 20% a 0,05% durante 10 minutos. A contaminação bacteriana foi nula para um clone, de 1% a 9% para outros dois. Já a taxa média de contaminação fúngica foi de 41,33%. O autor sugere tratamentos com maior tempo de exposição ao NaOCl e/ou aplicações mais frequentes de fungicidas nas plantas matrizes.

Outros trabalhos com estabelecimento de eucalipto in vitro têm sido realizados, testando HgCl2 (HAJARI et al., 2006; SHARMA; RAMAMURTHY, 2000; WATT et al., 2003), hipoclorito de sódio (BENNETT et al., 1994; FANTINI JUNIOR; GRAÇA, 1990; JOSHI et al., 2003; SANTOS et al., 2004) e hipoclorito de cálcio (HAJARI et al., 2006; WATT et al., 2003).

Na Tabela 6, estão relacionados alguns protocolos de desinfes­tação de explantes primários de algumas espécies ornamentais e frutíferas.

Tabela 6. Protocolos de desinfestação de explantes primários de algumas espécies ornamentais e frutíferas.

Espécie

Explante

Desinfestação

Amarílis (Hppeastrum sp.)

Bulbos

Lavar os bulbos inicialmente com água e detergente, posteriormente com álcool 70% durante 1 minuto, seguido de imersão em solução de hipoclorito de cálcio a 3% mais 5 gotas de Tween 20 por 10 minutos, com agitação. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Antúrio (Anthurium andraeanum Lindl.)

Folhas jovens

Lavar as folhas em água corrente com detergente e esponja bem macia. Colocá-las em recipiente adequado e lavá-las com álcool 70% por 5 minutos. Escorrer. Adicionar solução de hipoclorito de cálcio a 1,5% mais 3–4 gotas de Tween 20 e, sob agitação, permanecer por 10 minutos. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Bromélia (Neoregelia carolinae)

Plantas após frutificação

Lavar a planta em água corrente para a retirada total de solo e das folhas. Mergulhar o caule, primeiramente, em solução de cisteína (65 mM) por 5 minutos. Colocar em frasco apropriado e cobri-lo com álcool 70%, por 10 segundos. Escorrer. Adicionar solução de hipoclorito de cálcio 1,5% mais Tween 20 (2–3 gotas) por 10 minutos, sob agitação. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Copo-de-Leite Neozelandês (Zantedeschia elliottii)

Brotações dos tubérculos

Imersão em álcool etílico 70%, durante 10 segundos. Escorrer. Imersão, durante 20 minutos, em solução de hipoclorito de sódio a 1,5%. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Gérbera (Gerbera jamesonii Bolus ex Hook)

Inflorescências

Retirar as lígulas. Imersão em álcool etílico 70%, durante 1 minuto. Imersão, durante 30 minutos, em solução de hipoclorito de sódio preparado com 25 mL de produto comercial de 5% a 6% em 200 mL de água destilada e esterilizada. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Orquídea

Cápsula fechada

Lavar as cápsulas fechadas com solução de hipoclorito de sódio (1 parte de água sanitária: 1 parte de água) por 30 minutos. Escorrer. Fazer tríplice lavagem com água destilada e esterilizada

Rosa

Hastes de roseira com gemas

Lavar as hastes em água destilada e, em seguida, em álcool 70%, em fluxo laminar

Banana (Musa spp. Musaceae)

Rizomas

Imersão em álcool 70% (v/v) por cerca de 1 minuto. Posteriormente, tratamento com hipoclorito de sódio de 1% a 2%, com algumas gotas de Tween 20 (0,01% v/v) durante 15 minutos. Após, sob câmara de fluxo laminar asséptica, lavar cinco vezes com água destilada esterilizada

Fonte: adaptado de Lameira et al. (2000) e Tombolato e Costa (1998).

Manipulação dos explantes nas subculturas

Bactérias endógenas de crescimento lento podem ter origem no explante inicial, aparecendo algumas semanas após o isolamento. Esse caso não chega a representar grande problema, pois, nesse estágio, apenas um reduzido número de plantas derivou do explante contaminado (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

O problema se estabelece quando uma contaminação persis­tente se instala em culturas anteriormente limpas em estágios avançados da multiplicação. Estas bactérias, em geral, não são patogênicas, mas, competindo pelo meio de cultura, comprometem a multiplicação, o crescimento e o posterior enraizamento da planta. Uma vez instaladas na cultura, por terem crescimento lento e serem de difícil visualização, elas podem ser transmitidas de um material para outro. Um fator complicador que favorece a disseminação dessas bactérias é sua resistência às rápidas imersões em etanol absoluto e às temperaturas normalmente atingidas durante a flambagem dos instrumentos.

Um método de indexação das culturas consiste em trans­ferir os explantes suspeitos de contaminação durante duas ou três subculturas em meio rico em nutrientes que estimulam o crescimento das bactérias (extrato de levedura-peptona-glucose-ágar), descartando aqueles que apresentarem contaminação e passando adiante apenas aqueles não contaminados (BOULAY, 1984).

Na fase de multiplicação, o enfoque maior deve ser dado às medidas preventivas tomadas durante a repicagem, tais como:

– Cuidadosa observação da base das culturas na contraluz, que pode ser facilitada com a utilização de agentes solidificantes que deixam o meio mais transparente, detectando mais facilmente a contaminação.

– A troca frequente do álcool de flambagem e dos res­pectivos recipientes (estes devem ser esterilizados ante­riormente).

– A utilização de dois conjuntos de ferramentas de repicagem (cada conjunto composto por duas pinças e dois bisturis), em alternância de 10 a 15 minutos cada, ficando o conjunto não utilizado imerso em hipoclorito de sódio concentrado ou em álcool 95%.

– Flambagens demoradas e repetidas dos instrumentos em intervalos de 5 minutos ou a cada certo número de frascos repicados.

– A não ocorrência de trabalho simultâneo com material contaminado ou suspeito de contaminação e material limpo.

Mecanismo de ação de produtos utilizados na desinfestação inicial dos explantes e adicionados ao meio de cultura

Álcool – Está entre os mais efetivos e largamente utilizados contra contaminantes bacterianos, que agem desnaturando proteí­nas e incrementam a permeabilidade da membrana (INGRAM, 1990; INGRAM; BUTKE, 1984). Segundo Pelczar et al. (1996), a atividade antimicrobiana dos álcoois deve-se principalmente à sua capacidade de desnaturar proteínas. Os álcoois são também solventes de lipídios, lesando assim as estruturas lipídicas da membrana de células microbianas. Além disso, parte de sua eficiência como desinfestante da superfície pode ser atribuída à ação detergente e de limpeza que auxilia na remoção mecânica de microrganismos.

A imersão dos instrumentos em etanol a 70% ou concen­trações maiores, seguida de flambagem, é um método comum de esterilização empregado por laboratórios de cultura de tecidos (SINGHA et al., 1987), e, enquanto o álcool proporciona a esteriliza­ção, a flambagem é realizada para queimar o etanol. O etanol absoluto é relativamente menos efetivo como esterilizante. A água incrementa a molhabilidade do álcool com atividade máxima de desinfestação em torno de 70% a 80% v/v. Álcoois não são unicamente germicidas, mas também removem as ceras superfi­ciais dos tecidos de plantas. Uma imersão preliminar em etanol permite que os tecidos das plantas possam ser mais efetivamente molhados e penetrados por outros germicidas.

Da maioria dos álcoois, o etanol é o mais usual para desin­festação, mas raramente este é utilizado unicamente. Higuchi e Amoki (1989) constataram que 4 minutos de imersão em etanol 70% foi mais efetivo do que de 10 a 15 minutos em 1% de hipoclorito de sódio na remoção de contaminantes em segmentos de rizomas de Asplenium.

A duração do pré-tratamento varia de acordo com o tipo de tecido ou órgão (30 segundos a 1 minuto é o mais recomendado para material tenro) a ser desinfestado, manipula-se a concentração da solução e tempo de exposição de maneira inversamente proporcional. O etanol 70% e 80% geralmente são utilizados por alguns segundos, uma vez que acima destas concentrações é menos eficiente e pode desidratar rapidamente os tecidos (PASQUAL, 2001b). Não há diferença em se utilizar o etanol antes ou após o hipoclorito de cálcio.

Por outro lado, Wistreich e Lechtman (1988) e Nester et al. (1995) citados por Thomas (2004), evidenciam que endósporos de bactérias são difíceis de hidratar e requerem prolongada exposição. A possibilidade de disseminação de esporos de Bacillus resistentes ao calor por meio dos instrumentos flambados com álcool já foi relatada (BOXUS; TERZI, 1987; SINGHA et al., 1987).

No isolamento e caracterização de bactéria sobrevivente ao álcool associada à cultura de tecidos de videira, Thomas (2004) identificou a bactéria Bacillus pumilus, que pode permanecer como endofítica em cultura de tecidos de videira e sobreviveu em etanol aquoso por longos períodos (14 dias). Etanol a 90% foi a concentração mais efetiva como bactericida.

Hipoclorito – É um produto químico utilizado para esterilização de superfícies, frutas e hortaliças, água, entre outros. Sua utilização em larga escala é devido ao seu vasto espectro de atividade biocida contra bactérias, fungos e vírus, além do fato de ser um produto relativamente barato (EMMANUEL et al., 2004). O hipoclorito de sódio causa alterações biossintéticas no metabolismo celular e a destruição de fosfolipídios, formando cloraminas que interferem no metabolismo celular. Gera reações oxidativas com inativação enzimática irreversível em bactérias e a degradação de lipídios e ácidos graxos (ESTRELA et al., 2002). O íon hipoclorito é usualmente obtido do NaOCl ou CaOCI. A ação bactericida de soluções de hipoclorito se deve ao ácido hipocloroso (HOCl) e o íon OCl-. O primeiro é muito mais ativo que o segundo em função da eficiência da clorina. O ácido hipocloroso (HClO) é formado quando o cloro livre é responsável pela ação antimicrobiana do cloro e seus compostos.

Quando adicionados à água, os hipocloritos e as cloraminas sofrem hidrólise, dando origem ao ácido hipocloroso. Este ácido sofre nova reação, originando o oxigênio nascente (O). O oxigênio nascente liberado nesta reação é um poderoso agente oxidante que pode destruir substâncias celulares vitais. O cloro pode também combinar diretamente com proteínas celulares e destruir suas atividades biológicas (PELCZAR et al., 1996). Para uma desinfestação mais efetiva do material vegetal, soluções de hipoclorito devem ser usadas com um pH entre 6 e 7. A atividade germicida do hipoclorito de sódio e cálcio é relatada por sua capacidade oxidativa (AMONEX DO BRASIL, 2004).

Água oxigenada – A ação da H2O2 se deve ao ataque da membrana lipídica, DNA e outros componentes das células, pelos radicais livres tóxicos que o peróxido produz. Alguns microrganismos aeróbicos são capazes de produzir catalase ou superóxido dismu­tase, assim eles se protegem da atividade microbicida transformando o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Para evitar esse efeito, o peróxido de hidrogênio utilizado para esterilização é de concentração maior e possui estabilizantes (AMONEX DO BRASIL, 2004).

Formaldeído – O formaldeído tem uma estrutura química simples (HCHO). É um gás que se mostra estável somente em altas concentrações e em temperaturas elevadas. É extremamente tóxico, e seus vapores são intensamente irritantes às mucosas. Em temperatura ambiente, o formaldeído gasoso polimeriza-se, formando uma substância sólida incolor chamada paraformaldeído que rapidamente libera formaldeído pelo aquecimento. O formaldeído é também comercializado em solução aquosa como formalina, que contém de 37% a 40% (p/v) da substância. O metanol é usualmente adicionado (de 10% a 15%) para prevenir a polimerização de formaldeído. Em solução, o formaldeído é utilizado para a esterilização de certos instrumentos. Na forma gasosa pode ser utilizado para desinfecção e esterilização de ação fechada.

O formaldeído é um composto químico extremamente reativo, e sua atividade microbiana parece ser devida à capacidade de inativar constituintes celulares, como proteínas e ácidos nucleicos. As células vegetativas são destruídas mais rapidamente com o formaldeído do que formas esporuladas.

O formaldeído tem ação lenta e, em concentração de 5%, necessita de 6 a 12 horas para agir como bactericida e de 18 horas, a 8%, para agir como fungicida, além de apresentar alta toxicidade.

Segundo Fior (2004), o paraformaldeído (PF) pode ser empre­gado como agente de desinfestação de tecidos vegetais destinados ao cultivo in vitro. Para a desinfestação de segmentos nodais de Limonium platyphyllum, foi suficiente a exposição dos tecidos a duas drágeas de 500 mg de PF 99,9% por duas horas, à temperatura ambiente, dentro de um frasco de vidro lacrado de 150 mL. Porém, a exposição de tecidos vegetais por tempo prolongado provoca altas taxas de oxidação.

Óxido de etileno – O óxido de etileno é um composto orgânico líquido a temperaturas abaixo de 10,8 oC, mas torna-se um gás acima destas. Uma característica importante é o seu poder de penetração. Atravessa e esteriliza o interior de grandes pacotes, como objetos, roupas e mesmo certos plásticos. Assim, certos materiais, como seringas, podem ser adicionados e então esterilizados.

O óxido de etileno inativa enzimas e outras proteínas que têm átomos de hidrogênio lábeis, como em grupos sulfidrilas. Essa reação é denominada alquilação. O anel da molécula do óxido de etileno se rompe para formar -CH2CH2O-, que se insere entre os átomos de enxofre e hidrogênio do grupo sulfidrila (PELCZAR et al., 1996).

Detergentes – Também denominados surfactantes, são com­postos que diminuem a tensão superficial dos tecidos e também utilizados para limpar superfícies. A ação umectante deve-se ao fato de serem compostos anfipáticos. Quando uma substância apolar, como as gorduras, é colocada em uma solução aquosa de detergente, os grupos hidrofóbicos do detergente ligam-se às substâncias, enquanto os grupos hidrofílicos criam uma superfície que pode ser encharcada com a água (PELCZAR et al., 1996).

PPM – O PPM TM (Preservative Plant Mixture) é um biocida de amplo espectro de ação e é mais barato em relação a antibióticos. Ele pode ser usado na concentração de 0,5 mL L-1 a 2 mL L-1 combinado ou não com antibióticos com a metade de sua concentração. Pode ser usado para reduzir a contaminação de bactérias e fungos em cultura de tecidos de plantas, e em altas concentrações para reduzir contaminações endógenas (PLANT CELL TECHNOLOGY, 2009).

Conforme Niedz e Bausher (2002), as isotiazolonas são uma classe de biocidas industriais que têm sido utilizadas profilaticamen­te na forma de Preservative Plant Mixture (PPM) no meio de cultura para controlar contaminação microbiana.

O PPM TM penetra na parede celular de bactérias ou fungos e inibe a atividade de enzimas chaves, como o ciclo do ácido cítrico e cadeia de transporte de elétrons. Dados recentes indicam que o PPM pode inibir o transporte de monossacarídeos e aminoácidos.

Em plantas lenhosas como citrus, o controle de contaminação bacteriana e fúngica é muito difícil de ser obtido. Niedz e Bausher (2002) reduziram a contaminação por fungos e bactérias em citrus, mas constataram fitotoxidade em explantes oriundos de matrizes mantidas no campo, quando tratados com 20 mL L-1 de PPM; já os contaminantes dos explantes coletados de plantas mantidas em casa de vegetação foram adequadamente controlados com 5 mL L-1. Niedz e Bausher (2002) relatam que pequena fitotoxici­dade foi observada até altas concentrações testadas de 2 mL L-1, duas vezes maior do que a recomendada pelos fabricantes.

De acordo com Compton e Koch (2001), o PPM afeta a embriogênese somática em melão. Além disso, afirmam que o efeito do PPM TM é dependente da espécie. Lemos (2000), em trabalho com microestacas de gravioleira (Annona muricata) tratadas com 10 mL L-1 de PPMTM por 4 horas antes da inoculação em meio de cultura, e Digonzelli et al. (2001), em explantes de cana-de-açúcar e com adição de 0,250 mL de PPM TM adicionado ao meio de cultura, constataram a eficiência desse anticontaminante. De acordo com Palú (2002), o anticontaminante PPM TM, na concen­tração de 0,5 mg L-1, adicionado ao meio de cultura e em pré-tratamento com solução 25% (v/v), é eficiente na desinfestação de anteras de cafeeiro.

Fungicidas – Efetivamente, todos os fungicidas sistêmicos inibem, seletivamente, processos metabólicos específicos, com­partilhados apenas por grupos restritos de fungos, atuando tão somente contra os patógenos visados. A alta especificidade de ação leva à alta fungitoxicidade inerente aos fungos sensíveis e à baixa fitotoxicidade. A baixa fitotoxidade, aliada à absorção e à capacidade de translocação, leva ao efeito sistêmico.

Dentre os fungicidas sistêmicos, o mais importante grupo utilizado comercialmente são os benzimidazóis, incluindo os fungi­cidas benomil, carbendazim, tiofanato metílico e thiabendazole. Segundo Coutinho et al. (2006), a introdução dos fungicidas sistêmi­cos do grupo dos benzimidazóis, na década de 1960, tornou-se um marco na história do desenvolvimento dos fungicidas. Dentre os fungicidas desse grupo, os mais utilizados são benomil, tiofanato-metílico e carbendazim (MAZELLIER et al., 2002).

O sítio primário de ação dos benzimidazóis é a Tubulina, e o processo afetado é a mitose. Segundo Davidse (1988 citado por COUTINHO et al., 2006), os benzimidazóis atuam nos fungos pela inibição de proteínas específicas, chamadas de a e b tubulinas, que mediante polimerização constituem os microtúbulos (LEROUX, 2003). Quando essas proteínas entram em contato com tais fungicidas, a formação dos microtúbulos é inibida. Como resultado as células não se dividem e passam a ser multinucleadas, levando o fungo à morte.

O ingrediente ativo benomil pertence ao grupo químico dos benzimidazóis; entretanto, foi proibido no Brasil. Os ingredientes ativos desse grupo, carbendazim, tiaben­dazol e tiofanato metílico, podem ser utilizados como substitutos.

Outro grupo de fungicidas são os inibidores da biossíntese de ergosterol, uma rota importante para o ótimo crescimento e metabolismo dos fungos. Muitos fungicidas deste grupo têm sido sintetizados e desenvolvidos, e, dentre estes, o miconazole tem demonstrado forte micotoxicidade e ausência de fitotoxidade (TYNAN et al., 1993).

Fungicidas como reguladores de crescimento – A incor­po­ração de fungicidas nos meios de cultura vem sendo utilizada, apresentando efeitos positivos na multiplicação de plantas cultivadas tanto in vitro com in vivo (COLOMBO et al., 2004). O benomil é muito utilizado no controle de contaminações fúngicas do meio de cultura e do material vegetal (HAUPTMANN et al., 1985).

Apesar de proibido no Brasil, o benomil não só previne contaminações fúngicas (BECKER, 1971; ERWIN, 1973; SAENGER, 1970) como também possui algumas propriedades reguladoras de crescimento de plantas (BECKER, 1971; SAENGER, 1970; SCHREIBER; HOCK, 1975; SCHRUFT, 1970). Ele depreciou o crescimento de seedlings de Ulmus americana L., Tagets sp., Rhamnus frangula L., Platanus occidentialis L., Acer saccharinum L. (SCHREIBER; HOCK, 1975); entretanto, promoveu vigorosas brotações em videira (Vitis vinifera L.) (BECKER, 1971), tabaco (Nicotiana tabacum e N. clevelandii) (SAENGER, 1970) e certas espécies de turfa (SCHREIBER; HOCK, 1975) e aumentou o enraizamento de estacas de Pinus (Pinus strobus L. e Pinus mugo var. mughs Zeneri.) (KIANG et al., 1974; THIELGES; HOITINK, 1972).

Atividade citocinínica do benomil foi observada em calos de soja (Glycine max L.) e em cotilédones de Raphanus sativus L. (SKENER, 1972). Yang (1976), testando o efeito do benomil na multiplicação e enraizamento de aspargo (Asparagus officinalis L.) em meio MS, verificou que concentrações entre 50 ppm e 250 ppm proporcionaram maior número de novas brotações; entretanto, menores porcentagens de enraizamento. Já concentrações entre 25 ppm e 100 ppm estimularam novas brotações com maior comprimento. De acordo com Thomas (1973), esse efeito do benomil deve-se, possivelmente, à sua semelhança estrutural com as citocininas.

Haldeman et al. (1987), utilizando benomil em associação com rifampicina no cultivo in vitro de ápices caulinares de Camellia sinensis e Camellia japonica, obtiveram efetivo controle de conta­minação fúngica e bacteriana. Na desinfestação de explantes le­nhosos de jabuticabeira e goiabeira, Caldas e Taketomi (1993) cons­tataram que o tratamento mais eficaz para reduzir a contaminação foi com a adição de benomil em concentrações de 10 mg L-1 a 100 mg L-1 no meio de cultura.

Brown et al. (1981) testaram fungicidas e bactericidas no cultivo in vitro de orquídeas e constataram que amphotericina B, benomil, gentamicina, nistatina, penicilina G, omadine sódico e vancomicina isolados ou em diversas combinações não tiveram efeito deletério na germinação de sementes, mas inibiram o crescimento de ápices caulinares.

Também foi constatada a influência como fitorregulador do fungicida clorotalonil. Colombo et al. (2004) constataram que concentrações entre 0,1 g L-1 e 0,2 g L-1 desse fungicida influenciaram tanto a propagação in vitro quanto a percentagem de sobrevivência durante a aclimatização das orquídeas Cattleya loddigesii e Laelia lundii.

Antibióticos – São compostos produzidos por microrganis­mos, que inibem outros microrganismos, em baixas concentrações, exibindo alto grau de especificidade. Os antibióticos atuam sobre os microrganismos de diversas maneiras. Os principais pontos de ação incluem: 1) inibição da síntese do peptideoglucano da parede celular bacteriana; 2) lesão da membrana citoplasmática, e 3) interferência na síntese de ácido nucleico e proteínas.

Pelczar et al. (1996) relataram a eficiência comprovada da combinação de antibióticos, visto que é muito mais difícil um microrganismo tornar-se resistente contra dois antibióticos simulta­neamente. Inúmeros trabalhos têm sido conduzidos para estudar contaminações bacterianas in vitro (BUCKLEY et al., 1995; HOUWE; SWENNEN, 2000; HUMARA; ORDÁS, 1999; KESKITALO et al., 1998; KNEIFEL; LEONHARDT, 1992; ODUTAYO et al., 2004; PEREIRA et al., 2003; REED et al., 1995; TENG; NICHOLSON, 1997). Neste sentido, vários antibióticos têm sido utilizados em cultura de tecidos, a exemplo de cefatoxima (TOLEDO; ROCA, 2001), ampicilina (ANDRADE et al., 2003), estreptomicina (ANDRADE et al., 2003), rifampicina (ANDRADE et al., 2003; HALDEMAN et al., 1987; HÖRNER et al., 2000b; LEGGATT et al., 1988; PHILLIPS et al., 1981; POLLOCK et al., 1983; VIANNA et al., 1997; YOUNG et al., 1984), kasugamicina (ARRUDA; DAMIÃO FILHO, 2001), tetraciclina e gentamicina (VIANNA et al., 1997), neomicina e cloranfenicol (LEGGATT et al., 1988), sulfametaxazol e trimetroprima (ANDRADE et al., 2005).

Na Tabela 7 estão relacionados alguns antibióticos utilizados na quimioterapia de infecções bacterianas e fúngicas.

Tabela 7. Alguns antibióticos utilizados na quimioterapia de infecções bacterianas e fúngicas.

Antibiótico

Ativo contra

Mecanismo de ação

Efeito

Bactericida

Bacte­riostático

Canamicina

Maioria das bactérias gram-negativas, exceto Pseudomonas

Induz a síntese anormal de proteínas

+

Tetraciclinas

Largo espectro; muitas bactérias gram-positivas e gram-negativas

Interfere com a síntese de proteínas

+

Cloranfenicol

Largo espectro; infecções graves por gram-negativas

Interfere com a síntese de proteínas

+

Vancomicina

Bactérias gram-positivas, incluindo estafilococos produtores de penicilinase e enterococos

Interfere com a síntese de proteínas

+

Rifampicina

Tuberculose

Bloqueia a síntese proteica bacteriana pela inibição da RNA polimerase DNA dependente, que transcreve o DNA em mRNA

+

Antifúngicos (Nistatina e Polienos)

Infecções fúngicas

Lesão da membrana celular

+

Fonte: adaptado de Pelczar et al. (1996).

Medidas de controle de microrganismos

A determinação exata da fonte de contaminação muitas vezes é dificultada, já que, como mencionado anteriormente, os microrganismos podem ser introduzidos em vários pontos do processo de micropropagação. Contudo existem formas de prevenir o aparecimento de contaminações, para tanto é necessário que se verifique e controle sistematicamente todas as operações e áreas onde possam ser introduzidos os microrganismos contaminantes.

Como regra geral, as plântulas contaminadas devem ser eliminadas do processo de micropropagação. No entanto, essa regra pode ser desconsiderada nos casos em que o material vegetal em questão for de grande valor ou de difícil controle e encontrar-se contaminado por microrganismos. Como exemplos, citam-se materiais raros do banco de germoplasma, orquídeas raras e caras, ipeca (planta medicinal, cujo preço das raízes é altíssimo), dentre outras.

Segundo Leifert et al. (1994a), os sistemas de Análise dos Postos de Controle Crítico de Risco (APCCR) são as mais eficientes técnicas de manejo de contaminações do que o tratamento com antibióticos e outros antimicrobianos. Comentam também que compostos antibacterianos e antifúngicos de amplo espectro nem sempre conseguem eliminar todos os organismos-alvo, além de terem efeitos negativos no crescimento e/ou enraizamento de culturas de tecidos de plantas. Frequentemente o crescimento bacteriano é somente suprimido (efeito bacteriostático) pelos tratamentos antimicrobianos e, quando estes são removidos, o crescimento bacteriano recomeça (BARRETT; CASSELLS, 1994; FALKINER, 1990).

Uma alternativa barata ao uso profilático de antibióticos em determi­nados sistemas in vitro é a acidificação do meio de cultura, prevenindo o estabelecimento e/ou a proliferação dos contaminantes bacterianos (LEIFERT et al., 1994b). A utilização de um sistema fotoautotrófico também possibilita o cultivo de tecidos sem a proliferação de contaminantes, pois nesses sistemas há a remoção dos carboidratos, essenciais para o rápido crescimento de muitos contaminantes. De acordo com Kubota e Tadokoro (1999), uma das vantagens da micropropagação fotoautotrófica é o baixo risco de contaminação, o que facilita o uso de grandes recipientes de cultura, contribuindo para a redução do custo de produção. Sayegh e Long (1997 citados por LEIFERT; CASSELLS, 2001), resgataram culturas de Calathea, Alpinia, Primula, Omphalodes, Begonia, Hosta, Streptocarpus, Penstemon, Yucca, Rhododendron, Maranta e Cordyline, contaminadas com fungos e bactérias, transferindo-as para cultura autotrófica usando espuma de poliuretano como suporte.

Um outro conceito, a biotização, em que as microplantas são inoculadas in vitro ou in vivo com inoculantes bacterianos e fungos micorrízicos arbusculares, representa uma oportunidade (CASSELLS, 2000), e seus benefícios foram reportados por Cordier et al. (2000).

Diversos compostos químicos, como hipoclorito de sódio ou cálcio (já descritos), antibióticos, cloreto de mercúrio, álcoois e fungicidas, também têm sido usados para tratamentos superficiais dos explantes. Concentrações e tempo de exposição dos diferentes compostos químicos dependem grandemente do tipo e tamanho do explante (LEIFERT et al., 1991a).

Bactericidas

Se as culturas não são descartadas; por exemplo, se a limpeza do material propagativo não é possível ou se a contaminação é apenas detectada após grandes quantidades de plântulas terem sido produzidas; as mesmas podem ser descontaminadas pela incorporação de antibióticos no meio de cultura. Vários autores têm descrito a sensibilidade dos antibióticos às bactérias isoladas em cultura de tecidos vegetais (POUSEN, 1988) ou têm incluído antibióticos no meio de crescimento de plântulas para suprimir ou eliminar contaminações bacterianas.

Alguns autores constataram que certos tratamentos com antibióticos não têm efeito na contaminação, e outros ainda afirmam que muitos dos antibióticos têm sido tóxicos para as plantas in vivo e in vitro, podendo apenas ser incorporados no meio de cultivo com as plântulas por determinados períodos de tempo.

Entretanto, Pereira et al. (2003), conduzindo trabalho com o objetivo de isolar, caracterizar e identificar bactérias endofíticas contaminantes encontradas em tecidos de batata durante a micro­propagação e selecionar antibióticos para o controle in vitro desses microrganismos, constataram que brotações apresentando conta­minação bacteriana durante a etapa de multiplicação in vitro foram superficialmente desinfestadas. Os internódios foram transferidos para placas de Petri com ágar nutriente, onde permaneceram incubados a 28 oC por até cinco dias. Após purificação, as bactérias foram caracterizadas e identificadas por testes taxonômicos. Um total de oito estirpes bacterianas foram isoladas e identificadas como pertencentes às famílias Acetobacteriaceae e Enterobacteriaceae e aos gêneros Corynebacterium, Pseudomonas e Xanthomonas. Os melhores resultados para a inibição do crescimento bacteriano foram obtidos com os antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estrepto­micina e tetraciclina em concentrações que variaram de 32 mg L-1 a 256 mg L-1.

Liu et al. (2005), visando detectar bactérias endofíticas asso­ciadas à necrose do ápice foliar em plantas micropropagadas de Limonium sinuatum, identificaram a ocorrência de Pasteurella mul­tocida, Stenotrophomonas maltophilia e Alcaligenes sp. Observa­ram que a adição de augmentina e cofotaxima foi eficiente na eliminação das bactérias endofíticas das culturas. Em contrapartida, a acidifi­cação do meio de cultura não foi efetivo.

Andrade et al. (2003) obtiveram sucesso no controle do desenvolvimento de bactérias em explantes de mangueira (Mangifera indica L.) com a utilização do antibiótico Trim (sulfametaxazol + trimetoprima). A incorporação de sulfato de cobre e própolis ao meio de cultura não evitou o crescimento da bactéria.

De acordo com Phillips et al. (1981), apenas a rifampicina, entre seis antibióticos testados, controlou a contaminação bacteriana sem afetar o desenvolvimento dos explantes, em Helianthus tuberosus. Posteriormente, Vianna et al. (1997) confirmaram esse resultado, concluindo que nos tratamentos contendo rifampicina houve de 70% a 75% de explantes sadios de mamoeiro. Reuveni et al. (1990) afirmam que a rifampicina, além de reduzir o nível de contaminação, não prejudica o desenvolvimento dos explantes.

Em trabalho com 10 diferentes cultivares de plantas, Leggatt et al. (1988) isolaram e caracterizaram 31 microrganismos, dentre os quais muitos isolados foram resistentes a antibióticos. Rifampicina, cloranfenicol e neomicina foram os mais eficientes na inibição de bactérias.

Habiba et al. (2002) isolaram e caracterizaram bactérias endógenas associadas ao rizoma de bananeira, bem como medidas de controle. Os explantes foram coletados de matrizes mantidas no campo e, após remoção das camadas superficiais de tecidos, foram tratados com HgCl2 a 0,1% por 15 minutos e posteriormente imersos em soluções dos antibióticos ampicilina, gentamicina e tetraciclina. Uma taxa de 100% de culturas livre de contaminação foi obtida pela imersão dos explantes em 160 mg L-1 de gentamicina por 100 minutos.

Testando a eficiência dos antibióticos rifampicina, tetraciclina, penicilina, ampicilina, agrimicina e norfloxacino e os fungicidas Benlate® e Anfotericina® na assepsia para estabelecimento in vitro de porta-enxertos de macieira, Souza et al. (2003b) constataram que nenhum dos antibióticos foi eficiente. A anfotericina apresentou resultados positivos na eliminação de contaminantes fúngicos.

Pereira e Fortes (2003), com o objetivo de avaliar a toxicidade de antibióticos no cultivo in vitro da batata, verificaram que a ampicilina foi o único antibiótico que não afetou a sobrevivência e o desenvolvimento dos explantes de batata em meio de multiplicação, podendo ser indicada para trabalhos de descontaminação in vitro dessa espécie. A estreptomicina apresentou efeito fitotóxico mais pronunciado sobre a cultura da batata quando presente em meio de cultura de consistência líquida. Os antibióticos tetraciclina e cloranfenicol, independente da consistência, não devem ser adicionados ao meio de cultura, pois afetam severamente o desenvolvimento in vitro da batata.

Mistura de antibióticos

A cultura de plantas pode conter mais que um contaminante, sendo a mistura de agentes antimicrobianos a melhor medida profilática.

Stimart (1986) constatou que, utilizando 500 µg L-1 de estrepto­micina e 500 µg L-1 de carbenicilina separadamente, não poderia eliminar o contaminante Hyphomicrobium da suspensão de células de Datura, mas o controle foi obtido quando 100 µg L-1 de ambos componentes foi usado em combinação. A mistura de antibióticos frequentemente mostra efeitos sinergísticos, não apenas no controle de microrganismos, mas também na indução de plantas mais bem formadas. A mistura de 10 µg L-1 de rifampicina e 1 g L-1 de benomil foi uma combinação efetiva para o controle de fungos e bactérias de Camellia, mas a mistura de rifampicina e trimetoprima recomendada aumentou a oxidação fenólica de explantes de café (HANUS; ROHR, 1987).

Leggatt et al. (1988) constataram, em trabalho com dez diferentes cultivares de plantas, que rifampicina, cloranfenicol e neomicina foram os antibióticos mais eficientes na inibição de bactérias. Complementaram recomendando que a combinação de dois destes pode produzir maior sucesso do que seu uso isolado.

Seguem alguns exemplos adicionais do uso da mistura de antibióticos para a remoção de contaminantes (GEORGE, 1993):

1. 250 µg mL-1 carbenicilina + 2,5 µg L-1 de anfotericina B por uma semana.

2. 15 µg mL-1 de rifamicina + 15 µg mL-1 de trimetoprima + 0,1% de fungicida Tilt MBC.

3. 25 µg mL-1 de cefolotoxina + 25 µg mL-1 de tetraciclina + 6 µg mL-1 de rifampicina e 6 µg mL-1 de polimixina B.

4. 10 µg mL-1 de rifampicina + 1 g L-1 de benomil.

5. De 50 µg mL-1 a 100 µg mL-1 (dependendo da cultivar) de canamicina + 200 µg mL-1 de cefalotoxina.

6. Mistura complexa de 20 µg mL-1 de gentamicina + 20 µg mL-1 de canamicina + 30 µg mL-1 de clortetraciclina + 60 µg mL-1 cloranfenicol + 75 µg mL-1 de rifampicina + 750 µg mL-1 de benomil.

7. Vancomicina-HCl + micostatina.

8. 20 µg mL-1 de rinfampicina + 20 µg mL-1 trimetoprima.

9. 250 µg mL-1 de carbenicilina + 25 mL-1 de nistatina por uma semana.

Outros métodos utilizando antibióticos

Tratamento dos explantes

Os antibióticos não necessitam de ser adicionados ao meio de cultura. Os explantes podem ser embebidos ou colocados em solução com o antibiótico antes de inoculados, ou as plantas-mãe podem ser borrifadas com antibióticos antes dos explantes serem removidos.

Tratamento da planta-mãe com compostos antimicrobianos

O efeito bacteriostático da mistura complexa de compostos antimicrobianos em brotos apicais e axiais de Hevea foi maior quando ele foi adicionado ao meio de cultivo. A embebição dos explantes não foi efetiva (ENJALRIC et al., 1988).

A utilização de antibiótico em cultura de tecidos é uma questão delicada, uma vez que ele deve manter sua capacidade bactericida ou bacteriostática, ser solúvel, apresentar-se estável durante o crescimento das culturas, não ser tóxico às células vegetais, ter amplo espectro de ação e ter baixo custo. Trabalhos nos quais foi avaliado o nível de toxidez de vários antibióticos demonstraram que os do grupo dos betalactamos, tais como ampicilina, carbecilina e, particularmente, as cefalosporinas, possuem amplo espectro de ação, e sua toxidez é mínima nas concentrações que controlam bactérias. A rifampicina sozinha ou em combinação com trimeto­prima também forneceu amplo espectro de ação. Os antibióticos do grupo dos aminoglicosídeos, como a estreptomicina, neomicina, canamicina e gentamicina, são os menos recomendados por causa de sua toxidez aos tecidos vegetais (MONTARROYOS, 2000).

A Tabela 8 apresenta alguns exemplos de antibióticos comumente utilizados em cultura de tecidos com suas respectivas toxicidades e/ou segurança.

Tabela 8. Exemplos de fitotoxidade de antibióticos e seus usos contra contaminantes de cultura de tecidos vegetais.

Composto

Segurança ou fitotoxicidade relatada

Concentração
(µg mL-1)

Sucesso na remoção do contaminante

Efeito

Dose
(µg mL-1)

Planta/resultado

Planta

Organismo

Resultado

Amphotericina

S

I G

C R

1

10

Cultura de células

Vanda

Brotos apicais de Cymbidium

Ampicilina (sódio)

S

Cultura de células

400

Protoplasto de Petúnia

Contaminantes

Bactericida (com outros compostos)

Augmentina

S

S

N. plumbaginifolia

Cultura de células

Bracitracina

I C

E C

100

5

Flores de verão

Calos de Rumex acetosa

100

Helianthus annus

Contaminantes

Bactericida

Carbenicilina (sódio)

Cefaloridine

S

500–1.000

Protoplasto de Nicotiana

Sungonium, Ficus

Agrobacterium

Vários

Bactericida

Bacteriostático

S - seguro; I G - inibição da germinação; E C - estímulo do crescimento; C R - crescimento reduzido; I C - inibição do crescimento.

Fonte: adaptado de George (1993).

Pulverizando plantas de Geranium com 200 µg mL-1 de oxitetraciclina em intervalos semanais de março até agosto, Falkiner (1990) reduziu a incidência de escoriações causadas pela bactéria sistêmica Corynebacterium fascians.

Fungicidas

Alguns fungicidas podem ser incorporados ao meio para suprimir a introdução de fungos por ácaros, mas observou-se que eles reduzem a razão de crescimento e/ou enraizamento de plântulas.

Diversos trabalhos são conhecidos por usarem fungicidas sintéticos para o controle de fungos em material excisado e em culturas estabelecidas, mas a fitotoxidade é potencialmente depen­dente do genótipo (GEORGE, 1993).

Quando quantidade de 5 µg mL-1 a 50 µg mL-1 de benomil foi dissolvida em dimetilsulfóxido e adicionada ao meio contendo calos de Cymbidium, houve inibição da formação de plantas. Similarmente 50 µg mL-1 inibiu in vitro a germinação de sementes de três gêneros de orquídeas. Portanto, benomil dissolvido em dimetilsulfóxido é tóxico para a suspensão de culturas (GEORGE, 1993).

Existem alguns fungicidas alternativos como imazalil (20 µg mL-1) e captafol (100 µg mL-1), que contiveram contaminações fúngicas e o crescimento de fungos saprófitas como Alternaria brassicae em cultura de calos de Brassica junceae sem ocorrer toxicidade (POUSEN, 1988).

Três fungicidas naturais (Mycosin, Mycosan e Chitosan) foram comparados com fungicidas-padrão (carbendazim e enxofre) e avaliados com relação ao controle de Botrytis cinerea em kiwizeiro in vitro e em condições de campo (PAK et al., 1998). Os fungicidas Mycosin e Mycosan tiveram boa eficácia contra o fungo e foram os únicos produtos que inibiram a germinação dos conídios. Em con­trapartida, Chitosan teve atividade fungicida muito baixa. O fungicida Carbendazim foi eficaz no comprimento do tubo germinativo e crescimento micelial em baixas concentrações, embora não tenha inibido a germinação dos conídios. Os fungicidas naturais proporcionaram a vantagem de serem efetivos tanto contra cepas sensitivas quanto resistentes.

Trabalho para avaliar a efetividade de fungicidas do grupo das anilinopyrimidinas, cyprodinil e pyrimethanil contra cepas de Botrytis cinerea resistentes a benzimidazóis, dicarboximidas e a uma mistura de benzimidazol-diethofencarb foi conduzido por Petsikos-Panayotarou et al. (2003). Os autores constataram que ambos os fungicidas foram efetivos contra as cepas de Botrytis cinerea.

Clotrinazole foi recomendado para eliminar as leveduras de cultura de tecidos, sendo apenas efetivo sobre uma das duas leveduras identificadas como contaminantes de cultura de meristema de macieira. A concentração 10 µg mL-1 de iminooctodine controlou ambos os organismos, mas, no entanto, 0,1 µg mL-1 foi tóxico. A anfotericina B e nistatina que foram usadas para eliminar leveduras de cultura de tecidos de macieira foram inofensivas (GEORGE, 1993).

Tynan et al. (1993) avaliaram a efetividade do miconazole como agente antifúngico para cultura de tecidos de várias espécies vegetais, testando-o contra 23 fungos comumente associados com plantas ou cultura de tecidos destas. O crescimento de todas as culturas de fungos testados foi inibido na presença do fungicida. Além da inibição do crescimento das hifas, a prevenção ou redução da esporulação foi efetiva. A adição de miconazole ao meio de cultura não causou nenhuma toxicidade na maioria das culturas testadas.

Em trabalho para controlar o desenvolvimento de Rhodotorula spp. em macieira cultivada in vitro, Nagy et al. (2005) utilizaram vários fungicidas. Dentre estes, ProClin® 300, mancozeb, triforine, myclobutanil, tiabendazole, mancozeb + zoxamid e nitrato de prata inibiram o crescimento das leveduras isoladas e não foram fitotóxicos. Já os fungicidas miconazole, PPMTM, sulfato de cobre, sorbato de potássio e cycloheximida inibiram o crescimento das leveduras, mas foram fitotóxicos. O benomil não demonstrou ser fitotóxico, mas somente foi efetivo contra os contaminantes em altas concentrações.

Visando à diminuição da contaminação in vitro por fungos e bactérias na micropropagação de pau d’alho (Gallesia gorazema), Sato et al. (2004) testaram concentrações de benomil adicionadas ao meio de cultura. Constataram que a contaminação fúngica diminuiu com o aumento das concentrações de benomil e que a contaminação bacterina foi menor nas concentrações de 200 mg L-1 a 500 mg L-1. Em contrapartida, com o aumento de sua concentração, o benomil induziu a oxidação, provavelmente por fitotoxidez causada aos explantes.

Shields et al. (1984) testaram inúmeros agentes antifúngicos em N. plumbaginifolia e N. Tabacum. Segundo os autores, dos que foram utilizados [benomil, carbendazim, tiabendazole, fenbendazole, nistatin, fungizone (amfotericina B), clotrimazole, griseofulvin, imazalil e miconazole], carbendazim, fenbendazole e imazalil podem ser empregados com relativa segurança e possuem atividade antifúngica de largo espectro. Os fungicidas de uso clínico, clotrimazole e miconazole, afetaram negativamente os explantes.

Em trabalho para avaliar a fitotoxicidade de fungicidas e germicida na micropropagação de Oncidium varicosum, Oda et al. (2003) verificaram que o fungicida chlorotalonil e o hipoclorito de sódio não tiveram nenhum efeito fitotóxico sobre as plântulas. Em contrapartida, os fungicidas azoxystrobin, em todas as con­centrações testadas, e o benomil, a 0,8 g L-1, foram letais. Resultado seme­lhante foi obtido por Watt et al. (1996), que observaram que o benomil (de 0,5 g L-1 a 1 g L-1) e chlorotalonil (de 0,25 g L-1 a 0,5 g L-1) foram prejudiciais ao cultivo in vitro de Eucalyptus grandis. Em contrapartida, constataram que o fungicida sistêmico cloridrato de propamocarbe , a 0,36 g L-1, não afetou significativamente o desenvolvimento das plantas e é um potencial fungicida para uso na erradicação de infecções fúngicas em culturas de Eucalyptus.

Santana et al. (2003), avaliando a eficácia de substâncias antimicrobianas (benomil e ampicilina) sobre microrganismos superficiais e endofíticos em três espécies de Annonacenae in vitro, constataram que existe considerável diferença nas taxas de conta­minação entre as espécies estudadas. O benomil foi efetivo na desinfestação dos segmentos foliares e, na concentração de 1,0 g L-1, eliminou todos os fungos, enquanto a ampicilina foi ineficaz contra a contaminação bacteriana.

Hipoclorito e outros produtos

Em trabalho visando ao controle da contaminação no estabe­lecimento in vitro de macieira (Malus domestica Borkh.), Erig e Schuch (2003) observaram que a desinfestação dos explantes com NaOCl, de modo geral, foi mais eficiente. A lavagem das brotações em água corrente, antes da desinfestação, diminuiu a oxidação, porém aumentou a contaminação bacteriana.

Na assepsia de sementes de bromélia imperial (Alcantarea imperialis), Rodrigues et al. (2003) testaram concentrações de NaOCl (100%, 70% e 40%) e tempos de imersão (5, 15 e 25 minutos). Os autores concluíram que a imersão das sementes por 25 minutos em hipoclorito de sódio a 70% proporcionou o melhor resultado.

Silva et al. (2003), testando o efeito de concentrações de NaOCl (20%, 30% e 40% da concentração comercial) e tempo de imersão (8 e 12 minutos) na desinfestação de explantes de inhame roxo (Dioscorea rotundata Poir) coletados no campo, não verificaram eficiência dos tratamentos, constatando contaminação por fungos e bactérias de 66,7% a 100%.

Visando ao estabelecimento de protocolos de assepsia de ápices caulinares de bacurizeiro (Platonia insignis Mart.), cajazeira (Spondias mombin L.) e umbu-cajazeira (S. mombim x S. tuberosa), Souza et al. (2003a) testaram tempos de imersão (0, 5, 10, 15 e 20 minutos) em solução de NaOCl a 1% e de bicloreto de mercúrio a 0,02%. O uso do HgCl2 resultou em menores índices de contaminação quando comparado ao tratamento controle e ao NaOCl, porém sem diferir significativamente deste último. O NaOCl apresentou maior eficiência (45,21% de contaminação aos 30 dias de incubação) no tempo de imersão de 15 minutos e menor (66,8%) quando o tempo de imersão foi de 5 minutos. Para o HgCl2, a maior eficiência (35,10% de contaminação após 30 dias de incubação) ocorreu para o tempo de imersão de 10 minutos, com a menor eficiência (59%) sendo observada para o tempo de imersão de 5 minutos.

Cox et al. (2003), visando à otimização dos procedimentos de desinfestação para posterior germinação e crescimento in vitro de samambaia (Schizaea dichotoma), realizaram a desinfestação de esporos utilizando NaOCl, estreptomicina e a combinação destes. Foi constatado que somente os esporos desinfestados com estreptomicina germinaram.

O HgCl2 tem sido relativamente usado para a desinfestação. Entretanto, de acordo com George (1993), o produto é tóxico e deve ser manipulado com cuidado. Segundo Teixeira (2001), pode ser usado em concentrações de 0,05% a 0,2%. Em trabalho com Pfaffia tuberosa, Flores et al. (2006) constataram que danos causados em explantes foram devidos ao uso do HgCl2. No entanto, Martins e Nicoloso (2004) verificaram que apenas o uso de HgCl2 durante 5 minutos não foi eficiente para a desinfestação dos explantes, sendo necessárias várias limpezas sucessivas para obter 40% de explantes desinfestados.

No estabelecimento de culturas assépticas de peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron), Ribas et al. (2005) utilizaram, com matrizes, mudas com dois anos e mantidas em casa de vegetação climatizada sob pulverizações quinzenais com benomil a 0,5 g L-1. Os explantes retirados de brotações apicais foram submetidos a tratamentos com NaOCl (0,125% e 0,25%) ou HgCl2 (0,025%; 0,05% e 0,1%). Os tratamentos com 0,25% de NaOCl e 0,05% de HgCl2 proporcionaram os melhores resultados de controle de contaminação. Para os autores, HgCl2 foi mais eficiente do que o NaOCl.

Outra forma na tentativa de eliminar ou minimizar contami­nações in vitro é a adição de compostos ao meio de cultura. Nesse sentido, trabalhos têm sido conduzidos utilizando diferentes substâncias, como NaOCl (TEIXEIRA et al., 2005a, 2005b, 2006), H2O2 (YANAGAWA et al., 1995). Albuquerque et al. (2006) verificaram a eficiência do óleo essencial de Lippia gracillis adicionado ao meio de cultura, constatando inibição de 95%, 58% e 89,4% para Curvularia lunata e uma das espécies do gênero Aspergillus, respectivamente. Os fungos Trichoderma sp., Cladosporium sp., Penicillium sp., Sporotrichum sp., Chrysosporium sp. e duas espécies de Aspergillus foram inibidos completamente. Outras espécies e gêneros também têm sido estudados e suas propriedades antimicrobianas avaliadas, como Achillea (BAREL et al., 1991; ÜNLÜ et al., 2002); Artemisia caerulescens subsp. Gallica (MORÁN et al., 1989); Actinidia chinensis, Feijoa sellowiana e Aberia caffra (BASILE et al., 1997); Azadirachta indica (GOVINDACHARI et al., 1999, 2000); Toona ciliata e Amoora rohituka (CHOWDHURY et al., 2003); Mentha spicata, Lavanula angustifolia e Salvia fruticosa (ADAM et al., 1998); Salvia officinalis e Salvia triloba (DELAMARE et al., 2007); Cinnamomum zeylanicum, Mentha piperita, Ocimum basilicum, Origanum vulgare, Teloxys ambrosioides, Syzygium aromaticum, Thymus vulgaris e C. zeylanicum (MONTES-BELMONT; CARVAJAL, 1998); Salvia santolinifolia (AHMED et al., 1994); Inula helenium e Rosmarinus officinalis (BOATTO et al., 1994; CELIKTAS et al., 2007); Carissa lanceolata (LINDASAY et al., 2000); Yersinia pseudotuberculosis (BAKHOLDINA et al., 2001); Origanum (ADAM et al., 1998; BENDAHOU et al., 2008; DEMETZOS et al., 2001; MANOHAR et al., 2001); Lippia (PASCUAL et al., 2001, PESSOA et al., 2005); Adiantum lunulatum (REDDY et al., 2001); Thymus (ARRAS; USAI, 2001; BOUNATIROU et al., 2007; DOB et al., 2006; EBRAHIMI et al., 2008; PINA-VAZ et al., 2004; RASSOLI; MIRMOSTAFA, 2003; REDDY et al., 1998; ROTA et al., 2008; SOKMEN et al., 2004); Heteropyxis natalensis (VUUREN et al., 2007); Garcinia smeathmannii (KUETE et al., 2007); Guatteriopsis (COSTA et al., 2008); Pelargonium (LALLI et al., 2008); Treculia (KUETE et al., 2008); e Citrus (SHARMA; TRIPATHI, 2008; VIUDA-MARTOS et al., 2008).

Além destes, outros trabalhos com inúmeras espécies foram desenvolvidos: Amin et al. (2005); Bankova et al. (1999); Braca et al. (2008); Chang et al. (2001); Cos et al. (2006); Datefera et al. (2003); Dorman e Deans (2000); Dwivedi e Singh (1998); Franzblau e Cross (1986); George et al. (2006); Gundidza e Gaza (1993); Isman (2000); Lambert et al. (2001); Machado et al. (2003); Maksimović et al. (2005); Matasyoh et al. (2007); Najjaa et al. (2007); Ojala et al. (2000); Oyedeji et al. (1999); Pérez et al. (1999); Periago et al. (2002); Rios et al. (1987, 1988); Rios e Recio (2005); Skočibušić et al. (2006); Wannissorn et al. (2005); Yang et al. (2007).

Vírus

A seguir serão descritas as principais medidas de controle para as viroses em cultura de tecidos vegetais.

Cultura de ápices caulinares

Considera-se meristema apical o tecido que se encontra distal ao mais novo primórdio foliar, tendo o aspecto de uma cúpula proeminente ou plataforma achatada, estando, algumas vezes, embutido numa depressão. Seu tamanho não deve exceder 0,1 mm. As células desse tecido têm a propriedade de permanecerem na condição embrionária e, por meio de atividades morfogenéticas complexas, darão origem ao eixo vascular, folhas, gemas, órgãos de reprodução e outras estruturas laterais (CLARK, 1997).

A cultura de ápices caulinares, erroneamente chamada de cultura de meristemas, é utilizada para propagação de plantas in vitro, recuperação de plantas livres de vírus, conservação e intercâmbio de germoplasma e transformação (TORRES et al., 1998).

Provavelmente, todas as espécies propagadas vegetativa­mente estão infectadas com um ou mais vírus, principalmente os latentes que são difíceis de serem detectados pela sintomatologia visual.

A cultura de ápices caulinares é uma estratégia para o estabe­lecimento de estoques de plantas matrizes livres de vírus. Esse método baseia-se na premissa de que a concentração desse pató­geno na planta infectada não é uniforme. A estratégia consiste em reproduzir, in vitro, plantas a partir de tecidos pressupostamente livres de vírus. Basicamente, a metodologia consiste na excisão da cúpula meristemática apical com um ou dois primórdios foliares, onde ainda não se observa conexão vascular com os tecidos da planta, podendo ser cultivada em meio nutritivo adequado para diferenciação e desenvolvimento dos sistemas caulinar e radicular. Existem hipóteses que relatam que os vasos condutores não conseguem atingir o meristema ainda indiferenciado e em constante multipli­cação e, portanto, onde as partículas virais não conseguem alcançar. No entanto essas hipóteses ainda não estão comprovadas.

Microenxertia

Esta técnica consiste em microenxertar, em condições assép­ticas, um ápice caulinar, contendo de dois a três primórdios foliares, excisado de uma planta matriz, sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro. A microenxertia é aplicável quando não é possível a obtenção de plantas livres de viroses por cultura de meristemas.

A obtenção do porta-enxerto é feita por meio da germinação de sementes in vitro, que, na sua formação embrionária, eliminam a maioria dos vírus. Em seguida, o ápice caulinar é microenxertado em uma excisão em forma de T invertido no porta-enxerto, obtendo-se assim uma planta possivelmente livre de vírus (PASQUAL et al., 2001). Para que a microenxertia possa ser usada em toda a sua potencialidade, é necessário que seja implementado um sistema de indexação que permita identificar os vírus presentes na planta escolhida para matriz. Para citros, a indexação é realizada mediante a utilização de plantas indicadoras; por exemplo, a identificação da sorose do citrus é feita pela plantas indicadoras Laranja Pineapple e tangor Dweet (TORRES et al., 1998).

Termoterapia

Elevadas temperaturas são efetivas para a inativação e elimi­nação eventual de muitas viroses e algumas doenças bacterianas sistêmicas. Para este propósito é necessário selecionar um regime de temperatura que seja efetivo no tratamento, mas não letal para a planta ou material propagativo (GEORGE, 1993).

Quimioterapia

A erradicação de vírus em cultura de tecidos e órgãos poderia obviamente ser simplificada se houvesse um composto químico que pudesse limitar a replicação ou se movimentar em um largo espectro de espécies.

A prevenção de infecções viróticas em algumas plantas se dá por 2-thiouracil. Ele pode inibir a síntese de RNA ou vir a ser incorporado no seu RNA, caso o vírus seja não infectante.

O composto químico 1-β-D-ribofuranos-y1-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ribavirin) é o agente antiviral mais usado com sucesso em cultura de tecidos, mas ele não é suficientemente efetivo para ser usado em locais que utilizam outras técnicas em conjunto para eliminação do vírus (GEORGE, 1993).

Na recuperação de plantas de Cymbidium livres do CyMV, adicionou-se ao meio de cultura, respectivamente, ditiouracil (0,1 mmol L–1) e ribavirin (0,2 mmol L-1). Esse tratamento foi bastante efetivo, e a maioria das plantas obtidas permaneceu livre de vírus 2,5 anos após a quimioterapia (PORTER; KUEHNLE, 1997).

Reguladores de crescimento

Alguns autores têm sugerido que citocininas podem ser responsáveis pela erradicação de vírus durante a cultura de meristemas, mas isso não é ainda uma ideia concreta. Há relatos de que elevadas concentrações de citocininas produziram estruturas temporárias nas folhas de algumas espécies ornamentais seme­lhantes às produzidas pelo ribavirin.

O ácido giberélico (GA3) também é usado para o controle de viroses, visto que esse regulador de crescimento induz o alongamento celular rapidamente, fazendo com que a replicação viral não acompanhe o crescimento do vegetal.

Eletroterapia

A eletroterapia refere-se à manutenção da planta ou parte desta em corrente elétrica contínua durante um determinado período de tempo. Em plantas de Solanum tuberosum infectadas com PVX, porções de caule de 4 cm a 5 cm de tamanho, submetidas a 15 mA durante 5 minutos, formaram brotações em até 80% dos explantes. Ao mesmo tempo não foi detectada a presença do vírus X entre 60% e 100% das plantas regeneradas (LOZOYA-SALDANÃ, 1996 citado por TORRES et al., 1998). Esses autores ainda ressaltaram que essa estratégia tem mais vantagem que a termoterapia, pois produz, com maior eficiência, plantas livres de vírus em um menor intervalo de tempo. Em adição, os pulsos elétricos têm mostrado efeito no crescimento e morfogênese in vitro.

Estiolamento

O desenvolvimento da planta no escuro faz com que não haja formação de clorofila; as folhas permanecem pequenas e rudimentares, e os entrenós alongam-se acentuadamente. A taxa de replicação e/ou movimentação viral não acompanha o alongamento do ápice, e, assim, esse explante tem maior possibilidade de estar livre de contaminantes. A combinação dessa técnica com a termoterapia é mais eficiente para recuperação de plantas livres de vírus (TORRES et al., 1998).

Insetos e ácaros

Muitos insetos e ácaros são resistentes a uma gama de inseticidas e acaricidas, e muitos destes, como o endossulfan, são ativos contra tripes e ácaros e altamente fitotóxicos quando presentes no meio de cultivo de plantas (GEORGE, 1993). Medidas preventivas como desinfestação dos explantes antes do estabelecimento in vitro, bem como limpezas dos compartimentos do laboratório, assepsia e detetização anual do mesmo, são eficazes na redução da entrada desses patógenos in vitro. Portanto, deve-se majoritariamente evitar a entrada destes no laboratório por meio do controle preventivo, visto que o tratamento com produtos químicos no meio de cultivo é problemático.

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