Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Cultivo in vitro de plantas

4ª edição

L. Pedro Barrueto Cid

Editor Técnico

Embrapa
Brasília, DF
2015

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

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Presidente: Maria Isabela Lourenço Barbirato

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Coordenação editorial: Selma Lúcia Lira Beltrão, Lucilene Maria de Andrade, Nilda Maria da Cunha Sette

Supervisão editorial: Wyviane Carlos Lima Vidal

Revisão de texto: Jane Baptistone de Araújo, Maria Cristina Ramos Jubé

Revisão do e-book: Francisca Elijani do Nascimento

Normalização bibliográfica: Celina Tomaz de Carvalho, Iara Del Fiaco Rocha

Projeto gráfico da obra impressa, editoração eletrônica e tratamento de imagens: Júlio César da Silva Delfino, Paula Cristina Rodrigues Franco

Projeto gráfico e editoração eletrônica do e-book: Francisco Regis Ferreira Lopes, Alexandre Abrantes Cotta de Mello, Leandro Sousa Fazio

Capa: Carlos Eduardo Felice Barbeiro

Ilustração da capa: zigóticos de café tratados com tetrazólio – L. Pedro Barrueto Cid

Tradução dos capítulos 3 e 5: L. Pedro Barrue to Cid

1ª edição

1ª impressão (2010): 1.000 exemplares

2ª edição

E-book (2012)

3ª edição

1ª impressão (2014): 1.000 exemplares

4ª edição

E-book (2015)

Todos os direitos reservados.
Para uso exclusivo de EMBRAPA RECURSOS GENETICOS E BIOTECNOLOGIA. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Informação Tecnológica

Cultivo in vitro de plantas / L. Pedro Barrueto Cid, editor técnico. – 4. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2015.

E-book. : il. color.

E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.

ISBN 978-85-7035-406-8

1. Cultura in vitro. 2. Cultura de tecido. 3. Micropropagação. I. Cid, L. Pedro Barrueto. II. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

CDD 581.0724

© Embrapa 2015

Autores

Ana Cristina Miranda Brasileiro

Engenheira-florestal, Ph.D. em Biologia Molecular e Celular Vegetal, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

Don J. Durzan

Fisiólogo de plantas, Ph.D. em Metabolismo do Nitrogênio, professor da University of California, Davis, Califórnia, EUA

Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biotecnologia, professor da Universidade Federal de Alagoas, Maceió, AL

Francisco J. L. Aragão

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biologia Molecular e Celular, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

Frederico Henrique da Silva Costa

Engenheiro-agrônomo, doutor em Agronomia, professor da Universidade Federal do Acre (Ufac), Rio Branco, AC

João Batista Teixeira

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biologia de Plantas, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

Jonny Everson Scherwinski-Pereira

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

L. Pedro Barrueto Cid

Biólogo, Ph.D. em Ciências, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

Leonardo Soriano

Engenheiro-florestal, mestre em Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Piracicaba, SP

Maria Cristina Rocha Cordeiro

Biomédica, Ph.D. em Ciências, pesquisadora da Embrapa Cerrados, Brasília, DF

Miguel Jordan Zimmermann

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, professor da Escola de Biotecnologia, Universidad Mayor, Santiago, Chile

Apresentação

A cultura de tecidos hoje no Brasil é uma realidade não apenas em muitos laboratórios acadêmicos, senão também em empresas privadas, bem articuladas comercialmente e relacionadas com culturas de importância econômica, tais como: cana-de-açúcar, flores, eucaliptos e pinheiros.

A literatura internacional sobre a matéria informa-nos de que a cultura de tecidos de planta, ou micropropagação, movimenta bilhões de dólares em todo o mundo, notadamente na Alemanha, na Holanda, na Inglaterra, na Índia, nos EUA, e em outros países. Assim, esse método tem aquecido os mercados e vem promovendo a criação de novos laboratórios, empregos, tecnologias e patentes. Além disso, a micropropagação tem fortalecido novos paradigmas por meio do uso da biologia molecular, com vistas na obtenção de plantas mais resistentes, produtivas, aromáticas ou coloridas, dentro de uma visão mais moderna e dinâmica do agronegócio internacional.

Ademais, no mundo acadêmico, a cultura de tecidos, desde muito tempo, tem dado suporte a muitas e diferentes linhas de pesquisa envolvendo inúmeras teses de pós-graduação nas áreas da genética, da fisiologia de plantas, da fitopatologia, da fitotecnia, etc. Mais tarde, esses conhecimentos constituíram o arcabouço de muitos avanços tecnológicos, como a descoberta das citocininas, dos protoplastos, dos haploides, a limpeza clonal, o aprimoramento de meios nutritivos, o uso de biorreatores, os protocolos de micropropagação, etc.

No Brasil, a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia apresenta-se não somente como um centro de referência nacional e internacional nessa área, mas também como um centro pioneiro com foco na biotecnologia agrária e florestal. Por isso, ela não poderia deixar de patrocinar um livro a respeito desse assunto, que envolve os aspectos mais importantes da cultura de tecidos. Para tanto, foram convidados especialistas destacados dessa área do conhecimento.

Todos os participantes desta obra esperam que este livro tenha boa acolhida entre os profissionais e os estudantes dessa disciplina, o que representará um grande estímulo para nós, bem como uma grande recompensa pelo esforço desenvolvido.

L. Pedro Barrueto Cid

Editor Técnico

Prefácio

Satisfaz-nos, profundamente, lançar a segunda edição do livro Cultivo in vitro de plantas, em função da boa acolhida que teve a primeira edição e seu rápido esgotamento de livraria, fato este que ultrapassou nossas expectativas de demanda.

Nossa obra foi um esforço didático e profissional em prol da informação simples e efetiva para estudantes e professores ligados à área de biotecnologia botânica e agronômica deste País-continente, que ainda tem fronteira agrícola por desbravar.

Já estamos iniciando o terceiro milênio, e, cada vez mais, a imprensa inunda nossos ouvidos com conceitos como economia verde, desenvolvimento sustentável, clonagem de plantas, resistência a pragas e enfermidades, a fim de cobrar inovação, produtividade e eficiência no âmbito do agronegócio nacional, para produzir e exportar alimentos com valor agregado, questão esta que a Embrapa não perde de vista.

Dessa forma, e sem pretender esgotar o tema, nosso livro apresenta uma variedade de tecnologias na área biotecnológica de plantas, inclusive com um capítulo novo sobre protoplastos, justamente para um melhor aporte a nossos leitores interessados.

Finalmente, esperamos que esta edição, que a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tão apropriadamente ajudou a germinar, seja tão bem-vinda como a anterior, para que possa fortalecer o espírito de todos os participantes desta obra, no sentido de que o esforço realizado não foi em vão.

L. Pedro Barrueto Cid
Editor Técnico

Capítulo 1

Explante, meio nutritivo, luz e temperatura

L. Pedro Barrueto Cid
João Batista Teixeira

Do ponto de vista biológico, os organismos vivos reproduzem-se sexual ou assexuadamente. No primeiro caso, a variabilidade genética e a evolução são favorecidas; no segundo, isso não acontece.

Nas plantas superiores, a reprodução assexuada pode ocorrer por meio de vários processos, tais como: o enraizamento de estacas, a enxertia, a apomixia e a micropropagação.

Do ponto de vista comercial, é interessante que cultivares de importância agronômica sejam propagadas assexuadamente, pois esse tipo de propagação resulta em plantas uniformes quanto ao seu fenótipo (crescimento, floração, frutificação, etc.). Isso decorre do fato de que essas plantas são altamente selecionadas para características desejadas (alta produção, resistência a doenças, etc).

Por via sexual, a conservação dessas características poderia ser obtida por endogamia, ou seja, pelo cruzamento entre indivíduos relacionados pela sua ascendência ou com eles mesmos. Porém, nem todas as plantas de importância agronômica podem cruzar-se por meio da autofecundação, e, mesmo que isso fosse possível, deve-se considerar o problema da depressão endogâmica, ou seja, a perda de vigor, que resulta em tamanho reduzido das plantas, albinismo, susceptibilidade a doenças, etc. Ademais, ainda que as plantas possam retrocruzar, muitas vezes carregam uma herança indesejável que deve ser posteriormente retirada (VALOIS et al., 1996). Por isso, a via clonal é uma alternativa para que se fixem características de importância agronômica e comercial, a partir do cruzamento entre híbridos interespecíficos por meio da genética clássica. Contudo, é sabido que o enraizamento de estacas via clonal, por exemplo, apesar de ser uma importante ferramenta de propagação assexuada, dificulta a produção em grandes quantidades. Além disso, a capacidade de indução de raízes adventícias, importante para o processo, diminui com a idade da planta doadora de estacas.

A enxertia, por sua vez, é uma prática comercial realizada em algumas culturas, tais como a seringueira, o limoeiro, entre outros. No entanto, em nível comercial, essa técnica é uma prática cara e laboriosa, além de oferecer risco de incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto. Além disso, existe a possibilidade de transmissão mecânica de vírus, fato que ocorre, por exemplo, com o vírus fanleaf, que, no caso da videira, é passado à planta pelo nematoide Xiphinema index (BAVARESCO; WALKER, 1994). Por essas razões, o uso da enxertia é desencorajado em muitos casos. Já a apomixia não deixa de ser um modelo interessante do ponto de vista clonal; no entanto, na prática, não há exemplos concretos a propagar.

Assim, a micropropagação, ou propagação in vitro, mesmo sendo uma prática dispendiosa em termos de mão de obra, de laboratório e de equipamentos, oferece uma melhor relação custo-benefício, pois permite produzir, em escala comercial, material uniforme e selecionado, bem como realizar pesquisas de apoio às diferentes áreas da biologia, como a genética, a fitopatologia e a fisiologia vegetal.

Notadamente, a micropropagação in vitro de plantas anuais ou perenes possibilitou que houvesse avanços no campo do melhoramento por meio da transformação de plantas, ou seja, permitiu a ocorrência de rearranjos genéticos no material vegetal, sob condições in vitro, os quais, por meio exclusivo do melhoramento tradicional, seriam muito demorados e caros. Assim, a cultura de tecidos de plantas in vitro, como técnica, permite o aumento da produção e causa menos danos ambientais, por isso contribui para que os laboratórios e os países que a adotam tenham mais vantagens competitivas. Em países como a Alemanha, a Índia, a Holanda e os EUA, entre outros, a cultura de tecidos aplicada à floricultura, por exemplo, gera bilhões de dólares anualmente e, consequentemente, aumenta a oferta de empregos, além de gerar novas demandas por genótipos, rápida multiplicação clonal, plantas livres de doenças e independência de fatores sazonais (GOVIL; GUPTA, 1997; WINKELMANN; GEIER, 2006).

A micropropagação requer a análise de alguns parâmetros, tais como explante, assepsia, meio nutritivo, etc., os quais são importantes na compreensão do trabalho in vitro.

Explante

A cultura de tecidos de plantas é um termo que exprime o conceito de que uma ampla gama de tipos de tecidos da planta pode ser cultivada, sob condições assépticas e in vitro, visando micropropagação, melhoramento, armazenamento ou limpeza clonal. A micropropagação é um termo usado exclusivamente para referir-se à propagação in vitro a partir de alguma parte específica da planta – chamada explante –, baseada na capacidade morfogenética e totipotencial das células (VASIL; HILDEBRANDT, 1965).

Qualquer parte separada da planta destinada ao uso in vitro denomina-se explante. A lista de possíveis explantes é longa e variada, e os seguintes exemplos podem ser citados: fragmentos de raízes, hipocótilos, epicótilos, cotilédones, flores e folhas. Além desses, grãos de pólen, embriões, óvulos, nós, gemas axilares ou apicais também podem ser usados como explantes.

A escolha do explante poderá ser influenciada por vários fatores, tais como: disponibilidade de material, nível de contaminação, juvenilidade do tecido e estação do ano.

Nem todos os explantes reagem da mesma forma a uma determinada condição in vitro. Dessa forma, em Saussurea obvallata (planta medicinal e ornamental), verificou-se que os explantes foliares reagiram mais satisfatoriamente que raízes, hipocótilo e cotilédones, em termos de indução de calos e de organogênese (DHAR; JOSHI, 2005).

Os requerimentos nutricionais também poderão variar conforme o explante. Assim, pólen, embriões, bulbilhos, entre outros, poderão ter suas próprias exigências. Da mesma forma, o nível morfológico do explante também poderá influir nesse processo, já que, se o material inicial for um fragmento foliar, para virar calo, deverá desdiferenciar-se. Uma vez na forma de calo, esse fragmento deverá rediferenciar-se produzindo embriões somáticos ou gemas adventícias. Tudo isso ocorre de acordo com requerimentos nutritivos e hormonais particulares, seja adicionando alguns ingredientes seja reduzindo outros, pois a morfogênese, em um caso ou em outro, passará de células vacuoladas parenquimatosas do calo para células mais totipotentes ou embriogênicas, com núcleo proeminente, denso citoplasma, pequenos vacúolos e intensa síntese de RNA. Esse aspecto nutricional será abordado um pouco mais adiante.

A viabilidade do explante também é um aspecto vital a ser considerado, já que muitos embriões, especialmente de sementes recalcitrantes (da seringueira, do café, etc.), podem estar em condições não viáveis para seu uso in vitro. Nesse caso, o cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC), ou simplesmente tetrazólio, é usado como auxiliar para detectar rapidamente a viabilidade do material. O tetrazólio produz uma coloração avermelhada quando o tecido está viável. Notadamente, essa coloração é muito nítida no ápice radicular e apical dos embriões. Em uma semente do tamanho do feijão, não é necessária a utilização de lupa para que se observe a coloração vermelha que demonstra viabilidade. No entanto, em sementes de orquídea e de eucalipto, em vista de seu pequeno tamanho, o uso de microscópio estereoscópico faz-se necessário (Figura 1).

Figura 1. Sementes de orquídea (Oncidium phimatochilum) submetidas ao teste do tetrazólio (0,1% por 24 horas em temperatura de laboratório) para avaliação de sua viabilidade após algum tempo de armazenamento em refrigerador.

Foto: L. Pedro Barrueto Cid

O trabalho com embriões tem dado origem a uma linha importante de pesquisa, como é o caso do resgate de embriões imaturos derivados de cruzamentos interespecifícos, com o objetivo de obter genótipos novos e superiores (LIU et al., 2007).

Assepsia

Historicamente, este conceito foi desenvolvido a partir do século 19 em trabalhos pioneiros do médico húngaro Ignácio Semmelweis, do inglês Joseph Lister e do francês Louis Pasteur. Antisséptico é qualquer substância ou agente capaz de inibir ou combater microrganismos ou patógenos. Imbuído dessa ideia, Semmelweis usou as propriedades antissépticas do cloro (água de cloro) como profilático, para reduzir a morte nos hospitais por febre puerperal que, na ocasião, alcançava índices alarmantes, e preconizou a lavação das mãos e dos instrumentos com esse tipo de composto. Já Lister e Pasteur envolveram-se mais com a ideia global de microrganismos do ar como causadores de infecções e de doenças. Em termos profiláticos, Lister usou o ácidocarbólico, e Pasteur desenvolveu a técnica que ficou conhecida como pasteurização. Mais tarde, em 1878, Kock, na Alemanha, reconheceu a utilidade do vapor quente para esterilizar instrumentos.

A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes existentes na superfície do explante oriundo de material de campo ou de casa de vegetação, é um passo inevitável na cultura in vitro. Pode ser alta ou baixa, controlável ou não, constituída por fungos ou bactérias. As contaminações por vírus já são mais difíceis de diagnosticar.

No geral, o procedimento da assepsia começa com a limpeza da câmara de fluxo laminar com álcool 70%. Após a imersão em álcool 95%, o bisturi e as pinças que forem utilizados em processo de excisão devem ser flambados. Os discos de papel-filtro e as placas de Petri de vidro, assim como a vidraria em geral, precisam ser esterilizados em autoclave por 20 minutos, a 121 ºC e em pressão de uma atmosfera.

A assepsia dos explantes é frequentemente realizada por meio de alvejantes comerciais à base de cloro, embora diferentes substâncias possam ser utilizadas para essa finalidade. O teor de cloro ativo desses alvejantes varia de 2,0% a 2,5% e, geralmente, sua fonte é o hipoclorito de sódio (NaOCl), embora incluam também hidróxido e carbonato de sódio, sem especificar sua concentração, o que é uma limitação, ainda que não crítica. O NaOCl poderá ser também encontrado em uma formulação mais concentrada (10% a 12%), porém com menos outros produtos misturados. Nesse caso, dada a alta concentração, o produto deverá ser usado numa forma mais diluída. Outra formulação comercial para a assepsia dos explantes é o hipoclorito de cálcio (CaOCl2) a 7% (p/v), contudo, nesse caso, é necessário previamente filtrar o produto.

Em sua aplicação prática, o delineamento experimental do uso do hipoclorito pode ser simples e reduzido a uma concentração em que há vários tempos de imersão, como por exemplo, 0,0; 5,0; 10; 15; 20 minutos, etc. É conveniente que, durante esse tempo, os explantes fiquem sob agitação e que o hipoclorito contenha também algumas gotas de Tween 20 para facilitar a ação superficial do desinfetante. Depois desse tratamento, os explantes devem ser lavados com água esterilizada para que o hipoclorito residual seja removido.

Mesmo tomando todas as providências de uma assepsia rotineira, às vezes não é possível contornar completamente a contaminação por esta ter uma base endógena (Figura 2).

Figura 2. Estacas de café oriundas de casa de vegetação, submetidas à assepsia com hipoclorito de sódio e colocadas para brotar em vermiculita, em condições de laboratório. Durante o período, as estacas foram cobertas com saco plástico transparente e o substrato umedecido periodicamente. Apesar da assepsia, as estacas foram contaminadas. Enquanto a estaca está verde, a aparição de fungo é retardada, porém, uma vez marrom, o fungo alastra-se rapidamente na estaca. Trata-se provavelmente de uma contaminação de origem endógena.

Foto: L. Pedro Barrueto Cid

Em geral, por serem oxidantes enérgicos, além de facilmente removíveis pela água de lavagem, os hipocloritos são bastante utilizados na assepsia superficial dos explantes. Contudo, durante sua manipulação, é necessário evitar seu contato com a pele ou sua inalação, para diminuir o risco de irritações nas mãos ou na mucosa bronquial. Além de sua efetividade como agentes desinfetantes, os hipocloritos têm sido citados como estimulantes da germinação, em virtude de sua capacidade de estimular a atividade da α-amilase, ou, ainda, pelo fato de promoverem a quebra da dormência (KANEKO; MOROHASHI, 2003; MIYOSHI; MII, 1998).

O cloreto de mercúrio (HgCl2) também é um desinfetante enérgico e tem sido utilizado com sucesso na assepsia externa de explantes oriundos do campo. É solúvel em água e, normalmente, usado na concentração de 0,1% (p/v), por um ou dois minutos. Depois desse tratamento, os explantes devem ser lavados com água esterilizada abundante antes de serem inoculados no meio nutritivo. Mesmo assim, em alguns casos, como em embriões de café, por exemplo, esse produto mostrou-se tóxico, já que, logo após o tratamento ou depois de inoculados no meio nutritivo, tornaram-se marrons, o que evidencia intensa oxidação. Um alerta importante sobre esse produto é o fato de ele ser extremamente tóxico para o ser humano, por isso precauções devem ser tomadas a fim de evitar contato do produto com a pele. Além disso, seu descarte pela pia nunca deve ser feito no laboratório.

No combate à contaminação endógena dos explantes, procedimentos alternativos na cultura de tecidos também têm sido utilizados, como, por exemplo, o uso de água quente em bulbos e em gemas axilares de plantas lenhosas com resultados bastante importantes (LANGENS-GERRITS et al., 1998). Em outros casos, a assepsia convencional à base de cloro não apresentou resultados satisfatórios, de forma que foi necessário lançar mão de fungicidas e de antibióticos. Nesse caso, os rizomas foram lavados previamente com água de torneira e depois submetidos a diferentes concentrações e marcas de fungicidas. Em seguida, ficaram sob agitação por um período de até 48 horas e, depois, foram transferidos para meios de cultura apropriados. Semelhante tratamento feito também com antibióticos permitiu contornar satisfatoriamente a contaminação (KRITZINGER et al., 1998). Com relação ao fungicida Benlate, a experiência prática também tem sido satisfatória. Por exemplo, quando nós de mandioca (Manihot esculenta Crantz) colhidos no campo foram tratados primeiramente com hipoclorito de sódio 2,0% – depois com Benlate e Claforam 0,1% por 30 minutos – e, em seguida, foram inoculados em meio de cultura, a contaminação dos explantes foi reduzida.

O uso do Claforam (cefotaxima sódica), um antibiótico de amplo espectro, tem mostrado bons resultados, além de apresentar como vantagem adicional o fato de ser mais específico para o metabolismo da bactéria do que da planta. Assim, observou-se que a quantidade de 100 ppm desse antibiótico foi eficaz para contornar a contaminação bacteriana e não afetou a germinação nem o crescimento de plântulas de aipo, de berinjela, de cebola e de tomate (BARRUETO CID; DURZAN, 2003).

A literatura a respeito de cultura de tecidos oferece um amplo leque de antibióticos, tais como: sulfato de estreptomicina, timetina, canamicina, norfloxacina, ciprofloxacino, carbelicilina, rifampicina, tetraciclinas, etc. Estes podem ser usados separadamente ou em combinações. O problema principal a respeito desses antibióticos é a dúvida quanto ao fato de eles serem ou não sistêmicos no tecido da planta. Algumas experiências realizadas com sulfato de estreptomicina indicam que eles não são sistêmicos (ROMEIRO, 1995), portanto testes experimentais são necessários para delimitar melhor sua faixa de ação na cultura de tecidos.

Embora a contaminação bacteriana seja frequentemente encontrada nas culturas in vitro, é necessário ter certa precaução para não confundi-la com leveduras, pois, em ambas, o formato da colônia é muito parecido (Figura 3).

Figura 3. Leveduras (Saccharomyces boulardii) visualizadas em uma placa de Petri. Por se tratar de um fungo imperfeito, a colônia é mais parecida com uma colônia de bactérias do que com a de um fungo filamentoso, podendo, então, ser confundida com uma contaminação bacteriana.

Foto: L. Pedro Barrueto Cid

A contaminação na cultura de tecidos pode ser o maior obstáculo para o estabelecimento e a propagação de clones, por isso existe um verdadeiro arsenal de substâncias para enfrentar o problema. Por exemplo, o Plant Preservative Mixture (PPM) é um biocida também listado nesse arsenal. Ele é estável em alta temperatura, no entanto possui um espectro amplo de componentes (metilisotiazolinona, cloreto de magnésio, nitrato de magnésio, benzoato de sódio e sorbato de potássio) que podem afetar o ciclo de Krebs e o transporte da cadeia de elétrons. Assim, a dosagem e a espécie usadas são questões muito importantes que precisam ser consideradas (COMPTON; KOCH, 2001).

Outro problema relacionado com o explante é a oxidação fenólica. No entanto, esse item será abordado mais adiante.

Meio nutritivo

A técnica da micropropagação ocupa um lugar chave na chamada “segunda revolução verde”, na qual o rearranjo gênico manual (DNA recombinante) está sendo usado para melhorar a qualidade dos produtos agrícolas.

Nessa perspectiva, os meios nutritivos e a sua composição operam o “milagre” da vida, ou seja, a conversão dos explantes em plântulas e das plântulas em mudas, as quais têm o caráter clonal embutido em sua natureza e, por isso, possuem caráter de genótipo superior. São muitos os fatores que estão envolvidos em um protocolo eficiente de regeneração: tipo de meio básico de cultura, seguido do suplemento de reguladores de crescimento, concentração de sacarose, iluminação, explante, etc. (ZHANG et al., 2003). Se o meio nutritivo falhar, ou não for adequado em virtude de alguns de seus ingredientes, a obtenção de clones falha. Portanto, o conhecimento a respeito do meio nutritivo é da máxima importância.

Os ingredientes tradicionais de um meio nutritivo são: compostos inorgânicos, orgânicos, inertes e complexas substâncias naturais.

Os sais inorgânicos proveem os macronutrientes (cálcio, magnésio, enxofre, potássio, fósforo e nitrogênio) e os micronutrientes (zinco, ferro, cobre, manganês, cloro, molibdênio e boro). Outros elementos, como selênio, níquel e silício, não têm requerimento universal entre as plantas; por isso, não são considerados essenciais, ou seja, na sua ausência, as plantas podem crescer e desenvolver-se normalmente.

As plantas são concentradoras naturais de minerais (cálcio, fósforo, potássio, ferro, etc.) nos seus tecidos, especialmente em seus frutos, sementes e bulbos. No caso do selênio, por exemplo, existem plantas indicadoras desse elemento (Astragalus pectinatus), porque crescem em lugares em que a concentração desse elemento no solo é muito alta, como é o caso de algumas regiões áridas ou semiáridas (STADTMAN, 1974).

Em geral, as plantas retiram do solo altas concentrações de elementos essenciais, por isso a agricultura requer altas doses de adubo. De igual modo, a cultura de tecidos necessita incluir tais elementos no meio nutritivo. No caso do bulbo da cebola, por exemplo, a quantidade de macroelementos e de microelementos extraídos do solo é ilustrativa. As quantidades de macroelementos extraídos são: 69,7 kg ha-1 de N; 14,50 kg ha-1 de P; 57,09 kg ha-1 de K; 24,67 kg ha-1 de Ca; 4,47 kg ha-1 de Mg. Por sua vez, os microelementos são: 749,23 g ha-1 de Fe; 265,76 g ha-1 de Zn; 150,26 g ha-1 de B; 30,18 g ha-1 de Cu (VIDIGAL et al., 2002).

A água também forma parte do grupo de inorgânicos, e não poderia ser diferente já que, como solvente universal, por ter caráter bipolar, ela é indispensável para dissolver os sais e formar uma solução. É interessante que, apesar de a água ser um dipolo, não é uma substância iônica por excelência, visto que se dissocia muito pouco: 1 x 10-7 M. Ou seja, em cada 10 milhões de moléculas de água, uma está ionizada a 25 oC. No entanto,

pH = - log [ H+] ⇒ - log (1x 10-7)

demonstra que o pH da água pura, em teoria, é 7 (pH = 7), portanto é neutra. Quando se trata de cultura de tecidos, a água usada não deve ser retirada diretamente da torneira, porque esta contém muitos sais. Em vez disso, deve-se utilizar água destilada, ou bidestilada, ou ainda água deionizada (ultrapura). São necessários alguns cuidados no que diz respeito ao seu armazenamento, para evitar que ela não reaja com as paredes do container, portanto esses recipientes devem ser de boa qualidade, e recipientes de vidro ou plástico comum não devem ser utilizados para essa finalidade. Nessa mesma linha de raciocínio, deve-se evitar a carbonatação da água, o que pode acontecer em recipientes abertos.

Existem várias formulações de meios nutritivos, entre os quais estão: o meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962); o WPM (LLOYD; McCOWN, 1980); o B5 (GAMBORG et al., 1968); e o SP (BARRUETO CID, 2005). A escolha de um desses meios, em geral, é baseada na literatura, na experiência com cada espécie vegetal ou por tentativa e erro. Ademais, quando se tratar de requerimentos nutricionais específicos, vai depender da espécie ou do explante. Por exemplo, a germinação do pólen in vitro poderá incluir boro e cálcio em maior concentração, enquanto a indução de brotos a partir de um calo poderá exigir menos nitrato de amônia (PIERIK, 1987). Todavia, nos testes de avaliação de tolerância de algum genótipo, ambos poderão exigir a presença de NaCl ou de alumínio (BASU et al., 1997; GANDONOU et al., 2006), o que não é usual em qualquer meio nutritivo para planta.

A seguir, serão destacados os ingredientes dos meios nutritivos mais importantes para a cultura de tecidos.

Sacarose

A presença deste tipo de composto é essencial para o crescimento das plantas, visto que a fotossíntese da planta, ou do explante, é limitada. A sacarose é um dos carboidratos mais usados na preparação de meios nutritivos. Sua concentração mais usual varia de 2% a 3%; no entanto, ocasionalmente, ela pode ser usada em concentrações maiores, de até 6%, como no caso de embriões, na indução de bulbilhos de alho ou na tuberização em raízes de mandioca. Além disso, a sacarose é parcialmente hidrolisada na sua passagem pela autoclave em glicose e em frutose. Nessa reação, o pH, ou ainda o carvão ativado, que também é frequentemente utilizado, podem ser importantes fatores, e a glicose ou a frutose raramente são incluídas nos meios. Na autoclave, o açúcar pode ainda experimentar a reação de Maillard, que dá ao meio uma coloração amarelo-escura, que varia de intensidade conforme a magnitude do fenômeno. Trata-se de uma reação entre açúcares e peptídeos, forçada pela alta temperatura. Do ponto de vista químico, essa reação é diferente da caramelização, que é outro exemplo de browning, em que apenas açúcares participam. Essa reação é altamente complexa, além de ser indesejável na cultura de tecidos. Ela ocorre quando os açúcares são aquecidos acima de seu ponto de fusão, o que leva à formação do 5-hidroximetil-furfuralaldeído.

Vitaminas

As vitaminas usadas na cultura de tecidos pertencem ao grupo das hidrossolúveis ou grupo B. Esse grupo é constituído pelas seguintes vitaminas: B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B6 (piridoxina), ácido pantotênico, ácido nicotínico (niacina), ácido fólico, ácido ascórbico, biotina e cobalamina. Desse elenco, a tiamina, o ácido nicotínico e a piridoxina são encontrados na maioria dos meios nutritivos. A biotina e o ácido pantotênico, no entanto, são de uso mais restrito.

Em geral, as vitaminas atuam como um fator não proteico dentro de enzimas, coenzimas, além de serem cruciais para que essas enzimas possam catalisar reações importantes dentro do metabolismo primário da célula. Assim, por exemplo, a tiamina atua na descarboxilação de α-cetoácidos; a piridoxina, na transferência de grupos aminos; o ácido nicotínico, em reações de óxido-redução; a biotina, na transferência de CO2; o ácido pantotênico, na transferência de grupos acila, entre outros (LEHNINGER, 1988).

As vitaminas do grupo das lipossolúveis, tais como as vitaminas A, D, E e K, não são usadas. Não se tem conhecimento, por exemplo, de que a vitamina A participe de alguma reação dentro da planta. Ela se origina a partir dos betacarotenos, os quais são de origem isoprenoide, isto é, derivados do isopreno, um hidrocarboneto com cinco carbonos chamado também de 2-metilbutadieno.

As vitaminas E, K e D também são de origem isoprenoide, porém a vitamina D possui um caráter mais esteroidal. Os esteroides são moléculas complexas relacionadas ao colesterol.

Pelo fato de as vitaminas serem sintetizadas pela planta, fica a dúvida em relação a seu requerimento pelo explante. Contudo, do ponto de vista fisiológico, não há como saber se um explante em particular (raiz, hipocótilo, etc) teria ou não a capacidade de sintetizar tiamina, ou se essa capacidade ficaria restrita a outros órgãos que poderiam exportar esse tipo de metabólito. Por exemplo, a capacidade de produzir tiamina varia conforme as espécies. Assim, nos frutos, a goiaba-vermelha e a graviola podem ter muito mais tiamina do que no mamão maduro e na manga. A inclusão de algumas vitaminas ao meio nutritivo parte dos seguintes pressupostos: o explante, por definição, é uma parte separada da planta; e, na planta, a produção de vitaminas é diferente nos órgãos. Portanto, a inclusão das vitaminas no meio nutritivo torna-se necessária para nutrir o explante.

Inositol

Este composto orgânico de baixo peso molecular (180 g), e solúvel em água, é rotineiramente usado na preparação de meios. Em muitos casos, tem um efeito benéfico e não se conhecem respostas inibitórias ou essenciais nas concentrações utilizadas (50 mg L-1 a 100 mg L-1).

Hormônios

Os hormônios são biomoléculas produzidas pela planta, cuja finalidade é induzir respostas fisiológicas, tais como indução de raízes, indução de brotos, alongamento de entrenós, etc.

A interação do hormônio com a membrana celular está sob intensa pesquisa, cujo objetivo é conhecer melhor as características do receptor (números de domínios, tipo de inserção na membrana celular, relação com a proteína G, ubiquitinação, etc.), bem como canalizar o estímulo ou o sinal até o núcleo das células-alvo (WOODWARD; BARTEL, 2005).

Nas plantas, existem vários tipos de hormônios, tais como: as auxinas, as citocininas, as giberélicas, o etileno, o ácido abscísico e o ácido jasmônico.

De um modo geral, as moléculas que têm seu efeito parecido com o dos hormônios são denominadas reguladores de crescimento (RC). A diferença é que os hormônios não são sintéticos, ou seja, são produzidos pelas plantas. Incluem-se nos RC o Picloram, a Benzilaminopurina, o TDZ, entre outros.

Os RCs e os hormônios atuam em baixíssimas concentrações, na ordem de mg (miligramas) ou µM (micromolares), isto é, 10-6 molar.

É oportuno frisar que:

1 molar = 1 mol L-1 = 1 M

1 milimolar = 0,001 mol L-1 = 1 mM

1 micromolar = 0,000001 mol L-1 = 1 µM

(Um mol de qualquer substância orgânica tem o mesmo número de moléculas por volume.)

Na cultura de tecidos, as auxinas e as citocininas, em formas naturais ou sintéticas (RC), fazem parte do grupo de hormônios mais frequentemente usados. As giberélicas são usadas ocasionalmente, enquanto o etileno e o ácido abscísico são de uso muito raro.

Auxinas

As auxinas, em seu significado etimológico, exprimem a ideia de crescimento, ou seja, desencadeiam vários processos fisiológicos, entre os quais está a formação do fruto (PANDOLFINI et al., 2007). Entre as auxinas hormonais, o ácido 3-indolacético (AIA) é o mais conhecido. Foi isolado pela primeira vez em 1934 na urina de mulheres grávidas. Alguns anos depois, na mesma década, foi isolado em leveduras e em culturas de Rhizopus suinus. Em 1946, foi extraído de grãos de milho imaturos e, posteriormente, de muitas outras plantas (HOPKINS, 1999).

Na cultura de tecidos, as auxinas são frequentemente usadas na indução de calos a partir de um explante e no enraizamento a partir de brotos. São exemplos de auxinas: o AIA (PM 175,2); o ácido indolbutírico (PM 203,2); o ácido naftalenoacético (PM 186,2); o 2,4-diclorofenoxiacético (PM 221,0); e o Picloram ou ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-picolínico (PM 241,5). Alguns RCs têm uma posição ambígua, pois atuam como auxina ou como citocinina. Esse é o caso do Tidiazuron ou TDZ [1-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il) ureia].

A concentração usada depende da finalidade, que pode ser, por exemplo, a indução de calo ou o enraizamento. Em geral, na indução de calos, a concentração é maior, porém isso também depende do tipo de composto usado. Assim, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e o Picloram são mais potentes como auxina que o ácido 3-indolacético (AIA) e o ácido naftalenoacético (ANA).

A indução de calos em alho foi alcançada por meio de uma mistura de 2,4-D e de Picloram, na ordem de 5 µM cada (BARRUETO CID et al., 1994). No entanto, em café, o Picloram foi usado sozinho, na ordem de 4 µM (BARRUETO CID et al., 2004). Para o enraizamento de brotos de eucalipto, utilizaram-se 2,5 µM de ácido indolbutírico (AIB) (BARRUETO CID, et al., 1999). Todavia, na indução de calos, quando o carvão ativado estiver presente no meio nutritivo básico, a concentração de auxina ainda é mais elevada, podendo chegar a 100 mg L-1 (REYNOLDS; MURASHIGE, 1979). Isso ocorre porque o carvão ativado tem propriedades adsorventes (MOHAMED-YASSEEN, 2001).

As auxinas se comportam como ácidos fracos e não são solúveis em água, por isso um aspecto importante em relação a elas é a necessidade de que sejam dissolvidas para serem incorporadas ao meio. Na prática, elas se dissolvem bem em meio básico (KOH ou NaOH 0,1 N ou 1,0 N). É recomendável trabalhar com soluções estoques guardadas no refrigerador e, a partir daí, usá-las para a preparação do meio básico. Essas soluções estoques devem manter-se livres de quaisquer impurezas, portanto devem apresentar-se transparentes e límpidas. O TDZ é um pouco refratário e, uma vez dissolvido, após alguns dias, volta a cristalizar-se. Por isso, é recomendável prepará-lo e, em seguida, estocá-lo em freezer, mantendo-o congelado. O TDZ, embora seja um derivado da ureia, também pode agir como citocinina.

Citocininas

As citocininas pertencem a um grupo de substâncias que promovem a divisão celular, e sua origem está relacionada com a adenina. Historicamente, o descobrimento das citocininas está ligado ao DNA autoclavado de esperma do arenque. As citocininas na cultura de tecidos, em geral, são usadas para promover a indução de brotos adventícios a partir de calos ou para induzir multibrotação a partir de gemas axilares ou apicais (BARRUETO CID et al., 1994); no entanto, podem inibir a indução de raízes em plântulas. De um ponto de vista mais fisiológico, elas inibem a senescência foliar e a dominância apical.

Considerando-se o aspecto químico, as citocininas são compostas por um anel adenílico e por uma cadeia lateral isoprenoide, a qual se origina a partir do ácido mevalônico, e, depois, converte para isopentenil pirofosfato (∆3 -iPP). Este último, por sua vez, converte-se em dimetilalil-pirofosfato (∆2 -iPP ou DMAP). Existem outras derivações do ∆3 -iPP, a saber: o geranil pirofosfato, que dá origem aos monoterpenos (mentol); o farnesil pirofosfato, que origina os sesquiterpenos (ác. abscísico); e o geranilgeranil pirofosfato, que origina os diterpenos (como giberelinas) ou os tetraterpenos (como carotenoides).

Entre as citocininas naturais, encontram-se a zeatina (ZEA) e o isopentenil adenina (IPA) ({9R-5’P} IPA) (Figura 4). Entre as citocininas sintéticas, destacam-se a cinetina (CIN) (6-furfurilaminopurina) e a 6-benzilaminopurina (BAP). Nesse caso, a cadeia lateral isoprenoide foi substituída por um anel cíclico de caráter furfural (cinetina) ou benzênico (6-benzilaminopurina).

Figura 4. Estrutura química das citocininas. (A) ribotil-zeatina; (B) ribotil-isopenteniladenina.

O sulfato de adenina é um composto púrico com efeito benéfico sobre o crescimento e desenvolvimento de embriões e de gemas adventícias e oferece a vantagem de ser solúvel em água. Foi introduzido no campo da cultura de tecidos no laboratório de Skoog, com o objetivo de induzir a organogênese a partir de medula de fumo (SKOOG; TSUI, 1948), ou a embriogênese somática (VIBHA et al., 2009).

O TDZ também pode agir como citocinina, mas ele é um derivado da ureia. Há relatos que informam a capacidade do TDZ, como citocinina, para indução de brotos adventícios (BARRUETO CID et al.,1997; THENGANE et al., 2001).

As citocininas são bases fracas, isto é, podem ser dissolvidas a partir de ácido clorídrico 1 N ou 0,1 N. Com a aplicação de uma pequena quantidade desse ácido as citocininas se dissolvem. Em seguida, completa-se o volume com água. Após transferir a solução do béquer, onde foi preparada, para um frasco de 50 mL, ela deve ser guardada no refrigerador, não necessariamente no freezer.

Giberelinas

As giberelinas (AG) são hormônios de natureza diterpenoide (C-20), originadas do geranilgeranil pirofosfato. Estão relacionadas, notadamente, com o crescimento caulinar das plantas e com a produção de a-amilase em sementes de gramíneas.

As giberelinas são um grupo vasto de compostos, que hoje chegam a uma quantidade de aproximadamente 120. No entanto, na cultura de tecidos, a mais usada é a AG3 (PM 384,5 g). Mesmo assim, seu uso na cultura de tecidos é restrito e está relacionado com o alongamento de brotos (BARRUETO CID, 1999).

Etileno

O etileno (C2H4) é um hormônio de caráter gasoso capaz de influenciar a morfogênese das plantas em muitos aspectos (KUMAR et al., 1998). Não é frequentemente usado na cultura de tecidos, porém pode ser produzido pelo explante.

No tecido, pode promover efeitos indesejáveis, tais como: oxidação fenólica, queda foliar, hiperhidricidade (vitrificação). Portanto, afeta negativamente as duas maiores vias de regeneração de plantas: a organogênese e a embriogênese somática. Contudo, o etileno também pode favorecer esse tipo de morfogênese (HATANAKA et al., 1995; KUMAR et al., 1998).

O metabolismo e a fisiologia do etileno foram desenvolvidos tanto a partir das pesquisas relacionadas com duas enzimas de sua rota metabólica – a ACC sintase e a ACC oxidase (MCKEON et al., 1995) – quanto com o uso de inibidores de sua síntese, tais como: a aminoetoxi-vinil-glicina (AVG), o ácido salicílico, o cloreto de cobalto (CoCl2), etc.; além de inibidores de sua ação, tais como: o nitrato de prata (AgNO3), o tiossulfato de prata (Ag2S2O3), o CO2 e o 2,5-norbornadieno. Essas pesquisas visavam melhorar a performance da regeneração, como em Brassica campestri (CHI; PUA, 1989). Por sua vez, o uso de cefotaxima, de cefalosporina e de inibidores do etileno melhorou o potencial regenerativo de calos de Pennisetum americanum (PIUS et al., 1993). Nessa mesma linha de trabalho, é oportuno mencionar o incremento da regeneração de plântulas por inibição da ACC oxidase, por meio da construção antisense em plantas transgênicas de Brassica juncea (PUA; LEE, 1995), por meio da qual foi possível verificar o papel regulatório do etileno na organogênese.

Finalmente, é bom lembrar que as auxinas, em geral, têm a propriedade de induzir síntese de etileno em muitas espécies. Em cultura de tecidos, usam-se frequentemente auxinas na fase de indução de calos, porém é bom ter em mente que elas poderão estimular a síntese de etileno e, com isso, oxidar o explante ou o calo ou, até mesmo, inibir a embriogênese somática, fato que ocorreu em Daucus carota, por meio do uso de ethefon (TISSERAT; MURASHIGE, 1977).

O ethefon, ou ácido 2-cloroetilfosfônico, é um composto que, em pH alcalino, libera etileno. Em escala comercial, por exemplo, é usado pelos produtores de abacaxi (Ananas comosus) para antecipar e uniformizar a floração. Na seringueira (Hevea brasiliensis), o ethefon é utilizado para aumentar a produção de látex.

Ácido abscísico (AAB)

O ácido abscísico (AAB) é um sesquiterpeno (C15) que, nas plantas em geral, está relacionado à dormência, ao estresse hídrico, ao fechamento de estômatos, etc. Dessa forma, cumpre muitas funções na planta (HIRAYAMA; SHINOZAKI, 2007; SEO; KOSHIBA, 2002). No entanto, na cultura de tecidos, não tem sido usado frequentemente como hormônio vegetal. Ao ser utilizado dessa forma, observa-se um efeito importante na fase embrionária, o que impede tanto a germinação precoce de embriões zigóticos (NAIDU; SREENIVASAN, 2004) quanto a embriogênese somática (LEMUS, 2005), e, ainda, a poliembriogênese (DURZAN et al., 1994).

Brassinosteroides (BRs)

Os brassinosteroides, ou brassinas, são hormônios vegetais de mesma natureza dos fitoesteroides polioxigenados e são dotados de atividade reguladora de crescimento vegetal (ZULLO; ADAM, 2002). Entre esses fitoesteroides, cabe mencionar o sitosterol e o campesterol, os quais foram descobertos, nas décadas de 1970 e de 1980, no pólen de algumas plantas, como por exemplo, da espécie Brassica napus. Os BRs caracterizam-se por sua capacidade de promover alongamento no eixo caulinar da planta e promover a formação de traqueídes, por exemplo, neste caso, em Zinnia elegans sob condições in vitro.

A partir da técnica de isolamento e de purificação, descobriram-se brassinas em muitas famílias de plantas, entre as quais as crucíferas, as leguminosas, as fagáceas, as rutáceas, etc. Sua presença já foi verificada em 27 famílias de plantas superiores (SASSE, 2003).

Em geral, os efeitos das brassinas não têm sido muito relatados na cultura de tecidos, porém alguns esparsos trabalhos que mostram estimular a regeneração têm sido publicados (LU et al., 2003; SASAKI, 2002).

Triacontanol

Outro composto de caráter hormonal, mencionado com pouca frequência na cultura de tecidos é o triacontanol (TRIA). Tal composto é um álcool de 30 carbonos {CH3 (CH2)28 CH2OH} e é um componente natural da cutícula de alfafa e de outras plantas. Algumas publicações relatam umh efeito positivo na regeneração de plantas in vitro (REDDY et al., 2002; TANTOS et al., 2001).

Ácido jasmônico

O ácido jasmônico, seu metil-éster e derivados estão amplamente distribuídos no reino vegetal. São sintetizados a partir do ácido linolênico e desempenham papéis importantes no desenvolvimento das plantas e nas respostas destas aos estresses ambientais (PEÑA CORTÉS, 2000). O uso desses compostos não tem sido frequentemente relatado na literatura sobre cultura de tecidos. Seu efeito parece mais indireto sobre a organogênese, porém apresenta uma ação mais direta sobre a produção de metabólitos secundários, como o diterpenoide paclitaxel (taxol), ou em calos induzidos por Picloram (FURMANOWA et al., 1997).

Misturas complexas

Com respeito a outros ingredientes que podem estar presentes no meio nutritivo, vale a pena mencionar alguns de estrutura complexa, tais como o hidrolisado de caseína, (50 mg L-1 a 500 mg L-1), a água de coco (5% a 20% v/v), o extrato de malte (400 mg L-1 a 500 mg L-1), o extrato de levedura (100 mg L-1 a 500 mg L-1) e a banana passada no liquificador (10% a 50% v/v), etc. Alguns, como a água do fruto do coqueiro, podem ser esterilizados por filtração e depois adicionados ao meio já autoclavado. Esse tipo de ingrediente, com quantidade e composição não conhecidas (aminoácidos, sais, vitaminas, elementos minerais, etc.), é usado para complementar os meios nutritivos normais quando estes falham em produzir os resultados esperados.

Ágar

O ágar é um polissacarídeo de alto peso molecular usado na cultura de tecidos para dar suporte a explantes e a plantas mantidas in vitro. O ágar oferece a vantagem de ser solúvel em água, além de fundir-se a 100 oC e de permanecer semissólido à temperatura ambiente. Ademais, é um produto relativamente inerte e pode conter impurezas orgânicas e inorgânicas, entre as quais estão o sódio e o cloro (SCHOLTEN; PIERIK, 1998). Por isso, às vezes é necessário lavá-lo com água antes de utilizá-lo.

Pode ser usado numa faixa de concentração que varia de 0,5% a 0,7%, embora, na faixa de 0,5% a 0,6%, o explante acomode-se melhor. Também existem registros de uso em concentrações mais altas, como 1,1%, com o objetivo de evitar vitrificação do material. Nesse caso, porém, a regeneração foi afetada (DEBERGH, 1983).

A concentração tem sua importância porque, em níveis mais altos, ela pode afetar a disponibilidade e a difusão dos ingredientes. Além disso, existe a possibilidade de ocorrer um efeito osmótico. O pH é um fator que pode afetar a estabilidade do ágar gelificado. Em valores de 4 ou abaixo de 4, sua solidificação é dificultada, ou impossibilitada.

O ágar pode ser substituído pelo Gelrite, que é um polissacarídeo obtido de bactérias, altamente puro e transparente quando solidificado. Sua consistência (gel strength) no meio de cultura está relacionada à concentração de cátions, como cálcio e magnésio. A faixa de concentração a ser usada na preparação de meios pode variar de 0,15% a 0,25%.

Uma alternativa para o uso de agentes gelificantes, como o ágar e o Gelrite, são as pontes de papel ou suportes de espuma de plástico, usados em meios líquidos; embora o uso de amido de milho também tenha sido relatado (BARRUETO CID et al., 1994).

Carvão ativado (CA)

O carvão ativado tem sido incorporado ao meio nutritivo para melhorar o crescimento ou promover a organogênese de uma ampla variedade de espécies (PAN; STADEN, 1998). Seu efeito tem sido atribuído à sua capacidade de adsorção de substâncias inibidoras liberadas pelo tecido (fenóis) e pelo meio (5-hidroximetilfurfural), após sua passagem pela autoclave. Contudo, nessa adsorção, vitaminas e hormônios também pode ser retidos. Como já foi mencionado no item que trata das auxinas, íons como cobre e zinco também podem ser retidos em alta proporção (WINKLE et al., 2003). Outro detalhe prático é que, durante a autoclavagem, o CA pode estimular a hidrólise da sacarose e promover a formação de glicose e de frutose, mas esse fenômeno ocorre mais frequentemente em concentrações mais altas de carvão (DRUART; WULF, 1993). Contudo, há indicações de que o pH do meio seja um fator decisivo nessa hidrólise, já que, em meios tamponados (pH = 5,5, por exemplo), tal hidrólise foi reduzida (WANN et al., 1997). No entanto, a realidade é que, nos laboratórios, os meios tamponados são raramente usados. Uma das razões para isso é a presença dos componentes adicionais que entram na composição desses tampões. Normalmente, a concentração de CA varia de 0,1% a 0,3%, e é adicionado ao meio cujo pH foi previamente ajustado para 5,7 ou 5,8. Depois de o meio ser autoclavado, é conveniente agitar os tubos ou frascos que contêm o CA para que haja uma melhor distribuição. Embora, às vezes, essa prática não seja realizada, não tem sido observado efeito negativo no crescimento do material.

Pelo fato de o CA possuir distintas fontes de origem (madeira, casca de coco, etc.), alguns laboratórios, às vezes, costumam tratá-los com água deionizada antes que seja adicionado ao meio. Esse procedimento visa reduzir possíveis componentes inibitórios.

Luz

Em um laboratório de cultura de tecidos, é necessário cuidar da energia radiante para promover um bom desenvolvimento de culturas in vitro.

Em relação à luz, existem três características principais que devem ser observadas: fotoperíodo, irradiância e composição espectral. O fotoperíodo necessita ser previamente ajustado para 12/12, 14/10 ou 16/8 (relação de horas de luz/escuro) (MORINI et al., 1991).

Normalmente, os tubos fluorescentes comuns são usados como fontes luminosas. Eles são mais eficientes que as lâmpadas incandescentes, embora sejam mais caros. Além disso, as lâmpadas fluorescentes perdem menos energia na forma de calor.

É necessário colocar de três a cinco lâmpadas no teto das prateleiras dos armários metálicos que são usados. O vão entre as prateleiras deve ser de aproximadamente 50 cm. Nessas condições, geralmente a irradiância no nível das placas ou tubos de ensaio é de aproximadamente 30 µmol m-2 s-1. Essa é uma quantidade de energia suficiente para os requerimentos normais de carbono das plantas, já que a outra parte é complementada pela sacarose do meio nutritivo. A energia que é emitida nessa irradiância deve conter radiação fotossinteticamente ativa (PAR, em inglês), correspondente à faixa de 400 nm a 700 nm (nanômetros), que são os comprimentos mais efetivos para a fotossíntese.

A questão da composição espectral está relacionada à característica dos tubos fluorescentes que serão usados, ou seja, de sódio ou de mercúrio. A descarga elétrica, em síntese, passa através das partículas de vapor que estão dentro dos tubos e causam emissão de luz branca com predominância de algum tipo de comprimento de onda: alaranjada, no caso do sódio, e azulada, no caso do mercúrio.

A luz é uma forma de energia radiante e resulta da superposição de campos magnéticos elétricos que se propagam como ondas ou como “partículas” ou fótons. Os fótons têm diferentes valores de energia. Assim, os fótons da região ultravioleta são mais energéticos que os da região vermelha (Tabela 1). Um mol de fótons de qualquer comprimento de onda tem 6,023 x1023 fótons.

Tabela 1. Comparação entre o conteúdo energético de três comprimentos de ondas.

Comprimento de onda (λ)

Energia (KJ mol⁻¹)

UV (280 nm)

471

Azul (425 nm)

274

Vermelho (640 nm)

181

Para fins de cultura de tecidos, as unidades de iluminação lux e foot-candles1 são atualmente pouco utilizadas. Prefere-se usar medidas de energia como a irradiância, por exemplo, pelo fato de ser uma unidade que se relaciona mais com a energia que com a sensibilidade do olho humano.

A irradiância expressa a ideia de energia incidindo sobre uma superfície. Suas unidades são W m-2 e Joule m-2 s-1, e ambas são equivalentes, embora a segunda inclua a dimensão de tempo. Para essa finalidade, não é aconselhável o uso das unidades de energia erg ou caloria.

A irradiância também pode ser expressa em termos de moles de fótons por metro quadrado por segundo (mol m-2s-1), que também recebe o nome de Einstein m-2 s-1. Um Einstein representa uma quantidade muito grande de fótons (6,0 x1023), por isso utiliza-se o µEinstein ou µmol m-2 s-1.

Embora a intensidade luminosa e a irradiância sejam, às vezes, consideradas equivalentes, elas representam conceitos distintos. A intensidade exprime a ideia de emissão luminosa de uma fonte, e não necessariamente o fluxo de fótons ou a densidade de fótons fotossinteticamente importantes para a planta (PAR).

Para se ter uma ideia dos valores da irradiância, basta lembrar que, no topo da atmosfera, ou seja, onde não há nuvens, há aproximadamente 1.400 J m-2 s-1 ou W m-2 e 2.000 µE m-2 s-1. No entanto, depois que a luz atravessa as nuvens, esse valor pode cair para aproximadamente 400 µEm-2s-1.

Com respeito ao laboratório, é conveniente conhecer a irradiância das lâmpadas, tanto por uma questão do ponto de compensação luminosa quanto para evitar aquecimento. Contudo, conforme já foi mencionado anteriormente, aproximadamente 30 ± 10 µmoles m-2 s-1 podem ser apropriados. Para evitar aquecimento da sala pelos reatores das lâmpadas é conveniente colocá-los fora da sala de cultura.

Com respeito aos efeitos da composição espectral sobre a morfogênese, os resultados têm sido variados. A luz da região azul pode estimular um tipo de organogênese (raiz/brotos) e a luz vermelha, outro.

Temperatura

A temperatura é um fator ambiental que regula o crescimento das plantas. Esse controle ocorre de diferentes maneiras e depende do tipo de planta, ou seja, se ela é de clima temperado ou tropical. No entanto, no que diz respeito às culturas in vitro, essas diferenças são minimizadas, pois as condições experimentais são padronizadas nos laboratórios.

No laboratório de cultura de tecidos, é conveniente que a temperatura seja mantida o mais estável possível. Em geral, a faixa de temperatura a ser usada pode variar entre 23 °C e 27 °C, portanto é necessário dispor de um sistema de refrigeração com controle automático de temperatura, justamente para reduzir ao mínimo essas variações de temperatura entre o dia e a noite. Ademais, embora não seja frequente, existem laboratórios que usam temperaturas diferentes durante o dia e a noite: 26 °C e 20 °C, respectivamente.

A uniformidade da temperatura dentro da sala de cultura constitui um dos princípios básicos da experimentação – o controle local –, que garante um tratamento térmico semelhante ao do material dentro das unidades experimentais ou das parcelas durante a experimentação, visando sua maior precisão. O controle local não somente deve ficar restrito à temperatura senão também à irradiância nas prateleiras. Os outros dois princípios básicos da experimentação são a repetição e a casualização.

Referências

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Capítulo 2

Oxidação fenólica, vitrificação e variação somaclonal

L. Pedro Barrueto Cid
João Batista Teixeira

A micropropagação de plantas tem-se convertido em uma tradicional técnica para clonar plantas com fins experimentais ou comerciais. Contudo, essa técnica apresenta problemas, como é o caso da contaminação, mencionada no capítulo 1. Somando-se a isso, três outros problemas podem ocorrer durante a cultura in vitro, quais sejam: a oxidação fenólica, a vitrificação e a variação somaclonal.

A oxidação fenólica

A oxidação fenólica, responsável pela cor marrom do explante, é um fenômeno frequente em frutas climatéricas, como a banana, a manga e a maçã. Porém, em frutas não climatéricas, como o morango, o limão e a uva, não se observou o problema.

O pardeamento é atribuído à polifenoloxidase (PPO), uma enzima cobre dependente, que catalisa a reação de orto-difenóis (ácido clorogênico), por exemplo, para orto-diquinonas, as quais, ao se polimerizarem, dão a cor escura ou parda aos produtos (Figura 1) (MAYER, 1987). Sabe-se que tal reação é desencadeada no processo de senescência ou por injúria dos tecidos. Contudo, a fisiologia da enzima é um enigma e, do ponto de vista genético, parece ser codificada por dois genes (ZHOU et al., 2003), cuja transcrição e regulação são a chave para sua expressão e entendimento. Por isso também, o gene que codifica a PPO tem sido clonado com o objetivo de avaliar o efeito da baixa temperatura na pós-colheita de abacaxi.

Figura 1. Células de banana em suspensão. À esquerda, elas estão completamente oxidadas; à direita, seu aspecto é normal. Ambas estavam em similares condições experimentais.

Foto: Kazumitsu Matsumoto

A PPO é uma enzima que está presente tanto em plastídios da raiz, do hipocótilo e do fruto, quanto nos cloroplastos do mesófilo. No entanto, reações histoquímicas não têm mostrado atividade nos cloroplastos de células-guarda ou de células da bainha em plantas C4. Do ponto de vista bioquímico, seus substratos são os orto-difenóis, como já mencionado, que estão presentes no vacúolo. Quando, por alguma razão externa (um ferimento, por exemplo) ou interna (um processo de apoptose, por exemplo), a enzima entra em contato com o substrato, em presença de oxigênio, ocorre a formação e a polimerização de quinonas (VAUGHN; DUKE, 1984). Não se sabe ainda se essa reação está envolvida em resistência à doença.

Na cultura de tecidos, o corte do explante com bisturi desencadeia a oxidação fenólica. Notadamente, ela ocorre frequentemente em plantas perenes, como eucalipto, manga, banana, etc. Porém, em plantas não perenes, como o Anthurium de jardim, esse fenômeno também pode estar presente em até mesmo 50% dos explantes (CHEN et al., 1997). Pode ocorrer também em Strelitzia reginae, cujos explantes apresentam alto nível de oxidação fenólica, o que inviabiliza qualquer tentativa de micropropagação sem o uso de antioxidantes (ZIV; HALEVY, 1983).

Para enfrentar esse grave problema de produção de fenóis por parte do tecido, tem-se apelado para um leque amplo de artifícios (THOMAS; RAVINDRA, 1997), entre os quais pode ser citada a adição de carvão ativado e de PVP (polivinilpirrolidona). Este último existe em diversos pesos moleculares.

O carvão ativado constitui uma boa alternativa tanto por sua propriedade adsorvente, no caso dos exsudados fenólicos liberados para o meio, quanto, talvez, por sua capacidade de fixar o cobre. Nesse caso, o carvão ativado torna a PPO inativa. No caso do PVP, sua propriedade de captar elétrons é sua principal vantagem.

O PVP pode ser usado também na forma insolúvel. Nesse caso, o produto é comercialmente conhecido como Polyclar T (peso molecular 40.000), e, antes de ser inoculado, o explante deve permanecer em agitação, por algum tempo, em meio líquido em presença de Polyclar T.

Existem outros produtos que podem prevenir a oxidação fenólica, a saber: o ácido cítrico, o ácido ascórbico, a L-cisteína, os sulfitos e os metabissulfitos de sódio, a tiureia, o ácido tartárico, o ácido salicildroxâmico, o ditiotreitol (DTT) e a bentonita (argila) (THIS, 2007). Alguns produtos não são incluídos no meio nutritivo, e o explante é submerso por algum tempo em uma placa de Petri, ou em um béquer, na câmara de fluxo laminar. A concentração de tais produtos deve ser previamente avaliada. No caso do DTT, verificou-se que, na concentração de 0,1%, houve uma diminuição da oxidação fenólica, bem como uma melhora da embriogênese somática de Pinus patula (MALABADI; STADEN, 2005).

Os possíveis mecanismos de ação estariam relacionados ou com uma ação quelante do produto (aprisionamento do cobre da enzima) – como é o caso do ácido cítrico, da tiureia, etc. – ou com a captura do oxigênio molecular – como é o caso do ácido ascórbico. Além disso, a exposição do explante a esses ácidos também seria responsável por tornar o pH da enzima menos apropriado, considerando-se que o pH ótimo está na faixa de 6 a 7.

Além das alternativas já citadas, as seguintes ações também podem ser executadas: trocar o meio mais frequentemente, manter o explante no escuro, reduzir o tamanho da lesão, usar temporariamente um meio com pH mais baixo (4,8), usar ágar mais purificado com menor teor de cobre, pesquisar tecidos menos susceptíveis à oxidação e usar pontes de papel. Também há evidências de que altas concentrações de 2,4-D reduziriam a síntese de fenóis. No entanto, nesse esquema, as citocininas teriam um efeito contrário, e a peroxidase teria um importante papel (SHAH et al., 1976).

Vitrificação ou hiper-hidricidade

A vitrificação (Figura 2) é uma desordem fisiológica e morfológica (KEVERS et al., 2004), que, no momento da propagação in vitro, pode afetar tanto plantas herbáceas como lenhosas. Não é um fenômeno frequente, e depende muito das condições in vitro para que ocorra e se expresse em diferentes graus (PEREZ TORNERO et al., 2001).

Figura 2. Plântulas de mamão obtidas com aproximadamente 1 µM de BAP (A). Brotos vitrificados de mamão obtidos com 10 µM BAP (B). Em ambos os casos, foi usado meio SP.

Fotos: L. Pedro Barrueto Cid

Uma planta vitrificada apresenta as seguintes características: desenvolvimento insuficiente, folhas quebradiças e translúcidas, estômatos anormais, pouco desenvolvimento do domo apical, primórdios foliares alongados, grandes espaços intercelulares na região do corpo subapical das gemas, incompleta conexão vascular entre primórdios foliares e câmbio vascular, xilema menos lignificado e mesófilo com tecido paliçádico e esponjoso não bem estruturado. Em resumo, as plantas não têm valor comercial (DEBERGH et al., 1981; VIEITEZ et al., 1985).

Entre as causas responsáveis pela vitrificação, estão a alta concentração de citocinina e a alta umidade relativa nos tubos de ensaio ou nas placas de Petri. Também há evidências de que o cloro, a amônia e o etileno estejam envolvidos nesse processo (ZIV, 1991).

Existem plantas que possuem pouca tendência a apresentar o fenômeno, tais como o abacaxi e as orquídeas. Outras plantas, como o café, o mamão, a mandioca, o cravo e o pêssego, são susceptíveis à vitrificação quando expostas a altas concentrações de citocinina ou meios líquidos. Portanto, esses fatores devem ser monitorados atentamente por ocasião do seu cultivo in vitro.

Não existem muitas evidências diretas que comprovem que a temperatura seja um possível fator desencadeante do processo. No entanto, há evidências indiretas, já que a umidade relativa no interior dos tubos ou nas placas é afetada pela temperatura do ambiente. Esse fator favorece a condensação do vapor de água nas paredes dos tubos ou das placas, por isso alguns autores têm aumentado a concentração do ágar a fim de diminuir a vaporização da água (DEBERGH et al., 1981).

Da mesma forma que ocorre com a temperatura, tampouco existem evidências fortes de que os radicais livres atuem como estimulantes desse processo, embora seja possível suspeitar de sua participação. Essa suposição existe porque a vitrificação é um desarranjo metabólico e, em decorrência disso, é possível que os elétrons da fotólise da água, em vez de serem encaminhados para os fotossistemas I e ll, saiam dos “trilhos” e estimulem a formação de superóxido (O.2). Consequentemente, isso afetaria a estrutura normal das células – suas membranas celulares, a síntese de clorofila, a estrutura enzimática, etc. E esses sintomas são todos característicos da vitrificação.

Variação somaclonal

A cultura de tecidos oferece diferentes modalidades de metodologias, tais como: indução de calos, indução de gemas adventícias, células em suspensão, cultura de protoplastos, etc. Porém, em todas essas modalidades, existe o risco de ocorrer variação genética nas células ou nas plantas regeneradas. Tal fenômeno, na literatura sobre cultura de tecidos, denomina-se variação somaclonal. O termo somaclone exprime a ideia de qualquer planta originada sob condições in vitro (LARKIN; SCOWCROFT, 1981). O termo mutação é utilizado quando a causa dessa variação é conhecida e hereditária. Quando a causa não está determinada ou não é conhecida, o termo variante é usado.

Além disso, pode ocorrer a variação fenotípica, mas esta pode não ser hereditária, se a transmissão não acontecer durante a meiose. Nesse caso, trata-se de uma variação de natureza transitória, denominada variação epigenética. Uma possível causa relacionada a esse fenômeno é a metilação do DNA no nível de 5-metil deoxicitosina (5-mdC), que pode ocorrer pela influência de alguns fatores (ambiente, idade da cultura in vitro, etc.), bem como pela ação da variação somaclonal no genoma da planta (VALLEDOR et al., 2007).

A variação somaclonal induzida ou espontânea deve ser rastreada em várias gerações das plantas propagadas por sementes, a partir de R0 (planta obtida in vitro), e deve continuar em R1, R2, R3, seja em casa de vegetação seja em campo. Se, já na R1, não existir mais tal variação, conclui-se que se trata de uma variação epigenética. Por exemplo, por uma questão de microambiente, uma planta in vitro (R0) pode conter diferentes números e formas de estômatos, de espessura de cutícula, de morfologia, etc.; porém, se depois, na casa de vegetação, esses fatores se estabilizarem, trata-se de um fenômeno epigenético. Somando-se a isso, no que diz respeito à não manutenção de uma característica na geração R1, pode-se afirmar que a autopolinização de R0, ou seja, o processo sexual, serve como peneira (screening) contra a variação somaclonal, oferecendo, assim, uma resistência à mudança em virtude de uma homeostase gênica (CUSTERS et al., 1990).

A variação genética ou somaclonal ocorre menos frequentemente quando as plantas obtidas são originadas de gemas nodais ou axilares. No entanto, o risco aumenta quando as plantas são adventícias, ou seja, originam-se por meio de calo, de suspensão celular, de protoplastos e de embriogênese somática. Não se trata, porém, de um fenômeno previsível. Em Pisum sativum, por exemplo, a análise de calos de quatro genótipos, após 45 dias, mostrou uma altíssima proporção de calos diploides em relação aos triploides, tetraploides, octoploides e aneuploides, e parte da explicação relacionada com essa variação foi atribuída aos reguladores de crescimento (KUMAR; MATHUR, 2004). Ademais, calos haploides de gérbera (Gerbera jamesonii) oriundos de óvulos foram capazes de regenerar majoritariamente plântulas haploides (80%), e, em menores proporções, plantas diploides (15%) e plantas mixoploides (4%) (MIYOSHI; ASAKURA, 1996).

Como mencionado anteriormente, a variação somaclonal existe, mas não é automática nem inevitável. Em Vitis vinifera, por exemplo, plantas regeneradas a partir de folhas via embriogênese somática apresentaram apenas 2,5% de variação somaclonal (tetraploides), sendo o restante diploide, conforme mostrou a contagem de cromossomos (KUSOVA et al., 1997).

Parece que o genótipo também tem sua importância, já que cultivares de uma mesma espécie – Dieffenbachia (Araceae) – apresentaram diferentes taxas de variação somaclonal (SHEN et al., 2007). A variabilidade do somaclone pode ter mais probabilidades de ocorrer se o explante não for inicialmente diploide. Sabe-se que, na planta, nem todos os tecidos são rigorosamente diploides. Por exemplo, o parênquima cortical da raiz ou mesmo as células da endoderme apresentam frequentemente tetraploidia ou octoploidia (STREET; ÖPIX, 1970). Ademais, é conhecida a natureza poliploide de cultivos agronomicamente importantes, como a batata, o trigo, a banana, a mandioca, a cana-de-açúcar, etc. Contudo, do ponto de vista da cultura de tecidos, tal característica (poliploidia) pode favorecer a instabilidade genética dos calos ou do material regenerado. Tal situação pode ser ainda mais agravada com o uso de altas concentrações de BAP, como, por exemplo, 22 µM ou 67 µM, mesmo que as plantas de banana tenham sido originadas de gemas apicais (SHEPHERD; SANTOS, 1996; GIMENEZ et al., 2001).

Em geral, os poliploides são originados de progenitores geneticamente diferentes. Mesmo assim, na agricultura, como já mencionado, existe uma gama ampla de poliploides. Apesar da grande quantidade de poliploides na agricultura, eles não são de fácil obtenção nem muito viáveis na natureza. Assim, algumas plântulas originadas de sementes em viveiros de Pinus elliottii apresentaram crescimento raquítico e baixa fertilidade em virtude de carregarem uma natural poliploidia (MERGEN, 1958). Com isso, observou-se que plantas poliploides não são de fácil equilíbrio ou balanço genético, ainda que sejam muito propensas à evolução dentro de uma população mendeliana, isto é, dentro de um grupo de indivíduos que habitam em uma mesma área geográfica e que se reproduzem entre si. Esse fato ocorre porque os mecanismos de impedimento ou as barreiras naturais em nível citológico (inibição do crescimento do tubo polínico, despareamento de cromossomos, etc.) tornam-se operantes, isolando o mutante de seu correspondente biótipo. É interessante observar que as angiospermas, em geral, apresentam mais tendência à poliploidia que as gimnospermas. Nestas últimas, esse fenômeno é raro (MERGEN, 1958).

Às vezes, nas células dos calos, especialmente após muito tempo de cultivo, acontece endorreduplicação seguida de mitose. Isso provoca a variação no número de cromossomos e, consequentemente, a formação de poliploides, ou seja, de células possuidoras de vários complementos cromossômicos: YY⇒YYYYYY (células triploides, tetraploides, octoploides, etc).

Na natureza, os poliploides podem ser autopoliploides ou alopoliploides. No primeiro caso, os indivíduos surgem por não redução meiótica na autofecundação. No segundo caso, por não redução meiótica no cruzamento interespecífico entre dois indivíduos com genomas diferentes. Na agricultura, são exemplos de poliploides (tetraploides): o café, derivado do cruzamento sem redução meiótica entre duas espécies; o amendoim; a alfafa; algumas espécies de banana, etc. São exemplos de alopoliploides naturais: a mandioca, o algodão, o fumo, a cana-de-açúcar, o trigo, a aveia, o morango, algumas espécies de bananas, etc. No laboratório, podem-se induzir artificialmente tetraploides por meio da colchicina, que inibe a formação do fuso acromático durante a anáfase e, consequentemente, promove a duplicação do número de cromossomos da célula (EECKHAUT et al., 2004; GU et al., 2005; EWALD et al., 2009).

No entanto, a poliploidia ou a aneuploidia (neste último caso, o indivíduo pode ser 2n + 1 ou 2n - 1) não são visivelmente notadas em calos. Além disso, quando produzidas, observa-se uma falta de correlação positiva entre poliploidia e/ou aneuploidia e o potencial organogênico, o que representa uma séria dificuldade para iniciar novos órgãos a partir do calo (STREET; ÖPIX, 1970; TAHA; FRANCIS, 1990).

Nem sempre a variação somaclonal pode acontecer por macrodesarranjos cromossômicos (quebra do cromossomo, inversão, aumentos nos complementos cromossômicos ou diminuição). Às vezes, a mutação pode ser bem mais pontual em nível de base do DNA. Por isso, esse fato pode refletir-se em nível de aminoácidos, e as células poderiam, então, ser deficitárias numa via metabólica, ou seja, não podem crescer num meio nutritivo básico porque a enzima de tal passo metabólico estaria alterada ou ausente. Trata-se de linhas de células auxotróficas, isto é, deficientes na síntese de um determinado metabólito. Porém, quando esse metabólito está presente no meio, a multiplicação celular é reiniciada.

A variação somaclonal tem dado origem a uma estratégia de seleção de mutantes. Nesse caso, as células que não sofreram mutação são seletivamente mortas, porque elas, pela sua necessidade de crescer e de se multiplicar, incorporariam algum ingrediente tóxico para elas. Por exemplo, se um análogo de aminoácido ou de base púrica fosse colocado deliberadamente no meio, as células auxotróficas detidas na sua multiplicação não absorveriam tal composto. As células auxotróficas então poderiam ser transferidas ou subcultivadas em outro meio que contenha a presença de determinado composto essencial para elas (aminoácido, vitamina, etc.).

Portanto, de acordo com a cultura de tecidos, seria possível obter mecanismos de manipulação de variação somaclonal visando a trabalhos em melhoramento de plantas, e não trabalhos de micropropagação, porque esta última é uma atividade conservativa. Baseando-se nesse ponto de vista, a cultura de tecidos pode ser uma eficaz aliada da genética. Como exemplo disso, é possível obter, via variação somaclonal, plantas de milho que contenham triptofano, que está normalmente ausente na zeína, proteína que representa cerca de 35% do total de proteínas do grão. Outro exemplo de como a variação somaclonal pode produzir impacto na agricultura diz respeito à diminuição ou à eliminação do período de frio, requerido pela cenoura para florir, o que facilitaria sua cultura em regiões mais tropicais.

Ainda dentro da linha de pesquisa da variação somaclonal no campo da cultura in vitro, progênies de Capsicum annum, oriundas de somaclones, foram avaliadas em relação a várias características, tais como: altura da planta, dias para florir, comprimento do fruto, peso de fruto, cor do fruto, número de sementes, etc. A maior variação foi encontrada na forma e na cor dos frutos, sugerindo desse modo que a variação somaclonal desse órgão poderia ser uma promissora linha de pesquisa, embora, para os melhoristas do ramo, isso talvez não fosse prioridade (ANU et al., 2004).

Uma linha de pesquisa a partir da variação somaclonal espontânea dentro do marco experimental da cultura in vitro pode ser muito demorada. Por isso, para que sejam obtidos mutantes por uma via mais rápida, costuma-se usar agentes mutagênicos, tais como etilmetanosulfonato (EMS), UV, raios X ou gama, para favorecer a indução de mutações (ARNOLD et al., 1998). Em Brassica napus, a resistência a Sclerotinia sclerotiorum foi induzida via EMS, e o ácido oxálico foi usado como repórter ou indicador da resistência dos calos obtidos (LIU et al., 2005).

É oportuno ressaltar que nem toda variação somaclonal é útil. Pode suceder que a variação esteja relacionada à forma ou à borda da folha, ao comprimento do pecíolo, etc. Além disso, nem toda variação é estável ou previsível. Pode-se afirmar ainda que nem toda variação genética dos somaclones está associada a um fenótipo. Em bananas, isso tem sido observado frequentemente no campo. Ademais, as diferenças nos padrões isoenzimáticos muitas vezes não têm estado associadas a mudanças morfológicas. Isso levanta a questão da necessidade de se detectar com mais propriedade a variação somaclonal (KLERK, 1990). Tal necessidade provém do fato de que esse fenômeno gera muita expectativa dentro da cultura de tecidos quando a palavra de ordem é melhoramento (breeding), especialmente em culturas altamente heterozigóticas, vinculadas a programas de melhoramento, os quais visam melhorar a resistência, como no caso de Fusarium oxysporum (THAKUR et al. 2002), a produtividade ou o colorido das flores (CHEN; HENNY, 2006).

Referências

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Capítulo 3

Embriogênese somática

Miguel Jordan Zimmermannn

Definição, usos e limitações

A embriogênese somática (ES) é um exemplo substancial da totipotencialidade da célula vegetal que pode implicar na regeneração de uma planta inteira. Algumas células somáticas podem tornar-se embriões e desenvolver-se normalmente. Em outras palavras, corresponde ao início da formação do embrião e ao seu desenvolvimento a partir de células diferentes dos gametas que formam o zigoto em um processo de reprodução normal. Por causa desse potencial, as células vegetais podem ser utilizadas em cultivo in vitro, o que permite a reprodução massiva de muitas espécies de plantas com vistas em sua conservação, desde que suas características genéticas sejam respeitadas. Outras aplicações estão relacionadas com o saneamento, a reprodução de plantas elites providas de programas de melhoramento genético e a reprodução de plantas transgênicas únicas constituídas por produtos de transformação advindos da engenharia genética.

O conhecimento dos requisitos necessários para o cultivo in vitro, juntamente com as adaptações metodológicas, permite cultivar células em biorreatores com produção automatizada, e praticamente indefinida, de numerosas espécies de plantas, bem como a obtenção de produtos de seu metabolismo (IBARAKI; KURATA, 2001). Ao mesmo tempo, é possível conservar esse material mediante a criopreservação com a subsequente criação de bancos de genes (GROUT; ROBERTS, 1995; WANG et al., 2004). Além disso, os embriões maduros podem ser armazenados e encapsulados em compostos como alginato, o que conduze à geração de sementes sintéticas (REDENBAUGH, 1993; REDENBAUGH et al., 1988). Assim, o modelo que embasa o entendimento do desenvolvimento embriogênico é uma poderosa ferramenta para a multiplicação e a geração de um grande número de indivíduos geneticamente iguais.

Os primeiros resultados sobre a regeneração de embriões somáticos foram escritos por Reinert (1958) e Steward et al. (1958), os quais utilizaram tecidos de cenoura (Daucus carota). Esse é um modelo experimental ainda muito utilizado por sua alta eficiência, além de já ter sido estabelecido para um grande número de espécies herbáceas e lenhosas. Os embriões são estruturas bipolares que contam com seus meristemas caulinares e radiculares e, por sua vez, manifestam um sistema vascular fechado. Isso significa que ele não está associado ou conectado com células basais nas quais estão assentados. Esse é o caso dos brotos produzidos por organogênese (HACCIUS, 1978). Além do mais, as proteínas específicas encontradas nos cotilédones de embriões são diferentes das existentes nos brotos, mesmo tendo sido originados do mesmo tecido (CROUCH, 1982). Entretanto, com relação aos embriões zigóticos devem-se citar algumas particularidades do sistema de geração de embriões somáticos conduzidos in vitro:

A indução da ES pode dar-se em diversos tecidos e órgãos da planta; obviamente, cada órgão representa um potencial morfogênico particular que está presente em seus explantes, o qual é afetado pelos seguintes aspectos: genótipo, grau e retenção da juvenilidade versus amadurecimento; determinação existente nos meristemas; metabolismo oxidativo; condição fisiológica estacional do material; estabilidade genética; deterioração clonal; entre vários outros a serem considerados (BONGA, 1982).

Em larga escala, como no caso dos biorreatores, é produzida uma grande variabilidade morfológica de embriões somáticos dentro de uma mesma população, em virtude de problemas de sincronização, tais como heterogeneidade entre as plântulas, manifestação da variação clonal e possíveis problemas em viveiro (BARRY-ETIENNE et al., 2002). Em resumo, várias considerações, além das mencionadas acima, devem ser levadas em consideração as quais podem limitar severamente a eficiência do processo em razão da formação de anormalidades morfológicas das plantas e aspectos advindos do desenvolvimento e da aclimatização posterior dos embriões no viveiro.

O processo indutivo, que parte de uma única célula somática (ou, em alguns casos, de uma célula gamética denominada androgênese), implica o uso de células totipotentes, as quais, durante sua desdiferenciação, assumem uma rediferenciação ao responderem mediante um estímulo, e ganham com isso a condição de “competentes”. Competente implica uma condição endógena permissiva para chegar a constituir uma célula em um embrião somático.

Embriões somáticos desenvolvidos não apresentam, em geral, uma fase de amadurecimento e/ou de dessecação imposta, como ocorre com embriões zigóticos que podem germinar prematuramente. Anatomicamente, a ES diferencia-se dos embriões zigóticos, pois esses não evidenciam diferenciação de endosperma. Além disso, há falta do desenvolvimento do suspensor salvo, a menos que se considerem umas poucas células vacuoladas como resultado de uma divisão inicial de uma célula somática (DODEMAN et al., 1997; QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006). As células vacuoladas somente se colorem com Evans Blue, diferentemente do conjunto pró-embrionário globular, que adquire coloração vermelha com acetocarmin (DURZAN, 1988; GUPTA; DURZAN, 1987), que é indicativo de uma ativa síntese de RNA (SANTACRUZ RUVULCABA et al., 1998).

O fenômeno da ES, sob condições indutoras in vitro, produz as mesmas etapas de desenvolvimento dos embriões zigóticos como, por exemplo, os estágios de desenvolvimento globular, de coração, e de torpedo; constituindo mais tarde um estado de amadurecimento ou cotiledonar em dicotiledôneas. Esses processos são sequenciais e muito similares ao que acontece in vivo durante a indução dos embriões zigóticos na planta, visto que parece evidente que, não somente o zigoto como também um conjunto de diferentes células somáticas, sendo competentes, podem empreender uma mesma ação sob condições ambientais artificiais, como possuir e expressar, em comum, programas genéticos intrínsecos que conduzem à formação de um embrião (ZIMMERMANN, 1993). Apesar do que foi dito anteriormente, recentemente, tem-se assumido que o dito potencial é limitado a um número reduzido de células capazes de formar embriões somáticos (VOGEL, 2005), e que, além disso, sua frequência é extremamente variável entre as espécies. Isso depende, em parte, da idade do explante, da sazonalidade, do genótipo, mas também de requerimentos específicos como composição, nível nutricional, agente gelificantes e fitorreguladores presentes nos meios de cultivo (LITZ; GRAY, 1992; MOLINA et al., 2002).

Fases e formas no desenvolvimento de embriões somáticos

Van Arnold et al. (2002) descreveram cinco etapas que circunscrevem o processo, a saber:

[...] a) iniciação de cultivos embriogênicos, que implica o cultivo de um tecido primário em um meio que contém reguladores de crescimento, principalmente do tipo ‘auxina’, mas também citocininas. b) proliferação de cultivos embriogênicos, geralmente realizada em meios sólidos ou líquidos, igualmente suplementados com reguladores de crescimento; c) pré-amadurecimento de embriões somáticos, realizada em meio sem reguladores de crescimento com o objetivo de inibir a proliferação e estimular a formação do embrião com início do desenvolvimento precoce; d) amadurecimento dos embriões somáticos, que se realiza mediante cultivo em meio suplementado com AAB (ácido abscísico) e/ou sob reduzido potencial osmótico e, e) desenvolvimento de plântulas, que ocorre na ausência de reguladores de crescimento. (VAN ARNOLD et al., 2002).

Em termos temporais, considerando-se o modelo de cenoura (Daucus carota), que é uma das espécies mais estudadas, o processo da embriogênese inicia-se com a formação de um calo, que pode ocorrer em um período de 2 a 3 meses. Em continuidade, as células que são advindas desse calo podem ser subcultivadas seguidamente em meio líquido, na presença de 2,4-D, em suspensão, e, posteriormente, elas são transferidas para um meio fresco sem reguladores. Nessas condições, embriões globulares deveriam ser visualizados após uma semana, e os estágios que necessitam de um maior desenvolvimento (coração e torpedo) somente podem ser distinguidos a partir de 2 ou 3 semanas de cultivo (Figura 1). As condições de cultivo, apesar de mais conhecidas, têm igual e grande relevância, visto que, por um lado, os reguladores de crescimento são consumidos e, por outro lado, o metabolismo celular implica grandes variações de pH no meio. Normalmente, em cenoura, observa-se que os pHs que se mantêm altos retêm a sequência do desenvolvimento embrionário estabelecida em relação a meios com pHs ácidos, os quais mantêm, ao contrário, as células em estágios proliferativos (SMITH; KRIKORIAN, 1990). Muitas são as referências sobre os requerimentos de cultivo e de meios nutritivos que utilizam meios básicos, tais como: Murashige e Skoog (1962), Nitsch (1969), Gamborg et al. (1968), entre outros. Em Reinert e Yeoman (1982), é possível obter um manual geral de laboratório que se refere à metodologia e a meios de cultivo.

Figura 1. Vários estágios de desenvolvimento de embriões somáticos de Carica pubescens do tipo globular, coração e torpedo.

Foto: Miguel Jordan Zimmermann

Existem dois tipos de ES in vitro: direta e indireta. A forma direta (ESD) implica a existência de células somáticas competentes e/ou pré-embrionárias que são capazes de empreender a via embriogênica do explante primário, podendo constituir-se em embriões com pouca reprogramação em relação à modalidade indireta (ESI). A ESI derivada de células de um órgão implica, por sua vez, em sucessivas desdiferenciações celulares e em reorganização da sua fisiologia, de seu metabolismo e de sua expressão gênica na constituição do embrião. Experimentalmente, a ESI ocorre em duas grandes etapas. Na primeira fase, somente células competentes podem crescer em meios apropriados, os quais, normalmente, estão suplementados por hormônios do tipo “auxinas”; com os quais se formam centros embriogênicos. Em outras palavras, implica inicialmente em uma indução que tem como objetivo alcançar um switching, a fim de modificar sua competência para a expressão de embriões, passando então previamente por uma fase não organizada e proliferativa de células indiferenciadas (calo), sob uma condição que derivará em centros embriogênicos. Essas porções podem distinguir-se por uma síntese polarizada de DNA (KOMAMINE et al., 2005). Em uma segunda fase, os centros embriogênicos se proliferam de forma lenta, normalmente em meios sem hormônios, e continuam com divisões celulares sucessivas em distintas zonas do centro embriogênico, as quais conduzem finalmente à formação de embriões cujos estádios são: globular, de coração e torpedo. Finalizado o estágio de torpedo, inicia-se uma fase de amadurecimento, na qual, posteriormente, os embriões tipicamente “germinam” (Figura 2) e dão origem a uma “plântula” (AMMIRATO, 1983). Finalmente, é possível definir, além disso, um tipo denominado de embriogênese somática secundária (ESS) que consiste na formação, geralmente direta, de novos embriões somáticos iniciados a partir de outros embriões gerados anteriormente (Figura 3), os quais, em geral, se forem utilizados na fase de embriogênese primária, podem ou não requerer reguladores (JORDAN; VELOZO, 1996). Esse fenômeno ocorre frequentemente em muitas espécies (em cítricos, em café e em outros cultivos), e inicia-se a partir de diversos tecidos e órgãos, tais como óvulos, integumentos, células epidérmicas, pecíolos, entre outros.

Figura 2. Germinação de embrião de C. pubescens no estágio cotiledonar.

Foto: Miguel Jordan Zimmermann

Figura 3. Embriogênese secundária em C. pubescens.

Foto: Miguel Jordan Zimmermann

Características de células somáticas embriogênicas e embriões

As características estruturais que representam as células somáticas embriogênicas são relativamente mais simples e muito mais conhecidas do que a definição dos parâmetros moleculares que as constituem, os quais são até hoje muito pouco conhecidos. O estudo das formas precoces tem sido facilitado mediante técnicas especiais de detecção, como imagens digitalizadas de contorno, biovolume, perímetro e área de projeção embrionária, que permitem distinguir entre os diferentes estágios de desenvolvimento dos embriões. Além disso, possibilitam sua separação de forma (CHI et al., 1994, 1996; VITS et al., 1992; ZHANG et al., 1996).

Estruturalmente, as células embriogênicas são pequenas, esféricas e agregadas, contêm um denso citoplasma e vacúolos pequenos, e/ou contêm poucos vacúolos, núcleos grandes com abundantes organelas e paredes celulares grossas (ALY et al., 2002; FEHÉR et al., 2002; HALPERIN, 1970; HALPERIN; JENSEN, 1967; NOMURA; KOMAMINE, 1985). As células embriogênicas mostram, em geral, acúmulo de amido e forte coloração com azul de toluidina, o que indica um alto teor de proteínas (PASTERNAK et al., 2002; YEUNG, 1995). Além disso, em alguns casos, podem evidenciar “fenolização”, tornando-se de cor escura como no caso de Coffea arabica (QUIROZ FIGUEROA et al., 2006). A fase anterior de sua formação correspondeu a células com grandes vacúolos que empreenderam uma divisão celular desigual (JONG et al., 1993) dando origem, assim, a uma célula embriogênica, com citoplasma mais denso e/ou núcleo proeminente, e a outra parenquimática. A divisão desigual indicada seria explicada pelo condicionamento de um padrão eixo apical-basal polar posterior, com uma expressão gênica específica e diferente que controlaria a manutenção da polaridade do embrião semelhante ao controle na formação dos futuros meristemas apical e da raiz (TAIZ; ZEIGER, 2006). Os embriões somáticos denotam bipolaridade, assim como os embriões zigóticos, ao possuir um polo radical e caulinar que dá origem a ambos os órgãos ainda em condições in vitro. A polaridade deve ser normalmente mantida e, em parte, com a eliminação e/ou redução de 2,4-D do meio depois do estado pré-globular, bem como com o aumento do estímulo elétrico polar, favorece-se a embriogênese (FEHÉR et al., 2003). Ademais, com o estabelecimento da polaridade, permite-se ainda o fluxo de auxina na direção ao pólo radical pela presença de carreadores do tipo PIN1 (GELDNER et al., 2001; TAIZ; ZEIGER, 2006). Para a condição polar embrional, postulou-se, além disso, a presença e a distribuição de canais de cálcio (PETITPREZ et al., 2005; VALLEE, 1997).

Fatores que controlam ou afetam a morfogênese da ES

Precondicionamento

Sem corresponder a um fator limitante, o cultivo preliminar do tecido ou do órgão materno, antes de proceder à sua extração e ao cultivo do explante definitivo, parece promover a resposta indutiva e morfogênica posterior. O explante definitivo aparentemente se estabelece pela via da “competência” morfogênica. Por meio do precondicionamento, é possível que ocorra uma resposta de brotação dos explantes que pode resultar, por sua vez, em um rejuvenescimento. Assim, foi observado que esse material pode gerar um calo embriogênico competente (LITZ, 1988). Além disso, essa competência é induzida em órgãos que antes não expressavam essa condição. O precondicionamento parece imprimir um efeito integral que envolve vários fatores, incluindo a qualidade de luz, as características do meio nutritivo e de fitormônios sobre o explante (LITZ, 1988; LITZ; GRAY, 1992). Para o café (Coffea arabica), o precondicionamento efetivamente otimiza a ES (SONDAHL; SHARP, 1977).

Estresse

Para a indução do processo, seja em monocotiledôneas seja em dicotiledôneas, considerou-se necessário que exista uma série de fatores, que corresponde a uma situação de estresse celular, uma condição geral que pode ocorrer por diversos fatores que envolvem a condição das células em cultivo, bem como todas as condições de cultivo in vitro. O estresse resulta em dano celular na extração do explante. A inserção do explante em um meio de cultivo diferente da planta mãe e a alta concentração de alguns sais levam a um estresse osmótico. A indução de mudanças endógenas do nível hormonal de auxinas e citocininas, sem considerar a demanda ou presença de hormônios próprios, podem provocar diversas reações particulares. Por exemplo, Smith e Krikorian (1990) conseguiram induzir a ES a partir de embriões zigóticos danificados, em meios nutritivos livres de hormônios, somente com a aplicação de NH4 como única fonte de nitrogênio. Ademais, em um meio livre de auxina, o peróxido de hidrogênio (H2O2) aparece como o fator causal da indução da ES em calos de Lycium barbarum, em que se detectou, além disso, a presença de novas proteínas (entre 35~55 kDa). Ambas as respostas podiam, por sua vez, ser revertidas mediante aplicação de cicloheximida e actinomicina D (KAIRONG et al., 2002). Adicionalmente, a presença de vários íons de metais pesados (CoCl2, NiCl2, ZnCl2, e CdCl2) também pode levar a uma indução da ES (KIYOSUE et al., 1990). Recentemente, Katou et al. (2007) demonstraram que, frente a um dano mecânico ou ferida, é induzida uma fosfatase MAPK que se liga à calmodulina (CaM) – uma proteína que liga cálcio – que, por sua vez, regula as atividades de outras cinases em regiões danificadas, além de intervir na produção do processo embriogênico (ANIL; RAO, 2000; JANSEN et al., 1990; PERERA; ZIELINSKI, 1992; SANDERS et al., 1999). O cálcio, por sua vez, afeta os canais de K+, e isso aparentemente poderia provocar uma adaptação das células diante dos altos níveis de Na+ (KASUKABE et al., 2006), uma condição que ocorre durante o processo de desinfestação do material, em que usualmente é utilizado hipoclorito de Na. As poliaminas também poderiam ter um efeito antiestresse, com um papel protetor em face da salinidade que afeta a membrana plasmática (ROY et al., 2005). Adicionalmente, as poliaminas induzem rapidamente a formação de óxido nítrico ou ON (TUN et al., 2006), que pode ativar vários efeitos, entre os quais o de ser citoprotetor em vez de tóxico, uma vez que atua como antioxidante, prevenindo, assim, a morte celular programada (PCD). Por sua vez, a presença de sinais de ON nas plantas poderia implicar também a ativação de proteínas cinases e de outras enzimas por meio da indução intracelular de cálcio (DE STEFANO et al., 2006; NEILL et al., 2006). Recentemente, foi descrito que, em tabaco, as lesões causam uma rápida ativação de várias proteínas cinases, a saber: proteínas cinases ativadas pelo mitógeno MAPKs; proteínas cinases relacionadas com lesão (Wounding protein kinases – WIPK); proteínas cinases ativadas por ácido salicílico (SIPK), que afeta níveis de ácido jasmônico e de ácido salicílico (SEO et al., 2007); hormônios que também poderiam estar relacionados com as repostas indutivas da ES, pelo fato de estimularem a síntese de H2O2 e/ou afetar os níveis de etileno, os quais também podem promover ou inibir o processo (LAMB; DIXON, 1997; QUIROZ FIGUEROA et al., 2006).

Reguladores de crescimento

O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é o principal e mais eficiente regulador sintético indutor da ES descrito na literatura. Deve ser utilizado por tempo indutivo determinado, que varia de 3 a 7 dias, de acordo com a espécie, e, logo após, retirado do meio de cultivo, na presença ou não de outros reguladores. Sua função primordial é a de induzir a ES. Além disso, tem o papel de produzir um aumento dos níveis endógenos de auxina, ou seja, do ácido indolacético (PASTERNAK et al., 2002). Também conduz a funções do tipo fosforilação, que serão indicadas mais adiante.

Hormônios do tipo auxina são essenciais para que se alcance a fase de formação de massas celulares proembriônicas (PEMS), bem como a de transição de proembriões do estado globular para o de coração. As auxinas levam à síntese de novos produtos gênicos, ainda não estabelecidos na fase anterior. Aparentemente, a partir da primeira divisão assimétrica que conduz a uma condição polar, a presença de auxinas nessa fase é fundamental para mediar um transporte polar e para síntese de DNA (FUJIMURA; KOMAMINE, 1980). Juntamente com a demanda por auxinas, ressalta-se igualmente a importância da presença de citocininas (BAP ou TDZ) combinadas ou seguidas com auxinas. Por exemplo, em arroz, que não mostrava respostas depois da aplicação de 2,4-D, a adição posterior de TDZ e/ou BA permitiu tanto a formação de embriões somáticos como também a de brotos (GAIRI; RASHID, 2004). Similarmente, a citocinina 4-CPPU, N-(2-cloro-4-piridil)-N´-fenilureia, aparece como indutora da ES e é administrada em uma larga faixa de concentrações (FIORE et al., 2002). Além disso, vários derivados da difenilureia também podem induzir a ES em citros, alguns com maior eficiência do que em BAP (CARRA et al., 2007).

Em geral, as células mais novas, além de serem as mais competentes, são também as mais sensíveis à aplicação de auxinas exógenas. Mesmo que as auxinas sejam requeridas durante a proliferação das massas de células proembriogênicas (derivadas de calos embriogênicos), nem sempre a sua presença é indispensável para o desenvolvimento de embriões somáticos como já foi demonstrado em cenoura (VRIES et al., 1988a). A função precoce da auxina é aparentemente a de reprogramar o desenvolvimento das células que irão produzir a embriogênese assexuada (DUDITS et al., 1991), de maneira que se manifeste a expressão de células não organizadas (DUDITS et al., 1995). Grosset et al. (1990), Pasternak et al. (2002) e Fehér et al. (2003) indicam que a presença de fitormônios pode ativar um processo de fosforilação atribuído a proteínas cinases (MAPK), as quais, em conjunto, conduzem tanto a uma resposta de diferenciação, como a um efeito em nível de pós-indução do embrião somático (ROITSCH, 1999; HIRT, 2000). Durante o desenvolvimento dos embriões somáticos, observou-se também um incremento da atividade da N-acetilglutamato cinase (NAGK) – uma enzima do ciclo da ornitina – que está relacionada ao aumento de alguns aminoácidos, como arginina, glutamina e glutamato, nos estágios globular e de torpedo (LOHMEIER; VOGEL et al., 2005).

Além disso, foram relatadas também respostas embriogênicas sem a presença de hormônios, apesar de estarem relacionadas à inclusão de sacarose ou de compostos que induzem estresse osmótico ao meio (KAMADA et al., 1993), condição essa que conduz geralmente à ESD. O AAB também tem sido considerado um hormônio indutor da ES pelo fato de iniciar o processo de formação embrionária pré-globular em células de cenoura (NISHIWAKI et al., 2000) e em Nicotiana plumbaginifolia (SENGER et al., 2001). Em cenoura, a deficiência do hormônio provocou malformações, enquanto sua adição posterior reverteu o processo embriogênico para a normalidade (NISHIWAKI et al., 2000). Ademais, existe maior evidência com respeito ao requerimento do AAB na fase final de amadurecimento do embrião somático, apesar do requerimento osmótico. Por isso, devem-se empregar altas concentrações de sacarose, maltose, dextranas ou polietilenoglicol (PEG), a fim de aumentar o potencial osmótico, satisfazendo, assim, a demanda por estresse hídrico (GUTIERREZ-PESCE; RUGINI, 2004; LECOUTEUX et al., 1993; STRICKLAND et al., 1987).

Aparentemente, o grupo das coníferas requer concentrações muito mais altas de AAB do que as angiospermas: cerca de 15 mg L-1 (Informação verbal)1. Com o amadurecimento, o nível de AAB nos cotilédones aumenta por causa do armazenamento de compostos de reserva. Assim, a germinação é reprimida, o que leva a tolerância à dessecação (THOMAS, 1993), que, pela produção de proteínas do tipo LEA geradas pela presença de AAB e pela expressão de genes induzidos por estresse hídrico (DODEMAN et al., 1997), conduzem os embriões a um certo estado de inatividade metabólica mesmo que esse não seja o caso para todas as espécies. Segundo Anandarajah e McKersie (1990), um incremento de sacarose no meio também aumenta o vigor dos embriões somáticos. Em alguns casos, a glutamina também parece favorecer a síntese de proteínas de armazenamento dos embriões somáticos durante o processo da dessecação (LAI et al., 1992). Finalmente, para possibilitar uma rápida germinação durante a fase final do desenvolvimento de torpedo dos embriões somáticos, a aplicação de reguladores de crescimento é geralmente requerida, uma vez que existem trabalhos, por exemplo, mostrando o uso de GA3 (ZLENKO et al., 2002). Em coníferas é frequente o uso da glutamina e do hidrolisado de caseína.

As poliaminas (putrescina, cadaverina, espermidina e espermina) são outros compostos de possível ação hormonal, os quais têm sido indicados pelo fato de estimularem a ES na presença de outros hormônios (KAKKAR; SAWHNEY, 2002; KEVERS et al., 2002; LI; BURRIT, 2003). Entre elas, a putrescina aparece como tendo maior relevância em algumas espécies (BASTOLA; MINOCHA, 1995; SAKHANOKHO et al., 2005). As poliaminas têm dois ou mais grupos amino primários que atuam como fatores de crescimento em células eucarióticas. Sua função não está totalmente esclarecida, mas assume-se que está relacionada com sinais de transdução, como o fluxo de cálcio (THOMAS et al., 1993), com proteína cinase (DATTA et al., 1987) e também com reguladores de crescimento (TONON et al., 2001). Para algumas poliaminas, em especial a espermidina, tem-se atribuído também um papel antiestresse, que protege do efeito de salinidade tanto a membrana plasmática quanto a H-ATPase ligada a ela (ROY et al., 2005). Isso pode ocorrer no final do processo na fase de dessecação. Paralelamente, como se indicou antes, o AAB acumula-se nos embriões zigóticos sob condições normais e provocam um efeito de dessecação (ATTREE et al., 1995). O AAB participa da última fase de formação do embrião, ou seja, da maturação, por meio da produção de proteínas do tipo LEA. Além disso, ele suprime a formação de embriões secundários e aberrantes, sincroniza o cultivo e impede a germinação precoce (AMMIRATO, 1983). Recentemente, Steiner et al. (2007) relataram que, em Araucaria angustifolia, as poliaminas por si só favorecem o crescimento de embriões somáticos e, ao mesmo tempo, a putrescina e a espermidina induzem um aumento dos níveis endógenos de AIA e de AAB.

Genes e proteínas

Na maioria das espécies estudadas, muitos são os tipos de células que podem chegar a ser embriogênicas. Isso depende da sua capacidade de reprogramar a expressão gênica (competentes) para assumirem diferentes mudanças estruturais semelhantes aos embriões zigóticos, em meios de cultivo sob determinadas condições in vitro. Esse dado diz respeito aos programas e aos graus de diferenciação celular em plantas (SULTAN, 2000). Durante a indução da ES e, em cada um dos diferentes estágios de diferenciação embriogênicos (globular, estado de coração e de torpedo), a expressão gênica também varia, e esse é o padrão presente durante o processo de desenvolvimento completo da planta (ZIMMERMANN, 1993). Entretanto, deve-se considerar também que, em cada fase do estágio do desenvolvimento embriogênico, junto à síntese de novas proteínas, ocorre, da mesma maneira, a eliminação de polipeptídios de estágios anteriores, os quais, nesse momento, são desnecessários (SALLANDROUZE et al., 1999). Aparentemente, a transição da condição somática para a embriogênese implica, em maior escala, o silenciamento de genes quando comparada a sua atividade ou expressão (QUIROZ FIGUEROA et al., 2002).

Durante todo o processo de embriogênese, recapitula-se uma diferente expressão de genes, em que são ativadas mudanças complexas, em nível estrutural, semelhantes àquelas encontradas nos processos de formação dos embriões zigóticos normais in vivo, tais como a síntese de novos mRNA e proteínas. Vários genes que são ativados e/ou expressos durante as diferentes etapas do processo da ES têm sido recentemente caracterizados e comparados aos fenômenos que ocorrem nas células não embriogênicas. Além disso, a expressão de uma série de genes vinculados à divisão celular e à formação de membranas e de parede celular tem sido caracterizada. De igual modo, os efeitos causados por mudanças e/ou gradientes de metilação do DNA (ativados pela presença de fitormônios) são específicos para o desenvolvimento da ES. Particularmente, as auxinas naturais e sintéticas afetam fortemente o nível da 5-metil-citosina no DNA em células de cenoura, enquanto a aplicação de drogas específicas, que induzem a hipometilação, inibe a ES (LO SCHIAVO et al., 1989). Parece ainda que certo grau de metilação no DNA (SANTOS; FEVEREIRO, 2002), bem como a alteração nos níveis de fenóis solúveis de proteínas e a atividade de peroxidases na parede celular estão associados à indução da resposta embriogênica (CAUSEVIC et al., 2005). No entanto, nem para o evento inicial, vinculado à desdiferenciação celular é conhecido claramente o papel da expressão de genes específicos, uma vez que vários produtos codificados pelos genes expressos correspondem a proteínas com diversas funções. Apesar disso, recentemente foi descrito um gene de expressão muito precoce, o C-ESE1 (Carrot Early Somatic Embryogenesis), que ocorre nas células primordiais do embrião somático após a retirada do fitormônio (2,4-D) do meio. O C-ESE1 codifica uma proteína com domínios de aglutinina e o lócus de glico-proteínas, os quais se encontram associados com a deposição de novos polissacarídeos nas paredes a serem formadas nas células embriogênicas, assumindo um papel de associação/comunicação célula-célula (TAKAHATA et al., 2004). Esses genes expressos, possivelmente ligados a oligossacarídeos, além de serem derivados da hidrólise de paredes celulares, poderiam também atuar na regulação da ES (MALINOWSKI; FILIPECKI, 2002).

Entre as principais enzimas, distingue-se a SERK, uma proteína cinase receptora que contém domínios ricos em leucina (LRR) e cuja expressão está relacionada à interação com outras moléculas sinalizadoras (HECHT et al., 2001), determinando assim a condição de células competentes no processo da ES (FEHÉR et al., 2003; NOLAN et al., 2003; SCHMIDT et al., 1997). Observou-se que, em Daucus carota e em Dactilys glomerata, a única célula capaz de expressar o gene SERK possui a habilidade de gerar um embrião somático (SCHMIDT et al., 1997; SOMLEVA et al., 2000). Segundo Thomas et al. (2004), transcritos do gene SERK foram observados em girassol muito precocemente durante os primeiros dois dias de cultivo, e estão diretamente associados ao desenvolvimento da competência para a iniciação da ES. Em Ocotea, a expressão de SERK se evidencia depois de 7 dias de cultivo em agregados celulares que resultam em embriogênicos quando são tratados com 2,4-D, mas não se expressa em células não tratadas com esse regulador, as quais tampouco derivam em embriogênicas (SANTA CATARINA et al., 2004). Igualmente, uma alta expressão de SERK foi observada em calo embriogênico de cacau (Theobroma cacao) em seus estados iniciais. A diferença está também no fato de que foram observados sinais mais fracos, ou ausência de sinal, em outros órgãos (SANTOS et al., 2005). A adição de auxinas e de citocininas, além de favorecer a transcrição de SERK, conduz a uma maior e complexa expressão de outros genes pela presença de diversos mRNAs. Outras proteínas descritas são: as proteínas associadas à parede, as relacionadas com patógenos, as do tipo heat-shock do tipo globulinas, as histonas, as proteínas ribossomais e, no final da fase de desenvolvimento, aquelas relacionadas ao armazenamento, juntamente com outras proteínas embriogênicas (ECP31), as quais estão associadas à dessecação e à tolerância à dessecação do embrião, como é o caso das proteínas do tipo LEA (late embryogenesis abundant proteins) (BABU et al., 2007; KIYOSUE et al., 1992) indicam que as proteínas do gene HVA1, relacionado ao grupo das proteínas LEA, conferem tolerância à desidratação em arroz e protegem a membrana plasmática. De igual forma, o gene C-LEC1 em cenoura também está vinculado ao amadurecimento nos embriões somáticos e zigóticos (YAZAWA, 2004). Entre outras proteínas detectadas, pode-se mencionar as de transferência de lipídeos (LPT), que possuem função de transporte de fosfolipídios para várias organelas (KADER, 1996). Essas proteínas estão relacionadas igualmente às defesas, à adaptação ao estresse hídrico e, além disso, à regulação da expansão celular (DODEMAN et al., 1997), que ocorre por efeito do grupo de alérgenos de pólen relacionados tanto a proteínas do tipo expansinas (COSGROVE et al, 1997) quanto à síntese e à deposição de calose (DUBOIS et al., 1990). Vários outros fatores estão vinculados ao desenvolvimento normal do embrião, os quais medeiam sinais de transdução durante a morfogênese. Podem ser citados, por exemplo, em primeiro lugar, o Ca2+ vacuolar e a calmodulina; a deficiência de Ca2+ provoca clara inibição da ES (ANIL; RAO, 2000; JANSEN et al., 1990; PERERA; ZIELINSKI, 1992; SANDERS et al., 1999). Segundo Mahalakshmi et al. (2007), a resposta indutiva de 2,4-D sobre a ES em Triticum aestivum parece ser mediada por cálcio, dado que aplicações com quelantes sequestradores inibem essa resposta. Esses autores indicam, além disso, uma expressão variável de três genes regulados por cálcio, entre os quais a proteína cinase dependente de calmodulina, a proteína cinase dependente de cálcio e, provavelmente, a proteína ligante de cálcio durante o processo.

Compostos extracelulares excretados para o meio de cultivo

Várias proteínas, além de arabinogalactanas (AGPs), têm sido relacionadas à interação planta-patógeno e à degradação de calose durante o desenvolvimento (CHAPMAN et al., 2000). As AGPs possuem um alto conteúdo de polissacarídeos (aproximadamente 90% w/w), em que domina a galactose, a arabinose e, em menor escala, o ácido glucurônico, junto a uma pequena porção proteica, correspondente a 10% w/w (CLASSEN, 2007). Estão presentes em membranas e em paredes celulares, e aparecem expressando-se amplamente na etapa transitória do estado de torpedo e, por isso, são essenciais para a ES de cenoura. Sua particularidade é o fato de se encontrarem liberadas no meio de cultivo, como sinais que precedem a reformação da parede (VAN HENGEL et al., 2001). Particularmente, as AGPs agregadas ao meio de cultivo de cenoura restauram o potencial morfogênico de células que tinham perdido tal capacidade (KREUGER; VAN HOLST, 1993).

A fitosulfokina (PSK) – um pequeno peptídeo sulfatado em tirosina que atuaria como ligante extracelular nos primeiros estágios de desdiferenciação celular, de proliferação e de rediferenciação – é outro fator de crescimento de ação promotora da ES em algumas espécies. Seu papel é manter a capacidade de divisão celular e o estado juvenil das células embriogênicas (HANAI et al., 2000; IGASAKI et al., 2003; KOBAHASHI et al., 1999). Sua ação indutora é muito potente e aumenta em presença de polietilenoglicol (PEG), uma molécula que também aparece como promotora da ES (ATTREE et al., 1995; MARUYAMA et al., 2002). Além disso, a PSK aparece vinculada de forma precoce ao estabelecimento da polaridade, sinalizando e promovendo o desenvolvimento das células embriogênicas (FEHÉR et al., 2003).

Outros sinais em forma de moléculas solúveis que podem atuar sobre o controle da diferenciação durante a ES são as endocitinases, os citin oligossacarídeos lipofílicos (LCOs) e outras proteínas glicosiladas extracelulares secretadas para o meio nutritivo (JONG et al., 1992; VRIES et al., 1988b). É notável que meios condicionados usados preliminarmente, os quais contêm alguns desses componentes, têm demonstrado igualmente que podem levar à indução de embriões somáticos (HARI, 1980). Os LCOs têm sido encontrados nos meios condicionados de cultivos embriogênicos de Picea abies (DYACHOK et al., 2002).

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Capítulo 4

Organogênese

Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Um dos mais intrigantes mistérios da biologia diz respeito à morfogênese nos tecidos vegetais. Muitos estudos têm sido conduzidos por cientistas em todo o mundo tentando compreender as razões genéticas, fisiológicas e bioquímicas pelas quais as células e os tecidos vegetais, em um dado momento, diferenciam-se para formar órgãos com funções distintas daquelas a que estavam anteriormente submetidas. Os estudos em cultura de tecidos têm contribuído significativamente para esclarecer algumas questões relativas ao tema, pela facilidade metodológica na manipulação de nutrientes e de reguladores de crescimento, no controle de luz e de temperatura. Utilizando-se o cultivo in vitro pode-se induzir experimentalmente a diferenciação de células e de tecidos vegetais em embriões, em brotos, em raízes, em folhas e em outras partes das plantas. Mais recentemente, a biologia molecular tem esclarecido pontos importantes da morfogênese, principalmente ao descobrir e isolar genes de interesse e estudar indivíduos geneticamente modificados deficientes em genes responsáveis por etapas fundamentais da diferenciação dos tecidos. Todavia, a compreensão desse fenômeno está apenas no começo. O controle da organogênese nas plantas pode trazer um grande impacto para a agricultura, sobretudo com o direcionamento seletivo da produção de raízes, de brotos, de flores e de frutos.

Organogênese direta versus organogênese indireta

Novos órgãos vegetais, tais como brotos e raízes, podem ser induzidos em tecidos nos quais antes eles não existiam. Tais órgãos assim originados são chamados de “adventícios”. A criação de uma nova organização celular nos tecidos e o surgimento de novos órgãos, onde antes eles não existiam, é chamada de morfogênese ou organogênese. Assim, tecidos ou órgãos que possuem a capacidade para morfogênese ou organogênese são conhecidos como morfogênicos ou organogênicos.

Muitos trabalhos têm apresentado a possibilidade de se obterem brotos (cauligênese), raízes (rizogênese), embriões somáticos (embriogênese) e flores de forma adventícia. A cauligênese, a rizogênese e a embriogênese somática são os tipos de organogênese mais importantes para a multiplicação vegetal. A morfogênese tem sido observada em numerosas espécies de plantas cultivadas in vitro, mas ainda não é possível apresentá-la como fenômeno universal. Várias plantas e tecidos ainda são de difícil manipulação in vitro e pouco ou nada respondem aos estímulos e sinais aplicados, e, por isso, são chamadas de recalcitrantes.

Meristemas são zonas de intensa divisão celular e crescimento das plantas. São tecidos formados por células pequenas, indiferenciadas, com núcleos grandes e conteúdos citoplasmáticos densos. Morfogeneticamente responsivos, os meristemas podem surgir adventiciamente em uma das seguintes formas:

Diretamente de células diferenciadas de um tecido vegetal sem a proliferação de calos;

Indiretamente de células indiferenciadas ou desorganizadas (calos) ou ainda de culturas de células em suspensão.

Essas formas são chamadas de organogênese direta (Figura 1) e organogênese indireta (Figura 2), respectivamente. Muitas vezes, não é possível fazer uma clara distinção entre essas formas, uma vez que é comum a ocorrência simultânea dos dois tipos de organogênese em um mesmo tecido (explante).

Figura 1. Organogênese direta em explantes de hipocótilos de Annona muricata.

Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Figura 2. Organogênese indireta a partir de segmentos foliares em Hancornia speciosa. a) indução de calos; b) diferenciação de meristemas caulinares; c) gemas emergindo da massa calosa; d) detalhe de broto emergindo dos caules.

Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Células altamente especializadas em plantas intactas, no seu ambiente natural, nunca mudarão do seu estado diferenciado. Da mesma maneira, algumas células, mesmo quando estimuladas artificialmente, nunca se tornam morfogênicas, pois perderam a capacidade de se rediferenciar e de formar tecidos. Ademais, células diferenciadas que retêm a capacidade para se rediferenciarem e formarem novos tipos de tecidos em plantas intactas, ou que adquirem tal capacidade mediante um estímulo apropriado, são chamadas de competentes.

As células competentes possuem a habilidade de se dividirem e seguirem a direção de um novo caminho de desenvolvimento. Todavia, esse caminho pode ser limitado, pois as células competentes para formar brotos nem sempre são competentes para formar raízes, ou vice-versa. A competência de uma célula pode não ser inata ou pode não estar presente no momento em que ela é excisada da planta, mas a competência pode ser induzida in vitro em meios de cultura enriquecidos com reguladores de crescimento.

A competência é, portanto, o primeiro estágio da célula no caminho da morfogênese. O segundo estágio é aquele no qual as células competentes passam à condição de determinadas, ou seja, comprometidas a seguirem um novo programa genético particular de desenvolvimento morfogênico, por exemplo, seguir o caminho de raízes ou de brotos. O último estágio é aquele em que as células ou tecidos tornam-se morfologicamente diferenciadas de acordo com o programa previamente assumido. Essa programação pode ser observada tanto por via direta quanto por via indireta. Em cultivos in vitro de explantes de tecidos vegetais organizados (folhas, caules e raízes) ou desorganizados (calos e cultura de células), os reguladores de crescimento (hormônios vegetais) são os principais agentes indutores dos estímulos na presença de fatores nutricionais adequados.

O controle do tipo de organogênese depende do balanço dos hormônios exógenos, mas somente na fase de indução. Somente durante esse período, a composição hormonal do meio é tida como crítica. Lakshmanan et al. (1997) analisaram os estados de competência, indução e diferenciação, associados à regeneração direta de brotos, usando explantes foliares de Garcinia mangostana. Os autores observaram que a citocinina 6-benziladenina (BA) foi requerida durante o período de indução de 6 dias para que células competentes entrassem num estado determinado de cauligênese. Tem sido descrito que a BA exógena, além de agir diretamente nas células vegetais, pode agir também por meio do controle de acúmulo de outras citocininas. Esse efeito positivo da aplicação exógena de BA no acúmulo das citocininas 2-isopenteniladenosina (2iP) e 2-isopenteniladenosina ribosídica (2iPR) tem sido descrito para cauligênese de explantes foliares de Petunia hybrida. Entretanto, o papel do metabolismo endógeno desses hormônios ainda não foi completamente definido para todos os eventos de desenvolvimento in vitro (AUER et al., 1999).

A competência de uma célula ou tecido pode ser definida do ponto de vista da planta ou da pessoa que a manipula. Nem todas as células ou tecidos possuem a competência para se diferenciarem, talvez porque tais células sejam incapazes de responder ao sinal ou, ainda, porque a pessoa que as manipula ainda não tenha descoberto o estímulo adequado para tal.

Para alguns autores, os explantes necessitam adquirir competência antes que se possa induzir a organogênese de brotos. Prathanturarug et al. (2007) demonstraram que explantes nodais ou internodais de Mallotus repandus somente responderam positivamente à organogênese após terem sido pré-incubados em meio MS, sem reguladores de crescimento, por 14 ou 16 dias, respectivamente, antes de serem transferidos para o meio de indução que continha 4,44 μM de BA por 4 semanas. Essa técnica de estabelecimento das culturas antes da indução organogênica pode estar ligada ao condicionamento osmótico ou nutricional dos tecidos e parece ser uma alternativa interessante para tecidos recalcitrantes (LEMOS; BAKER, 1998).

Os centros sensíveis à morfogênese de um determinado tecido são apenas pequenas parcelas do seu número total de células. Esse é um dos grandes mistérios da biologia e não se sabe por que uma, e não outra célula, responde positivamente a um dado sinal tornando-se competente. Para alguns, apenas as células responsivas podem ser consideradas competentes, ao passo que, para outros, muitas células são capazes de responder aos estímulos impostos, mas apenas as que primeiro responderam têm a preferência para aceitar os metabólitos essenciais das células vizinhas, o que reduz a possibilidade daquelas seguirem o mesmo tipo de desenvolvimento. A resposta de apenas algumas células do explante ao estímulo indutor talvez possa ser explicada pela fase mais apropriada do seu ciclo celular para a multiplicação (LEMOS; BAKER, 1998).

Vários são os tipos de células que podem ser observados em uma planta. Alguns tecidos contêm células que, embora diferenciadas, mantêm-se íntegras e com todo o seu conteúdo genético original. Tais células são ditas totipotentes, pois, sob determinadas condições (estímulos ou sinais), podem retornar à condição de célula-tronco desdiferenciada ou meristemática. Células meristemáticas, parenquimatosas e epidérmicas são exemplos de células totipotentes. Todavia, se a célula perde seu complemento genético original (núcleo) durante a diferenciação, então essa célula deixa de ser totipotente e perde sua competência para responder a estímulos organogênicos em cultura. Células do xilema e tricomas são exemplos de células que perdem o núcleo e a capacidade de responder a estímulos externos e são, portanto, incapazes de reverterem à sua condição inicial de totipotentes.

A organogênese e o balanço hormonal

É de conhecimento geral, há mais de 50 anos, que as auxinas podem induzir a formação de raízes em culturas de tecidos. Esse fenômeno foi demonstrado no clássico trabalho de Skoog e Miller (1957) no qual se observou que a formação de brotos e raízes pode ser regulada pela relação auxina/citocinina (Figura 3). Raízes são rotineiramente induzidas em resposta à aplicação de auxinas dentro de estratégias de regeneração de plantas, de transformação e de enraizamento de estacas, mas menos atenção tem sido dada ao estágio de morfogênese (CALLIS, 2005). Sachs (1993) descreveu auxina como um sinal correlativo que coordena tanto o desenvolvimento com diferenciação vascular quanto outros processos de desenvolvimento vegetal. Ao que tudo indica, o fluxo de auxina é o determinante da canalização da diferenciação de tecidos vasculares.

Figura 3. Relação entre auxina e citocinina em explantes internodais de Annona muricata.

Fonte: adaptado de Skoog e Miller (1957).

A adição exógena de reguladores de crescimento ao meio de cultura desencadeia uma alteração do balanço hormonal endógeno dos tecidos dos explantes. A adequada combinação de auxina e de citocinina exógena pode interferir no balanço interno das citocininas endógenas e desencadear uma resposta de indução de novos meristemas de brotos. Mercier et al. (2003) quantificaram os níveis endógenos de cinco citocininas em segmentos foliares de abacaxizeiro e constataram que a aplicação exógena de ANA (1 mg L-1) e de BA (2 mg L-1) produziu o maior número de brotações na base de folhas de abacaxizeiro, enquanto, na sua ausência, nenhum broto era formado. O conteúdo hormonal presente na porção basal das folhas foi positivamente correlacionado com a resposta organogênica das culturas. A relação auxina/citocinina endógena atingiu o ponto mais baixo no terceiro dia, principalmente em virtude do forte crescimento do nível de 2-isopenteniladenosina (2iP). Os autores sugerem que a concentração endógena aumentada de 2iP tenha desencadeado o sinal indutor da resposta organogênica nas folhas do abacaxizeiro e que a produção endógena de 2iP tenha sido regulada em resposta à absorção dos reguladores de crescimento adicionados ao meio.

A presença constante ou excessiva de citocininas e de auxinas no meio de indução ou de multiplicação de brotos pode desequilibrar exageradamente o balanço hormonal endógeno dos explantes, além de inibir as respostas desejadas. A indução de brotos em explantes nodais de Pterocarpus marsupium, uma espécie de leguminosa arbórea, somente foi possível por meio da utilização de meio de cultura com 0,4 μM TDZ. Todavia, a presença contínua de TDZ após a indução inibiu o alongamento dos brotos, por isso foi necessária a transferência dos explantes para outro meio com 5 μM BA (HUSAIN et al., 2007).

O balanço hormonal endógeno dos explantes pode ser também afetado pela osmolaridade do meio e pela fonte de carbono disponível, como demonstrou Lemos e Baker (1998). Eles compararam a reação de internódios de graviola quando expostos a uma mesma combinação de reguladores de crescimento (2 mg L-1 BA e 0,5 mg L-1 ANA) sob diferentes fontes de carbono (sacarose, glucose, galactose e sorbitol). Eles observaram que internódios submetidos a fontes de carbono prontamente metabolizáveis (sacarose, glucose e galactose) produziram apenas calos, mas explantes submetidos ao sorbitol, um açúcar álcool não metabolizável pela gravioleira, mantiveram-se vivos, mas sem aparente resposta visível. Quando todos os explantes foram transferidos para um novo meio sem reguladores de crescimento e com sacarose, apenas aqueles induzidos em sorbitol produziram brotações, todos os demais continuaram a produzir apenas calos. Apenas o meio que continha sorbitol foi capaz de promover a diferenciação de células subepidérmicas em células meristemáticas e, posteriormente, em brotos.

Naquele trabalho, Lemos e Baker (1998) observaram que a primeira fase (competência) e a segunda fase (determinação) da organogênese não envolveram significativa proliferação celular. Dessa forma, a morfogênese foi iniciada em determinadas células-alvo sem a necessidade de uma fonte de carbono prontamente metabolizável para os explantes. Os reguladores de crescimento foram absorvidos do meio pelos explantes que tiveram o seu balanço interno modificado, mas sem apresentarem reações morfológicas exteriores significativas, o que foi possível graças à falta de uma fonte metabolizável de carbono para a produção de novas células. Esse estado de “fome” dos explantes criou as condições necessárias para “sensibilizar” as células-alvo e torná-las responsivas quando transferidas de meio (Figura 4) (LEMOS; BAKER, 1998).

Figura 4. Organogênese em células subepidérmicas de internódios de Annona muricata. (A) início da divisão celular em células responsivas (círculo) uma semana após a indução; (B) formação de meristemoides duas semanas após a indução; (C) gema apical emerge na superfície apresentando primórdios foliares visíveis quatro semanas após a indução.

Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Cauligênese

A organogênese em tecidos vegetais, cujo resultado visível é a produção de novas gemas e brotos, é chamada de cauligênese. Esse é um dos tipos mais comuns de organogênese procurada em cultura de tecidos pela sua grande aplicação na produção massal de mudas. Ela ocorre em resposta à manipulação de reguladores de crescimento exógenos aplicados ao meio de cultura. Dependendo das forças de equilíbrio entre os níveis endógenos e exógenos de hormônios aplicados, sobretudo das citocininas e das auxinas, as respostas podem ser cauligênese ou rizogênese.

Meristemas de brotos formados diretamente em tecidos de explantes são frequentemente iniciados 48 horas após o começo da divisão celular em cultura de tecidos. Cada mitose preliminar é rapidamente seguida por novas divisões no ciclo celular até que se formem os primórdios meristemáticos. Esses primórdios aparecem de forma aparentemente aleatória nos tecidos, mas observa-se que posteriormente eles tendem a uma equidistância uns dos outros. Algumas vezes, o novo núcleo meristemático surge de um conjunto de células-mãe que se dividiram dando origem a várias outras com o mesmo potencial, as quais juntas formam um meristemoide. Outras vezes, a origem do novo órgão é unicelular e pode ser confirmada pela elevada incidência de plantas mutantes puras que surgem de um tecido submetido a tratamento mutagênico. Se as plantas fossem originadas de várias células, então um grande número de quimeras poderia aparecer.

Os meios de cultura e os reguladores de crescimento que favorecem a rápida proliferação celular e a formação de calos em um explante nem sempre são os mesmos que conduzem a meristemas morfogênicos – que resultam na formação de brotos ou de raízes. Calos mantidos prolongadamente em um mesmo meio de cultura terminam por produzir organogênese a partir de centros meristemáticos ali formados. Caso sejam frequentemente subcultivados, tais calos permanecem indiferenciados e nunca chegam a formar órgãos. De forma oposta, alguns calos somente produzem órgãos quando são removidos do meio de indução e transferidos para meios de regeneração com ou sem reguladores de crescimento (LEMOS; BAKER, 1998).

Os meristemoides podem ser originários da reprogramação de células desdiferenciadas dos calos ou, mais comumente, de células que retêm a competência para a morfogênese já existente no tecido original (Figura 5). Em alguns casos, tais brotos são, na verdade, parte de embriões somáticos inadvertidamente induzidos na massa calosa (GEORGE, 1993).

Figura 5. Cauligênese indireta em folhas jovens de Anthurium sp.

Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos

O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), regulador de crescimento do grupo das auxinas, tem sido apontado por inúmeros estudos como o mais efetivo indutor de calos organogênicos em cultivos in vitro. Todavia, nem sempre as culturas requerem a presença de 2,4-D para a iniciação de calos. Por exemplo, em segmentos foliares de Dieffenbachia sp., o 2,4-D não foi o único indutor de calos organogênicos. Eles se formaram tanto na presença de Tidiazuron (TDZ), a 5 μM, como na presença de 2,4-D, a 1 μM (SHEN et al., 2007). A ação do TDZ induzindo a formação de calos e de brotos em várias espécies vegetais foi constatada por vários autores (DATTA; MAJUMDER, 2005; GURRIARAN et al., 1999; LANDI; MEZZETTI, 2005; MITHILA et al., 2003). Diz-se que o TDZ possui tanto atividade de citocinina como de auxina e pode ser substituído in vitro por auxinas ou pela combinação de auxinas e citocininas (SINGH et al., 2003), ou ainda aumentar os níveis endógenos de auxinas (HUTCHINSON et al., 1996).

As citocininas formam uma classe de hormônios de plantas que possuem um papel central no ciclo celular e influenciam numerosos programas de desenvolvimento. Werner et al. (2003) observaram que as citocininas regulam o número de divisões pelas quais as células podem passar antes de deixarem o meristema. Portanto, as citocininas estão diretamente envolvidas no controle da passagem de células do estado proliferativo indiferenciado (meristemáticas) para o estado diferenciado fora do meristema.

Plantas geneticamente modificadas de Nicotiana e Arabidopsis com reduzido conteúdo endógeno de citocininas produziram brotos subdesenvolvidos, meristemas apicais menores e apenas 3% a 4% de produção de células foliares em relação às plantas normais, o que indica uma necessidade absoluta desse hormônio para a formação das gemas e para o crescimento foliar. Em contraste, os meristemas das raízes dessas plantas deficientes em citocininas eram maiores e cresceram mais rapidamente e com mais raízes laterais. Esses resultados sugerem que as citocininas possuem papéis opostos para raízes e brotos (WERNER et al., 2001). Esse fato é de grande importância na cultura de tecidos vegetais, uma vez que o uso de elevadas concentrações de citocininas para estimular as brotações de gemas pode levar à inibição da indução ou à paralisação do crescimento das raízes.

Trabalho realizado em arroz por Kurakawa et al. (2007) mostrou que um gene específico, conhecido como Lonely Guy (LOG), é requerido para manter a atividade meristemática, e a perda da sua função causa terminação prematura do meristema apical. O gene LOG codifica uma enzima ativadora da citocinina que atua na parte final da sua síntese. O gene LOG converte diretamente nucleotídeos inativos de citocininas em formas de base livre, as quais são biologicamente ativas pela ação da fosforibohidrolase específica da citocinina. O LOG mRNA está localizado especificamente nos meristemas apicais, o que indica que a ativação das citocininas é feita naquele ponto. Os autores propuseram a existência de uma enzima ativadora da citocinina como um mecanismo regulador da sua atividade.

Vários tipos de explantes têm sido propostos para a organogênese ou embriogênese somática de plantas. Para cana-de-açúcar, o uso de folhas jovens cortadas transversalmente em anéis de 1 mm a 2 mm de largura logo acima do meristema, até cerca de 8 cm de comprimento, é um bom exemplo disso. Anéis cortados nas porções mais próximas do meristema (até 4 cm) apresentaram maiores percentagens de organogênese direta do que as porções mais distais (entre 5 cm e 8 cm). Isso mostra que a posição e a idade do tecido interferem na capacidade de regenerar meristemas. O posicionamento dos explantes no meio de cultura também influenciou significativamente a organogênese. As melhores respostas foram obtidas nos explantes dispostos com a parte distal (de cabeça para baixo) em contato com o meio (LAKSHMANAN et al., 2006).

Rizogênese

A indução de raízes por auxinas ainda não está muito bem compreendida nos seus muitos aspectos, sobretudo no aspecto molecular. Um interessante estudo conduzido por Ludwig-Müller et al. (2005) distinguiu o papel de duas auxinas ativas na planta, o ácido indol-3-butírico (AIB) e o ácido indol-3-acético (AIA), sobre o AIA endógeno durante a indução de raízes adventícias em segmentos de caule de Arabidopsis. O AIB (10 μM) aplicado exogenamente, e não o AIA, induziu eficientemente raízes adventícias. As raízes foram inibidas pelo ácido 3,4,5-triiodobenzoico (TIBA), um inibidor do transporte polar de auxina. Eles sugeriram que o aparecimento das raízes adventícias ocorreu pela interação entre o AIA endógeno e o AIB exógeno. O AIA endógeno existente é transportado para a base do segmento de caule e, assim, induz a formação de raízes. Em segmentos de caule em que o transporte polar foi inibido por TIBA, a formação de raízes não ocorre, mesmo na presença de AIB.

A indução de raízes adventícias em explantes de caule e de folhas tem ocorrido, na maioria das vezes, de forma empírica, a partir da adição de auxinas ao meio de cultura, o que altera a relação auxina/citocinina endógena dos tecidos. Na presença da auxina no meio de cultura, é comum o aparecimento de calos (não tanto quanto é comum numa combinação auxina-citocinina), enquanto as raízes aparecem logo após. Explantes foliares de Medicago truncatula foram utilizados para investigar a origem da indução de raízes pelas auxinas (ROSE et al., 2006). Um exame histológico revelou camadas de células calosas, que surgiram das nervuras foliares e, dentro desse tecido, primórdios radiculares derivados de células do floema junto com novo tecido vascular. Os autores sugeriram que as células derivadas das nervuras eram do tipo pró-cambiais e funcionavam como células pluripotentes, com a propensão de formar meristemas radiculares ou tecidos vasculares em resposta ao sinal da auxina adicionada ao meio.

Raízes laterais e adventícias in vitro são formadas pós-embrionicamente nas plantas por estímulos do ambiente de cultivo. Entre os reguladores de crescimento do grupo das auxinas, o AIB parece ser o mais responsivo em termos de indução de raízes adventícias em estacas e em explantes de culturas de tecidos (Figura 6). Desde a sua descoberta, há mais de 50 anos, o AIB tem sido utilizado em inúmeros experimentos, a maioria deles envolvendo estudos de tentativa e erro para atingir as condições ótimas de enraizamento de espécies vegetais. A maior habilidade do AIB em promover raízes adventícias, comparando-se ao AIA, tem sido atribuída à sua maior estabilidade na solução e nos tecidos vegetais (NORDSTRÖM et al., 1991).

A concentração efetiva do AIB em vários estudos foi também dependente do pH do meio. Observou-se que, a baixos valores de pH, são necessárias concentrações menores de AIB para induzir raízes em estacas de macieira (HARBAGE; STIMART, 1996). As diferenças entre espécies fáceis e difíceis de enraizar ocorrem, possivelmente, em virtude das diferenças no metabolismo da auxina. Espécies difíceis de enraizar não são capazes de hidrolisar conjugados de AIB nos pontos adequados para o desenvolvimento das raízes adventícias (EPSTEIN; LUDWIG-MÜLLER, 1993). Mas é possível induzir raízes em tais espécies após a aplicação de um inibidor de conjugação.

Figura 6. Rizogênese direta em explantes cotiledonares de Hancornia speciosa (A) e de Annacardium occidentale (B), em meios MS com 2 mg L-1 de AIB.

Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos

Para o enraizamento in vitro de explantes de Cotinus coggygria – uma planta lenhosa ornamental –, o AIB a 10 μM mostrou ser o melhor tratamento, induzindo em 100% o enraizamento, ou seja, houve menos calos basais e enraizamento mais rápido do que com AIA e 2,4-D sozinhos, ou em mistura. Nenhuma raiz formou-se com 2,4-D. Estudos histológicos revelaram um aumento na atividade mitótica após 73 h em cultura, nas células do parênquima cortical, entre os vasos de floema – como sempre acontece em plantas lenhosas. Os tecidos vasculares dos primórdios radiculares se conectaram aos do explante antes mesmo da emergência das raízes que ocorreu dez dias após a indução. A mistura de auxinas promoveu apenas a formação de calos (METIVIER et al., 2007).

Florescimento

Os meristemas fornecem novas células para que a planta produza órgãos durante toda a sua vida, e sua atividade contínua depende de genes reguladores que equilibram a proliferação de células meristemáticas com as células recrutadas para a organogênese. Durante o desenvolvimento floral, esse balanço é modificado para privilegiar a organogênese, o que causa a terminação do meristema após produzir determinado número de órgãos (SABLOWSKI, 2007).

A indução de flores in vitro é um fenômeno interessante do ponto de vista científico, uma vez que pode trazer à luz as melhores condições fisiológicas para que tal evento ocorra na natureza. Os hormônios vegetais influenciam vários processos do desenvolvimento, desde a germinação das sementes até a produção de brotos, de raízes e de flores. O importante papel da auxina na indução floral e no desenvolvimento tem sido descrito em vários trabalhos com ervilha (FRANKLIN et al., 2000), Vigna radiata (AVENIDO; HAUTEA, 1990) e com Vigna mungo (IGNACIMUTHU et al., 1997). No entanto, para algumas espécies, a auxina ora não produz qualquer efeito (RASTOGI; SAWHNEY, 1987) ora é inibidora (DEATON et al., 1984) do desenvolvimento floral. Zhang (2007) observou que a necessidade de auxina para o florescimento in vitro de Perilla frutescens foi variável. Entre as auxinas testadas, o AIB foi mais eficiente do que o ANA e o AIA na indução de flores. A adição de 1 mg L-1 de AIB ao meio induziu a produção de raízes em 65,6% de flores normais, de forma que algumas delas chegaram à produção de frutos e de sementes viáveis. No entanto, concentrações superiores a 2 mg L-1 de AIB não induziram flores, mas calos. A presença de raízes foi fundamental para a produção de flores in vitro de P. frutescens, o que indicou que a formação das raízes tem um papel importante nesse fenômeno. A presença de ANA ou de AIA no meio melhorou a produção de raízes, mas foi ineficiente para produzir flores in vitro.

A necessidade de citocinina para o crescimento de flores tem sido descrito para mono e dicotiledôneas (WANG et al., 2001; ZHONG et al., 1992; ZHOU et al., 2004). Zhang (2007) observou que, quando todos os outros parâmetros estavam nos níveis ótimos, a melhor concentração de BA para a indução floral de P. frutescens foi de 1 mg L-1, na qual 86,2% dos explantes produziram flores normais.

A concentração de sacarose também é um fator que pode influenciar a organogênese de flores in vitro. A presença de concentrações próximas de 30 g L-1, em geral são tidas como apropriadas para a indução floral em batata (AL-WAREH et al., 1989), e ginseng (LEE et al., 1989) e em Vigna mungo (IGNACIMUTHU et al., 1997).

Composição dos meios de cultivo para a organogênese

Uma grande variedade de protocolos de meios de cultivo para o estabelecimento da organogênese e da micropropagação é descrita na literatura. A maioria deles envolve a estratégia do uso de meios semissólidos para estabelecimento, indução, multiplicação e enraizamento dos explantes.

Os sais (macro e micronutrientes) presentes no meio de Murashige e Skoog (1962) – MS – são a base para a preparação da maioria dos meios de cultivo para a organogênese (LAKSHMANAN et al., 2006). Modificações substanciais são, por vezes, necessárias dependendo da variedade utilizada e do propósito do cultivo. Todavia, devem-se conduzir com cuidado mudanças no perfil dos sais do meio MS. Donato et al. (1999) evidenciaram que o uso de fontes únicas de N orgânico (glutamina) ou inorgânico (KNO3), ou a combinação dos dois, produziu significativamente menos brotações em explantes de cana-de-açúcar do que a mistura original de nitrato e amônio do meio MS.

Uma alternativa para o uso de nitrogênio em meio de cultura, proposta por Sobhakumari et al. (2004), é a utilização de bactérias nitrificantes associadas a doses reduzidas do elemento nas formulações tradicionais. A inoculação de culturas líquidas in vitro de cana-de-açúcar, var. Co 86032, com isolados das bactérias Azospirillum e Methylobacterium, promoveu o aumento significativo na produção de novos brotos e no alongamento de plantas em cultivos in vitro, utilizando a 50% da dose padrão de N do meio MS. Isso indicou que a utilização de microrganismos fixadores de N pode reduzir os custos de produção de mudas micropropagadas.

Variações na composição dos reguladores de crescimento têm sido testadas em profusão. O fato de diferentes variedades e/ou explantes responderem diferentemente à multiplicação in vitro tem levado pesquisadores à experimentação de vários tipos, combinações e concentrações de reguladores de crescimento. Cheema e Hussain (2004), por exemplo, testaram seis combinações das citocininas benziladenina e cinetina em seis variedades de cana-de-açúcar, e encontraram diferenças significativas para as respostas genotípicas de multiplicação e de comprimento de brotos e de raízes nas diferentes formulações propostas.

A influência da luz foi estudada em interessante trabalho de Garcia et al., (2007) com quatro diferentes variedades de cana-de-açúcar brasileiras. Eles observaram que explantes cultivados no escuro sob baixas concentrações de Picloram ou de 2,4-D (4,0 µM e 4,5 µM, respectivamente) apresentaram formação de calos a partir do parênquima caulinar bem como massas pré-embriogênicas derivadas de feixes da bainha do floema de folhas imaturas. Embriões somáticos surgiram na sequência após transferência das massas pré-embriogênicas para o claro, em meio desprovido de reguladores de crescimento. Já explantes cultivados sob luz desde o início, e em elevadas concentrações de Picloram e de 2,4-D (40 µM e 22,6 µM, respectivamente), mostraram primeiramente organogênese direta, a partir de camadas externas do parênquima do caule, seguida pelo desenvolvimento de calos organogênicos. Observaram-se também calos pré-embriogênicos a partir de feixes da bainha do floema de folhas imaturas, mas esses não derivaram em embriões viáveis.

O tipo e a concentração dos carboidratos no meio de cultura têm influenciado a morfogênese de tecidos vegetais. Os açúcares presentes na seiva do floema das plantas têm sido positivamente relacionados com a melhor fonte de carbono usada nos meios de cultura (WELANDER et al., 1989). A sacarose é o açúcar mais comum encontrado na seiva do floema da maioria das plantas (ZIMMERMANN; ZIEGLER, 1975) e, não por acaso, a principal fonte de carbono utilizada em culturas de tecidos. Outros açúcares têm sido testados com variada gama de respostas. A galactose é tida como tóxica para tecidos vegetais em cultura, mas açúcares como a rafinose e a estaquiose, que são galacto-oligosacarídeos presentes em pequenas quantidades na seiva de anonáceas, estimularam a rizogênese em explantes de graviola (LEMOS; BLAKE, 1996).

Conclusão

A indução de estruturas organizadas adventícias, onde antes elas não existiam, tem estimulado a hipótese da totipotência em pelo menos parte de células maduras em diferentes tecidos vegetais. Tais células, embora completamente diferenciadas, quando submetidas a estímulos ambientais adequados (induzidos ou não), são sensibilizadas e podem alterar o seu ciclo celular. Nesse caminho, iniciam uma viagem de volta a uma condição meristemática já vivenciada anteriormente, a qual havia sido perdida com a especialização dos tecidos. A existência dessa memória genética remanescente nas células tem sido estudada e provada empiricamente em algumas plantas-modelos. A compreensão desse fenômeno somente agora começa a ser desvendada. Pesquisas moleculares têm isolado vários genes que são indicados como candidatos-chave do controle da morfogênese, sem os quais as células não exercitam tal habilidade.

De uma forma geral, os sinais enviados para as células são direta ou indiretamente hormonais. A existência de receptores nas células, de natureza proteica ou não, capazes de decodificar o estímulo e de desencadear as alterações metabólicas necessárias para um novo programa celular, ainda está por ser desvendado. Estudos têm tentado demonstrar a totipotência universal das células vegetais para a morfogênese. Embora experimentos empíricos tenham demonstrado que células vivas nucleadas são capazes de retomar a sua condição meristemática inicial e se rediferenciarem em novos órgãos, até o presente momento não foi possível prever quando, onde e como esse fenômeno ocorrerá.

Referências

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Capítulo 5

Poliembriogênese

Don J. Durzan

A poliembrogênese é um fenômeno que resulta da clivagem de um embrião monozigótico (Monozygotic Clevage Polyembryony – MCP) a partir de seus primeiros estádios de desenvolvimento. Esse processo resulta, então, em uma formação múltipla de embriões, geneticamente iguais entre si e idênticos àqueles originados via massa embrionária oriunda do suspensor (Embryonal Suspensor Mass – ESM), durante o desenvolvimento normal da semente.

Muitas plantas gimnospermas e angiospermas apresentam potencial para poliembriogênese, porém ela é mais comum nas primeiras, nas quais as sementes apresentam vários embriões, dos quais apenas um será ativado, enquanto os outros permanecem não desenvolvidos na base da semente.

Entre as gimnospermas, as coníferas compreendem o maior e mais antigo grupo de plantas (SPORNE, 1965). Algumas chegam a viver mais de 5 mil anos (Pinus spp.), enquanto outras são as plantas mais altas do planeta (Sequoia, Fitzroya ). As coníferas apresentam grande adaptação ao meio ambiente e podem viver em solos ácidos, pobres em nitrogênio, além de ocupar áreas montanhosas. Algumas são capazes de reter suas folhas por um período de 20 a 30 anos, mantendo um padrão fotossintético, mesmo durante muitos períodos de estresse (FERGUNSON, 1968).

As coníferas são economicamente importantes, pois sua madeira pode servir para distintos usos, tais como: na construção civil, no aquecimento dos lares (combustível) e na fabricação de papel. Do seu metabolismo secundário, podem, ainda, ser extraídas drogas medicinais, incluindo algumas com efeito anticancerígeno. Além disso, servem de abrigo para a fauna silvestre. Contudo, a sombra da extinção ameaça muitas delas, como, por exemplo, a Fitzroya cupressoides, encontrada nos bosques frios do sul do Chile.

Em geral, as populações naturais de coníferas são autógamas e carregam um interessante background genético. No entanto, produzem poucas sementes e de qualidade duvidosa. Por esse motivo, a regeneração natural de suas florestas é dificultada. Por isso, justifica-se o desenvolvimento de métodos baseados na poliembriogênese monozigótica via clivagem precoce do embrião, que tem importância nos programas de melhoramento e manutenção.

A formação de bancos de germoplasma, via melhoramento clássico, tem sido importante no que concerne ao estabelecimento de linhas de progênies e parentais conhecidas e selecionadas. Porém, esse processo é longo e demorado. Dessa forma, a presente revisão mostrará a estratégia de manutenção dessas plantas, por meio do resgate de embrião, a partir de ESM com potencial poliembriogênico (MCP), a qual tem sido decisiva para a multiplicação clonal de muitas coníferas de importância econômica.

A MCP tem contribuído muito com a indústria florestal, já que tem permitido testar uma gama de novos genótipos no que diz respeito à plasticidade ambiental sob diferentes terrenos e localizações, bem como a resistência a doenças. Isso significa que, mesmo assim, são necessários anos para que se avalie corretamente a interação genótipo-ambiente, além do subsequente estabelecimento de novos ciclos de plantios baseados em material clonal cuidadosamente avaliado.

Os genótipos elite que mostram poliembriogênese podem ser criopreservados em nitrogênio líquido, e seus embriões podem ser conservados por anos, conforme as necessidades dos programas de melhoramento. Então, quando descongelados e cultivados in vitro, esses embriões ainda continuam a regenerar mais clones via clivagem e poliembriogênese.

Para a pesquisa científica, esse material clonal pode prover uma excelente fonte de protoplastos totipotentes, os quais podem ser usados para processos de fusão de células e genomas de outros genótipos, visando explorar um potencial industrial florestal.

A poliembriogênese é diferente de outros métodos de micropropagação, nos quais os explantes são cortados de diferentes partes da planta, tais como folhas, hipocótilos e ápices, para originar clones via organogênese ou embriogênese somática.

Apomixia e poliembrionia

Apomixia é a substituição da reprodução sexual por vários tipos de reprodução assexual, nos quais não há fusão dos gametas. As causas da apomixia e da poliembrionia são geralmente atribuídas a um substrato comum (MOGIE, 1992). A poliembrionia é uma característica hereditária controlada por um ou por mais genes recessivos, os quais atuam juntos durante a recombinação.

Em biotecnologia, a apomixia visa fixar o vigor híbrido, poupando tempo, trabalho e dinheiro no estabelecimento de cultivares ou variedades. Contudo não é fácil estabelecê-la.

A poliembronia foi reportada primeiramente por Leeuwenhoek, em 1719, em sementes de Citrus. Em 1878, Strassburger estudou as origens adventícias desses embriões e referiu-se a eles como “poliembronia esporofítica”. Ademais, o resgate de ESM a partir de sementes é inicialmente um produto da meiose e da fertilização, isto é, da reprodução sexual, e suas células têm a capacidade de reter seu potencial para gerar múltiplos embriões geneticamente iguais por poliembriogênese. A falta de uma adequada identificação da poliembriogênese tem levado ao uso inadequado do termo indução na literatura da embriogênese somática.

É importante entender a diferença entre MCP e simples poliembrionia. Esta última poderia ser chamada mais propriamente de poliembrionia polizigótica. Nesse caso, múltiplos embriões são originados de zigotos diferentes, o que os torna geneticamente diferentes. A poliembrionia polizigótica é encontrada tanto em gimnospermas quanto em angiospermas. Em Pinus spp., um simples óvulo pode ter potencial para produzir de 1 a 200 embriões geneticamente diferentes por poliembrionia polizigótica.

Totipotencialidade e morte celular

O zigoto é considerado totipotente, e o termo totipotencialidade significa a capacidade que o zigoto possui de diferenciar-se dando origem aos demais tecidos da planta. F. C. Steward, trabalhando na Universidade de Cornell, foi o primeiro a demonstrar a totipotencialidade a partir de células em suspensão, oriundas da região floemática de raízes de cenoura. As plantas resultantes dessas células foram capazes de conservar a totipotencialidade e passar suas características para as outras gerações (STEWARD, 1968, 1975). Essa capacidade do zigoto é singular e o distingue do resto das células somáticas. Contudo, outras células podem ser pluripotentes, unipotentes ou programadas para morrer por apoptose (programmed cell death – PCD) (HAVEL; DURZAN, 1996a, 1996b; 1999). A apoptose é importante na formação da madeira, da megasporogênese e da poliembriogênese, além de defender as plantas de pragas e de doenças.

Modelos de desenvolvimento na poliembriogênese

Diferentes modelos de poliembriogênese têm surgido em coníferas, dos quais um está baseado no desenvolvimento da semente em estádios ou em etapas iniciais, com ou sem MCP, segundo foi formulado por Dogra (1979). É um modelo complexo, derivado do desenvolvimento morfológico de um proembrião, o qual apresenta células embrionais primárias inferiores (pE) e superiores (pU), como proposto por Doyle (1963). Nesse modelo, um zigoto carente de núcleo é formado depois da fertilização, o qual produz um proembrião primário que contém embriões iniciais. Doyle e Looby (1939) observaram que, no embrião primário, cada célula apresenta potencial para ser um “embrião inicial”, além de possuir a capacidade de autorregenerar-se. Embriões iniciais como esses dão origem a embriões independentes com características próprias, fato esse que foi negligenciado por um longo período.

A capacidade de desenvolvimento dos proembriões num estádio muito precoce depende do número variável de mitoses anucleares (free-nuclear mitoses), do número de embriões iniciais e dos fatores nutricionais do gametófito feminino haploide, durante o processo de formação da semente. A proembriogenia (ou proembrionia) envolve todos os estádios que antecedem à elongação do suspensor. Todas as etapas que ocorrem depois da elongação do suspensor, mas antecedem o estabelecimento do meristema radicular, são referidas como embriogenia precoce (SINGH, 1978).

Conforme Dogra (1979), a morfogênese do embrião é particionada ou dividida em uma camada terminal de células embrionárias (E), em uma outra do suspensor (S) e em uma terceira camada de células primárias superiores (U). A camada de células do suspensor deriva da terceira camada e se manifesta depois de divisões internas no proembrião primário, isto é, a nutrição do embrião processa-se por meio do suspensor, via citoplasma do óvulo. Posteriormente, o embrião dominante e outros produzidos por MCP são nutridos a partir da região de erosão do gametófito feminino haploide. Mais tarde, essa região será chamada também de endosperma. Finalmente, embriogenia refere-se ao processo de formação do embrião com seus cotilédones durante o estabelecimento da semente.

Dogra (1967, 1979, 1984), baseando-se em dissecação e em análise de raios X de sementes, também classificou o desenvolvimento precoce do embrião em dois tipos. Um tipo é representado por Picea, por Pseudosuga e por outras coníferas, as quais não mostram MCP (Figura 1A). Outro tipo é representado por Pinus spp., em que a MCP é iniciada pela subdivisão de um zigoto, que resulta em um grupo de embriões competentes e geneticamente iguais (Figura 1B), os quais poderiam ou não tornar-se independentes uns em relação aos outros (Figuras 2A e 2B).

Figura 1. Poliembriogênese. (A) Embrião não clivado de sementes de Pseudosuga menziesii em meio semissólido. Esse embrião pode ser multiplicado por MCP por meio de cultura líquida; (B) Embriões juvenis, formados por ESM e por clivagem múltipla, oriundos de sementes de abeto-da-noruega; (C) Embriões de Pinus lambertinana cultivados em meio semissólido incrementam a produção de mais embriões via MCP; (D) Cultura em suspensão em frascos do tipo Nippled, com rotação de 1 rpm e em ambiente escuro, incrementa de forma intensiva a poliembriogênese. A uniformidade dos embriões juvenis pode ser alcançada por um procedimento denominado gradiente de densidade; (E) Placa de Petri com embriões poliembriogênicos em suspensão, formando parte de um experimento com diferentes tratamentos, que visam à otimização do seu desenvolvimento; (F) População uniforme de embriões poliembriogênicos juvenis (iniciais), tingidos com carmim acético (MCP) e azul de Evan (suspensor anucleado).

Fotos: Don J. Durzan

A MCP incrementa grandemente as chances de que uma semente tenha ao menos um embrião sobrevivente. Na maioria das vezes, em sementes, e por razões nutricionais, somente um embrião dominante torna-se bem-sucedido. O resto (ESM) permanece inibido na base do embrião.

Figura 2. MCP e apoptose. (A) No abeto-da-noruega, as células proembrionais são intensamente tingidas com carmim acético, enquanto as células do suspensor (estrutura axiais) não apresentam essa coloração; (B) Massa de células proembrionais clivadas produziram três proembriões que ainda não se separaram completamente; (C) Testes com Terminal Uridine Deoxynucleotidyl Transferase, dUTP, Nick End Labeling (TUNEL) para apoptose (avermelhado) detectam fragmentação do DNA no lugar inicial de clivagem (asterisco). Núcleos não apoptóticos coloriram-se de azul com 4’-6 diamidino-2-fenilindole (DAPI); (D) Os núcleos proembrionais (azul com DAPI) diferenciam-se dos núcleos apoptóticos das células que constituem o suspensor (avermelhados pela análise TUNEL); (E) A microscopia ótica revela duas massas proembrionais não separadas, com clivagem retardada; (F) A clivagem das massas proembrionais no processo da poliembriogênese produz liberação de óxido nítrico (ON), que é detectado por DAF-2DA-verde. O ON forma-se nas camadas exteriores dos proembriões.

Fotos: Don J. Durzan

Jäger (1899) sugeriu uma forma de descobrir a capacidade de formar embriões em Taxus baccata, bem como de demonstrar experimentalmente tal situação. Essa proposta encontrou suporte aproximadamente um século depois, quando embriões resgatados de massas embrionais do sistema embrião-suspensor foram removidos desde seu confinamento na semente. Quando isso ocorreu com o auxílio de cultura de células em suspensão no abeto-da-noruega (Norway spruce), embriões individuais oriundos dessas massas embrionais foram vistos em constante clivagem, regenerando embriões, enquanto as condições de cultura foram mantidas (DURZAN et al., 1994; DURZAN; GUPTA, 1987; GUPTA; DURZAN, 1986 a, 1986b;1987a, 1987b).

Segundo, Havel e Durzan (1996a, 1996b), a formação de um suspensor anucleado ao longo de uma fileira axial de células envolve apoptose (Figuras 2C e 2D). Nesse processo, os núcleos das células na parte distal do eixo tubular são fragmentados com liberação de nucléolos no citoplasma. Produtos mucilaginosos são formados quando as células do suspensor anucleado são alongadas, e, de um modo geral, mucílagos são liberados frequentemente no meio de cultura. Durante o crescimento, o desenvolvimento e a diferenciação do embrião, o turnover de proteínas regulatórias foi influenciado pela ubiquitinação de aminoácidos em proteínas (DURZAN, 1988b, 1989b, 1996, 2006).

A multiplicidade de embriões via mecanismos ESMs é ampla e variada no abeto-da-noruega e representa uma resposta aos diferentes lugares geográficos em países como a Finlândia. Por isso, quando colocados em meio de cultura, esses embriões mostram diferentes padrões de formação ESM, os quais vão depender de sua capacidade genômica para promover a poliembriogênese, de acordo com os diferentes ambientes onde essas sementes foram coletadas (JOKINEN; DURZAN, 1994). Ademais, em Pinus banksiana, uma influência do ambiente sobre o tamanho e a composição bioquímica das sementes foi verificada por meio de diferentes coletas tanto no Canadá como nos Estados Unidos (DURZAN; CHALUPA, 1976). Por causa da grande variabilidade genética e geográfica dessas coníferas, nenhum meio de cultura poderia ser aplicado indistintamente ou satisfatoriamente a todos os genótipos.

Em 1985, quando Dogra visitou meu laboratório em Davis, ele testemunhou como a produção de embriões via ESMs em Pseudosuga menziesii, em abeto-da-noruega e em Pinus taeda era a expressão da MCP em cultura de células em suspensão (Figuras 1B e 1D). Isso claramente demonstrou que tanto as espécies que apresentam clivagem quanto as que não apresentam poderiam exibir poliembriogênese quando o sistema embrião-suspensor e os embriões juvenis são cultivados in vitro. Contudo, o grau de poliembriogênese foi genótipo dependente e influenciado pelas condições do meio, especialmente pela presença de ácido abscísico.

Outro modelo de embriogênese baseado em embriões imaturos do abeto-da-noruega foi desenvolvido nos laboratórios de Sara Von Arnold e, mais tarde, foi utilizado também por outros pesquisadores. Nesse caso, proliferações de massas proembriogênicas (Proliferating Proembryogenic Masses – PEMs) com células meristemáticas foram iniciadas pela aplicação adequada de auxina e citocinina no meio de cultura (HAKMAN et al.,1985). Essas massas proembriogênicas se multiplicaram por sucessivas mitoses acêntricas como se tratasse de um processo predominante. No estádio PEM I, pequenos agregados celulares são caracterizados por compactas colônias de células com densos citoplasmas (FILONOVA et al., 2000a, 2000b). Em PEM ll, esses agregados celulares podem ter mais de um vacúolo. Embora os estádios mais juvenis da proembriogenia não possam ser definidos com precisão, os estádios posteriores correspondem àqueles que acontecem no curso normal da embriogenia zigótica. Em PEM lll, agregados celulares apresentam-se alongados com densos citoplasmas, porém mais soltos do que compactos e com uma polaridade alterada. A remoção de reguladores do crescimento ativa a formação de embriões a partir de PEM lll. PEMs não derivam para embriogênese somática a menos que PEM lll tenha sido alcançada. Cabe assinalar que o ácido abscísico promove o ulterior desenvolvimento dos embriões somáticos e favorecem o passo da embriogênese tardia para formas mais maduras. A passagem por meio dessa série de três estádios é requerida para a transdiferenciação de células em embriões somáticos, que é definida como a transição de uma célula em estado diferenciado para outro.

Os três estádios da proembriogenia (PEM), de alguma forma, emulam a embriogênese das angiospermas (KOMAMINE et al.,1992; STEWARD, 1968, 1975), ainda que elas representem diferentes histórias evolutivas e filogenéticas diante das coníferas. O modelo da proembriogenia foi mais tarde modificado para que incluísse clivagem do embrião. Atualmente, diferentes estratégias moleculares estão sendo desenvolvidas para entender melhor essa problemática.

Convém salientar que alguns autores partilham da ideia de que o meristema apical possui células especiais capazes de iniciar órgãos, como é o caso das células-tronco em animais (WEIGEL; JÜRGENS, 2002). No entanto, os genes dessas células-tronco são expressos somente em certas camadas do meristema.

As células-tronco do meristema apical não parecem fazer parte das células meristemáticas em PEMs. Na verdade, elas são consideradas pluripotentes, e são responsáveis pela formação de novos órgãos, mais do que pela formação de novos embriões (BHALLA; SINGH, 2006). Não se sabe também como as células meristemáticas relacionadas com PEM diferenciam-se a partir de embriões juvenis ou iniciais. O fato é que diferentes modelos explicam o desenvolvimento de embriões em coníferas, e a poliembriogênese (MCP) adiciona ainda mais complexidade e dúvidas à literatura da cultura de tecidos.

Embriogênese somática e poliembriogênese em coníferas

A embriogênese somática foi induzida primeiramente em embriões imaturos de Picea abies, abeto-da-noruega (CHALUPA 1985, HAKMAN et al., 1985). Por sua vez, a poliembriogênese somática, em termos de clivagem e de sistema embrião-suspensor, foi primeiramente observada em células em suspensão (DURZAN; GUPTA, 1987; GUPTA; DURZAN, 1986a, 1986b, 1987a, 1987b,). Utilizaram-se diferentes níveis de ácido abscísico nesses estudos com a finalidade de separar embriões clivados e de recuperar embriões individuais em espécies com ou sem clivagem embrionária (BOULAY et al., 1988, DURZAN; GUPTA, 1988a, 1988b). Ademais, estudos sobre a suscetibilidade do ácido abscísico e o desenvolvimento da expressão genética no processo da maturação de embriões somáticos têm sido conduzidos em Pinus taeda (VALES et al., 2007).

Desde 1990 até 1995, a embriogênese somática e a MCP de material diploide e haploide foram descritas em Larix sp. (BONGA et al.,1995). Na maioria dos casos, o sucesso foi alcançado com explantes de duas semanas de idade após a fertilização (mês de junho). A embriogênese somática de cotilédones foi também induzida com um sucesso variável.

Para Psudosuga menziesii, a melhor época para induzir satisfatoriamente células ESMs de sementes em desenvolvimento do tipo não clivadas deu-se logo após a fertilização (HONG et al.,1991). Da mesma forma, células em ESMs foram obtidas e cultivadas sem maiores problemas a partir de calos, e o material clonal obtido a partir de células em suspensão foi satisfatoriamente transferido para o solo (DURZAN, 1988a; DURZAN; GUPTA, 1987). Essa situação novamente provou o potencial latente dos embriões iniciais em espécies cuja poliembriogênese (MCP) não era conhecida. Sementes de Pinus lambertiana (do tipo clivagem) com apenas um embrião – bem desenvolvido –, quando armazenadas por 5 anos, apresentaram EMSs (sistema embrião-suspensor) e foram capazes de originar não somente embriões mas também plântulas sob condições in vitro (GUPTA; DURZAN, 1986a).

As informações fornecidas até aqui foram uma breve recapitulação histórica da poliembriogênese. Contudo, é importante reconhecer que muitos outros pesquisadores têm demonstrado esse fenômeno numa ampla variedade de coníferas, por meio da utilização de diferentes métodos de cultura. Assim sendo, uma ampla gama de pesquisadores tem dado uma apreciável contribuição para que seja possível compreender a poliembriogênese em plantas lenhosas.

Especificidade de diagnósticos e criopreservação de genótipos

A separação de células em suspensão por meio da centrifugação e do fracionamento melhorou a geração de linhagens celulares, de MCP e de maturação embrionária. A reinoculação dessas células incrementou sua cultura e permitiu que houvesse uniformidade e sincronização durante sua produção em massa (Figuras 1D e 1E) (DURZAN; CHALUPA, 1976). Ademais, a coloração dupla com aceto, carmim e azul de Evans (Figura 1F) permitiu visualizar bem as células proembrionais e diferenciá-las das células do suspensor. Esse fato, igualmente, permitiu avaliar a qualidade de ESMs depois da criopreservação em nitrogênio líquido (GUPTA et al.,1987a). A criopreservação tem sido repetida por outros autores por meio do uso do modelo da proliferação de massas proembriogênicas (PEM) e de suas consequentes variações para o armazenamento de germoplasmas.

Antibióticos específicos para ubiquitina PCNA (proliferating cell nuclear antigen) e para ensaios com TUNEL1 (nick end labeling) foram usados para seguir o recâmbio das proteínas regulatórias, a síntese de DNA, o ciclo celular e a apoptose (DURZAN, 1996; DURZAN et al., 2006; HAVEL; DURZAN, 1996a, 1999). Com todas essas técnicas, e com a distribuição de proteínas nas camadas celulares axiais, foi possível estabelecer um paralelo entre os diferentes perfis de proteínas obtidos por gel de poliacrilamina (DURZAN, 1996).

Ativas e mecanicamente estressadas, as células das coníferas no meio de cultura rapidamente liberam ON, o qual precede à produção de etileno (MAGALHÃES et al., 2000) (Figuras 2C e 2F). O ON é um radical livre que podze ter efeitos benéficos ou lesivos. Em baixos níveis, pode reduzir o dano que as diferentes espécies de oxigênio reativo podem causar. Em baixos níveis, ele também participa do sistema de sinalização celular dentro do âmbito da defesa da planta. Em altos níveis celulares, o ON contribui para o envelhecimento, causa danos ao DNA e leva à apoptose (MAGALHÃES et al., 2000; PEDROSO et al., 2000). O ON é originado a partir da arginina por meio de reação parcial no ciclo da ureia (DURZAN; PEDROZO, 2002; DURZAN; STEWARD, 1983; DURZAN et al., 2006). Por um lado, a arginina é também precursora de guanidinas monossubstituídas, que são inibidoras naturais da óxido nítrico sintase. Por outro lado, ela está envolvida na síntese de ureia, de ornitina, de agmatina, bem como na acumulação de prolina sob condições de estresse.

Filonova et al. (2002) tem proposto que a morte celular programada (programmed cell death – PCD) é o principal mecanismo responsável pela eliminação competitiva de embriões secundários em sementes poliembrionais. A PCD é tida como um mecanismo importante que possibilita a competição entre os vários embriões monozigóticos, garantindo a sobrevivência de um só. Isso ocorre por meio de um programa autocatalítico de autodestruição ainda não definido.

Esse programa, que ainda não está definido, não explica as várias outras formas de apoptose nem a poliembrionia modificada em Pinus spp., na qual a tal eliminação não acontece (SIMAK, 1973).

Com respeito à eliminação competitiva, o papel dos necro-hormônios produzidos por células moribundas (HABERLANDT, 1922; HAVEL; DURZAN, 1996a) e da degeneração de núcleos remanescentes eliminados desde a população de embriões ocorre em virtude de lesões ou mutações somáticas. A apoptose contribui para a formação de embriões apomíticos em células em suspensão no abeto-da-noruega (BELL, 1994). Vale considerar que as células apomíticas são reabsorvidas durante a formação da megáspora, e essa reabsorção tem sido considerada uma forma de canibalismo no processo de propagação das coníferas, pois isso tende a reduzir o número de indivíduos (HAIG, 1992). Ademais, com respeito ao tamanho e à viabilidade das sementes, importante informação tem sido reportada por Xiao et al (2006a, 2006b).

Em Pinus taeda, um sistema de nove estádios baseado na morfologia do embrião tem sido formulado para comparar a expressão gênica em embriões zigótenos e somáticos. Como exemplo pode-se citar a transcrição reversa que ajudou a encontrar a cópia de um gene para aquagliceroporina, o qual foi abundantemente expresso no suspensor de embriões zigóticos e somáticos dessa espécie (CIAVATTA et al., 2001). No entanto, sua fisiologia permanece ignorada. Em virtude disso, ainda são necessários mais esforços para melhorar critérios de avaliação no tocante a características fenotípicas e genéticas (DURZAN, 1989a).

Protoplastos e engenharia genética

Depois de 15 semanas, uma população de dez protoplastos oriunda do sistema embrião-suspensor (ESM), em Pinus taeda, desenvolveu mais de cem embriões somáticos (GUPTA; DURZAN, 1987a). Em trabalhos subsequentes, protoplastos de embriões do abeto-branco produziram plântulas (ATTREE et al.,1989).

Protoploastos originados de suspensão celular via ESMs de Pseudosuga menziesii e de Pinus taeda foram usados para introduzir genes com resistência a insetos via eletroporação (GUPTA et al.,1988). Tentativas similares têm sido realizadas com luciferase; entretanto, árvores transformadas com genótipo estável não têm sido obtidas.

Poliembronia em sementes e fatores ambientais

Condições climáticas adversas podem induzir a morte tardia do embrião e, consequentemente, ocasionar o aparecimento de sementes não viáveis (DOGRA, 2001). As condições climáticas severas no Ártico, notadamente na Escandinávia e na Rússia, contribuem para um pobre desenvolvimento da semente, porém esse fato pode estimular a poliembrionia (SIMAK, 1973). O pobre desenvolvimento está correlacionado tanto com a baixa temperatura quanto com uma estação curta de crescimento. As temperaturas baixíssimas estão relacionadas de forma positiva com o fenômeno da poliembronia. Os últimos estádios do desenvolvimento são inibidos de modo que apenas um embrião consiga se estabelecer. A falta de dominância entre os múltiplos embriões foi considerada uma semelhança de comportamento em relação ao ápice terminal e aos brotos laterais nas árvores. Se o broto do meristema apical perde a dominância, uma competição é desenvolvida em nível de brotos colaterais para estabelecer uma nova liderança.

Na floresta natural, onde predomina o fenômeno da autopolinização e sua respectiva carga genética, os genes letais ou semiletais podem eliminar completamente indivíduos originados por esse fenômeno. Sementes vazias ou embriões imaturos são frequentemente encontrados, assim sendo a poliembrionia pode contrabalançar a excessiva perda por autofecundação. Ademais, se algum embrião no óvulo, que se origina por autofecundação, morrer por incompatibilidade, a semente ainda tem o recurso de desenvolver algum outro embrião por conceito de fertilização cruzada. Porém, esse fenômeno é pouco frequente (HAGMAN, 1975).

Embriões haploides algumas vezes também podem ser encontrados em sementes poliembriônicas (ILLIES, 1964; SIMAK et al., 1968). Nesse caso, genes letais recessivos são diretamente expressos no haploide; no entanto, os embriões não sobrevivem. No material sobrevivente remanescente haploide, a duplicação de cromossomos via colchicina poderia oferecer embriões diploides, os quais seriam depurados dos fatores letais.

Os diferentes genótipos também podem variar na sua habilidade de liberar etileno em cultura (JOKINEN; DURZAN, 1994). Altos níveis de etileno podem facilmente afetar de forma negativa outras células genotípicas com bom potencial morfogenético, caso elas se encontrem nas mesmas condições de cultura daquelas células de alta produção de etileno, a menos que a produção de etileno seja removida por algum meio.

Protocolo para Pseudosuga menziesii

Pinus taeda e Psudosuga menziesii são duas das mais importantes coníferas encontradas nos Estados Unidos tanto por sua capacidade de fornecer madeira quanto pelo fato de fornecer polpa de celulose e papel. É interessante o fato de que as sementes de Pseudosuga menziesii não exibem MCP, mas podem realizá-la quando proembriões são resgatados, cultivados e clonados por meio de células em suspensão (DURZAN; GUPTA, 1987). Esse processo, denominado poliembrogênese somática, está protegido por meio de patente (DURZAN; GUPTA, 1988b) e encontra-se licenciado para uso pela empresa Weyerhaeuser (EUA), uma das maiores do mundo em matéria de indústria florestal. Outras tecnologias adicionais sobre produção de embriões somáticos em cultura líquida, em distribuição e em venda de sementes manufaturadas estão também protegidas por patentes pela mesma empresa, visto que essa é uma forma de reduzir custos e incrementar a eficiência da propagação clonal em massa (CARLSON et al., 1997; GUPTA et al., 1991, 1993).

A Weyerhaeuser usa a tecnologia de biorreatores no desenvolvimento e amadurecimento de embriões (Figura 3A) (TIMMIS, 1998). Nessa empresa, mais de 700 genótipos têm sido criopreservados em nitrogênio líquido. Além disso, mais de 250 mil clones de uma ampla gama de genótipos têm sido produzidos para testes de campo (Figuras 3C e 3D). Dentro desse elenco de tecnologias, cabe mencionar também a produção de sementes sintéticas no abeto-da-noruega, para facilitar sua manipulação e propagação clonal (Figura 3B).

Figura 3. (A) Embriões clonais de abeto-da-noruega produzidos por MCP, em meio semissólido, apresentando cotilédones em desenvolvimento; (B) Embriões de abeto encapsulados em um gel de alginato. O material de encapsulamento não tem um caráter nutricional; (C) Em casa de vegetação, o material clonal é submetido à avaliação para que se observe seu ganho genético; (D) No campo material clonal, em plena avaliação true-to type, para observar variação somaclonal e potencial comercial.

Fotos: Don J. Durzan e Gupta

Ganhos genéticos em florestas clonais

No tocante aos programas de melhoramento genético de plantas lenhosas, a propagação vegetativa per si pode dobrar, em curto espaço de tempo, os ganhos genéticos (G) na silvicultura (TIMMIS et al.,1987). Além disso, ela oferece economia de recursos ao evitar longos ciclos de testes e de produção de sementes. Dentro do âmbito genético, esses ganhos podem ser representados por G, ou seja, pela variação genética total, que pode ser desdobrada em variância aditiva (Va) e não aditiva. A Va é também um coeficiente de melhoramento para a população, mas, em se tratando de propagação por semente, somente Va pode ser manipulada. Todavia, existem outros componentes da variância genética total, que são de caracteres específicos, a saber: variância dominante (Vd), variância epistática (Vi), variância clonal (Vclonal) e a variância fenotípica total para a população clonal (Vpc). Em geral, a interação genótipo-tratamentos e mudanças clonais (aberrações cromossômicas, por exemplo) podem provocar importantes variações na captura do ganho genético (PARK et al.,1993).

O potencial da cultura de tecidos em plantas lenhosas pode ser apreciado por meio da empresa Weyerhaeuser que, somente em 2005, plantou 36.892 clones de Pseudosuga menziesii e 1.250 de Picea abies, todos obtidos por embriogênese somática. No tocante a Pinus taeda, foram colocados 27.866 clones, e 2.109 clones elites foram estabelecidos em casa de vegetação, os quais estavam prontos para serem transferidos para o campo. Hoje a mesma empresa está em condições de produzir cerca de 100 milhões de plântulas por ano das espécies Pseudosuga menziesii e Pinus taeda.

Na Europa, clones produzidos por PEMs têm sido testados no campo para abetos, pinheiro e outras coníferas (HÖGBERG et al., 2003). No Norte e no Sul da América, no Sudeste Asiático e na Nova Zelândia, várias indústrias privadas e governamentais têm massificado a produção clonal. Além disso, testes de campos têm sido iniciados para avaliar a realidade econômica dessas florestas clonais, visto que o custo de produção de uma muda clonal é mais alto de que o de uma originada por semente. Entretanto, é bom lembrar que a produtividade do material clonal oferece um potencial produtivo mais atraente, portanto a relação custo-benefício é mais favorável.

Desafios futuros

Não se pode negar o tremendo impacto da cultura de tecidos, bem como da embriogênese somática no campo da agricultura e nos empreendimentos florestais. Contudo, restam problemas biológicos subjacentes que precisam ser esclarecidos, de modo que seja possível controlar e manipular com mais precisão o processo embriogenético, com o objetivo de melhorar a mecanização e a automatização para que se obtenha uma participação no mercado mais eficiente e competitiva. É evidente que isso será alcançado com o maior progresso das ciências básicas e das condições in vitro, nas quais os sistemas clonais mais robustos e flexíveis sejam desenhados dentro do âmbito do melhoramento florestal de coníferas com vistas na adaptação a diferentes ambientes.

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Capítulo 6

Biorreatores para produção de mudas em larga escala

João Batista Teixeira
L. Pedro Barrueto Cid

Biorreatores são equipamentos para cultivo sob regime de imersão temporária ou permanente de células, de gemas, de embriões ou de qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado em cultura de tecidos de plantas. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, com renovação do ar durante o cultivo e com o monitoramento de um ou de mais parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, entre outros.

Os primeiros biorreatores para cultivo de células vegetais consistiram em adaptações de equipamentos já existentes no mercado – denominados fermentadores –, os quais foram desenvolvidos para o cultivo de fungos e de bactérias, tanto em escala experimental (de tamanho pequeno), quanto em escala industrial (de médio e de grande porte). Assim, os primeiros biorreatores testados em plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, que foram adaptados para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma muito parecida com o que era feito com fungos e bactérias.

Inicialmente, os fermentadores foram empregados com pouca ou com nenhuma modificação no cultivo de células vegetais. Para isso, pequenos ajustes foram feitos basicamente na taxa de renovação de ar e na forma de agitação das células. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados, principalmente na década de 1980, e uma série de modelos específicos para plantas foi desenvolvida.

Nas últimas décadas, biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de embriões, de gemas e de plântulas, com o objetivo de produzir mudas em larga escala. Um dos primeiros relatos sobre o uso de biorreatores na propagação vegetal foi feito por Takayama e Misawa (1981), para micropropagação de begônia. Nesse caso, os autores utilizaram segmentos de folhas com gemas adventícias induzidas in vitro, seguindo protocolos de cultivos desenvolvidos em meio gelificado. O desenvolvimento das gemas foi avaliado em meio líquido sob agitação em frascos de Erlenmeyers ou em biorreatores com aeração forçada. Procedimentos similares foram adaptados para outras espécies vegetais, como, por exemplo, para embrião somático de café (NORIEGA; SÖNDAHL, 1993) e para produção de microtubérculo de batata (AKITA; TAKAYAMA, 1994).

Os biorreatores são utilizados igualmente para produção de embriões somáticos (TAUTORUS et al., 1992; DENCHEV et al., 1992) e de sementes sintéticas (ATTREE et al., 1994; ONISHI et al., 1994). Essa metodologia exige completo domínio sobre as fases de indução, de seleção e de multiplicação de calos embriogênicos, bem como das fases de diferenciação, de maturação e de germinação dos embriões somáticos. Eventualmente, o encapsulamento de embriões diferenciados, que dão origem a sementes sintéticas, pode representar um passo importante na obtenção de propágulos de alta qualidade que possam ser eficientemente convertidos em plantas tanto em biorreatores quanto em condições de casa de vegetação.

Constituição básica dos biorreatores

A constituição básica dos primeiros biorreatores usados para cultura de embrião, de gemas e de hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos fermentadores utilizados para cultivo de células vegetais (TAKAYAMA; AKITA, 1994). Basicamente, esses equipamentos apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo; motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco, no qual são encaixados uma ou mais hélices; bomba compressora de ar; sensores de temperatura, de pH e de oxigênio (TAKAYAMA; AKITA, 1994).

O frasco de cultura é desenhado de tal forma que permita uma ótima aeração do meio de cultura, bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. Os frascos podem ser feitos de vidro, de aço inoxidável, de policarbonato, de polipropileno ou de qualquer outro material que resista à autoclavagem (temperatura de 121 °C por um período de 15 a 30 minutos). Frequentemente, o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta, por onde circula água com temperatura predeterminada, para controle da temperatura de cultivo (TAKAYAMA; AKITA, 1994). O volume dos frascos normalmente varia de 1 L a 20 L, embora volumes menores como 250 mL e 500 mL e maiores (30 L ou, até mesmo, 300 L) já tenham sido utilizados. Entretanto, a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 L a 4 L (TAKAYAMA; AKITA, 1994).

A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitas de diversas formas. A mais comum é a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão, combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (TAKAYAMA; AKITA, 1994). O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0,22 µm a 0,44 µm de diâmetro.

Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e de embriões

Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas, de embriões e de plantas. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e pela construção do frasco (TAKAYAMA; AKITA, 1994).

Biorreatores do tipo aerador agitador (aeration agitation bioreactor)

Este tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. A agitação é feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (KESSEL; CARR,1972; PREIL et al., 1988). A grande desvantagem desse modelo de biorreator é o fato de que, para haver uma boa homogeneização do meio, faz-se necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas, o que, em regra geral, causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo, principalmente em hastes e em gemas.

Biorreator do tipo tambor rotatório (roller drum bioreactor)

Neste tipo de biorreator, o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos, que servem de apoio e também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. Nesse modelo, o dano mecânico é mínimo e é adequado ao cultivo de embriões e de plantas. Entretanto, o nível de oxigenação só é adequado, quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (TANAKA et al., 1983).

Biorreator do tipo filtro rotatório (spin filter bioreactor)

O biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central, por onde o meio de cultura é descarregado (STYER, 1985). Esse elemento é responsável tanto pela homogeneização como pela aeração do material em cultivo. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (WHEAT et al., 1986).

Biorreator do tipo borbulhamento (air driven bioreactor)

O biorreator do tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. A homogeneização do meio e a aeração são feitas via borbulhamento de ar a partir do fundo do frasco. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha.

A relação altura-diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples. Se a relação for de 3 ou mais, o biorreator é do tipo coluna de bolha. Esses modelos de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares, de bulbos, de cormos e de tubérculos (TAKAYAMA; MISAWA, 1981; TAKAYAMA et al., 1991). Esse tipo foi primeiramente desenvolvido e utilizado na micropropagacão por Takayama e Misawa (1981).

Biorreator do tipo levantamento de ar (air lift bioreactor)

O meio de cultura neste tipo de biorreator é movido de baixo para cima, dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco, pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Esse modelo apresenta bons resultados, uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e causa pouco dano mecânico ao material em cultivo (PARK et al., 1989). A única característica que difere esse biorreator do modelo anterior é o fato de que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no interior do frasco de cultivo.

Biorreator do tipo fase gasosa (gaseous phase bioreactor)

Este modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. O meio de cultura pulverizado sobre o material em cultivo é, em seguida, drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (USHIYAMA, 1984). Esse tipo de biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células, de tecidos e de órgãos, porque não causa dano mecânico, nem agitação via borbulhamento. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo, o que pode ser contornado pela inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril.

Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (oxygen permeable membrane aerator bioreactor)

O frasco de cultura deste tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso em relação ao oxigênio, que pode ser de teflon, de silicone, de policarbonato ou de polipropileno, através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados a dano mecânico, uma vez que não há nenhum tipo de agitação; entretanto, a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (LUTTMAN et al., 1994).

Biorreator do tipo sobreaeração (overlay aeration bioreactor)

Neste modelo, a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. Eventualmente, esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (ISHIBASHI et al., 1987). O modelo apresenta deficiência na aeração, o que pode comprometer o crescimento, sobretudo, de células e de tecidos.

Biorreator de imersão temporária

Em todos os modelos descritos anteriormente, com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio, o material em cultivo permanece continuamente imerso no meio de cultura. Essa imersão contínua causa problemas de hiper-hidratação dos tecidos, dos órgãos e das plântulas. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado, a hiper-hidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios, que irão afetar o crescimento e o desenvolvimento do material em cultivo, fenômeno conhecido por hiper-hidricidade.

Com o objetivo de eliminar ou minimizar esse problema, desenvolveu-se um modelo de biorreator, chamado de imersão temporária (ALVARD et al., 1993). Nesse tipo, o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Em seguida, o meio é drenado, e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura.

O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos, um superior e um inferior, os quais se encontram conectados entre si por um tubo. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior, enquanto o material a ser cultivado, no superior. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. Quando todo o meio passa para o compartimento superior, ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Após um período preestabelecido, a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada e o meio retorna ao compartimento inferior por gravidade, permanecendo aí até que o ciclo recomece.

O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção, mas mantém as mesmas características de funcionamento, dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (TEISSON et al., 1995).

O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais, com diferentes tipos de explantes e apresenta resultados muito bons (ALVARD et al., 1993; CABASSON et al., 1997; ETIENNE et al., 1997; ETIENNE-BARI et al., 1999; MCALISTER et al., 2005; TEISSON et al., 1995).

Na realidade, o princípio da imersão temporária para cultivo de células e de tecidos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. (1952), relatado por Harris e Mason (1983). Segundo Harris e Mason (1983), Steward et al. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo era deficiência de oxigenação do meio de cultura. Com o objetivo de contornar esse problema, Steward et al. (1952) construíram um equipamento que foi denominado de auxophyton, que movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda, de tal forma que, em determinado momento, os segmentos de raiz eram expostos ao ar e, no momento seguinte, submersos no meio líquido. Com isso, houve um aumento da matéria fresca de 38,1 mg em meio gelificado para 98,6 mg em meio líquido no auxophyton. Esses frascos apresentavam uma série de mamilos (nipples), que permitiam a retenção do material em cultivo, segmentos de raízes ou mesmo células, e, consequentemente, o contato intermitente do material com o meio de cultivo.

Posteriormente, um equipamento desenvolvido por Harris e Mason (1983), para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos do tipo Erlenmeyer, apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. (1952). Nesse equipamento, o frasco do tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados, de tal forma que, em certa posição, o explante se encontrava submerso e, em outra posição, não submerso. O estoque inicial de explantes era obtido por meio do cultivo, por 28 dias, em meio gelificado com ágar. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária, a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com ágar.

Tisserat e Vandercook (1985) desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária que consistia em uma grande câmara de cultura, que era periodicamente cheia de meio de cultura. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório, esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser igualmente muito superior aos cultivos em meios gelificados.

Aitken-Christie e Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. Nesse sistema, o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido em que estavam os explantes. O meio permanecia em contato com o explante por um período de 4 a 6 horas. Após esse período, o meio era retirado por intermédio de uma bomba de vácuo. Esse procedimento era repetido a cada semana.

Pouco tempo depois, Aitken-Chistie e Davies (1988) desenvolveram um sistema semiautomático de cultivo sob imersão temporária, no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado, com adição e remoção automática e periódica do meio líquido.

Simonton et al. (1991) desenvolveram um equipamento automático de micropropagação, no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo, de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Embora esse sistema tenha apresentado um excelente desempenho quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura, alguns problemas foram identificados, como o uso de frasco relativamente grande, de difícil manuseio, além de alguns problemas de contaminação, especialmente do tipo bacteriana.

Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feita por Lorenzo et al. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar. O mesmo modelo foi utilizado por Escalona et al. (1999) para multiplicação de gemas de abacaxi. Esse sistema utiliza dois frascos: um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura.

Biorreator de imersão temporária (modelo da Embrapa)

A participação da mão de obra no processo convencional de micropropagação é da ordem de 60% a 70% do custo final da muda. Grande parte do envolvimento dessa mão de obra diz respeito principalmente à fase de alongamento/enraizamento, em virtude do uso de grande número de frascos, além da manipulação de cada explante em capela de fluxo laminar, para subdivisão dos agregados de gemas em segmentos menores o suficiente para serem cultivados em frascos individuais.

Dessa forma, qualquer medida visando à redução do envolvimento de mão de obra irá contribuir significativamente para baixar o custo final da muda, o que tornará o processo mais econômico. Com o intuito de reduzir o número de frascos envolvidos no processo e de eliminar a necessidade de manipulação dos agregados de gemas e de multibrotos em capela de fluxo laminar e a repicagem para os frascos de alongamento, desenvolveu-se um biorreator de imersão temporária. Após ser submetido ao Inpi para fins de patenteamento, esse biorreator recebeu o código PI 0004185-8 em 28 de agosto de 2000.

Vantagens do uso de biorreatores em relação ao processo de micropropagação convencional

O uso de biorreator de imersão temporária, sobretudo na fase de alongamento/enraizamento, apresenta uma série de vantagens em relação ao processo convencional, tais como:

Uso de meio líquido, que permite melhor nutrição do tecido, melhor taxa de crescimento, além de acelerar o processo.

Emprego da imersão temporária, que propicia uma renovação adequada do ar no interior do frasco de cultivo e evita o contato permanente dos tecidos em cultivo com o meio de cultura líquido, o que é prejudicial.

Uso de frascos maiores, que podem chegar a dezenas de litros. Com isso, os agregados de gemas ou multibrotos não precisam ser subdivididos antes de serem transferidos para o meio de alongamento/enraizamento, o que reduz significativamente o envolvimento de mão de obra e também diminui os riscos de recontaminação durante a manipulação dos explantes.

Menor risco de erro na etiquetagem, já que o número de frascos manipulados é consideravelmente menor.

Maior uniformidade das mudas ao final do processo.

Menor estresse gasoso e mecânico, com reflexos positivos no crescimento e no vigor das mudas.

Melhor resposta morfogenética em decorrência das melhores condições de cultivo.

Finalmente, em decorrência de todos esses fatores, redução significativa da mão de obra, o que diminui expressivamente os custos de produção.

Características do equipamento

As características básicas são as seguintes:

Pode utilizar diferentes tipos de frascos, que variam em
tamanho, formato, constituição, tipo de tampa, transparência, etc.

A montagem é modular e comporta desde uma até dezenas de pares de frascos.

Pode ser montado em diferentes ambientes, nos quais haja variações no que diz respeito à intensidade de luz, ao fotoperíodo e à temperatura.

Pode ser facilmente convertido para o funcionamento no regime de imersão contínua, quando necessário.

Oferece como opção o uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio, de nitrogênio e de gás carbônico.

O cultivo de mudas de diferentes espécies depende apenas do ajuste dos meios nutritivos, bem como do intervalo de imersão.

Pode ser utilizado, igualmente, para a multiplicação de bactérias e de fungos, desde que sejam feitas pequenas modificações em termos de taxa de aeração, de uso de misturas gasosas específicas e de ajuste do meio de cultura.

Descrição do equipamento

Figura 1. Biorreator de imersão temporária desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, composto de cinco prateleiras com oito pares de frascos cada. (A) Kit de biorreator com 40 pares de frascos; (B) Frasco de meio (esquerda) e frasco de cultivo (direita); (C) Compressor de ar, filtros, válvulas solenoides e temporizadores.

Fotos: João Batista Teixeira

O biorreator desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Figura 1) é constituído pelos seguintes equipamentos: frascos de armazenamento de meio (Figura 1B, esquerda), frascos de cultivo (Figura 1B, direita), filtro de ar com poros de 0,22 µm (Figura 1B), válvulas solenoides, frasco de borbulhamento, temporizadores, fonte de pressão positiva, filtro de ar/óleo (Figura 1C).

Funcionamento do equipamento

O ar do tanque do compressor entra no sistema, passando inicialmente pelo filtro de ar seco, para remover óleo e partículas sólidas por meio da válvula solenoide comandada pela programação do temporizador. O ar, em seguida, passa pelo frasco de borbulhamento, que contém água deionizada, para uma segunda filtragem e umidificação do ar. Depois disso, o ar entra na canalização, passa pelo filtro de esterilização e faz pressão no interior dos frascos de meio de cultura. Com isso, o meio é pressionado a passar para os frascos de cultivo, o que resulta na imersão do material e na renovação do ar no interior dos frascos. Após alguns minutos, há inversão do fluxo de ar, e a pressão é exercida nos frascos de cultivo. Com isso, o meio de cultura retorna ao frasco de meio, completando o ciclo. Depois de determinado intervalo de tempo preestabelecido pela programação dos temporizadores, o ciclo recomeça. Normalmente, o tempo de imersão é de alguns minutos, o que é suficiente para a transferência total do meio para o frasco de cultivo. Por sua vez, o intervalo entre os períodos de imersão varia de 2 a 6 horas, dependendo da espécie e do material que está sendo cultivado. O equipamento aqui descrito, além de funcionar no sistema de imersão temporária, pode ser adaptado para funcionar sob regime de imersão contínua. O período de borbulhamento sob regime de imersão contínua pode ser programado de acordo com a necessidade do explante em cultivo.

Uso do biorreator na produção de mudas de abacaxi

A produção de mudas de abacaxi pode ser conduzida em frascos convencionais sem grandes problemas (TEIXEIRA et al., 2001). Usa-se meio gelificado nas fases de estabelecimento e de meio líquido, em camada fina, nos meios de multiplicação e de alongamento/enraizamento. Até a fase de multiplicação, o número de frascos utilizados é relativamente pequeno. Por exemplo, para a produção de mil mudas, o número de frascos (do tipo frasco de maionese com 250 mL) até a fase de multiplicação é da ordem de 10 a 20 unidades. Já para a fase de alongamento/enraizamento, o número de frascos pode subir para cem, considerando-se 10 mudas por frasco ao final do processo. Muitas vezes, o número de mudas por frasco é ainda menor, por isso faz-se necessário um número maior de frascos, que pode chegar a 150 unidades.

O uso de frascos pequenos na fase de alongamento/enraizamento encarece substancialmente o preço final da muda, em decorrência do envolvimento de mão de obra para lavagem dos frascos, preparo de meio de cultura e manipulação dos explantes em capela de fluxo laminar de ar estéril. Já o uso de biorreator, principalmente na fase de alongamento/enraizamento (Figuras 2A e 2I), pode contribuir significativamente para redução do uso de mão de obra. Para a fase de alongamento/enraizamento, seriam necessários não mais do que cinco frascos de biorreator, para produzir, ao final do processo, algo em torno de mil mudas. Já em frascos do tipo maionese de 250 mL, seriam necessários cerca de cem frascos para produzir o mesmo número de mudas. Além do mais, os multibrotos resultantes ao final da fase de multiplicação não precisam ser subdivididos antes de serem transferidos para a fase de alongamento/enraizamento, como ocorre com o processo convencional, resultando em economia de mão de obra.

O biorreator pode ser utilizado na fase de multiplicação. Entretanto, como o equipamento tem um custo relativamente alto, é desaconselhável o seu uso nessa fase, para que o mesmo possa ser utilizado um maior número de vezes durante o ano. A fase de alongamento/enraizamento dura entre 45 e 60 dias, o que permite o uso de um kit de biorreator por cinco a seis ciclos de cultivo por ano.

Produção de mudas em um kit de biorreator de 40 pares de frascos

Figura 2. Fase de alongamento/enraizamento conduzida em biorreator de imersão temporária desenvolvido pela Embrapa. (A) e (B) Vista geral dos frascos ao final da fase de alongamento/enraizamento; (C) Unidade de cultivo representada pelo frasco de meio e pelo frasco com os explantes; (D) Vista aproximada das gemas alongadas antes da abertura dos frascos; (E) Aspecto das mudas após o corte do frasco ao meio; (F) e (G) Aglomerado de mudas após a retirada do frasco de cultivo; (H) Aspecto das mudas, que apresentam comprimento entre 5 cm e 8 cm; (I) Separação do aglomerado de mudas em tufos menores, para fins de aclimatação.

Fotos: João Batista Teixeira

Cada kit de biorreator semelhante ao da Figura 1A é composto de 40 pares de frascos. Cada frasco de 5 L produz, ao final de cada ciclo de alongamento/enraizamento, de 100 a 200 mudas. Portanto, para o cultivo de 40 frascos, são produzidas de 4 mil a 8 mil mudas ao final de cada ciclo. Considerando-se que são cinco ciclos de cultivo por ano, o total produzido por kit varia de 20 mil a 40 mil mudas.

Número necessário de gemas para produção de 20 mil mudas em biorreator

Cada plântula que entra no processo de produção deve passar, no máximo, por cinco ciclos de multiplicação. Esse é um limite prático para que se evite o aparecimento de mudas fora do padrão varietal. A taxa de multiplicação no período de um mês varia de três a quatro por gema. Em cinco ciclos, cada plântula que entra no processo de multiplicação vai dar origem a, no mínimo, 250 gemas. Já para a produção de 20 mil mudas, serão necessárias, pelo menos, 80 plântulas, ou seja, 16 plântulas por ciclo de alongamento/enraizamento em biorreator. Dessa forma, em vez de se trabalhar com 2 mil frascos do tipo maionese de 250 mL, serão necessários apenas 40 frascos de biorreator, os quais serão utilizados em cinco ciclos de cultivo por ano.

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Capítulo 7

Conservação in vitro de recursos genéticos de plantas: estratégias, princípios e aplicações

Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Frederico Henrique da Silva Costa

Os recursos genéticos vegetais podem ser conceituados como a fração da biodiversidade vegetal, com previsão atual ou potencial de uso, que representa uma fonte imensurável de variabilidade genética para ser aplicada direta ou indiretamente na obtenção de produtos ou serviços. Desse modo, os recursos genéticos vegetais compreendem as variedades tradicionais (existentes em áreas menos influenciadas pelas variedades exóticas), as variedades melhoradas (oriundas do melhoramento genético), as linhas avançadas e as espécies nativas (aí incluídas os parentes selvagens de espécies cultivadas). Tais materiais, além de representarem uma fonte de variabilidade genética para a produção de novas variedades que atendam as necessidades de produtores e de consumidores, também são importantes por proverem segurança ao meio ambiente, evitando que condições bióticas e abióticas possam causar danos irreparáveis aos ecossistemas (FRALEIGH, 2006).

Todavia, apesar da importância desses recursos, grande parte vem sendo destruída de modo irreversível, antes mesmo do seu pleno conhecimento científico, acarretando, assim, a depredação dos ecossistemas e, consequentemente, a erosão genética, com efeitos às vezes desastrosos para o meio ambiente. Entre as principais causas da destruição dos ecossistemas vegetais, estão a exploração predatória, a devastação indiscriminada de florestas e sua conversão em áreas agrícolas, as quais são resultados da industrialização, da urbanização e do desenvolvimento econômico (RAZDAN, 2003).

Atualmente, a conservação dos recursos genéticos vegetais tem sido tratada como prioritária em vários países, além de ser considerada como elemento principal de qualquer estratégia que objetive assegurar o suprimento de alimentos e o desenvolvimento do setor agrícola, desde que associada à preservação de outros recursos naturais (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Isso porque, a disponibilidade de variabilidade genética vegetal por meio dos diversos métodos de conservação constitui um requerimento básico à continuidade de programas de melhoramento clássicos e modernos (engenharia genética), essenciais ao desenvolvimento de genótipos de elevada importância comercial. Adicionalmente, essa disponibilidade provê uma fonte de compostos para uso na indústria farmacêutica, na alimentação e na proteção das culturas (PANIS; LAMBARDI, 2006). Além disso, no caso da introdução de novos genótipos em substituição aos genótipos primitivos ou convencionalmente cultivados, torna-se imprescindível a documentação e a conservação destes últimos, uma vez que as variações climáticas e os riscos naturalmente existentes também podem influenciar negativamente o habitat natural das espécies e, dessa forma, acelerar o processo de erosão genética dos recursos genéticos vegetais (RAZDAN, 2003).

Assim, desde os anos de 1970, grande número de raças primitivas e de espécies silvestres de culturas cultivadas tem sido amostrado e conservado em bancos ex situ, isto é, fora de seu habitat natural (PANIS; LAMBARDI, 2006). Esse modo de conservação pertence ao importante conjunto de atividades que compõem a gestão dos recursos fitogenéticos (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Entretanto, a manutenção desses recursos sob condições de campo, ou mesmo em viveiros, por meio de métodos convencionais de conservação, necessita normalmente de extensas áreas e de mão de obra intensiva. Além disso, essas espécies estão sob risco iminente de desaparecimento, em razão de fatores como: adversidades ambientais, ataque de pragas e dificuldades de multiplicação (NASSAR, 2003).

Como alternativa aos problemas da conservação convencional, novas e diversas estratégias biotecnológicas, baseadas na cultura in vitro de células, de tecidos e de órgãos vegetais, têm sido desenvolvidas e aprimoradas. Tais técnicas, além de possuírem potencial para superar as diversas limitações inerentes aos métodos convencionais de conservação ex situ e in situ, facilitam também o intercâmbio de recursos genéticos vegetais livres de pragas, que é um fator crucial, considerando-se a interdependência de nações e de regiões do mundo em termos de acesso aos recursos genéticos. Ademais, os progressos obtidos na área, especialmente no que diz respeito a sua utilização para conservação por longos períodos, são considerados relevantes, em virtude do reduzido número de pesquisadores envolvidos (RAZDAN, 2003). Há relatos do seu uso em mais de 60 espécies, incluindo em monocotiledôneas e em dicotiledôneas, com maior representatividade nas espécies de clima temperado (RAZDAN; COCKING, 2000).

Diante desse contexto, e em virtude da necessidade de informações atuais em língua portuguesa sobre a conservação in vitro de recursos genéticos vegetais, este capítulo tem como objetivo dar subsídios ao melhor entendimento acerca do assunto, abordando as principais estratégias, usos e aplicações da conservação e da criopreservação de espécies vegetais in vitro.

A conservação dos recursos genéticos vegetais

Em geral, qualquer tecnologia destinada à conservação de germoplasma tem como princípio básico preservar o máximo possível a diversidade genética de determinado vegetal, tanto no nível de espécies, quanto de variedades ou de indivíduos, visando a seu uso atual e futuro como fonte de variabilidade (RAZDAN, 2003).

Para tanto, existem basicamente dois modos de preservar os recursos genéticos vegetais: a conservação in situ e a conservação ex situ. O primeiro modo objetiva principalmente conservar os habitats naturais nos quais a diversidade genética existe, incluindo áreas selvagens e de proteção ambiental, reservas e sistemas agrícolas tradicionais, e a sua utilização é priorizada por programas mundiais de conservação estratégica, lançados desde 1980. Por sua vez, a conservação ex situ compreende a retirada dos recursos genéticos de seu ambiente de ocorrência natural e sua transferência para condições de armazenamento artificiais (laboratório), de modo adequado e por curtos ou mesmo longos períodos de tempo. Além disso, consiste no principal método para a conservação dos recursos genéticos, que pode ser constituído por materiais cultivados e selvagens, e requer para seu uso conhecimento sobre a estrutura das populações, técnicas de amostragem, métodos de regeneração e manutenção de variabilidade genética, particularmente em plantas alógamas (RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Contudo, independentemente do modo, a importância de se conservar os recursos genéticos vegetais é evidente em razão de suas múltiplas inter-relações, principalmente entre os programas de melhoramento genético, os agricultores e a produção de alimentos (Figura 1).

Figura 1. Representação esquemática sobre a importância da conservação dos recursos genéticos vegetais e suas inter-relações com os programas de melhoramento genético, os agricultores e a produção de alimentos.

Limitações associadas aos métodos convencionais de conservação de recursos genéticos de plantas

Preservação de sementes

De maneira geral, em se tratando de preservação ex situ, o armazenamento de sementes é um dos métodos mais utilizados, em razão de a maioria das espécies vegetais produzirem sementes capazes de suportar determinado grau de secagem e de armazenamento, em geral, a baixas temperaturas (sementes ortodoxas). Entretanto, a conservação de sementes é considerada problemática para, pelo menos, três grandes grupos de espécies vegetais: no primeiro grupo, estão as espécies que não produzem sementes, ou a fazem de modo insatisfatório, por isso são propagadas vegetativamente, a exemplo da bananeira (Musa spp.); o segundo inclui as espécies que possuem genótipos estéreis e aqueles que produzem sementes ortodoxas, mas geralmente com alto grau de heterozigose, fatos que limitam a conservação de genes combinados ou não, a exemplo da maçã (Malus spp.), da batata (Solanum tuberosum), da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e da mandioca (Manihot esculenta); o terceiro grupo inclui espécies de plantas que produzem sementes recalcitrantes (caracterizadas pela sensibilidade ou intolerância ao dessecamento abaixo do nível crítico de umidade), incluindo várias frutíferas e madeireiras, especialmente de origem tropical, como coqueiro (Cocos nucifera), abacateiro (Persea americana), mangueira (Mangifera indica) e cacaueiro (Theobroma cacao) (ENGELMANN, 2004; PANIS; LAMBARDI, 2006; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Além dessas, existem as espécies produtoras de sementes intermediárias que também apresentam problemas de armazenamento, bem como aquelas sementes que, embora tolerem o dessecamento, são intolerantes a baixas temperaturas, a exemplo do cafeeiro (Coffea arabica), do mamoeiro (Carica papaya) e do dendezeiro (Elaeis guineensis) (RAZDAN, 2003).

Somando-se a essas restrições, a conservação de espécies por sementes apresenta a inabilidade de manter clones distintos (exceto em espécies apomíticas); portanto, não se trata de um método a ser aplicado para culturas propagadas vegetativamente, como a batata, a banana, o abacaxi, a mandioca e outras.

Conservação em campo

Em virtude das razões mencionadas anteriormente, o método de conservação ex situ em condições de campo tem sido tradicionalmente o mais utilizado e preferido para as espécies de propagação vegetativa. Todavia, essa forma de conservação apresenta inconvenientes que limitam sua eficácia e ameaçam a segurança e a estabilidade dos recursos genéticos conservados (RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN, 1998). Entre as desvantagens comumente reportadas estão as perdas ocasionadas por pragas, condições ambientais adversas, erro humano e vandalismo. Soma-se a essas o fato de os bancos de germoplasma em condições de campo apresentarem altos custos de manutenção. Também não se pode esquecer de possíveis perdas de acessos conservados no caso de limitações ou cortes orçamentários. Além disso, esse tipo de conservação requer consideráveis áreas de terra, mão de obra e manejo (PANIS; LAMBARDI, 2006). Concomitantemente, existem também os problemas relacionados às etapas de coleta e ao intercâmbio dos recursos genéticos, uma vez que, para culturas propagadas assexuadamente, o material utilizado constitui-se geralmente de partes vegetativas que nem sempre sobrevivem quando excisadas da planta mãe (matriz), além de apresentarem o potencial de disseminar pragas e doenças, que são limitações importantes para o intercâmbio de germoplasma (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Estratégias de conservação in vitro de recursos genéticos de plantas

Em consequência das limitações inerentes aos métodos convencionais de conservação ex situ e in situ, tecnologias alternativas, como as de conservação in vitro, têm sido desenvolvidas e aprimoradas. Atualmente, tais alternativas são consideradas estratégicas para a conservação de recursos genéticos vegetais, sobretudo para aquelas espécies multiplicadas assexuadamente que produzem sementes recalcitrantes ou, ainda, para as provenientes de engenharia genética (RAZDAN, 2003).

Em princípio, a simples introdução de determinado material vegetal in vitro constitui uma forma de coleção de germoplasma. Todavia, em virtude da inviabilidade de se manter elevado volume de material, aliado à necessidade de transferências periódicas em curto período de tempo (normalmente de quatro a seis semanas), torna-se impraticável utilizar o simples cultivo in vitro para a conservação de germoplasma. Somando-se a esses fatores, existem ainda os problemas relacionados às perdas ocasionadas por erro humano ou por contaminação microbiana, durante os subcultivos/transferências, além das limitações associadas à instabilidade genética advinda normalmente do excesso de repicagens ou da ação de reguladores de crescimento (WITHERS et al., 1990). Ademais, a conservação de células e de calos embriogênicos de importância por meio de subcultivos periódicos consome tempo, além de geralmente reduzir o potencial embriogênico (PÉREZ et al., 1997).

Como alternativa, modificações no padrão de crescimento das culturas têm sido utilizadas para a conservação in vitro de germoplasma vegetal, cada qual com a possibilidade de ser aplicada de acordo com o material vegetal e com as estruturas física e humana disponíveis. Nesse contexto, a conservação de espécies vegetais pode ser realizada, de maneira geral, a partir de dois sistemas: a) sistemas de baixo/lento crescimento; b) sistemas de criopreservação ou conservação a temperaturas ultrabaixas (-196 ºC).

Em ambos os sistemas, a conservação é feita por meio de alterações no ambiente de cultivo, com o objetivo principal de desacelerar ou suprimir totalmente o crescimento do material vegetal preservado durante o maior tempo possível, sem, contudo, influenciar negativamente sua estabilidade genética e viabilidade (GEORGE, 1993; WITHERS; ENGELMANN, 1998; ROCA et al., 1991). Desse modo, vários são os tipos de coleções in vitro relatados, entre os quais se destacam: a) coleções de base in vitro (conservação por longo período usando criopreservação, porém sem distribuição); b) coleções ativas in vitro (armazenamento de materiais em baixo crescimento por um período relativamente curto, os quais podem ser usados para multiplicação, avaliação, indexação e distribuição); c) banco de genes in vitro (compreende as coleções ativa e de base), empregado para intercâmbio de germoplasma em âmbito nacional e internacional (RAZDAN, 2003).

As vantagens potenciais dos métodos de conservação in vitro são várias e incluem: a) necessidade de espaço físico relativamente pequeno; b) manutenção do material vegetal sob condições livres de estresses bióticos (pragas e patógenos) e abióticos (condições ambientais adversas); c) disponibilidade de material vegetal para propagar grande número de plantas de forma rápida sempre que necessário; d) potencial para prolongar o tempo necessário para a realização de subcultivos/repicagens; e) facilidade para ser aplicada nos procedimentos de manipulação genética em virtude de prover, por exemplo, um modo simples de armazenamento de material experimental; f) permite o acesso imediato ao germoplasma preservado pelos melhoristas; g) redução dos obstáculos inerentes aos sistemas de quarentena no que diz respeito ao transporte internacional de material vegetal vivo entre centros de pesquisa e outras instituições. Além disso, as técnicas in vitro permitem os seguintes procedimentos: conservação de variação somaclonal nas culturas e nas linhagens de células de uso medicinal; armazenamento de pólen com vistas na melhoria de sua longevidade; conservação de germoplasma raro e de espécies ameaçadas de extinção; retardamento do processo de envelhecimento de materiais vegetais (ISLAM et al., 2003; RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Por exemplo, coleções de banana mantidas in vitro sob condições de crescimento mínimo facilitam o intercâmbio de germoplasma, pois reduzem o peso e o volume do material a ser transportado, além de possibilitarem mínima ou nula disseminação de doenças e melhor controle das condições ambientais. Ademais, os acessos podem ser rapidamente multiplicados (OLIVEIRA et al., 2000). Nesse mesmo sentido, as técnicas in vitro têm sido usadas amplamente para distribuição internacional de recursos genéticos vegetais com notáveis exemplos testados e comprovados para as culturas da batata, da mandioca, da batata-doce e da banana. É necessário, porém, salientar que alguns cuidados quanto à consistência do meio de cultura (se for o caso), tais como tipo de recipientes (tubos de ensaio, frascos, etc.) (WITHERS; ENGELMANN, 1998) e identificação correta devem ser considerados com o objetivo de assegurar a estabilidade do material em trânsito.

Diversos são os tipos de material vegetal (explantes) utilizado para a conservação in vitro, tais como: ápices caulinares, meristemas, propágulos vegetativos em vários estádios de desenvolvimento (brotos, gemas axilares, segmentos nodais), protoplastos isolados, suspensão de células, cultura de calos e plântulas organizadas (RAZDAN, 2003).

Sistemas de crescimento lento (crescimento mínimo)

O crescimento mínimo é considerado o modo mais direto de restringir o crescimento e o desenvolvimento de plantas in vitro. Para isso, realizam-se modificações nas condições físicas ou químicas do meio de cultura, com o objetivo de aumentar ao máximo os intervalos de subcultivos ou estendê-los indefinidamente, porém sem afetar a viabilidade genética e biológica das plantas regeneradas. Tais modificações incluem a manipulação dos constituintes do meio de cultura, conseguido geralmente pela adição de reguladores osmóticos (açúcares álcoois – sorbitol e manitol, e/ou sacarose), de reguladores de crescimento (citocininas – BAP, ABA, ancimidol), e/ou pela omissão/redução de alguns constituintes orgânicos e inorgânicos; alterações nas condições do microambiente in vitro (redução da temperatura de cultivo e modificações na composição de gases – O2 e CO2); tipos de fechamento dos recipientes de cultivo (RAZDAN, 2003; ROCA et al., 1991; SARKAR et al., 2005; WITHERS; WILLIAMS, 1998); e, mais recentemente, a técnica de encapsulamento de propágulos vegetativos (sementes sintéticas ou artificiais).

Ademais, outras variações podem ser realizadas por meio da alteração da intensidade e da duração do período de luz, de modo que sua redução aumente a viabilidade das culturas submetidas a baixas temperaturas, possivelmente em razão da diminuição do processo de deterioração dos tecidos (OLIVEIRA et al., 2000). Contudo, o que tem sido verificado é a predominância da combinação desses fatores em detrimento do uso separado. Porém, é necessário destacar que a utilização rotineira desse sistema para conservar recursos genéticos vegetais pode ser limitada em virtude da interação genótipo-ambiente, bem como por falta de informação acerca da estabilidade genética do material conservado (NEGRI et al., 2000). Nesse contexto, os mesmos autores observaram diferenças na capacidade de conservação entre variedades de macieira, de modo que a variedade primitiva/crioula (landraces) teve potencial para retomar o crescimento reduzido drasticamente após um ano, enquanto a variedade comercial ‘Starkspur Red’ manteve 90% de sobrevivência após 18 meses de conservação.

Técnicas clássicas

Uso de baixa temperatura (armazenamento a frio)

É um método de conservação em médio prazo aplicado a algumas plantas, no qual o material vegetal é subcultivado por várias vezes, em intervalos de tempo relativamente longos, em condições de baixas temperaturas (1 ºC a 20 ºC), de maneira que se reduza a atividade enzimática e metabólica das plantas (RAZDAN, 2003).

Somando-se a isso, a suplementação do meio de cultura com reguladores de crescimento, como o ABA, o ancimidol, os açúcares álcoois e/ou a sacarose, bem como a diminuição da intensidade de luz, ou mesmo a total ausência dela em associação à baixa temperatura, podem efetivamente auxiliar na velocidade de redução da taxa de crescimento (ISLAM et al., 2003). Dessa forma, prolonga-se o intervalo entre os subcultivos e reduz-se a necessidade de mão de obra e de reagentes. Consequentemente, diminuem-se os riscos de perdas por contaminação (LEMOS et al., 2002). Além disso, a utilização desse método permite obter uma coleção para uso na distribuição de plantas, com a vantagem adicional de ser simples e de proporcionar, normalmente, alta taxa de sobrevivência do material (possivelmente pelo fato de não haver tratamentos com substâncias criogênicas, as quais são muito empregados na criopreservação) (RAZDAN, 2003). Sucesso por meio dessa técnica tem sido reportado em diversas espécies e, até mesmo, nas culturas economicamente importantes (Tabela 1).

Quanto às suas limitações, pode-se citar a possibilidade de acumular células que variam geneticamente de acordo com o tempo de armazenamento, seja em virtude do uso em excesso ou inapropriado de reguladores de crescimento, seja pelo elevado número de repicagens. Além do mais, quando comparado à criopreservação, esse método apenas reduz o crescimento das culturas, já que não provoca o congelamento das células e dos tecidos, diferentemente do que ocorre com a temperatura do nitrogênio líquido que paralisa completamente o metabolismo das células (RAZDAN, 2003).

Tabela 1. Espécies conservadas in vitro sob condições de baixa temperatura, associadas ou não a outras modificações do meio de cultura, exceto à tecnologia de sementes sintéticas.

Espécie

Explante utilizado

Tempo de conservação

Temperatura
(oC)

Outras
condições

Referência

Banana

Brotos

Até 615 dias(1)

16

–

Van Den Houwe et al. (1995)

Maçã

Brotos apicais e segmentos nodais simples

12 a 18 meses

4

MS 50% sais + BAP (0,89 µM) + ABA (5 µM), em ambiente escuro

Negri et al. (2000)

Banana (diploides)

Plantas sem raízes e pseudocaule podado

450 dias

17

MS sem reguladores de crescimento, sacarose (20 g L-1)

Oliveira et al. (2000)

Batata (Solanum tuberosum L.)

Microestacas

16 meses

6

MS + ancimidol (10 µM) + sacarose (60 g L-1)

Sarkar et al. (2001)

Cana-de-açúcar (Saccharum sp.)

Brotos

12 meses

15

MS líquido + ABA (1 mg L-1) + sacarose (20 g L-1)

Lemos et al. (2002)

Menta (Mentha spp.)(diploides, tetraploides e octaploides)

Explantes nodais e apicais

6 meses

20 e 10 (por três semanas) e 2 (por seis meses)

MS sem reguladores de crescimento

Islam et al. (2003)

Orquídea (Vanilla spp.)

Brotos

360 dias

2

MS ½ + sacarose (15 g L-1) + manitol (15 g L-1)

Divakaran et al. (2006)

Drosophyllum lusitanicum

Segmentos com dois nós

8 meses

5

MS + sacarose (60 g L-1) + manitol (20 g L-1) + zeatina (0,91 µM), em ambiente escuro

Gonçalves e Romano (2007)

(1) Outros acessos necessitam de transferências para meio de cultura fresco a cada 60 dias, o que mostra a grande variabilidade entre os acessos testados (400). Os autores verificaram ainda que bananas selvagens diploides são mais difíceis de serem conservadas por longo período, em prejuízo de bananas comestíveis triploides e tetraploides.

Utilização de substâncias reguladoras de crescimento (ABA, ancimidol, ácido acetil salicílico, etc.) e de reguladores osmóticos (manitol, sorbitol, sacarose, etc.)

A esse respeito, a literatura tem reportado com frequência o uso de agentes osmóticos como os açúcares álcoois manitol e sorbitol, além da sacarose. Por sua vez, a utilização de reguladores como o ácido abscísico (ABA), o paclobutrazol (PBZ), o ancimidol e o ácido acetilsalicílico (CANTO et al., 2004; LEMOS et al., 2002; LOPEZ-DELGADO et al., 1998) também tem sido reportada. Contudo, todas essas substâncias são sempre associadas a baixas temperaturas, e a decisão de utilizar determinado regulador e sua concentração é função de cada espécie e tipo de explante, os quais apresentam diferentes concentrações endógenas de hormônios.

De acordo com Dumet et al. (1993), os agentes osmóticos acima citados, ao serem adicionados ao meio de cultura, promovem a remoção do excesso da água intracelular, por gradiente osmótico, por isso o crescimento da cultura ocorre de forma mais lenta. Esse fato corrobora relatos de George (1993), que afirma que o sorbitol não é usualmente metabolizado pelas plantas, além do fato de sua atuação estar frequentemente relacionada à modificação do potencial osmótico do meio de cultura. Nesse mesmo sentido, Fortes e Pereira (2001) relatam que, entre os agentes osmóticos mencionados, o manitol tem proporcionado bons resultados no que diz respeito à restrição do crescimento e do desenvolvimento de diversas espécies, por isso é frequentemente empregado. Sua eficácia tem sido atribuída ao fato de esse carboidrato reduzir o potencial hídrico do meio de cultura e, com isso, promover um estresse osmótico causado pela diminuição na absorção de água e de nutrientes presentes no meio. Além disso, resultados satisfatórios na inibição do crescimento vegetal, quanto ao uso do manitol, são também relatados quando há associação com o ácido acetilsalicílico (AAS) (LOPEZ-DELGADO et al., 1998).

No caso do PBZ e do ancimidol, seu estudo é justificado em virtude de essas substâncias interferirem na síntese do ácido giberélico, inibindo o crescimento em diferentes espécies de plantas (CANTO et al., 2004; SARKAR et al., 2001). Dessa forma, apresentam potencial para aumentar o intervalo entre subcultivos. Todavia, de acordo com Canto et al. (2004), poucas são as pesquisas acerca dos efeitos desses reguladores in vitro, havendo relatos até mesmo da ineficiência do PBZ quando usado em concentrações de 0,5 mg L-1 a 1,0 mg L-1 para a cultura do abacaxizeiro.

Quando se trata do uso de agentes osmóticos, outro aspecto importante é o fato de que a utilização de determinadas concentrações pode ocasionar redução significativa na viabilidade e consequente deterioração após o período de armazenamento, o que pode causar toxidez, elevada oxidação ou problemas de excessivo potencial osmótico (FORTES; PEREIRA, 2001; LEMOS et al., 2002). Discussão a esse respeito é reportada por Fortes e Pereira (2001), segundo os quais embora a combinação de manitol (87,6 mM) com ácido acetilsalicílico tenha sido mais efetiva em restringir o crescimento de microestacas de batata, apenas 37% sobreviveram, sugerindo maior estresse fisiológico em detrimento do uso de sacarose, que proporcionou 76% de sobrevivência, após 9 meses de armazenamento.

Técnicas alternativas

Algumas técnicas constituem alternativas para os métodos de criopreservação e de armazenamento a frio. Entre elas, incluem-se as alterações na atmosfera de cultivo (proporção dos gases O2 e CO2), conseguidas por meio da redução na quantidade de O2 disponível. Essa redução é obtida pelo recobrimento do material propagativo com óleo de querosene, óleo mineral ou meio líquido, ou, ainda, pelo uso de atmosfera modificada. O sucesso no uso desses métodos depende do tipo de material e da espécie vegetal. Além disso, há relatos de sua eficiência na redução do crescimento de pera (Pyrus communis), café (Coffea sp.) e genótipos de gengibre (Zingiber officinale), embora problemas como a hiper-hidratação e baixas taxas de restabelecimento e sobrevivência dos explantes também tenham sido relatadas em alguns casos (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Acrescenta-se ainda que, no sistema em que a pressão atmosférica que circunda os tecidos cultivados é reduzida, tem-se a vantagem da redução da atividade microbiana (RAZDAN, 2003). Ademais, a conservação em médio prazo, utilizando-se pouco oxigênio à temperatura ambiente, pode ser interessante para espécies tropicais, as quais são sensíveis ao frio, embora os resultados estejam ainda em âmbito experimental (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Conservação à temperatura da sala de crescimento

Embora a maioria dos trabalhos sobre conservação in vitro utilize baixas temperaturas (igual ou inferior a 20 ºC), pesquisas têm sido conduzidas com o intuito de manter material vegetal sob temperaturas próximas, ou mesmo semelhantes, àquelas utilizadas nas salas de crescimento (Tabela 2). Para tanto, associações com substâncias reguladoras de crescimento e agentes osmóticos também são reportadas (BONNIER; VAN TUYL, 1997; FORTES; PEREIRA, 2001; NAIDU; SREENATH, 1999; TYAGI et al., 2007). Uma das vantagens de se manter a conservação sob essa temperatura é o fato de não ser necessário nenhum procedimento de encapsulamento ou desidratação, nem equipamentos mais sofisticados. Além do mais, a estrutura laboratorial existente é aproveitada.

Tabela 2. Espécies para as quais a conservação à temperatura semelhante àquelas utilizadas nas salas de crescimento tem sido reportada.

Espécie

Explante utilizado

Tempo de conservação

Temperatura
(oC)

Sobrevivência/Conversão

Referência

Lilium longiflorum e L. henryi

Bulbinhos

28 meses

25 ºC(1)

Satisfatória

Bonnier e Van Tuyl (1997)

Café

Embriões zigóticos

24 meses

25 ºC(2)

70%

Naidu e Sreenath (1999)

Batata (Solanum tuberosum L., cv. Macaca)

Microestacas de batata

9 meses

25 ºC ± 2 ºC(3)

76%

Fortes e Pereira (2001)

Curcuma longa cv. Prathibha

Ápices caulinares

12 meses

25 °C ± 2 °C(4)

56% a 50%

Tyagi et al. (2007)

(1) Material cultivado em meio MS ¼, adicionado de sacarose (90 g L-1), 16 h de luz (10 µmol m-2 s-1 a 20 µmol m-2 s-1).
(2) Material cultivado em meio MS, suplementado de ABA filtrado (18,9 µM), mantido no escuro.
(3) Material cultivado em meio MS, suplementado com sacarose (87,6 mM) e AAS (0 mg L-1 a 120 mg L-1), mantido a 16 h de luz.
(4) Material cultivado em meio MS, acrescido de BAP (2,5 mg L-1), açúcar comercial ou em cubos, sob 16 h a 40 μmol m-2 s-1.

No caso de lírio, por exemplo, baixas temperaturas não são diretamente aplicadas, em virtude do fato de que, sob temperatura de 0 ºC a 10 ºC, a dormência dos bulbinhos é quebrada, o que ocasiona a proliferação de brotos durante o armazenamento prolongado. Ademais, a morte dos bulbos de lírio durante o prolongado armazenamento à temperatura de -2 ºC é reportada, assim como a cristalização de gelo (BONNIER; VAN TUYL, 1997).

Uso de sementes sintéticas (técnica de encapsulamento)

Sementes artificiais ou sintéticas têm sido definidas como estruturas análogas à semente botânica, obtidas a partir do encapsulamento de micropropágulos (unidades encapsuláveis1) em endosperma artificial2, passíveis de ser utilizadas para semeadura sob condições in vitro ou ex vitro e, sobretudo, capazes de se converterem em plantas normais (GUEDES et al., 2007; HASSANEIN et al., 2005; STANDARDI; PICCIONI, 1998). Essa tecnologia foi inicialmente concebida por Murashige em 1977, e a primeira semente artificial envolveu embriões somáticos com a finalidade de melhorar a sua conversão. Desde então, desenvolveram-se diversos estudos, os quais permitiram sua aplicação não apenas para embriões somáticos, mas também para ápices caulinares, agregados de células, gemas axilares, entre outros propágulos vegetativos (GUEDES et al., 2007; NYENDE et al., 2003; STANDARDI; PICCIONI, 1998). No entanto, para os embriões somáticos, fatores como o desenvolvimento anormal, o longo período para sua indução e a falta de sincronia entre as fases da embriogênese têm desencorajado a utilização desse tipo de explante (NYENDE et al., 2003), exceto para espécies em que os protocolos já se encontrem bem definidos e sejam de utilização rotineira.

Sua aplicação na conservação de recursos genéticos vegetais in vitro tem sido mais expressiva a partir da última década, com relatos para diversas culturas, incluindo cereais, frutíferas, hortícolas, ornamentais e florestais (MALABADI; STADEN, 2005; NAIK; CHAND, 2006), porém poucos aplicam essa tecnologia em longo prazo (LISEK; ORLIKOWSKA, 2004; MARUYAMA et al., 1997; NASSAR, 2003; NYENDE et al., 2003) (Tabela 3). Tal situação tem sido atualmente modificada, especialmente após a integração da técnica de sementes sintéticas ao método de criopreservação, como o encapsulamento-desidratação e o encapsulamento-vitrificação. Além disso, ao contrário da semente natural ou botânica, as sementes sintéticas não acumulam reservas de armazenamento, nem desenvolvem mecanismo de tolerância à seca. Por isso, sua utilização para o armazenamento possui certas limitações quando se objetiva a conservação por longos períodos, o que irá depender do tipo de unidade encapsulável, da constituição do endosperma sintético, da temperatura de armazenamento, dentre outros (NYENDE et al., 2003).

Tabela 3. Exemplos de espécies para as quais a tecnologia de sementes artificiais a partir de cápsulas de alginato de cálcio tem sido utilizada para conservação in vitro de germoplasma.

Espécie

Explante utilizado

Tempo de conservação

Temperatura
(oC)

Sobrevivência/Conversão

Referência

Cedro (Cedrela dorata)

Ápices caulinares

12 meses

12

80%

Maruyama et al. (1997)

Guazuma crinita

Ápices caulinares

12 meses

25

90%

Maruyama et al. (1997)

Jacaranda mimosaefolia

Ápices caulinares

6 meses

20

70%

Maruyama et al. (1997)

Orquídea [Geodorum densiflorum (Lam) Schltr.]

Protocormos

4 e 6 meses

4

86% e 71,6%

Datta et al. (1999)

Morangueiro e framboeseira

Ápices caulinares

9 meses

4

≤ 60%

Lisek e Orlikowska (2004)

Café (Coffea arabica)

Microestacas

12 meses

20

59%

Nassar (2003)

Cedrela fissilis Vellozo

Ápices caulinares

6 meses

25

44%

Nunes et al. (2003)

Batata (Solanum tuberosum L.)(1)

Ápices caulinares

360 dias

4

51% a 71%

Nyende et al. (2003)

Pinus patula

Embriões somáticos

3 meses

4

73%

Malabadi e Staden (2005)

Orquídea (Vanilla spp.)

Brotos e protocormos

10 meses

22

Satisfatório

Divakaran et al. (2006)

Amoreira

Gemas axilares

1 a 4 meses

4

46,5% a 40,2%

Kavyashree et al. (2006)

Hibiscus moscheutos

Segmentos nodais

18 meses

5

–

West et al. (2006)

(1) Esses autores utilizaram o sistema conhecido por dupla camada (hollow beads), o qual será descrito posteriormente (PATEL et al., 2000).

O crescente interesse por essa técnica deve-se às suas várias vantagens (Figura 2), bem como à associação com outros sistemas de conservação, por meio da utilização de temperaturas ultrabaixas (criopreservação). Em relação aos fatores-chaves para o sucesso dessa tecnologia, destacam-se a avaliação e a otimização de parâmetros, como a concentração de alginato de sódio, a concentração e o tempo de exposição ao cloreto de cálcio e a constituição do endosperma sintético (cápsula) (Figura 3). Os primeiros, por influenciarem a textura, a forma e o tamanho da cápsula; e o último, por seu papel na nutrição das unidades encapsuláveis (NYENDE et al., 2003; GUEDES et al., 2007).

Figura 2. Principais vantagens inerentes ao emprego da técnica de sementes sintéticas para a conservação in vitro de recursos genéticos de plantas.

Fonte: Danso e Ford-Lloyd (2003), Maruyama et al. (1997), Nassar (2003), Nyende et al. (2003), Wang et al. (2002) e West et al. (2006).

Sistemas de encapsulamento e princípios de utilização

Basicamente são três os sistemas de encapsulamento utilizados na produção de sementes sintéticas de material vegetal, a saber: a) cápsula de camada simples (beads); b) cápsula de camada dupla (hollow beads); c) cápsula farmacêutica. Todavia, apenas os dois primeiros serão abordados em virtude de sua maior aplicação na área vegetal.

Figura 3. Tipos de unidades encapsuláveis utilizadas para a produção de sementes sintéticas, visando à conservação in vitro de germoplasma vegetal. (A) microestaca (segmento nodal); (B) semente de orquídea recém-germinada in vitro; (C) embrião zigótico de café; (D) microbroto de abacaxi; (E) ápice caulinar; (F) embrião somático.

Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.

 Cápsula de camada simples (beads) – Este sistema consiste inicialmente em misturar as unidades encapsuláveis, sob condições de total assepsia, à matriz de encapsulamento com alginato de sódio. Posteriormente, com o auxílio de uma pipeta automática e uma ponteira autoclavada, ou de uma seringa descartável, os micropropágulos são individualmente resgatados juntamente com uma alíquota de endosperma sintético, e gotejados em solução de cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) para complexação3 (formação da cápsula). Passado determinado tempo, as cápsulas que contenham cada unidade encapsulável (sementes sintéticas) são submetidas à tríplice lavagem em água destilada e esterilizada para a retirada do excesso de CaCl2.2H2O, e, em seguida, são conservadas. Depois de conservadas, caso seja necessário, realiza-se a imersão das sementes sintéticas em solução de nitrato de potássio (KNO3), por certo período (descomplexação4), e faz-se nova lavagem. Por fim, as sementes artificiais são semeadas in vitro em recipientes para emergência das unidades encapsuláveis e para conversão em plantas (Figura 4).

Figura 4. Representação geral dos procedimentos necessários à produção de sementes sintéticas, no sistema de camada simples (beads), utilizando-se a técnica de encapsulamento com alginato de sódio. As setas largas indicam os eventos que ocorrem durante as etapas de complexação, de descomplexação e de conversão.

Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.

Cápsula de dupla camada (hollow beads) – Nas cápsulas de alginato de cálcio convencionais (beads ou camada simples) os micropropágulos geralmente ficam localizados próximos da superfície (Figura 5). Isso ocorre graças ao processo de produção da cápsula, no qual a completa proteção das unidades encapsuláveis não é conseguida, como ocorre na semente botânica (PATEL et al., 2000). Assim, esses autores propuseram como alternativa o método da dupla camada (hollow beads), com vistas tanto na conservação quanto na produção de sementes sintéticas de células vegetais, de ápices caulinares ou de embriões somáticos.

O método consiste inicialmente em misturar o material vegetal (unidades encapsuláveis) em 10 mL de solução (1,5%) de carboximetilcelulose com cloreto de cálcio (1%), seguido de gotejamento da suspensão (com o auxílio de seringa 10 mL) dentro de 400 mL de uma solução de alginato de sódio (0,8%). Assim, na superfície de cada gota, uma camada de alginato de cálcio é formada de dentro para fora, enquanto a região central permanece líquida. Decorridos 10 minutos de gelatinização, a solução de alginato com as hollow beads é diluída com água deionizada (400 mL), e a solução diluída é decantada (procedimento que é realizado duas vezes). Por fim, as hollow beads são transferidas dentro de solução de cloreto de cálcio (1%) e deixadas por mais 20 minutos para endurecer (polimerização). Como resultado, obtêm-se cápsulas constituídas de uma região central líquida, circundada por uma membrana de alginato de cálcio (Figura 5). Comparativamente, a Figura 5 mostra o sistema de cápsulas convencionais (beads), na qual se mistura o material com a solução de alginato de sódio, seguido de gotejamento na solução de cloreto de cálcio, o que resulta na gelatinização de fora para dentro da cápsula.

Figura 5. Representação dos sistemas de encapsulamento por cápsula de camada simples (beads) e de camada dupla (hollow beads) (PATEL et al., 2000).

Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.

As principais vantagens desse método, quando comparado com as cápsulas convencionais, incluem a completa proteção das unidades encapsuláveis e a não emergência precoce do explante. Utilizando esse método, Nyende et al. (2003) conseguiram satisfatório armazenamento por prolongados períodos de germoplasma de batata, em que houve 100% de regeneração dos ápices caulinares por até 180 dias, à temperatura de 4 ºC e 10 ºC. Ademais, após 270 dias, nenhuma regeneração ocorreu à 10 ºC, enquanto 100% foi registrada à 4 ºC. Além disso, os explantes encapsulados mostraram razoável regeneração após 360 dias à 4 ºC (51,5% a 70,8% entre os genótipos).

Criopreservação

Historicamente, apesar de a técnica de criopreservação ser relativamente antiga e bem estudada na área microbiológica e ani-mal, os estudos com vegetais superiores têm sido conduzidos apenas durante os últimos 40 anos, e duas principais linhas de pesquisa são seguidas: a) o melhor entendimento dos processos fisiológicos e bioquímicos envolvidos no processo de congelamento; b) a conservação de material vegetal sob condições viáveis (WITHERS; ENGELMANN, 1998). No caso específico da conservação in vitro, o rápido desenvolvimento nas últimas décadas, de novas tecnologias de criopreservação tem permitido que se ampliem em longo prazo as possibilidades de armazenamento de espécies cultivadas, florestais e daquelas em risco de extinção (PANIS; LAMBARDI, 2006).

Em princípio, a criopreservação é um método baseado na manutenção do metabolismo do material vegetal (explantes) sob condições de ausência de divisão celular ou de metabolismo zero. Para isso, os explantes são submetidos a temperaturas ultrabaixas (temperatura do nitrogênio ou NL: -196 °C ou -150 °C), na presença ou ausência de substâncias crioprotetoras. Tanto a temperatura do NL quanto a energia cinética molecular e a difusão são extremamente baixas e, assim, todas as divisões celulares e os processos metabólicos ocorrem muito lentamente ou são totalmente paralisados, o que permite a conservação por um período de tempo teoricamente ilimitado. Desse modo, a variabilidade genética e a deterioração do material armazenado são teoricamente inexistentes. Aliado a esses aspectos, o armazenamento em um banco criogênico custa mais barato que outros sistemas disponíveis, o que se deve ao fato do material criopreservado necessitar de pequeno volume, permitir a manutenção da sanidade do germoplasma preservado e requerer um mínimo de manutenção (ENGELMANN, 2004; SANTOS, 2004).

Nesse contexto, embora os estudos sobre os custos da criopreservação sejam ainda incipientes, estimativas têm confirmado vantagens financeiras quando se usa a criopreservação para a conservação de germoplasma. Por exemplo, os custos de manutenção anual de um acesso de fruteira temperada são de US$ 77,00 no campo, US$ 23,00 sob condições de crescimento lento in vitro e somente US$ 1,00 quando se utiliza a criopreservação. Já os custos anuais para conservar coleções de mandioca no Ciat (International Center for Tropical Agriculture, Cali, Colômbia), que inclui 5 mil acessos, chegam a cerca de US$ 5 mil sob criopreservação, ao passo que sob crescimento lento in vitro chegam a US$ 30 mil (ENGELMANN, 2004).

Além de sua capacidade de permitir o armazenamento de tecidos de maneira indefinida, com baixos riscos ao material conservado (RAZDAN, 2003), outra vantagem da criopreservação é a preservação, por prolongado período, de tecidos com características específicas, como linhagens de células medicinais e produtoras de alcaloides, cultura de pelos radiculares, tecidos geneticamente transformados e linhagens competentes a transformação (PANIS; LAMBARDI, 2006). Todavia, a criopreservação não é aplicável apenas à conservação de germoplasma. Ela pode ser também utilizada para os seguintes procedimentos: erradicação de vírus, fato demonstrado para as culturas da ameixeira, da bananeira e da videira (BRISON et al., 1997; HELLIOT et al., 2002; PANIS; LAMBARDI, 2006); criosseleção (seleção de amostras com propriedades especiais na população congelada); propagação de espécies em larga escala, baseada no processo de embriogênese somática, como no caso das coníferas, além da manutenção da juvenilidade de tecidos vegetais (ENGELMANN, 2004).

Desde 1975, o progresso obtido com essa tecnologia na área vegetal tem possibilitado a regeneração de plantas completas a partir de células, de meristemas e de embriões congelados e armazenados por longos períodos de tempo, quase indefinidos. Atualmente, a criopreservação tem sido utilizada com sucesso na conservação de germoplasma de um amplo número de culturas comercialmente importantes, como a mandioca (Manihot esculenta), a ervilha, o arroz, o coco, a cana-de-açúcar, a banana e o morango, além de outras espécies de uso medicinal, que se encontram ameaçadas de extinção (RAZDAN, 2003). Ademais, para espécies que possuem sementes recalcitrantes, tem-se observado menor avanço na pesquisa, possivelmente por causa do alto número de espécies, principalmente das selvagens, cada qual com características distintas, além do limitado nível de atividades de pesquisa envolvendo a conservação dessas espécies (ENGELMANN, 2004).

Sem dúvida, a criopreservação é atualmente a técnica de conservação in vitro que mais tem sido estudada. O aprimoramento de tecnologias voltadas para essa técnica tem promovido tanto a diversificação de seus métodos quanto a ampliação de seus usos (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Tal fato deve-se muito provavelmente aos significativos progressos que têm sido realizados na área nos últimos 15 anos, com o desenvolvimento de procedimentos baseados no fenômeno da vitrificação (ENGELMANN, 2004). No entanto, embora existam vários procedimentos criogênicos para um crescente número de espécies produtoras de sementes recalcitrantes e de órgãos/tecidos in vitro, o emprego rotineiro da criopreservação na biodiversidade vegetal é ainda considerado limitado (PANIS; LAMBARDI, 2006).

De modo geral, materiais como sementes ortodoxas ou brotos dormentes podem ser criopreservados sem qualquer pré-tratamento, o que é atribuído ao processo natural de desidratação desses materiais. Porém, a maior parte dos explantes criopreservados (suspensão de células, de calos, de ápices caulinares e de embriões) é constituída de altas quantidades de água celular livre, o que os torna mais sensíveis a danos durante o congelamento. Por essa razão, as células necessitam sofrer desidratação artificial para protegerem-se dos danos ocasionados pela cristalização da água intracelular em gelo, o que pode ser conseguido pelo uso de protocolos de criopreservação clássicos e por aqueles baseados na vitrificação, este último muitas vezes mais eficiente (MIAJA et al., 2000). Na Tabela 4, citam-se alguns exemplos do uso da criopreservação em larga escala para diferentes tipos de materiais, tolerantes ou não a desidratação (ENGELMANN, 2004).

Tabela 4. Exemplos práticos do uso em larga escala da criopreservação para conservação in vitro de recursos genéticos vegetais.

Material

Quantidade

Local

Espécies produtoras de sementes ortodoxas raras, ameaçadas de extinção e com limitada longevidade

37.654 acessos (cerca de 360.629 sementes)

National Center For Genetic Resources Preservation (NCGRP, Fort Collins, CO, EUA)

1.200 acessos de 50 diferentes espécies, principalmente plantas medicinais em extinção

National Bureau of Plant Genetic Resources (NBPGR, Nova Délhi, Índia)

Espécies produtoras de sementes intermediárias

Sementes de 80 acessos de Coffea arabica

Tropical Agricultural Research and Higher Education Center (Catie, Costa Rica)

Pólen

65 acessos de diferentes espécies

National Bureau of Plant Genetic Resources (NBPGR, Nova Délhi, Índia)

600 acessos que pertencem a 40 espécies de 15 diferentes famílias

Indian Institute of Horticultural Research (IIHR, Bangalore, Índia)

13 cultivares de pera e 24 espécies de Pyrus

National Center For Genetic Resources Preservation (NCGRP, Fort Collins, CO, EUA)

Espécies multiplicadas vegetativamente

519 variedades de batata

Institute for Crop and Grassland Science em Braunschweig (Alemanha)

200 acessos de batata

International Potato Center (CIP, Lima, Peru)

100 acessos de germoplasma de Musa

International Network for the Improvement of Banana and Plantain (INIBAP)

Fonte: Adaptado de Malaurie (2001), Panis e Lambardi (2006) e Keller et al. (2006).

Quanto aos fatores que determinam o sucesso da criopreservação, cita-se a proteção dos explantes contra injúrias durante o congelamento, as quais podem ocorrer em virtude da formação de cristais de gelo dentro das células que causam o rompimento das organelas e da própria célula (lise celular). Nesse sentido, o estado da água e o equilíbrio osmótico relacionado aos movimentos da água dentro e fora das células são parâmetros de particular importância para a criopreservação, uma vez que a água removida possui papel vital na prevenção da injúria pelo congelamento e na manutenção da viabilidade pós-descongelamento, essencial para o restabelecimento e para o crescimento do material criopreservado. Outra fonte potencial de dano às células está relacionada ao incremento na concentração de solutos intracelulares em níveis tóxicos, ou a perdas de solutos vitais durante o congelamento (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008; RAZDAN, 2003).

Etapas do processo de criopreservação

Independentemente da técnica utilizada, de modo geral o processo de criopreservação é constituído basicamente de cinco fases distintas: a) congelamento; b) armazenamento; c) descongelamento; d) restabelecimento dos explantes criopreservados; e) determinação da viabilidade.

a) Congelamento

Consiste em suspender os explantes em meio de cultura. Em seguida, realiza-se o tratamento com crioprotetores, a transferência para criotubos estéreis e o congelamento do material a partir de diferentes métodos, tais como: congelamento lento, rápido e/ou intermediário; congelamento seco; vitrificação ou encapsulamento-desidratação (Tabela 5). A escolha de um desses processos deverá considerar o grau de sensibilidade de cada material vegetal e de cada espécie a ser trabalhada (RAZDAN, 2003).

Tabela 5. Alguns métodos utilizados na fase de congelamento em protocolos de criopreservação de germoplasma vegetal.

Tipo de congelamento

Considerações gerais sobre o método

Lento

Primeiramente, o material é submetido ao congelamento por meio de taxas baixas de congelamento/esfriamento (de 0,5 ºC min-1 a 4 ºC min-1), iniciando-se em 0 ºC até alcançar -100 ºC. Em seguida, é transferido para NL (-196 ºC). Desse modo, ocorre o aumento da desidratação celular, que progressivamente concentra os constituintes celulares e diminui o ponto de congelamento, evitando assim os danos advindos da formação de gelo (ice damage) (Figura 6). Contudo, existe o risco de que a excessiva concentração de solutos possa ocasionar toxicidade. Ademais, se a taxa preliminar de resfriamento for muito rápida, pode ocorrer o aumento do gelo intracelular, o que ocasiona a ruptura das membranas da célula, notavelmente o plasmalema e tonoplasto (Figura 6) (GEORGE, 1993)

Rápido

Baseia-se na transferência direta dos frascos (criotubos) que contêm os explantes para NL (Figura 7), de modo que se reduza rapidamente a temperatura, a uma taxa que varia de -300 °C a 11.000 ºC min-1

Intermediário
(step-wise)

É caracterizado por combinar as vantagens dos métodos de congelamento lento e rápido. Para isso, o material vegetal é inicialmente resfriado a uma temperatura intermediária (de 1 ºC min-1 a 5 ºC min-1, por 30 minutos), seguido da imersão rápida em NL. Dessa forma, ocorre a formação de gelo na região externa às células, e o protoplasma não congelado perde água em virtude do deficit de pressão de vapor entre o protoplasma supercoloide e o gelo externo. Esse tipo é reportado para ampla variedade de explantes, incluindo ápices caulinares, gemas e culturas em suspensão, o que possibilita aos ápices caulinares de morangueiro um aumento de 60% a 80% na sobrevivência, quando comparado ao método de congelamento rápido (SAKAI, 1997)

Vitrificação

Inicialmente relatado para células vegetais por Uragami et al. (1989) e Langis et al. (1989), tem sido o método escolhido em larga escala para conservar tecidos vegetais por longos períodos (HELLIOT et al., 2002). A técnica é baseada no fenômeno de vitrificação, que se caracteriza por um processo físico definido como a transição da água diretamente da fase líquida para uma fase sólida amorfa (solução supersaturada e de alta viscosidade), obtido normalmente pela exposição a soluções crioprotetoras altamente concentradas, em que não há formação de gelo cristalino no congelamento

Encapsulamento desidratação

Nessa técnica, as células/tecidos são inicialmente encapsuladas em alginato de sódio, seguido de incubação em sacarose (0,85 M) (por 4–16 horas), de secagem das cápsulas em fluxo laminar (3–4 horas) e de posterior congelamento rápido em nitrogênio líquido. Dessa maneira, o material é induzido a adquirir tolerância à desidratação pelo uso exclusivo da sacarose como único crioprotetor. Porém, ressalta-se que esse método necessita de um controle cuidadoso quanto aos procedimentos para desidratação e penetração de crioprotetores, a fim de prevenir danos por toxidez química ou por excesso de estresse osmótico durante a desidratação

b) Armazenamento/manutenção das culturas criogênicas

Figura 6. Representação dos eventos físico-químicos que ocorrem às células do material vegetal a ser conservado durante o resfriamento lento.

Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.

Representa importante etapa do sistema de criopreservação, já que a manutenção do material congelado sob temperatura apropriada é fundamental para prevenir o aparecimento de cristais de gelo e, consequentemente, manter a viabilidade do material. Assim, as culturas são geralmente armazenadas a -196 ºC em botijões específicos, o que requer um suprimento constante de nitrogênio líquido. Nessa fase é também importante a realização de testes periódicos em algumas amostras durante o longo período de conservação para controle da viabilidade do material.

Figura 7. Representação dos eventos físico-químicos que ocorrem às células dos materiais vegetais a serem conservados, durante o esfriamento rápido.

Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.

c) Descongelamento

Consiste na imersão dos materiais criopreservados em água, à temperatura de 37 ºC a 40 ºC, que corresponde a um rápido descongelamento (de 500 ºC min-1 a 750 ºC min-1). Dessa maneira, as células são protegidas dos efeitos danosos decorrentes da formação de cristais de gelo, o que enfatiza a necessidade de se reduzir o conteúdo de água das células a um nível ótimo antes do congelamento.

d) Restabelecimento

Esta fase – considerada chave para o sucesso de qualquer protocolo de criopreservação – consiste em submeter o material descongelado ao restabelecimento do crescimento sob condições padrões. Isso porque todo material criopreservado deve necessariamente ser capaz de restabelecer seu padrão de crescimento e, com isso, ser utilizado para os devidos fins, caso contrário todo o material será perdido. Para tal, os materiais descongelados são lavados, normalmente por várias vezes5, para remoção das substâncias crioprotetoras utilizadas, as quais podem provocar injúria às células. Em seguida, os materiais são restabelecidos em meio de cultura fresco, o qual pode conter ou não substâncias reguladoras de crescimento, composição nutricional diferenciada, entre outras modificações, o que vai depender do material criopreservado (meristemas, plantas organizadas, calos, etc.).

e) Determinação da viabilidade

Após a criopreservação, é também importante que o material possua a capacidade de ser utilizado. Para isso, sua viabilidade pode ser rapidamente avaliada logo após a fase de descongelamento. Com esse intuito, algumas técnicas podem ser utilizadas, tais como: submissão do material criopreservado a testes de coloração com Fluorescein Diacetate (FDA) ou cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC) (RAZDAN, 2003); observações morfológicas sob microscópio de luz (expansão e esverdeamento de primórdios foliares, por exemplo) (MIAJA et al., 2000); observações em microscópio eletrônico, além de observações de fatores associados a estabilidade genética, os quais serão abordados posteriormente.

Protocolos de criopreservação

De modo geral, atualmente existem dois tipos de protocolos que são considerados para criopreservação: os convencionais ou clássicos, e aqueles baseados no processo de vitrificação, os quais diferem em seus mecanismos físicos.

Protocolos clássicos ou convencionais

No início, a maioria dos trabalhos sobre criopreservação de culturas in vitro tinha como foco um método baseado na crioproteção química e no esfriamento com desidratação gradual do material vegetal, protocolo particularmente promissor para cultura de células em suspensão (RAZDAN, 2003). Nos protocolos clássicos ou convencionais, a fase de congelamento é realizada na presença de gelo, e os protocolos envolvem, de maneira geral, as seguintes fases: a) pré-tratamento dos explantes com soluções crioprotetoras compostas de uma simples substância, ou de uma mistura de substâncias químicas, como o dimetil sulfóxido (DMSO); b) congelamento lento a uma determinada temperatura de pré-congelamento; c) rápida imersão em NL; d) armazenamento; e) descongelamento rápido; f) restabelecimento (ENGELMANN, 2004). Por sua vez, as substâncias crioprotetoras são usualmente adicionadas progressivamente até uma concentração final, que é inferior àquela das soluções crioprotetoras usadas nos protocolos de vitrificação. Contudo, embora esse pré-tratamento remova alguma água das células, a maior parte é retirada durante a primeira etapa do procedimento de esfriamento (esfriamento lento/pré-congelamento). Assim, na segunda fase do congelamento (imersão rápida em nitrogênio líquido), ocorre a cristalização da água remanescente ou a vitrificação dos solutos intracelulares (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).

São técnicas geralmente com certa complexidade operacional, que requerem normalmente a utilização de caros e sofisticados freezers programáveis, embora, em alguns casos, o uso desses equipamentos seja desnecessário, pois a fase de congelamento lento pode ser realizada com um freezer doméstico. Em relação à sua aplicação, sucesso tem sido reportado para sistemas não diferenciados como células em suspensão, calos e ápices caulinares de espécies tolerantes ao frio (ENGELMANN, 2004), diferentemente das espécies tropicais, para as quais tais procedimentos têm ocasionado danos em ampla zona do domo apical dos ápices caulinares, com exceção da cultura da mandioca (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).

Protocolos atuais baseados na vitrificação

Nas técnicas clássicas de criopreservação, a remoção do conteúdo de água celular e o comportamento da água remanescente durante os processos de congelamento e descongelamento ainda são considerados críticos para obtenção de sucesso. Por esse motivo, novas tecnologias têm sido desenvolvidas e estudadas. Tais técnicas são baseadas no fenômeno de vitrificação, um processo físico definido como a transição da água diretamente da fase líquida para uma fase sólida amorfa, de modo que se evite a formação de gelo cristalino (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).

A principal característica dos protocolos é o drástico processo de desidratação ao qual as amostras (material vegetal/explantes) são submetidas. Esse grau de desidratação celular e de dessecação antes do congelamento é obtido pela exposição a soluções crioprotetoras altamente concentradas (soluções de vitrificação) e/ou a condições físicas de secagem (ar estéril do fluxo laminar). Consequentemente, maior eficiência na remoção da água intracelular é alcançada, já que a maior parte, ou toda a água congelável, é retirada durante a fase de desidratação. Decorrido essa fase, as amostras são submetidas ao esfriamento, geralmente realizado de forma rápida pela imersão direta em NL, o que reduz a vitrificação dos solutos intracelulares. Assim, as células hidratadas, os tecidos e os órgãos são capazes de resistir à exposição à temperatura do NL, pois todos os fatores que influenciam a formação de gelo intracelular são evitados (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008; WITHERS; ENGELMANN, 1998). Engelmann (2004) afirma ainda que, em todos os novos protocolos de criopreservação, a fase crítica é a de desidratação, essencial para que se obtenha sobrevivência do material criopreservado; os protocolos clássicos, por sua vez, têm como fase crítica o congelamento.

Quando comparada às técnicas clássicas de congelamento, a criopreservação por vitrificação apresenta vantagens práticas. É a mais indicada para materiais, tais como órgãos complexos (ápices caulinares e embriões), constituídos por vários tipos celulares com exigências únicas. Ademais, pelo fato de evitar a formação de gelo no interior das células, apresenta o potencial de permitir que estruturas meristemáticas permaneçam intactas, além de assegurar altas taxas de restabelecimento dos explantes criopreservados de modo direto (sem passar pela fase de calos). Além disso, os procedimentos são operacionalmente menos complexos (não exige o uso de congeladores controlados) e possuem um amplo espectro de aplicação, ou seja, necessitam apenas de poucas modificações para diferentes tipos de células (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Os progressos na área de criopreservação vegetal, que utilizam protocolos baseados na vitrificação, têm sido desenvolvidos desde o final da década de 1980 e início dos anos de 1990. Esses processos permitiram, de modo geral, a existência de sete diferentes protocolos que são usados atualmente, muitos dos quais podem ser considerados combinações ou incorporações de outros: a) pré-crescimento; b) desidratação; c) pré-crescimento-desidratação; d) encapsulamento-desidratação; e) vitrificação; f) encapsulamento-vitrificação; g) droplet-freezing. O maior sucesso tem sido conseguido com os métodos de vitrificação, de encapsulamento-vitrificação e de droplet-freezing (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).

a) Pré-crescimento

Esta técnica baseia-se no cultivo dos explantes na presença de substâncias crioprotetoras, seguido do congelamento rápido pela imersão direta em NL (ENGELMANN, 2004).

b) Desidratação

É um procedimento simples que consiste na desidratação dos explantes, seguida do congelamento rápido pela imersão direta em NL. A dessecação pode ser conduzida em câmaras de fluxo laminar, de corrente de ar comprimido, ou, ainda, em dessecador com sílica gel. O tempo de dessecação varia de acordo com o tamanho do explante e com a quantidade de seu conteúdo de água (o ótimo está abaixo de 10% a 20 % de umidade, com base no peso fresco). Após o armazenamento, o material é submetido ao descongelamento e, então, transferido diretamente para seu restabelecimento sob condições padrões. Essa técnica tem sido aplicada para embriões zigóticos, ápices caulinares e eixos embrionários e há relatos em embriões de várias espécies recalcitrantes e intermediárias. Além disso, o estado fisiológico do material é considerado um fator importante, já que taxas variáveis são observadas quanto à sobrevivência (ENGELMANN, 2004; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

c) Pré-crescimento-desidratação

Em geral, compreende as seguintes etapas: tratamento de pré-crescimento com crioprotetores, dessecação (sob fluxo laminar ou sílica gel), congelamento rápido em NL, descongelamento rápido ou sob temperatura ambiente e recrescimento em meio padrão. O processo de dessecação segue o mesmo raciocínio do método de desidratação, enquanto o conteúdo ótimo de água para armazenamento deve estar entre 12% e 30%. Sua aplicação tem sido apenas para um limitado número de explantes (segmentos caulinares de plantas in vitro, embriões somáticos e zigóticos) e em poucas espécies até o momento (aspargo, melão, dendê e coco). Além disso, os materiais criopreservados que utilizam esse procedimento têm apresentado satisfatórias taxas de sobrevivência, além de um recrescimento normalmente rápido e direto, embora alterações nos padrões possam ocorrer em função do explante (ENGELMANN, 2004; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

d) Encapsulamento-desidratação

Este método, inicialmente descrito para meristemas de Solanum (FABRE; DEREUDDRE, 1990), fundamenta-se na tecnologia desenvolvida para a produção de sementes sintéticas, na qual explantes são encapsulados numa matriz de alginato de cálcio. Depois que os explantes são encapsulados, as sementes sintéticas resultantes são submetidas às seguintes fases: a) pré-cultivo6 em meio com alta concentração de sacarose (1–7 dias), exceto para espécies sensíveis que são submetidas a um progressivo incremento nos níveis de sacarose; b) desidratação/secagem dos explantes encapsulados sob atmosfera de fluxo laminar de ar, ou sílica gel7, até cerca de 20% de água; c) transferência para criotubos e submissão ao congelamento de forma rápida, pela imersão direta em NL, ou lentamente (abaixo de -100 ºC), dependendo do explante e do controle de conteúdo de água residual nas células; d) descongelamento do material criopreservado; e) recrescimento8 do material descongelado diretamente sob condições de cultivo padrão (ENGELMANN, 2004; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

Comparada a outras técnicas de criopreservação, o encapsulamento-desidratação apresenta as seguintes vantagens: fácil manipulação dos explantes, possibilidade de armazenar grandes quantidades de tecidos delicados, utilização de crioprotetores não tóxicos (sacarose, glicerol) e eficiência na proteção dos explantes durante a desidratação (VERLEYSEN et al., 2005). Ademais, apresenta a possibilidade de congelar com sucesso explantes de dimensões relativamente grandes, como ápices caulinares (> 5 mm de comprimento) e embriões nos estágios torpedo e coração (2 mm a 3 mm), além de preservar a integridade estrutural de muitas células meristemáticas, evitando, assim, a formação de calo após a criopreservação (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

e) Vitrificação

É um método efetivo contra o congelamento. Para tanto, utiliza soluções crioprotetoras, caracterizadas por serem altamente concentradas e por superesfriarem sob temperatura muito baixa. Isso permite a solidificação das estruturas de forma que se mantenham viscosas e estáveis, além de evitar o processo de cristalização e os danos por injúrias. Tais soluções, conhecidas pelas siglas PVS29 ou PVS3, são misturas complexas de substâncias crioprotetoras selecionadas por sua habilidade para vitrificar, ou seja, formar uma estrutura amorfa durante a etapa de esfriamento. Geralmente, baseiam-se em glicerol e apresentam menor toxidez, de maneira que sua utilização sob 25 ºC ou 0 ºC causa suficiente desidratação em células ou em meristemas sem, no entanto, provocar qualquer dano antes da fase de imersão em NL (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

De modo geral, os procedimentos de criopreservação via vitrificação consistem nos seguintes passos: a) tratamento do material vegetal com substâncias crioprotetoras (solução loading); b) desidratação com uma solução de vitrificação altamente concentrada (solução de vitrificação); c) esfriamento rápido pela imersão direta em NL; d) reaquecimento por imersão em água ou meio líquido em temperatura que varia de 20 ºC a 40 ºC, com o intuito de evitar o processo de devitrificação, o que pode levar à formação de cristais de gelo e prejudicar a integridade celular; e) remoção da solução de vitrificação (unloading) para evitar choque osmótico, o que é conseguido por meio da diluição da solução de vitrificação em meio líquido suplementado com sacarose ou sorbitol; f) recrescimento em meio de cultura padrão (WANG et al., 2005a; WITHERS; ENGELMANN, 1998).

O tempo de exposição a cada solução, bem como a concentração de algumas substâncias, variam entre os diferentes protocolos empregados (tipo de explantes, tamanho, etc.). No entanto, a prolongada exposição a soluções de vitrificação pode ocasionar injúrias nos explantes em decorrência da toxidez química ou do excesso de dessecação/desidratação. Nesse sentido, o pré-cultivo dos explantes em meio que contenha açúcar ou açúcares álcoois parece auxiliar na tolerância à dessecação, pois submete os explantes a um moderado estresse osmótico, que incrementa a tolerância (TOUCHELL et al., 2002).

Variações quanto aos protocolos baseados na vitrificação são observadas também para a fase de desidratação quando se utiliza a solução PVS, que pode ocorrer tanto em temperatura de 0 ºC quanto em temperatura ambiente. Nesse caso, Withers e Engelmann (1998) afirmam que, à temperatura de 0 ºC, ocorre redução da toxicidade dos explantes às soluções de vitrificação, o que resulta em maiores chances de sucesso. O recrescimento, por sua vez, geralmente é rápido, direto e com alta sobrevivência; no entanto, pode ocorrer desenvolvimento anormal dos explantes.

Entre as vantagens desse método, cita-se o fato de a vitrificação não requerer o uso de equipamentos programáveis ou ultrafreezers (-80 ºC), considerados caros, além de evitar a formação de gelo pelo uso de soluções crioprotetoras altamente concentradas, as quais dessecam as células e penetram nelas formando uma solução intracelular altamente viscosa, que, por sua vez, forma cristais metaestáveis a baixas temperaturas (ENGELMANN, 2004). Somado a isso, o procedimento de vitrificação é fácil de conduzir e, frequentemente, apresenta alta percentagem de restabelecimento (TAKAGI et al., 1997; THINH et al., 1999). Por esses motivos, tem-se tornado o método preferível para criopreservação nas últimas décadas, além de ser aplicado com sucesso para criopreservar pelo menos 140 espécies e cultivares atualmente (ENGELMANN, 2004). Ademais, pelo fato de os protocolos baseados na vitrificação e no encapsulamento-desidratação desidratarem a maior parte da água congelável a temperaturas não congeláveis e permitirem a imersão direta em NL, eles são simplificados e possibilitam ampliar a aplicação da criopreservação para diversos materiais, especialmente no caso de espécies tropicais (HIRAI; SAKAI, 2003) e de espécies particularmente sensíveis à baixa temperatura (WANG et al., 2005a).

f) Encapsulamento-vitrificação

Consiste na combinação entre o método de encapsulamento-desidratação e os procedimentos de vitrificação. Nesse método, os explantes são primeiramente encapsulados em cápsulas de alginato, sendo as sementes sintéticas posteriormente submetidas ao pré-cultivo. Em seguida, elas são tratadas com uma solução de vitrificação, armazenadas em NL, descongeladas e restabelecidas para crescimento (ENGELMANN, 2004; WANG et al., 2005b).

De modo semelhante à técnica de encapsulamento-desidratação, o encapsulamento-vitrificação apresenta como vantagens o fato de a cápsula (sementes sintéticas) permitir que os explantes sejam imersos diretamente em NL. Com isso, não é necessário o uso de freezers programáveis. Além disso, essa tecnologia, comparada a outros protocolos, como o da vitrificação, proporciona maior flexibilidade e facilidade de armazenamento de grande número de materiais (WANG et al., 2005b).

g) Droplet freezing

Este método, primeiramente desenvolvido para a cultura da batata, na década de 1970, tem possibilitado bons resultados, com altas taxas de sobrevivência (ENGELMANN, 2004; SANT et al., 2008). Consiste basicamente no tratamento dos explantes com solução que contém substâncias crioprotetoras, a qual é substituída pela solução de vitrificação. Em seguida, os explantes são dispostos sobre tiras de papel alumínio com minúsculas gotículas da solução de vitrificação, que são posteriormente imersas em NL, transferidas para criotubos com NL e submetidas ao descongelamento. Em seguida, os explantes são transferidos para a fase de restabelecimento (SANT et al., 2008).

Na Tabela 6, é possível observar alguns exemplos de trabalhos que envolvem as diferentes metodologias para a criopreservação de material vegetal.

Tabela 6. Exemplos de pesquisas que envolvem as diferentes metodologias de criopreservação, com vistas na conservação in vitro de recursos genéticos vegetais.

Espécie

Técnica de criopreservação

Explante

Tempo de armazenamento

Referência

Citrus spp.

Técnicas convencionais/clássicas

Cultura de calos embriogênicos

Até dois anos, com boa viabilidade e produção de embriões com bom padrão de crescimento

Pérez et al. (1997)

Batata-doce [Ipomoea batatas (L.) Lam.]

Droplet vitrification

–

Pennycooke e Towill (2000)

‘Troyer’ citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. × Citrus sinensis (L.) Osbeck.]

Encapsulamento-vitrificação

Ápices caulinares

Apenas imersão em NL por algumas horas

Wang et al. (2002)

Batata-doce [Ipomoea batatas (L.) Lam.]

Encapsulamento-vitrificação

–

Hirai e Sakai (2003)

Cosmos atrosanguineus

Encapsulamento-desidratação

Ápices caulinares

12 meses, com boa sobrevivência e recrescimento

Wilkinson et al. (2003)

Banana (Musa spp.)

Vitrificação

Meristemas

–

Helliot et al. (2003)

Crisâtemo (Dendranthema grandiflora Ramat.)

Várias

Ápices caulinares

–

Halmagyi et al. (2004)

Mamão (Carica papaya L.)

Vitrificação

Ápices caulinares

Dois anos, com percentual de sobrevivência acima de 70%

Wang et al. (2005a)

Framboesa (Rubus idaeus L.)

Encapsulamento-vitrificação e encapsulamento-desidratação

Ápices caulinares

–

Wang et al. (2005b)

Dendê Elaeis guineensis

Imersão rápida

Sementes

7 dias

Camillo et al. (2009)

Pinhão manso Jatropha curcas

Imersão rápida

Sementes

1 dia

Carvalho et al. (2009)

Orquídea (Híbridos de Dendrobium)

Vitrificação

Sementes

–

Vendrame et al. (2007)

Colocasia esculenta var. esculenta

Droplet vitrification

Ápices caulinares

–

Sant et al. (2008)

Estudos fisiológicos e moleculares relacionados à conservação in vitro de germoplasma

A utilização de tampas de polipropileno e de filme plástico como sistema de vedação, para prevenir a contaminação e a dessecação das culturas armazenadas in vitro, restringe a ocorrência de trocas gasosas entre a atmosfera dos frascos e o ambiente externo. Como consequência, gases como o etileno são acumulados no interior do recipiente de cultivo, os quais têm sido associados com algumas das anormalidades observadas nos materiais mantidos in vitro (SARKAR et al., 2002). Ademais, a alta umidade mantida nos recipientes de cultivo, aliada aos efeitos advindos do uso de reguladores de crescimento, de crioprotetores, de processos de natureza física e química, é fonte potencial para induzir desordens fisiológicas, estruturais e genéticas nos materiais sob conservação.

Para a maioria das culturas, a conservação in vitro de germoplasma pelo uso de técnicas de crescimento lento tem sido a melhor alternativa. Porém, pelo fato de os subcultivos serem mais espaçados nessas condições, o acúmulo de gases no interior dos frascos de cultivo, como o etileno, pode ser danoso e, em alguns casos, dificultar ou impossibilitar que plantas normais sejam regeneradas ao final do armazenamento. Isso ocorre porque algumas espécies respondem negativamente quando expostas ao etileno. Como alternativa para essas espécies, poderiam ser listadas a realização de transferências periódicas para meio de cultura fresco e a utilização de sistemas de vedação que permitisse a troca gasosa, entre outras. No entanto, quando o intuito é conservar germoplasma in vitro, tais alternativas podem ser onerosas, por causa da elevação dos custos, tanto pela aquisição de tampas especiais quanto pela constante necessidade de mão de obra para as repicagens. Além disso, existem os riscos quanto aos erros de manipulação das culturas e à ocorrência de contaminações microbianas, que são indesejáveis, principalmente quando existe pequena quantidade do germoplasma a ser preservado (SARKAR et al., 2002).

Nesse sentido, estudo mais recente utilizando o complexo aniônico tiossulfato de prata [Ag(S2O3)23-] (STS) reporta ser possível manter, ou mesmo melhorar, a qualidade de microplantas de genótipos de batata conservadas por tempo prolongado em virtude do efeito antietileno do STS (SARKAR et al., 2002). Segundo esses autores, a utilização de cápsulas de alginato que contenham o STS (procedimento indireto), colocadas diretamente sobre meio sólido de MS, acrescido de manitol (20 g L-1) e de sacarose (40 g L-1), permitiu a conservação das microplantas a 6 ºC ± 1 ºC, por 16 meses, com efeitos benéficos até mesmo sob altas concentrações de STS (1,0 mM a 4,0 mM).

Diante desse contexto, o aprofundamento das pesquisas relacionadas a aspectos estruturais, fisiológicos e da estabilidade genética do material vegetal preservado in vitro são de extrema importância para validação de métodos promissores de conservação. Além de possibilitarem o melhor entendimento dos efeitos de cada método empregado, tais estudos são importantes para apontar suas possíveis causas e permitir otimizações nas diferentes fases do processo de conservação e de criopreservação in vitro, de maneira que os danos em âmbito celular, até mesmo em regiões específicas dos materiais, possam ser avaliados e diagnosticados (PANIS; LAMBARDI, 2006).

Contudo, apesar de existirem vários estudos sobre a conservação in vitro de germoplasma vegetal, poucos avaliam as variações ocasionadas, sejam elas de ordem fisiológica, estrutural ou genética, o que dificulta a aplicação prática, rotineira e segura dos métodos desenvolvidos (SARKAR et al., 2001). O que tem sido observado nesse aspecto são pesquisas com o intuito de, por exemplo, elucidar os processos de crioinjúria e de crioproteção durante a criopreservação, os quais utilizam para isso de tecnologias mais avançadas, como a microscopia eletrônica, e até mesmo técnicas baseadas em marcadores moleculares (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Tal situação ocorre muito provavelmente por causa do crescente interesse, nos últimos anos, por esse método, pelo fato de ele envolver um maior número de fases in vitro e utilizar substâncias diversas (PANIS; LAMBARDI, 2006). Esses estudos são importantes por fornecerem subsídios sobre a viabilidade e a possibilidade de aplicação da criopreservação nos mais diversos tipos de germoplasma vegetal (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

É importante ressaltar também que o monitoramento da estabilidade biológica e da genética do germoplasma conservado pode ser realizado ainda durante o armazenamento in vitro, na fase de aclimatização ou em condições de campo (OLIVEIRA et al., 2000). No caso da estabilidade genética, testes dos genótipos doadores realizados em campo e comparações com os preservados in vitro são importantes para assegurar os resultados da estabilidade dos materiais vegetais (SARKAR et al., 2001).

Estudos fisiológicos

Como citado anteriormente, estudos estruturais e fisiológicos podem ser realizados a partir de observações de microscopia de luz e de microscopia eletrônica, incluindo aqui a varredura e a transmissão, conforme relatado nos trabalhos de Wang et al. (1998), de Helliot et al. (2003) e de Wilkinson et al. (2003). Por sua vez, aspectos do estado fisiológico dos materiais têm sido estudados basicamente por meio de exames visuais, com o intuito de verificar a hiper-hidratação, a vitrificação e a flacidez. Estes dois últimos são frequentemente verificados em microplantas de batata conservadas por longos períodos sob restrição de crescimento utilizando estresses osmóticos (SARKAR et al., 1999).

Estabilidade genética

De modo semelhante ao que é exigido para a propagação clonal, a conservação de recursos genéticos vegetais in vitro deve permitir que a espécie em questão seja mantida. Além disso, deve possibilitar que sua regeneração apresente fidelidade genotípica, o que é de especial importância no caso de espécies raras e em extinção, cujo tamanho da população pode ser extremamente baixo e nas quais qualquer perda adicional de material por causa da degradação genética pode ser inaceitável e danosa (WITHERS; ENGELMANN, 1998; WILKINSON et al., 2003). Todavia, poucos trabalhos com conservação in vitro abrangem os aspectos relacionados à fidelidade genética do material preservado (PANIS; LAMBARDI, 2006).

Dessa forma, a escolha do método de conservação a ser utilizado deve considerar a ocorrência de variação somaclonal, que pode estar associada também à natureza do material vegetal e às substâncias empregadas (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Com esse intuito, os pesquisadores têm utilizado várias técnicas, entre as quais se incluem: 1) marcadores morfológicos e características agronômicas; 2) marcadores citológicos incluindo descrição do cariótipo em nível cromossomal; 3) marcadores bioquímicos, incluindo análises de isoenzimas, eletroforese de proteína e produtos secundários; 4) marcadores de DNA (SARKAR et al., 2001; TYAGI et al., 2007; URBANOVÁ et al., 2002; WILKINSON et al., 2003). Este último tem como vantagem o fato de toda variação genotípica ter um efeito permanente e herdável sobre a espécie; ao contrário das variações fenotípicas, que podem ser reversíveis de acordo com as repostas ao estresse. Ademais, ressalta-se o fato de que a importância da estabilidade genética não pode ser subestimada e, quando possível, uma combinação de técnicas podem assegurar os resultados obtidos (WILKINSON et al., 2003).

Algumas das ameaças à estabilidade genética podem surgir de reações particulares (formação de radicais livres e danos moleculares por causa da radiação ionizante), as quais podem ocorrer, por exemplo, à temperatura de -196 °C (GROUT, 1990 citado por PANIS; LAMBARDI, 2006), ou mesmo em decorrência do uso de determinados crioprotetores, como o DMSO em determinadas concentrações (PANIS; LAMBARDI, 2006).

Nesse contexto, Harding (1994) observou a hipermetilação de DNA em microplantas de batata mantidas por longos períodos e submetidas a estresses osmóticos pelo uso de manitol, resultante provavelmente de uma resposta adaptativa das células. Por sua vez, Sarkar et al. (2001), ao avaliarem os efeitos do ancimidol na conservação de microestacas de batata por meio de marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), não constataram nenhuma instabilidade genética detectável após 16 meses de armazenamento. Já Wilkinson et al. (2003), ao utilizarem AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), não observaram variações genéticas de C. atrosanguineus armazenados em NL por 12 meses. Nesse mesmo contexto, brotos de espécies de Vanilla, cultivados em meio MS ½ suplementado com sacarose (15 g L-1) e com manitol (15 g L-1), e mantidos a 2 ºC por mais de sete anos com subcultivos anuais, não mostraram qualquer variação no DNA, quando avaliados por marcadores moleculares (DIVAKARAN et al., 2006).

Santos (2004) relata ainda que, pelo fato de embriões zigóticos serem sistemas altamente organizados, e por conterem tecidos meristemáticos e produzirem de forma direta plantas completas, sua utilização implica em um menor risco de variação somaclonal. Por isso, podem ser utilizados com sucesso para criopreservar germoplasma de muitas espécies que apresentam sementes recalcitrantes ou intermediárias.

Considerações finais a respeito da aplicação de técnicas in vitro para conservação de recursos genéticos vegetais

Uma limitação frequentemente reportada no uso rotineiro da conservação in vitro em larga escala está relacionada aos altos custos envolvidos, sobretudo para os métodos que necessitam de certo nível tecnológico, como a criopreservação, na qual o controle e a variação de temperaturas são indispensáveis para o congelamento e o descongelamento dos materiais criopreservados (RAZDAN, 2003; TYAGI et al., 2007). Além disso, existem os problemas que podem surgir em decorrência das diferentes respostas dos genótipos às condições padrões de cultivo. Tal situação tem sido reportada em germoplasma armazenado à baixa temperatura e apresenta o potencial de afetar seriamente o germoplasma da espécie na coleção in vitro, por ocasionar a perda desses acessos que não respondem as condições de cultivo (BRENNAN et al., 1990; DUSSERT et al., 1997). Aliado a esses fatores, existem os riscos de variações somaclonais, de erros de manipulação humana, de alterações estruturais e fisiológicas, além da dificuldade de restabelecimento e de regeneração do material criopreservado.

Dessa forma, torna-se imperativo que tecnologias mais baratas e seguras sejam desenvolvidas, as quais devem apresentar eficiência semelhante aos equipamentos convencionalmente utilizados, possibilitando assim maior aplicabilidade dos métodos de conservação in vitro, especialmente nos países em desenvolvimento (IAEA, 2004; TYAGI et al., 2007). Ademais, o desenvolvimento de técnicas para a distribuição, além de uma rede de informações para os materiais conservados, são fontes importantes para a melhoria do sistema de conservação in vitro.

Outro aspecto importante diz respeito ao fato de que, embora o método in vitro, quando comparado aos métodos convencionais, apresente considerável potencial e seja amplamente utilizado com relativo sucesso, ele não deve ser visto como substituto para o método in situ. Isso porque nenhuma técnica de conservação aplicada isolada conserva de modo adequado toda a diversidade genética de determinada espécie, ou seja, seu pool gênico (DIVAKARAN et al., 2006; WITHERS; ENGELMANN, 1998), pois cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens, além de requererem estratégias complementares para sustentar de modo efetivo o máximo de diversidade genética vegetal (GONÇALVES; ROMANO, 2007). Portanto, os métodos de conservação in vitro devem ser utilizados como uma estratégia complementar em programas de conservação de recursos genéticos, para que, dessa maneira, possam oferecer segurança adicional a esses recursos, tanto para uso atual quanto futuro, juntamente com os bancos de genes no campo (DIVAKARAN et al., 2006; MARTIN; PRADEEP, 2003).

Referências

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Capítulo 8

O diagnóstico molecular aplicado à cultura de tecidos vegetais

Maria Cristina Rocha Cordeiro

O diagnóstico molecular é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para diversos fins, tais como: os trabalhos que estudam as diferenças genéticas entre espécies de animais (Figura 1) ou plantas, as questões ambientais, como a poluição e seus efeitos sobre os organismos, e as doenças dos animais, dos vegetais ou dos seres humanos. No caso das doenças humanas, o diagnóstico molecular mobiliza grandes setores, como o farmacêutico (SERVICE, 2003), e possibilita tanto a prevenção quanto o tratamento dessas doenças.

Figura 1. Identificação molecular específica do nematoide Heterodera glycines em PCR, utilizando-se a combinação de primers 13. Meloidogynes incognita (Mi); M. javanica (Mj); M. arenaria (Ma); H. glycines (Hg); Prathylenchus brachyurus (P); Rotylenchulus reniformis (R); amostras de nematoide de vida livre (N1 e N2); peso molecular 100 pb (PM). A seta aponta para o fragmento específico amplificado somente na amostra de H. glycines.

Foto: Maria Cristina Rocha Cordeiro

De uma maneira geral, o diagnóstico molecular tem como base moléculas que podem ser proteínas ou sequências gênicas específicas. Essas moléculas são caracterizadas, estudadas e analisadas previamente, de forma que possam ser correlacionadas com situações fisiológicas específicas constituindo um biomarcador. Muitas são as metodologias utilizadas para distinguir um possível biomarcador. Por exemplo, pode-se citar a eletroforese em duas dimensões: a reação de polimerase em cadeia do DNA (PCR) e as várias ferramentas da engenharia genética.

Com um determinado biomarcador, pode-se realizar um diagnóstico molecular. Esse diagnóstico pode também ter como base diversas técnicas, tais como: a PCR; a eletroforese em uma ou em duas dimensões; o Western blot; o ensaio enzimático do tipo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), que utiliza anticorpos específicos ou não; os marcadores moleculares do tipo Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); os Simple Sequence Repeats (SSR); o Reverse Transcription PCR (RT-PCR); o Real Time quantitative PCR (RTqPCR); os microarranjos de DNA; entre outros.

Os diagnósticos moleculares de biomarcadores previamente selecionados utilizam metodologias que devem identificá-los de maneira que possam ser aplicadas quatro principais exigências: a sensibilidade, a reprodutibilidade, a especificidade e a distinguibilidade.

Neste capítulo, será dada ênfase a dois aspectos particulares do diagnóstico molecular utilizado na cultura de tecidos vegetais: a variação somaclonal e a detecção de plantas transgênicas.

Variação somaclonal

A variação somaclonal é um fenômeno que ocorre frequentemente na cultura de tecidos vegetais. Constitui uma alteração genética com relação ao material inicial. Em geral, é uma variação não desejável para quem trabalha com o objetivo de, por exemplo, micropropagar plantas em larga escala ou produzir plantas transgênicas que devem ser distintas apenas em um aspecto genético em relação à planta-mãe. As variações somaclonais podem ser de dois tipos: genética e não genética (epigenética) (JORDAN, 2005; LÓPEZ et al., 2004). Para mais detalhes, ver o capítulo 2 deste livro.

Primeiramente, é necessário esclarecer que a variação somaclonal pode ser identifcada por meio de marcadores fenotípicos e moleculares. Variações epigenéticas são, hoje, mais bem observadas por caracteres fenotípicos, enquanto as variações em nível genético podem ser observadas facilmente por ferramentas como: RAPD, Inter Sequence Simple Repeats (ISSR), SSR e Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).

Os marcadores moleculares mais usuais na identificação de variações somaclonais genéticas são: RAPD, ISSR e SSR (GUO et al., 2006; MARTINS et al., 2004). Esses marcadores representam uma cobertura total do genoma da planta, por isso podem mais facilmente identificar nele pequenas alterações. No caso desses marcadores moleculares, não é necessária a caracterização de um biomarcador específico, pois são observadas alterações diretas no genoma da planta que podem ser facilmente detectadas por meio da amplificação diferencial de bandas (fingerprinting). Os marcadores RAPD e SSR são duas ferramentas que estão baseadas na técnica de PCR (ROCHA C., 2005).

A PCR é uma técnica com a qual se pode amplificar em progressão geométrica fragmentos de DNA, específicos ou não (Figura 2). De uma maneira geral, esse processo ocorre em três fases distintas que se repetem em ciclos de número e de tempo variáveis. A primeira fase é chamada de etapa de desnaturação do DNA, a segunda é chamada de etapa de anelamento do oligonucleotídeo iniciador (primer) e a terceira é chamada de etapa de polimerização das novas cadeias do DNA. Com respeito às técnicas de marcadores moleculares que utilizam a PCR e são utilizadas para o diagnóstico de variações somaclonais, pode-se dizer que uma das principais diferenças é o fato de que, em RAPD ou ISSR, utiliza-se um único primer de sequência não especificada, enquanto os SSR utilizam dois primers específicos, caracterizados previamente para a espécie estudada. Além disso, os SSR são considerados marcadores codominantes, isto é, reconhecem a presença de alelos dominantes e recessivos. Esse fato permite reconhecer variações genéticas do tipo mutagênese nos diferentes alelos. Os marcadores RAPD ou ISSR não possuem essa característica por serem considerados dominantes, ou seja, apenas reconhecem alelos de caráter dominante (LÓPEZ et al., 2004).

Figura 2. Esquema geral da reação de PCR.

Ilustração: Maria Cristina Rocha Cordeiro.

No que diz respeito às principais exigências da técnica diagnóstica (especificidade, reprodutibilidade, distinguibilidade e sensibilidade), os marcadores RAPD perdem um pouco para os SSR nos quesitos especificidade e reprodutibilidade. No entanto, experimentos em duplicata minimizam essa situação e fazem deles também uma ferramenta bastante utilizada. Na verdade, os dois marcadores são complementares em sua análise.

Esses marcadores foram utilizados com êxito nas seguintes plantas: em amêndoas micropropagadas, com o objetivo de observar a estabilidade genética do material produzido (MARTINS et al., 2004); em Codonopsis lanceolata, uma planta medicinal (GUO et al., 2006); em cacau (Theobroma cacao) (LÓPEZ et al., 2004); e também em banana (VENKATACHALAM et al., 2007).

Detecção de plantas transgênicas

Plantas transgênicas são aquelas que foram transformadas geneticamente com relação a sua espécie original. Atualmente, são conhecidas muitas plantas transgênicas, que foram transformadas para adquirir características, tais como: resistência a insetos, a diferentes patógenos como fúngicos, bacterianos ou virais, herbicidas, etc. Destacam-se as plantas de interesse agronômico como a soja, o milho, o algodão, o tomate, a batata, etc. Para que se possa produzir uma planta transgênica, é necessário associar pelo menos dois grandes componentes metodológicos: a engenharia genética e a transformação genética de plantas relacionada com a cultura de tecidos vegetais. Primeiramente, é necessário que se obtenha um gene alvo específico que represente um papel relevante no sistema fisiológico da planta. Esse gene alvo é obtido por meio da utilização de diversas ferramentas metodológicas da engenharia genética. A transformação genética das plantas pode ser conseguida pelo método que utiliza o Agrobacterium (A. tumefaciens ou A. rizhogenes) ou biobalística seguida de metodologias de cultura de tecidos que visam regenerar e multiplicar o tecido vegetal transformado (PRIETO, 2005; BRASILEIRO; DUSI, 1999; LACORTE et al., 1999; SLUYS, 1999). Para mais detalhes ver os capítulos 9 e 10 deste livro.

Os genes alvos utilizados na transformação genética das plantas serão os biomarcadores que serão utilizados na identificação da planta transgênica.

A identificação da planta transgênica é importante em várias fases, tais como: na fase da produção da planta propriamente dita, visando à seleção das plântulas transformadas; na fase anterior à sua produção, em escala comercial, como, por exemplo, nos testes de biossegurança; e após sua liberação comercial, com a finalidade de monitoramento ambiental, tendo como objetivo controlar possíveis escapes gênicos entre plantas na área cultivada, bem como situações referentes ao comércio irregular de sementes ou à quantidade encontrada em alimentos derivados (MARCELINO et al., 2003). A forma de identificá-la ou reconhecê-la entre os parentais originais é realizada por meio de uma técnica diagnóstica que pode detectar sua molécula biomarcadora (Figura 3). Nessa figura, observam-se dez plantas fenotipicamente iguais; no entanto, somente a planta 3 contém uma marca genética diferente, amplificada em PCR, por ser uma planta transgênica.

Figura 3. Esquema geral do diagnóstico molecular de uma planta transgênica.

Ilustração: Maria Cristina Rocha Cordeiro.

As principais técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas com plantas transgênicas são: Southern blot, PCR, Western blot e ELISA. Porém, a mais utilizada, pela sua praticidade, é a PCR. As demais são utilizadas na pesquisa científica relacionada.

O Southern blot tem como base a técnica de eletroforese de DNA em gel de agarose. Os fragmentos de DNA separados nesse gel são transferidos para uma membrana de nylon e fixados nela. Posteriormente, ocorre hibridização com uma sequência específica que pode ser marcada, por exemplo, com radioatividade, quimioluminescência ou fluorescência (Figura 4) (SAMBROOK et al., 1989). Essa é uma técnica que oferece boa reprodutibilidade, distinguibilidade e especificidade. Ademais, sua sensibilidade aumenta com a utilização da fluorescência. Essa técnica necessita mais expertise do operador e sua realização envolve mais etapas de trabalho. Por isso, é mais lenta do que o PCR.

Figura 4. Esquema geral de uma análise em Southern blot.

Ilustração: Maria Cristina Rocha Cordeiro.

O Western blot e o ELISA são duas técnicas que se baseiam no reconhecimento específico de proteínas. Nesses dois casos, a busca é por proteínas traduzidas nas plantas transgênicas.

O Western blot se parece com o Southern blot, pois também tem como base uma separação eletroforética em gel. No entanto, aqui essa separação ocorre em géis verticais de poliacrilamida específicos para proteínas. Logo após a separação eletroforética, as proteínas são transferidas para uma membrana de nylon e, depois, são reconhecidas por anticorpos específicos (chamados anticorpos primários) e não específicos (anticorpos secundários). Este último está, em geral, marcado com uma molécula diferenciadora que se pode acionar por uma reação enzimática (por exemplo, biotina/avidina ou compostos que produzem fluorescência, etc.). Assim, nessa técnica, realiza-se um duplo reconhecimento de anticorpos.

No ELISA também se faz um duplo reconhecimento de proteínas específicas com anticorpos, mas essas não são separadas em um processo de eletroforese, e sim fixadas em placas apropriadas (Figura 5).

Figura 5. Esquema geral da técnica ELISA.

Ilustração: Maria Cristina Rocha Cordeiro.

Tanto o Western blot quanto o ELISA são técnicas muito específicas, distinguíveis, sensíveis e reprodutíveis. Porém, são técnicas que requerem grande expertise por parte do operador, além de requerer a produção de anticorpos primários específicos (monoclonais). Mesmo no caso da possível utilização de anticorpos primários não específicos (policlonais), sua produção, embora mais fácil, ainda é necessária. Por causa deste último aspecto, tanto o custo quanto o tempo de obtenção de resultados aumentam bastante quando comparados à técnica de PCR. A Tabela 1 apresenta um resumo das principais características, vantagens e desvantagens das técnicas diagnósticas.

Tabela 1. Resumo das principais características, vantagens e desvantagens das metodologias utilizadas no diagnóstico molecular.

Metodologia

Sensibilidade

Distinguibilidade

Reprodutibilidade

Especificidade

Custo

Tempo para obtenção de resultados

Expertise

PCR

++++

+++

+++

+++

+

+

+

RAPD

++++

+++

++

++

+

+

+

ISSR

++++

+++

+++

+++

++

+

+

SSR

++++

+++

+++

+++

++++

+

++

Southern blot

++++

+++

+++

+++

+++

++

++

ELISA

+++

+++

+++

+++

+++

++

++

Western blot

++++

+++

+++

+++

+++

++

++

Microarranjos de DNA

+++++++

+++

+++

+++

+++++

++

++++

RTqPCR

+++++++

+++

+++

+++

+++++

+

+++

(+) = baixo; (++) = médio; (+++) = alto; (++++) ou superior = altíssimo.

Todas essas metodologias são muito sensíveis. A escolha entre uma ou outra depende do custo, da expertise e da velocidade com que se deseja obter resultados.

As metodologias empregadas para o diagnóstico molecular de plantas transgênicas descrito acima também podem ser utilizadas para o diagnóstico de outros organismos geneticamente modificados (OGMs), como animais e microrganismos transgênicos.

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Capítulo 9

Introdução de genes em células vegetais mediada pelo processo biobalístico

Francisco J. L. Aragão
Ana Cristina Miranda Brasileiro

O processo biobalístico

O processo biobalístico (do inglês biolistic), também conhecido por aceleração de partículas ou bombardeamento de partículas, foi desenvolvido inicialmente por J. Sanford, N. Allen, T. Klein e E. Wolf, da Cornell University, (EUA) (SANFORD, 2000; SANFORD et al., 1987, 1993), como uma alternativa para introdução direta de material genético no genoma nuclear de plantas superiores. Desde então, sua universalidade de aplicações tem sido avaliada, demonstrando ser um processo efetivo e simples para a introdução e a expressão de genes em bactérias, protozoários, fungos, algas, insetos, tecidos vegetais e animais, além de organelas isoladas, como cloroplastos e mitocôndrias (ARAGÃO et al., 1992, 1993; BAILEY et al., 1993; BARRETO et al., 1997; BOGO et al., 1996; BOYNTON et al., 1988; DANIELL et al., 1991; HARRIER; MILLAM, 2001; JOHNSTON et al., 1988; KLEIN; FITZPATRICK-MCELLIGOTT 1993; RECH et al., 1996; SANFORD, 2000; SANFORD et al., 1993; VAINSTEIN et al., 1994).

O método consiste na aceleração de partículas com 0,2 µm a 3 µm de diâmetro, que atravessam a parede celular e a membrana plasmática, de forma não letal, carreando substâncias adsorvidas para o interior da célula (KLEIN et al., 1987; SANFORD, 1988). Embora moléculas de DNA, RNA ou proteínas possam ser carreadas, o processo biobalístico tem sido mais empregado para introduzir moléculas de DNA (nas formas circular ou linear) no citoplasma ou nas organelas, como o núcleo e o cloroplasto. Várias modificações têm sido introduzidas, o que aumenta a eficiência e possibilita a obtenção de plantas transgênicas de diversas espécies, que até então não haviam sido transformadas por meio de outras metodologias (ARAGÃO et al., 1996, 2000; BIRCH; FRANKS, 1991; CHRISTOU, 1995; LUTHRA et al., 1997; RECH et al., 2008).

Os sistemas de transformação mediados por Agrobacterium são eficientes e têm sido utilizados com sucesso para um grande número de espécies. Entretanto, para algumas espécies, em virtude dos sistemas de cultura de tecidos existentes, não é possível ainda realizar a transformação mediada por Agrobacterium. Nesses casos, a técnica de biobalística, graças à sua versatilidade, deve ser empregada, uma vez que pode transformar diferentes tipos de tecidos e de células, independentemente do genótipo. Além disso, trata-se de uma técnica rápida, que envolve menos manipulação das células em cultura, quando comparada a outros métodos. Vários tipos de explantes e de células podem ser utilizados para a transformação por biobalística, tais como folhas, calos, caule, etc.

Para aumentar a eficiência de transformação, a biobalística pode também ser utilizada juntamente com a inoculação com Agrobacterium em tecidos bombardeados cujos microferimentos ampliam a área de infecção (BIDNEY et al., 1992; BRASILEIRO et al., 1996). Nesse caso, ou o tecido pode ser bombardeado com partículas nuas para, em seguida, ser submetido a uma cocultura com Agrobacterium, ou as bactérias podem ser previamente misturadas às partículas que, então, são aceleradas.

A obtenção eficiente de plantas transgênicas de muitas espécies economicamente importantes, incluindo monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas, somente tem sido possível mediante o processo de biobalística (ARAGÃO; CAMPOS, 2007; CHRISTOU, 1995; JAEHNE et al., 1995). Plantas transgênicas de mais de 300 espécies já foram obtidas com a utilização dessa técnica.

A técnica de biobalística pode ainda ser aplicada ao estudo da expressão gênica transiente, em que uma sequência de DNA introduzida em uma célula pode vir a ser transcrita, mesmo sem ser integrada ao genoma. A maior intensidade da expressão gênica transiente é geralmente observada no período de 24 a 72 horas após a transferência, e não é praticamente detectada após uma semana. A análise da expressão transiente foi, e ainda é, bastante utilizada para otimização dos parâmetros envolvidos no processo de bombardeamento. No entanto, recentemente tem sido mais utilizada em estudos de regulação gênica e para a avaliação de sequências regulatórias (promotores). Nesses casos, constroem-se genes quiméricos, como as sequências regulatórias ligadas a genes marcadores (principalmente gus e gfp). As construções são utilizadas para bombardeamento de tipos celulares específicos. Para esse tipo de estudo, a biobalística apresenta vantagens sobre as técnicas que utilizam protoplastos (eletroporação ou transformação mediada por polietileno glicol – PEG), uma vez que os tipos celulares são transformados sem necessidade de manipulações in vitro mais sofisticadas. A expressão gênica pode ser analisada em células intactas e em tecidos organizados, o que é essencial para o estudo de promotores tecido-específicos. Além disso, a técnica de biobalística é simples e mais rápida.

Sistemas

Diferentes sistemas capazes de acelerar micropartículas cobertas com ácidos nucleicos, a velocidades superiores a 1.500 km h-1, têm sido desenvolvidos e construídos. Todos eles baseiam-se na geração de uma onda de choque com energia suficiente para deslocar uma membrana carregadora que contém as micropartículas cobertas com DNA (RECH et al., 1996, 2008) (Figuras 1 e 2). A onda de choque pode ser gerada das seguintes formas: por meio de uma explosão química (pólvora seca) (SANFORD et al., 1987); por uma descarga de hélio a alta pressão (ARAGÃO et al., 1996, 2000; SANFORD et al., 1991); pela vaporização de uma gota de água por meio da descarga elétrica com alta voltagem e baixa capacitância (CHRISTOU, 1993; McCABE et al., 1988, McCABE; CHRISTOU, 1993), ou baixa voltagem a alta capacitância (ARAGÃO et al., 1992, 1993; RECH et al., 1991); ou por uma descarga de ar comprimido (MORIKAWA et al., 1989). Outros sistemas não exigem a utilização de uma membrana carreadora (ARAGÃO et al., 1995; FINER et al., 1992; SAUTTER et al., 1991; TAKEUCHI et al., 1992; VAIN et al., 1993) (Figuras 1 e 2). Os sistemas que utilizam alta pressão de gás hélio e descarga elétrica têm demonstrado que possuem um amplo espectro de utilização, além de serem mais eficientes para a obtenção de altas frequências de transformação.

Figura 1. Esquema do princípio básico dos principais sistemas biobalísticos para transformação genética de plantas. Nesses sistemas, as micropartículas (1), geralmente de ouro ou de tungstênio, são recobertas pelo DNA que contém os genes a serem inseridos. As partículas são aceleradas a velocidades supersônicas (2) e penetram nas células vegetais de forma não destrutiva (3). Os sistemas diferem basicamente na geração de energia para movimentar as partículas e no suporte em que elas são depositadas, que pode ser de quatro tipos: (A) gás hélio com alta pressão, com as partículas depositadas sobre um suporte plástico (membrana carreadora de kapton ou mylar); (B) descarga elétrica para vaporização de uma gota de água, com as partículas depositadas sobre um suporte plástico; (C) gás hélio com baixa pressão, com as partículas presas por capilaridade (em suspensão em um meio líquido) em uma tela de metal (PIG); (D) gás hélio com baixa pressão, com as partículas depositadas (secas) no interior de um tubo fino de plástico. Nos sistemas com gás hélio com alta pressão e com descarga elétrica (A e B), a membrana carreadora fica retida em uma tela, por meio da qual as partículas atravessam em direção às células-alvo.

Ilustração: Francisco J. L. Aragão.

Figura 2. Equipamentos de biobalística desenvolvidos para transformação genética de plantas. (A) equipamento elétrico; (B) equipamento baseado em fluxo de hélio através de tubos plásticos; (C) PIG (Finer´s gun); (D) equipamento de alta pressão de gás hélio (Sanford´s gun); (E) equipamento com cartucho de pólvora; (F) equipamento portátil (hand-held gun).

Fotos: Francisco J. L. Aragão.

Os equipamentos originalmente desenvolvidos possuem uma câmara selada (com vácuo parcial), o que limita muito sua utilização em amostras grandes ou pouco resistentes a danos provocados pela exposição ao vácuo. Assim, desenvolveram-se equipamentos mais sofisticados que não requerem câmaras de vácuo e podem ser utilizados in vivo, mesmo em amostras grandes e em condições de campo (RECH et al., 1996; RINBERG et al., 2005; ROIZENBLATT et al., 2006; SHEFI et al., 2006) (Figura 2). Uma das versões mais recentes desses modelos é o HeliosTM, desenvolvido pela BioRad. Equipamentos manuais (hand-held gene guns) têm sido utilizados com sucesso tanto na transfecção de diversos tipos celulares e organismos, tais como bactérias, levedura, etc., quanto, especialmente, na introdução de genes em plantas e em animais em condições naturais (no campo ou casa de vegetação), bem como na inoculação de vírus em plantas (BURKHALTER; BERNARDO, 1989; GRUTZENDLER et al., 2003; O’BRIEN; LUMMIS 2004; RECH et al., 1996; SAMBROOK; RUSSELL, 2006).

As micropartículas

Micropartículas de distintas naturezas podem ser empregadas como carreadoras de DNA, desde que não degradem ou causem quebras em ácidos nucleicos, tenham alta densidade, tamanho e formato adequados. No início do desenvolvimento da tecnologia biobalística, testaram-se micropartículas de vários materiais, tais como metais com alta densidade, como platina e irídio, além de vidro, de sílica e de outros. Os testes resultaram em baixa frequência de transformação genética (SANFORD et al., 1993). Recentemente, a prata tem sido utilizada em uma técnica chamada de diolística (ROIZENBLATT et al., 2006). Atualmente, os microprojéteis mais empregados como microcarreadores têm sido partículas de ouro ou de tungstênio, cujas principais características são: 1) micropartículas de tungstênio têm formato irregular e medem de 0,2 µm a 3,0 µm; são potencialmente tóxicas para alguns tipos de células (ARMALEO et al., 1990; RUSSELL et al., 1992) e sujeitas à oxidação rápida com consequente efeito negativo sobre o DNA; seu custo é bastante reduzido; 2) micropartículas de ouro são biologicamente inertes e possuem formato esférico; seu diâmetro mede de 1,0 µm a 7,5 µm; são mais uniformes que as de tungstênio e têm um custo mais elevado. Além disso, experimentos com células animais têm demonstrado que partículas de ouro maiores são mais adequadas (CHENG; JOHO, 1994; RECH et al., 1996). Células desidratadas de Escherichia coli e de Agrobacterium tumefaciens, funcionando como uma forma natural de encapsulação de DNA, foram utilizadas com sucesso no lugar das micropartículas cobertas de DNA, para a transferência de genes em suspensão celular de fumo e de milho (RASMUSSEN et al., 1994).

O tipo apropriado de micropartículas varia de acordo com o tamanho das células a serem transformadas. Como regra geral, demonstrada empiricamente, as micropartículas devem possuir em torno de um décimo do tamanho da célula-alvo. Portanto, para células de microrganismos (células bacterianas e esporos fúngicos), micropartículas com diâmetro em torno de 0,2 µm (M5, Sylvania) são mais apropriadas. Para células de plantas, partículas com diâmetro de 0,2 µm a 1,5 µm (M10, Sylvania) são as mais indicadas. Mazus et al. (2000) mostraram evidências de que partículas de tungstênio podem interagir com plasmídios e causar quebras na molécula de DNA gerando moléculas lineares. É interessante notar que o tungstato de sódio, o óxido de tungstênio IV e o cloreto de tungstênio VI não causaram qualquer dano ao DNA. Além do mais, o fenômeno é dependente de pH (MAZUS et al., 2000). Para células animais, que apresentam maior tamanho, recomendam-se partículas de ouro, pelo fato de não apresentarem toxidez. As partículas de ouro (com diâmetro de 1 µm a 3 µm) também podem ser utilizadas para determinados tipos de células vegetais (ARAGÃO et al., 1993).

Diversas características relativas às micropartículas influem na eficiência de transformação, pela interação com o DNA ou com a célula. Dessa forma, estudos que avaliam o efeito de diferentes tamanhos, formatos, homogeneidade e tipo de material das partículas podem contribuir para a otimização do processo de biobalística. Recentemente, micropartículas com formato de rosca, em forma de tubos e com cavidades, têm sido desenvolvidas e podem ser bastante úteis.

Diversos protocolos de precipitação de DNA sobre as partículas têm sido descritos (SANFORD et al., 1993). O método mais
utilizado, desenvolvido inicialmente por Klein et al. (1987), emprega cloreto de cálcio e espermidina. As partículas com o DNA adsorvido são lavadas e ressuspendidas em etanol absoluto e distribuídas sobre a membrana carreadora. O etanol evapora rapidamente, e as partículas com o DNA permanecem secas sobre o macrocarreador. Como o etanol absoluto e a espermidina são muito higroscópicos, as partículas com o DNA tendem a absorver umidade, formando agregados. Esses agregados de micropartículas danificam as células quando as atingem e resultam em baixa frequência de transformação. O experimento de Smith et al. (1992) mostrou claramente que a umidade relativa do ar no momento da deposição das micropartículas na membrana é um fator muito importante. Esse fator é tanto mais importante quanto menor for o diâmetro das partículas utilizadas e menor for a célula-alvo. Por sua vez, DNA em excesso ou preparações impuras também causam a aglomeração das partículas (ARAGÃO et al., 1993; KLEIN et al., 1988). Variações nas metodologias de precipitação de DNA sobre as micropartículas, bem como protocolos alternativos, podem diminuir os problemas associados aos métodos disponíveis, principalmente pela redução da formação de agregados e na reprodutibilidade dos experimentos.

Parâmetros físicos importantes

Em virtude de sua massa reduzida, as micropartículas são rapidamente desaceleradas em consequência do atrito com o ar. Para que haja uma minimização desse efeito, nos principais sistemas de biobalística descritos (com exceção dos sistemas hand-held), a quantidade de ar na câmara deve ser reduzida com auxílio de uma bomba de vácuo, o qual deve ser mantido a uma pressão em torno de 710 mm de Hg. Vácuo acima desse nível não conduz a uma melhor frequência de expressão do gene introduzido, provavelmente por causa da redução do vapor residual de água da própria amostra biológica. Para certas aplicações, o vácuo deve ser reduzido, a saber: no caso do bombardeamento de células animais em cultura e animais in vivo (JOHNSTON et al., 1991). Em alguns casos, gás hélio é injetado na câmara de vácuo, de forma que substitua o ar residual. Essa adição de gás hélio, de baixo peso molecular e de baixa densidade, aumenta a eficiência de transformação, provavelmente pela redução do atrito e pela consequente diminuição da desaceleração. Esse fato tem sido observado principalmente em microrganismos, em que se utilizam micropartículas menores (0,2 µm). Em bactérias, o aumento da eficiência pode ser de 5 a 6 vezes maior, enquanto em leveduras, pode ser de até 4 vezes (SANFORD et al., 1993; SMITH et al., 1992). No caso de plantas, em que se empregam partículas até cinco vezes maiores (1,0 µm), a injeção de hélio na câmara de bombardeamento não apresenta efeito significativo na eficiência de transformação (SANFORD et al., 1993).

As distâncias entre as células-alvo e o ponto de origem das partículas ou da fonte geradora de energia para movê-las são extremamente importantes e devem ser otimizadas para cada tipo celular. No caso dos equipamentos de gás hélio a alta pressão, deve-se otimizar não somente a distância entre a membrana de ruptura e a membrana carreadora de partículas (macrocarreador), como também a distância entre a membrana carreadora até a tela de retenção e desta última até o tecido-alvo. Isso é importante pelo fato de ondas de choque se propagarem pelo interior do equipamento no momento do disparo. As ondas de choque e acústicas, necessárias para a aceleração do macrocarreador, podem causar danos às células-alvo (RUSSELL et al., 1992). A intensidade e a forma dessas ondas variam de acordo com as distâncias entre a fonte geradora da onda de choque (membrana de ruptura) e o macrocarreador, entre o macrocarreador e a tela de retenção, e desta última até as células-alvo. Esses parâmetros também influem na velocidade final das micropartículas, na sua capacidade de penetração e, consequentemente, na eficiência da transferência e na expressão gênica (KIKKERT, 1993; KEMPER et al., 1995; SANFORD et al., 1993).

Outro parâmetro importante é a pressão do gás hélio, que, na maioria dos casos, é de 1.200 psi; entretanto, deve ser ajustada para cada tecido a ser bombardeado. Uma pressão muito alta pode acarretar dano aos tecidos, enquanto pressões mais baixas podem levar a uma baixa penetração das partículas, que podem não atingir os tipos celulares desejados em cada tecido-alvo.

Desenho de vetores

O processo biobalístico é bastante influenciado por algumas das características dos vetores empregados, com efeitos marcantes sobre a introdução e a integração dos genes exógenos nas células. O DNA plasmidial pode ser precipitado sobre micropartículas, acelerado e introduzido, tanto na forma circular quanto na linear. O tamanho do vetor, de per si, aparentemente não é um fator limitante (LACORTE et al., 1997; SANFORD et al., 1993). Entretanto, há uma limitação da massa de DNA que poderá ser adsorvida pelas micropartículas, uma vez que, em grandes quantidades, o DNA tende a gerar aglomerados de micropartículas (ARAGÃO et al., 1993, LACORTE et al., 1997). Teoricamente, 400 a 800 cópias de um plasmídio de 10 kb são adsorvidas em uma micropartícula com 1,2 µm de diâmetro médio. Esses aglomerados causam danos às células por causa de suas dimensões e de sua massa. Demonstrou-se que o número de cópias dos genes introduzidos é um fator importante para sua expressão transiente (LACORTE et al., 1997). No entanto, a influência sobre a integração ainda necessita ser investigada. Finalmente, como o tamanho do vetor (DNA plasmidial) é diretamente proporcional à sua massa e inversamente proporcional ao número de cópias possível de ser precipitado sobre as micropartículas, deve-se então dar preferência a vetores pequenos, entre 2 kg e 15 kb. As frequências de transformação estável (isto é, a obtenção de plantas transformadas) parecem ser um pouco reduzidas no momento da utilização de vetores lineares (BONFIM et al., 2007; VIANNA et al., 2004). Entretanto, em virtude de questões de biossegurança, pode-se optar pela utilização de vetores lineares, os quais são produzidos após a remoção (pela digestão com enzimas apropriadas) de sequências gênicas que conferem resistência a antibióticos presentes nos vetores circulares. É recomendável que o vetor circular possua um sítio para uma enzima que permita a digestão e a eliminação de genes desnecessários para o processo de transformação genética. É possível a cotransformação, por meio da utilização de dois ou três vetores simultaneamente. Isso permitirá a segregação dos transgenes nas gerações seguintes. As frequências de cotransformação para genes presentes em um único vetor chegam a cerca de 100%, enquanto para genes presentes em vetores distintos são de aproximadamente 50% (ARAGÃO et al., 1996).

Ao contrário dos vetores de Agrobacterium, os plasmídios utilizados no processo biobalístico não necessitam de nenhuma sequência moduladora da sua integração no genoma vegetal. Em levedura (ORR-WEAVER et al., 1981) e em algumas espécies de Synechococcus (WILLIAMS; SZALAY, 1983), a integração do
DNA exógeno ocorre em virtude de sequências homólogas ao DNA cromossomal (recombinação homóloga). No entanto, a integração do DNA exógeno, introduzido por métodos diretos no genoma de células vegetais, parece ser diferente. Aparentemente, sua integração independe de presença de sequências homólogas no genoma vegetal (IIDA et al., 1990; MORIKAWA et al., 1994). Entretanto, o mecanismo de integração ainda necessita ser mais bem compreendido.

Transformação via bombardeamento de meristemas apicais

Com o surgimento dos processos biobalísticos, abriu-se a possibilidade de transformação direta in situ das células do meristema apical. Dessa forma, vislumbrou-se a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas por meio da transformação de celulas-mãe do meristema apical. No final dos anos de 1980, obteve-se a primeira planta transgênica (soja) pelo processo biobalístico. O processo ocorreu a partir de células transformadas do meristema apical (McCABE et al., 1988).

Embora a transformação mediada por Agrobacterium também possibilite a transformação de células meristemáticas (ULIAN et al., 1988), essa técnica não tem sido eficiente (BRASILEIRO et al., 1996). A combinação biobalística-Agrobacterium também já foi empregada (BIDNEY et al., 1992; BRASILEIRO et al., 1996), embora, de igual modo, não tenha demonstrado ser um método muito eficiente.

O meristema apical vem sendo alvo de um grande número de estudos, dos quais a maioria tem investigado a função das diferentes células que o compõem. Existe alguma confusão quanto aos termos utilizados para denominar determinados tecidos da região apical, que é constituída do meristema apical propriamente dito, dos primórdios dos órgãos laterais e da região de maturação, onde a diferenciação se torna aparente (CUTTER, 1965). Em feijão, ela é composta basicamente pelo meristema apical, pelos primórdios foliares e pelas folhas primárias.

As diferentes partes do meristema apical são definidas por dois conceitos distintos: por camadas e por zonas (MEDFORD, 1992). Segundo Satina et al. (1940), a primeira define três camadas distintas: L1, L2 e L3 (Figura 3). A camada L1 é a mais externa e forma a epiderme das regiões diferenciadas. A camada L2 divide-se preferencialmente no plano anticlinal (perpendicular à superfície), e também no plano periclinal (paralelo à superfície), no momento da formação dos órgãos. A camada L3 divide-se tanto no plano anticlinal quanto no periclinal. O segundo conceito baseia-se na divisão do meristema em zona (ESAÚ, 1977; STEEVES; SUSSEX, 1989). Há uma zona central, uma zona periférica e a medula (Figura 3). A zona central inclui todas as três camadas. Suas células dividem-se com menor frequência e, embora deem origem às demais células do meristema apical, não são permanentes (RUTH et al., 1985). As células periféricas têm como função a formação das regiões laterais. Vários estudos demonstraram que os brotos diferenciados são originados de novo em camadas subepidérmicas (L2 e L3) do meristema apical, embora a camada L1 também possa participar de sua formação (FRANKLIN et al., 1991; MALIK; SAXENA, 1992; McCLEAN; GRAFTON, 1989; MOHAMED et al., 1992). Esses brotos são formados nas regiões periféricas do meristema apical (ARAGÃO; RECH, 1997).

Figura 3. Eixo embrionário após a retirada das folhas primárias e detalhe da estrutura do meristema apical, dividido em camadas (L1, L2 e L3) e em zonas. ZC – zona central; ZP – zona periférica; M – medula.

Ilustração: Francisco J. L. Aragão.

A transformação dessas células meristemáticas por meio do processo biobalístico tem-se mostrado bastante eficiente. As micropartículas podem atingir as células das três camadas (ARAGÃO et al., 1993); entretanto, o bombardeamento de micropartículas da região meristemática de embriões posteriormente cultivados, sem qualquer tratamento, mostrou-se ineficiente para obtenção de plantas transgênicas (ARAGÃO et al., 1996, 2005; ARAGÃO; CAMPOS, 2007; Bonfim et al., 2007; RECH et al., 2008). Em cultivares de elite de algodão, a eficiência de transformação ficou entre 0,027% e 0,71% com relação ao número de plantas transgênicas obtidas e o número de embriões bombardeados (ARAGÃO et al., 2005; McCABE; MARTINELL, 1993). A frequência de transformação, no entanto, pode ser significativamente aumentada por intermédio da indução de organogênese na região do meristema apical. Em feijoeiro, a frequência de transformação foi de 0,9% com a utilização de vetores circulares (ARAGÃO et al., 1996), e de 0,2% a 0,8% com o uso de vetores lineares (BONFIM et al., 2007; VIANNA et al., 2004).

Incluem-se nos fatores biológicos que influenciam o processo desde aqueles relacionados à integração do DNA exógeno no genoma vegetal até os que se relacionam à neoformação de brotos a partir das células meristemáticas apicais. Além da fisiologia das células, a morfologia da região apical e sua resposta a citocininas são fatores muito importantes. Algumas variedades de feijão apresentam os meristemas apicais encobertos total ou parcialmente pelos primórdios foliares, o que dificulta sua transformação. Por isso, é necessário encontrar variedades cujo domo apical seja completamente exposto ao bombardeamento (ARAGÃO; RECH, 1997; BONFIM et al., 2007). Em caupi, não foi possível encontrar variedades com o domo apical exposto. No entanto, foi possível realizar a transformação pelo bombardeamento de células meristemáticas apicais após a remoção das folhas primárias e dos primórdios foliares (IVO et al., 2008). Esses pontos são extremamente importantes para o desenvolvimento de uma metodologia de transformação que seja independente da cultivar.

Transformação cloroplasmática

A transformação cloroplasmática (inserção do transgene no genoma do cloroplasto), em certos casos, tem algumas vantagens em relação à transformação do genoma nuclear. As principais vantagens apontadas são: altos níveis de expressão heteróloga (DE COSA et al., 2001; TREGONING et al., 2003); contenção do transgene, pois, para a maioria das plantas superiores, o genoma cloroplasmático tem herança materna (BIRKY, 2001; RUF et al., 2001; SVAB; MALIGA, 1993); ausência do efeito de posição, pelo fato de ser possível direcionar a integração para uma região específica (STAUB; MALIGA, 1992); e diminuição dos problemas de silenciamento gênico, quando múltiplos genes devem ser inseridos, visto que a maquinaria traducional dos cloroplastos tem a capacidade de traduzir transcritos policistrônicos (DE COSA et al., 2001; KANAMOTO et al., 2006; STAUB; MALIGA, 1995). Com o advento da biobalística, foi possível inicialmente transformar uma alga verde (Chlamydomonas) (BOYNTON et al., 1988). Entretanto, apesar de todas essas vantagens, quase uma década foi necessária até que essa tecnologia fosse desenvolvida para plantas superiores (SVAB et al., 1990; YE et al., 1990). Apesar de ser possível transformar cloroplastos por meio de outras metodologias (eletroporação e mediada por PEG), o processo de biobalística tem sido mais presente na literatura.

Inoculação de vírus e de viroides

A biobalística também é utilizada para a inoculação de vírus e de viroides em plantas. Esse método consiste na transferência do genoma viral clonado, ou mesmo do DNA ou do RNA de uma planta infectada, para a célula, o que possibilita a infecção. A técnica é empregada, principalmente em vírus, nos casos em que os métodos para inoculação mecânica não se mostram eficientes, como nos geminivírus, por exemplo (ARAGÃO et al., 1995; GAL-ON et al., 1997; GARZÓN-TIZNADO et al., 1993; GILBERTSON et al., 1991). Da mesma forma, o método se mostra eficiente quando usado para inoculação com viroides (MATOUŠEK et al., 2004). Ultimamente, a biobalística tem sido o método preferido por vários grupos para inoculação em estudos básicos de fitopatologia e em teste de plantas transgênicas resistentes, em detrimento de alternativas que envolvem vetor biológico (CALEGARIO et al., 2007; HELLOCO-KERVARREC et al., 2002; MAKWARELA et al., 2006).

Diolística

O processo de biobalística também é utilizado para introduzir substâncias fluorescentes ou coloridas (corantes) em células. Essa técnica é chamada de diolística (O’BRIEN; LUMMIS, 2004). É possível encontrar uma revisão sobre o assunto em O’Brien e Lummis (2007). Nesse processo, os corantes aderem-se às micropartículas ou aos filtros e, então, são “bombardeados” para penetrarem nas células. A utilização desses corantes não tóxicos, como carbocianina, os quais podem ser transportados pela célula, tem permitido a marcação de muitos tipos celulares e permanecem funcionais por um longo período (O’BRIEN; LUMMIS, 2007). A diolística tem vantagens sobre outras técnicas, como a microinjeção e a eletroporação, por ser mais simples, rápida e por poder marcar um maior número de células ao mesmo tempo. Além disso, a técnica de microinjeção pode dialisar o conteúdo celular e, dessa forma, causar ruptura em componentes celulares vitais, o que afeta o funcionamento da célula.

A técnica de diolística tem se mostrado muito útil para estudos da arquitetura e morfologia em células animais (O’BRIEN; LUMMIS, 2007), mas ainda é pouco utilizada para o estudo de células vegetais. Recentemente, corantes ligados ao cálcio têm sido utilizados para estudar oscilações na concentração de Ca+2 em células-guarda de Commelina communis, em células da alga verde Chlamydomonas reinhardtii e em zigotos da alga marrom Fucus serratus (BOTHWELL et al., 2006). Essa técnica também tem sido proposta para introdução de nanossensores óticos, que são aparatos de cerca de 1.000 nm de diâmetro, os quais podem “perceber” e transmitir informações sobre eventos químicos e biológicos (BUCK et al., 2004).

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Capítulo 10

Protoplastos: tecnologia e aplicações

Leonardo Soriano

Introdução

Os protoplastos são células vegetais desprovidas de parede celular devido à ação de enzimas específicas que degradam as fibras de celulose, hemicelulose e a matriz de pectina. Por serem osmóticamente sensíveis, os protoplastos são considerados os explantes vegetais mais atrativos à biotecnologia, sobretudo por conta da sua imediata resposta a estímulos externos, notável capacidade de fusão celular, extração de organelas e incorporação de materiais desejáveis, como DNA exógeno.

Por meio da totipotência celular, característica inerente às células vegetais, é possível regenerar uma planta completa a partir de um protoplasto. Esse notável sistema tem estimulado estudos de expressão de genes isolados e sua regulação, promovendo avanços nas áreas de genômica, proteômica e metabolômica (XIAO et al., 2012). Além disso, a obtenção de uma planta completa a partir de uma única célula assegura a sua fidelidade genética (DAVEY et al., 2003) e, por isso, os protoplastos são comumente empregados em programas de melhoramento genético de espécies de plantas de interesse agronômico.

Isolamento e cultivo de protoplastos

O primeiro relato da obtenção de protoplastos foi em 1892 por meio do isolamento mecânico (KLERCKER, 1892). No entanto, a técnica proposta disponibilizava poucas células intactas, e seu rendimento era muito baixo. Somente em 1960, Cocking (1960) conseguiu isolar protoplastos da ponta da raiz de tomateiro utilizando a enzima celulase, extraída do fungo Myrothecium verrucaria, aumentando consideravelmente o rendimento do processo. Dez anos mais tarde, utilizando o corante fluorocromo calcoflúor branco, Nagata e Takebe (1970) observaram a regeneração da parede celular e as primeiras divisões mitóticas ao estudarem protoplastos de mesofilo de Nicotiana tabacum. No ano seguinte, a primeira planta de N. tabacum, utilizando essa técnica, foi completamente regenerada (NITSCH; OHYAMA, 1971).

Os protoplastos podem ser isolados a partir de mesofilo (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990), raiz (COCKING, 1960), pecíolos (BIDNEY; SHEPARD, 1980), calos (KOBAYASHI et al., 1983), suspensões celulares (MIZUHIRO et al., 2001), embriões somáticos (NOMURA et al., 1982), hipocótilos (SINHA et al., 2003), cotilédones (DOVZHENKO et al., 2003), frutos (BROWN et al., 1997), coleóptilos (HALL; COCKING, 1971), pedicelos florais (FLICK; EVANS, 1983), segmentos caulinares (GNANASAMBANDAM; BIRCH, 2006), grãos de pólen (DUHOUX, 1980), ou seja, praticamente a partir de qualquer tipo de tecido vegetal.

O sucesso do isolamento está vinculado à espécie, estado fisiológico da planta, tipo e idade do explante, meio de cultura e fatores ambientais (MATSUMOTO, 2006), os quais influenciam na capacidade de protoplastos e células derivadas expressarem sua totipotência e desenvolverem-se em plantas viáveis.

Atualmente, há diversos protocolos de isolamento de protoplastos disponíveis na literatura, incluindo tanto para plantas monocotiledôneas quanto para dicotiledôneas, sobretudo por meio de enzimas pectocelulolíticas em conjunto com estabilizadores osmóticos (açúcares e poliálcoois) e estabilizadores de membrana (cálcio e fósforo) (CARNEIRO et al., 1998; DAVEY et al., 2003). Entretanto, os procedimentos de isolamento mecânico são raramente utilizados para o isolamento de protoplastos, mas ainda são úteis para estudos que exigem baixas concentrações celulares (BINDER et al., 2003).

Por conta da eficaz capacidade de degradar separadamente a celulose, a hemicelulose e outros polissacarídeos constituintes da parede celular, sem danificar a membrana plasmática, a escolha e a concentração das enzimas pectocelulolíticas variam de acordo com a composição e espessura da parede celular e da origem do tecido utilizado. As enzimas mais empregadas mundialmente nos laboratórios são extraídas de microrganismos saprófitas e possuem atividades pectinolíticas e celulolíticas, as quais atuam na despolimerização da celulose e descristalização de cadeias (CARNEIRO et al., 1998). Dentre as enzimas destacam-se as celulases Onozuka R10 e Driselase, a pectinase Macerase R10 e a pectoliase Y-23. A formulação da solução enzimática a ser empregada, bem como a concentração de cada enzima (0,1% a 5%), pode diferir sensivelmente até para cultivares da mesma espécie (CASTRO et al., 2011).

O período de incubação necessário para a digestão completa da parede celular varia de acordo com a espécie (14 a 20 horas). Recomenda-se que o tecido vegetal esteja em contato com a mistura enzimática sob agitação suave (20 rpm a 40 rpm), com pH (5,4 a 6,2) e temperatura (20 °C a 30 °C) que favoreçam a ação da solução na obtenção de protoplastos viáveis. Nessa etapa de isolamento, alguns aminoácidos como a glicina (0,1 M) podem ser adicionados à solução enzimática para maximizar a liberação de protoplastos (SUTIOJONO et al., 2002).

Após o período de incubação, a purificação dos protoplastos é realizada, verificando-se em microscópio óptico invertido a ocorrência de digestão da parede celular. A suspensão de isolamento é geralmente filtrada em peneiras de nylon (45 μm) e sucessivamente centrifugada (800 rpm a 1.000 rpm por 10 minutos) separando os protoplastos de restos celulares, impurezas e da solução enzimática. Em seguida, a cultura de protoplastos é plaqueada em meio líquido ou semissólido, cuja otimização da formulação é preponderante para as próximas etapas de divisão celular, formação de microcolônias e microcalos (ERIKSSON, 1985).

Para o cultivo de protoplastos e sua posterior regeneração, a maiora dos meios de cultura encontrados na literatura é baseada nos meios MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), B5 (GAMBORG et al., 1968), SH (SCHENK; HILDEBRANDT, 1972), KM (KAO; MICHAYLUK, 1975) e MT (MURASHIGE; TUCKER, 1969), cujas formulações contêm macro e micronutrientes, vitaminas, mio-inositol, açúcares e ácidos orgânicos, em concentrações que proporcionam uma alta viabilidade e eficiência de plaqueamento.

Para evitar o acúmulo de amido e induzir as primeiras divisões celulares, os protoplastos são cultivados na ausência de luz e temperatura entre 20 °C e 30 °C. A regeneração da parede celular ocorre de acordo com a fonte de protoplastos e as condições de cultura, podendo variar de 1 a 72 horas (KLEIN et al., 1981; NAGATA; TAKEBE, 1970; SIM et al., 1988). Para estimular a divisão celular de protoplastos recalcitrantes de beterraba (Beta vulgaris L.), Majewska-Sawka et al. (1997) recomendam a adição das poliaminas espermidina, espermina e putrescina (44 μM), associadas aos fitoreguladores ANA (ácido naftaleno acético – 5 μM) e BAP (6-benzilaminopurina – 2 μM), no meio de cultura.

A renovação do meio de cultura com a redução gradual da pressão osmótica deve ser realizada pela diluição com agentes osmóticos como o manitol, o sorbitol, a glicose, a celobiose e a sacarose, em concentrações de 0,3 M a 0,8 M. Essa etapa é essencial para a manutenção da divisão mitótica e, por conseguinte, a formação de microcolônias.

Os períodos de renovação do meio de cultura e de desenvolvimento das etapas sequenciais dependem do genótipo e estão relacionados ao estado fisiológico, eficiência de plaqueamento e integridade do protoplasto. Em cítrus, após uma semana de cultivo, é possível verificar células em divisão (KOBAYASHI et al., 1983); aos 30 dias, microcolônias (VARDI et al., 1975); e, após 8 a 10 semanas, microcalos (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990). A partir desse estágio, dependendo da espécie, o processo de regeneração pode ocorrer tanto pela via embriogênica (GRAMBOW et al., 1972) quanto pela via organogenética (BOURGIN et al., 1979).

Hibridação somática

A hibridação somática via fusão de protoplastos não é um evento dirigido, o qual permite a combinação total ou parcialmente de genomas nucleares e citoplasmáticos, sem perda significativa do vigor, aos níveis interespecíficos e intergenéricos para contornar incompatibilidades pré e pós-zigóticas, permitindo a produção de plantas híbridas com genes de resistência a pragas e doenças ou a estresses abióticos (LIU et al., 2005). Trata-se de um processo aditivo de protoplastos e tem sido uma ferramenta efetiva no melhoramento genético de espécies economicamente importantes, como batata, trigo, arroz e cítrus (JOHNSON; VEILLEUX, 2001). Em virtude de não existir segregação meiótica na hibridação somática, os genes recessivos deletérios nos genitores permanecem mascarados nos híbridos somáticos (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990).

Após o procedimento, podem ocorrer três resultados: a fusão completa dos núcleos dos genitores ou cariogamia; a perda cromossômica de um ou de ambos os núcleos; e a perda total do núcleo de um dos genitores (BENGOCHEA; DODDS, 1986). Este último ocorre em menor frequência, com a perda de um dos núcleos parentais e com apenas o intercâmbio aleatório de conteúdos citoplasmáticos (SAITO et al., 1993). O material resultante desse fenômeno é denominado como cíbrido, e, por manter intacto um dos genomas, é objeto de estudos para aumento da atividade fotossintética, taxas respiratórias entre outras reações metabólicas.

Após sucessivos testes quanto à composição de soluções e meios de cultivo, o primeiro relato de fusão de protoplastos bem sucedido foi por meio da utilização de altas concentrações de cálcio no meio de cultura, cuja atividade está fortemente relacionada à manutenção da estabilidade da membrana plasmática (KELLER; MELCHERS, 1973). No ano seguinte, com a descoberta do polietilenoglicol (PEG) e suas propriedades fusogênicas, a técnica se notabilizou como uma importante ferramenta para o melhoramento genético (KAO; MICHAYLUK, 1975). Desde então, foi explorado o potencial considerável em ampliar o conjunto de genes de culturas, e diversos trabalhos foram realizados produzindo híbridos interespecíficos (CARLSON et al., 1972; HELGESON et al.,1998; MATSUMOTO et al., 2002; OHGAWARA et al., 1985) e intergenéricos (KISAKA et al., 1998; LIU et al., 1999; OZMINKOWSKI JUNIOR; JOURDAN, 1994; ZHOU et al., 2001).

O processo de fusão pode ser resultante de tratamentos químicos ou físicos. No tratamento químico, a membrana plasmática dos protoplastos, após a etapa de isolamento, possui carga elétrica negativa, e, para induzir o contato íntimo entre as membranas plasmáticas, é necessária a neutralização das cargas da superfície da membrana pelo uso de policátions, como o polietilenoglicol (PEG), o qual atua como agente aglutinador e tem se mostrado um método simples e eficiente (BINSFELD, 1999; MOURÃO FILHO et al., 1996). A ação fusogênica do PEG pode ser visualizada em três etapas apresentadas na Figura 1. Por sua vez, o tratamento físico consiste no uso de uma corrente elétrica alternada de baixa voltagem, sob a qual os protoplastos são submetidos e alinhados. Em seguida, são aplicados pulsos curtos de corrente contínua, gerando poros temporários nas membranas, permitindo assim a fusão entre as células adjacentes (SHIMIZU et al., 1999). Visando ao aumento da eficiência da técnica, métodos mais refinados foram desenvolvidos, como a fusão eletroquímica, que incorporou a indução química à aplicação de pulsos de corrente elétrica (OLIVARES-FUSTER et al., 2005).

Figura 1. Fusão química de protoplastos. A) Protoplastos provenientes de calos de laranja-doce (cinzas) reunidos com protoplastos de mesofilo de tangerina (esverdeados). B) Fusão dos protoplastos pela ação do polietilenoglicol (PEG). C) Protoplastos pós-fusão, podendo ser observadas células híbridas. Barras: 20 μm.

Foto: Leonardo Soriano

A hibridação somática necessariamente utiliza protoplastos com propriedade embriogênica e alta capacidade de regeneração, geralmente provenientes de calos e suspensões celulares, juntamente com protoplastos provenientes do mesofilo, de cor esverdeada, para auxiliar no monitoramento da fusão.

Para favorecer a cultura de protoplastos e a formação de microcolônias de cítrus, a literatura recomenda o meio BH3, o qual apresenta uma composição bastante complexa, contendo um grande número de vitaminas, açúcares e ácidos orgânicos (GROSSER et al., 1992). No cultivo dos microcalos, calos e embriões somáticos, os meios de cultura utilizados na regeneração são baseados nas formulações dos meios MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e MT (MURASHIGE; TUCKER, 1969); bem como os de formulações derivadas do MT, como os meios de cultura EME, 1.500 e B+ (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 2010).

A produção de híbridos somáticos por fusão de protoplastos depende do sucesso de estágios sequenciais (BINSFELD, 1999; GROSSER et al., 1992), os quais são indicados na Figura 2.

Figura 2. Etapas sequenciais da hibridação somática via fusão de protoplastos: I) fontes viáveis de protoplastos (calos embriogênicos e fragmentos foliares); II) isolamento e cultura de protoplastos; III) indução de fusão de protoplastos com alta frequência e sem perda de viabilidade; IV) estabelecimento e indução da divisão celular nas células fusionadas; V) formação de microcolônias.; VI) manutenção dos microcalos; VII) indução da embriogênese somática; VIII) organogênese in vitro.; e IX) aclimatização e confirmação da hibridação.

Ilustração: Leonardo Soriano e Vitor Calderan

O período da fusão de protoplastos até a regeneração completa varia de acordo com a espécie utilizada e do tempo de resposta para emissão dos embriões, induzida pelo meio de cultura. Avaliações morfológicas, citológicas e análises moleculares são normalmente realizadas nas plantas após a aclimatização. Diversos métodos foram desenvolvidos para a confirmação da hibridação somática, incluindo análises comparativas da morfologia vegetativa das plantas regeneradas, quantificação da ploidia por citometria de fluxo e, principalmente, testes de paternidade utilizando marcadores moleculares (RFLP, RAPD e SSR) (MATSUMOTO et al., 2002; OLLITRAULT; LURO, 1995; SORIANO et al., 2012).

Transformação genética de protoplastos

Diferentemente de hibridação somática, a transformação de protoplastos é um evento dirigido, sendo possível a inserção de DNA exógeno específico diretamente através da membrana plasmática por meio de processos químicos e físicos. Essa técnica de transformação é rápida e fornece base para estudos de transformação nuclear transiente e estável (GUO et al., 2012), e também para transformação de organelas.

Destacada por sua eficiência e simplicidade metodológica, a transformação de protoplastos tem sido empregada em cultivares recalcitrantes ao processo de transformação convencional (FLEMING et al., 2000; KOBAYASHI; UCHIMIYA, 1989). Além disso, a transformação de protoplastos é vantajosa por não apresentar quimeras, pois a regeneração se dá a partir de uma única célula isolada, sendo essa característica importante para a sua utilização em programas de melhoramento e estudo da expressão de genes (GUO et al., 2012).

Protoplastos têm sido empregados em experimentos de transformação direta com plasmídios bacterianos desde Davey et al. (1980), com a integração de genes exógenos de forma aleatória no genoma da planta. Na transformação direta, um gene de interesse é agrupado em um cassete de expressão, contendo basicamente o promotor seguido de uma sequência codificadora, um gene marcador e um sinal de poliadenilação (terminador), que é inserido em um plansmídeo bacteriano e transferido diretamente em protoplastos, sem um vetor intermediário, como Agrobacterium tumafaciens (transformação indireta).

Novas técnicas fazem uso da síntese de peptídeos cellpenetrating peptides (CPPs), os quais auxiliam na condução de macromoléculas para o interior celular. No caso, os CPPs ajudam o plasmídio a atravessar a membrana plasmática dos protoplastos, aumentando a eficiência de transformação (MÄE et al., 2005).

De forma geral, a metodologia de transformação direta assemelha-se muito com a hibridação somática, com a desestabilização da membrana dos protoplastos por tratamento químico com polietilenoglicol (PEG) ou físico via eletroporação. Ao invés da união dos protoplastos genitores, é adicionada a suspensão plasmidial (0,8 µg plasmídio µL-1 a 1,0 µg plasmídio µL-1) contendo o DNA exógeno de interesse na suspensão de protoplastos numa concentração em torno de 2x106 protoplastos mL-1 (OMAR et al., 2008). Os genes de interesse são acompanhados por genes de seleção, que conferem resistência a antibióticos. Além desses, genes-repórteres como o β-glucuronidase (GUS) e o green fluorescent protein (GFP) são muito eficazes na detecção visual de células transformadas (GUO et al., 2012; PAOLI et al., 2007).

Normalmente a frequência de transformação, no entanto, é baixa; por isso, é necessário um sistema eficiente de seleção de células e regeneração de tecidos. Tratamentos térmicos prévios no DNA plasmidial e irradiação dos protoplastos receptores podem aumentar a eficiência de transformação, possivelmente pelo aumento da recombinação de DNA genômico com o DNA exógeno (DAVEY et al., 2003; TIWARI et al., 2001).

O protocolo de regeneração de plantas a partir da transformação de protoplastos é basicamente o mesmo que foi estabelecido na hibridação somática. Após a seleção, é possível detectar a integração de gene de interesse na planta regenerada por meio da combinação com os genes-repórteres, por citometria de fluxo (MADDUMAGE et al., 2002) e, principalmente, por meio de análises moleculares, como PCRs convencionais e quantitativas em tempo real (GUO et al., 2012) ou sondas específicas (TIWARI et al., 2001).

Outras aplicações e perspectivas

Novas abordagens quanto ao uso de protoplastos têm sido descritas, algumas das quais bem sucedidas anteriormente para sistemas animais. O principal objetivo no desenvolvimento de sistemas para protoplastos de plantas é a oportunidade de utilização como uma célula animal, porém com a vantagem de preservar a propriedade totipotente e a sua condição autotrófica.

Desde 1892 (KLERCKER, 1892), a maximização da estabilidade celular no meio de cultivo e o controle dos processos de divisão celular, crescimento e diferenciação a partir de uma célula isolada ainda constituem desafios instigantes para os botânicos. A orientação para desenvolvimento de protocolos viáveis pode ser obtida na literatura, porém, parâmetros intrínsecos à espécie e condições de cultivo devem ser determinados e adaptados empiricamente.

Nos últimos anos, houve interesse crescente pelo uso das plantas como sistemas de expressão gênica (XIAO et al., 2012). No tocante à fusão de protoplastos, uma nova aplicação é a criação de cromossomos híbridos. Koshinsky et al. (2000) obtiveram células de calos resistentes ao antibiótico higromicina com a fusão intergenérica de protoplastos de Nicotiana tabacum com Arabidopsis thaliana.

Quanto à transformação genética, mesmo com a consolidação técnica de transformação nuclear, um grande número de trabalhos destacam a transformação de plastídios, em virtude da alta síntese de macromoléculas nessas organelas e pela ausência de efeitos epigenéticos nas plantas regeneradas (BOCK, 2001; DANIELL et al., 2002; GOLDS et al., 1993).

Vale ressaltar que os protoplastos também constituem um sistema interessante para a obtenção de mutantes por radiações ou agentes mutagênicos químicos, por conta do volume de células homogêneas disponíveis a partir da formação de microcolônias e microcalos (BRETAGNE-SAGNARD et al., 1996; CARNEIRO et al., 1998). Outro exemplo pertinente no campo molecular é o emprego de protoplastos em pesquisas para a produção de proteínas e inserção de macromoléculas em células vegetais (BRIERE et al., 2004; MÄE et al., 2005; ROSENBLUH et al., 2004). Contudo, a tecnologia de protoplastos está apta para oferecer respaldo prático e teórico para o desenvolvimento dessas importantes áreas de estudo.

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Capítulo 11

O sistema Agrobacterium: do solo para o laboratório

Ana Cristina Miranda Brasileiro
Francisco J. L. Aragão

A galha-da-coroa (do inglês crown-gall), que se manifesta principalmente em plantas de propagação vegetativa, é uma doença de plantas conhecida na Europa desde a Antiguidade. Traduz-se pela formação de uma galha na coroa (junção entre o tronco e a raiz) ou diretamente nas raízes da planta infectada. Sabe-se, há mais de um século, que o agente etiológico causal da galha-da-coroa é Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria tipicamente do solo (CAVARA, 1897; SMITH; TOWNSEND, 1907). Estudos posteriores mostraram que, ao contrário das células sadias, os tecidos da galha-da-coroa, quando isolados da planta e cultivados in vitro, são capazes de crescer indefinidamente em meio de cultura, sem o acréscimo de reguladores de crescimento (BRAUN, 1958; WHITE; BRAUN, 1941). Essa particularidade despertou o interesse de cientistas que trabalham nos mais diferentes campos da pesquisa, pois, até então, pensava-se que a proliferação do tecido das galhas vegetais era induzida somente por um estímulo externo, de natureza química ou mecânica.

Inicialmente, os pesquisadores associaram o desenvolvimento dessas galhas ao câncer animal, como se tratasse de um verdadeiro “câncer vegetal”, o que estimulou numerosas pesquisas para o entendimento das causas dessa doença (FERNANDES; MARTINS, 1985; HOYKAAS; SCHILPERRORT, 1992). Esses estudos concluíram que o surgimento da galha é, na realidade, o resultado de um processo natural de transferência de genes da bactéria para a célula vegetal, que passam a sintetizar substâncias que estimulam a divisão celular no sítio de infecção. Os conhecimentos gerados desde então culminaram em um entendimento bastante aprofundado do parasitismo Agrobacterium-planta, que é considerado atualmente um sistema modelo para estudos das interações patógeno-hospedeiro, do transporte intercelular de macromoléculas e do direcionamento de proteínas para o núcleo. Nos últimos anos, o sofisticado e fascinante mecanismo de transferência de informação genética dessas bactérias para as plantas tem propiciado o uso de Agrobacterium como vetor natural de transferência de genes, o que permitiu a obtenção de um grande número de plantas geneticamente modificadas.

O gênero Agrobacterium

As agrobactérias (Agrobacterium spp.) são bactérias tipicamente do solo, do tipo bacilo Gram-negativo e aeróbico. Todavia, alguns isolados, quando se encontram nos tecidos vegetais, conseguem sobreviver sob condições reduzidas de oxigênio. Suas células apresentam um tamanho que varia de 0,6 µm a 1,0 µm x 1,5 µm a 30 µm, ocorrem isoladas ou aos pares e não formam esporos.

As agrobactérias são móveis na rizosfera por causa de dois flagelos polares e de dois a quatro filamentos laterais que permitem sua movimentação a aproximadamente 60 μm/segundo. Sua temperatura de crescimento está na faixa de 25 °C a 28 °C, com colônias geralmente convexas, circulares, lisas, apigmentadas ou de coloração creme (HOLT et al., 1994).

Agrobacterium tumefaciens é considerada a espécie-tipo do gênero Agrobacterium e foi descrita pela primeira vez como Bacillus tumefaciens por Smith e Townsend (1907). Posteriormente, o gênero Agrobacterium foi proposto por Conn e enquadrado na família Rhizobiaceae que agrupa, entre outros, os gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Phyllobacterium e Azorhizobium que são bactérias fixadoras de nitrogênio (HOLT et al., 1994, KERSTERS; DE LEY, 1984). No gênero Agrobacterium (do grego agros = campo e bakterion = bastonete), estão descritas, além de Agrobacterium tumefaciens, que causa a doença conhecida como galha-da-coroa (crown-gall), outras quatro espécies, que diferem entre si pela sintomatologia e especificidade de hospedeiro, quais sejam: a) A. rhizogenes (Riker) Conn., que provoca a síndrome da raiz em cabeleira (do inglês hairy root); b) A. rubi (Hildebrand) Starr & Weiss, que induz tumores em Rubus spp.; c) A. vitis Ophel e Kerr, que induz tumores em Vitis spp.; d) A. radiobacter (Beijejerinck & van Delden) Conn., que são bactérias saprófitas, não patogênicas.

Além da classificação baseada em sua fitopatogenicidade, as espécies de Agrobacterium estão subdivididas em pelo menos três biovares, de acordo com suas características bioquímicas, fisiológicas e nutricionais, determinadas pelos genes cromossomais (ANDRADE et al., 2003). Entretanto, a divisão em biovares nem sempre é possível, uma vez que várias linhagens apresentam características intermediárias. Dessa forma, nos últimos anos, a classificação das agrobactérias vem sofrendo uma série de críticas e tem recebido sugestões de alterações, de modo que a taxonomia do gênero Agrobacterium continua ainda controvertida (BERIAM et al., 1996; HOLT et al., 1994; KERSTERS; DE LEY, 1984). Além do mais, o recente sequenciamento completo dos plasmídios Ti e Ri mostrou que eles são altamente conservados, mesmo entre espécies diferentes, o que pode ser o ponto de partida para uma reclassificação do gênero (MORIGUCHI et al., 2001; SUZUKI et al., 2000; WOOD et al., 2001; ZHU et al., 2000).

Ocorrência da doença

As agrobactérias encontram-se distribuídas em todo mundo, em solos cultivados ou não, e, mais especificamente, na rizosfera das plantas contaminadas. Nestas últimas, são encontradas nas galhas, nas raízes ou no solo adjacente. As agrobactérias patogênicas ocorrem com maior frequência em regiões de clima frio. Essa preferência, provavelmente, está ligada à sensibilidade que elas têm a altas temperaturas, e à sensibilidade térmica do processo de infecção (LIPPINCOTT et al., 1981). Mesmo em solos com elevada incidência da galha-da-coroa, os isolados de A. radiobacter (não patogênicos) são de 10 a 100 vezes mais numerosos que os das outras espécies patogênicas (KRIMI et al., 2002).

Mais de 600 espécies vegetais são conhecidamente susceptíveis à infecção por A. tumefaciens e A. rhizogenes. A maioria delas pertence à classe das angiospermas dicotiledôneas (>60%) e das gymnospermas, e, mais raramente, às angiospermas monocotiledôneas (DE CLEENE; DE LEY, 1976; ESCOBAR; DANDEKAR, 2003). Na Europa, a doença conhecida como galha-da-coroa provocada por espécies de Agrobacterium fitopatogênicas é conhecida desde a Antiguidade, quando foi primeiramente observada em videiras por Aristóteles e por seu estudante Teofrasto. Embora sua incidência seja baixa, a galha-da-coroa pode tomar proporções devastadoras em certas culturas, principalmente em países temperados, o que conduz à perda quase total da produção, em particular para algumas espécies ornamentais, frutíferas e florestais, que são propagadas vegetativamente.

No Brasil, os primeiros relatos sobre doenças causadas por espécies de Agrobacterium surgiram na década de 1930 em pessegueiro. Posteriormente, a galha-da-coroa foi relatada em várias outras espécies, como castanheira, videira, ameixeira, alface, chuchu, mandioca, entre outras (BARROS et al., 2004; BERIAM et al., 1996; GOMES et al., 1998). Em Minas Gerais, a galha-da-roseira surgiu primeiramente em algumas propriedades. Posteriormente, as práticas agronômicas adotadas para essa cultura, como a propagação vegetativa e a enxertia, contribuíram para uma rápida disseminação do patógeno (ROMEIRO, 1995).

Além de plantas, Agrobacterium pode transformar, em condições de laboratório, uma vasta gama de organismos eucarióticos, desde fungos filamentosos, levedura, cogumelos cultivados a ouriços-do-mar e células humanas (BULGAKOV et al., 2006; LACROIX et al., 2006b). Essas descobertas abriram a possibilidade de utilização de Agrobacterium como um vetor universal de transformação genética que pode ser explorado como uma nova ferramenta biotecnológica para a engenharia genética de todos os organismos eucarióticos.

Biologia do processo infeccioso

A atração

No início do processo de infecção de uma planta por Agrobacterium (Figura 1A), ocorre o reconhecimento e a penetração da bactéria no tecido vegetal lesado, em decorrência de ferimentos superficiais causados por insetos, geadas ou tratos culturais. As bactérias são atraídas em direção ao tecido vegetal por quimiotactismo positivo em relação às moléculas-sinal, que são exsudadas pelas células presentes no local da lesão, como uma resposta inespecífica de defesa (TZFIRA; CITOVSKY, 2000). Essas moléculas-sinal são essencialmente compostos fenólicos, monossacarídeos, aminoácidos e prótons. A liberação de íons H+ (prótons) nos espaços intercelulares culmina com o abaixamento do pH no local do ferimento, condição que favorece o processo infeccioso.

As agrobactérias se fixam à célula vegetal em uma etapa inicial da formação do tumor, em virtude de um reconhecimento específico entre o isolado de Agrobacterium e a espécie vegetal hospedeira. Assim, uma vez em contato com as células vegetais, as bactérias sintetizam microfilamentos de celulose que estabilizam a ligação inicial e propiciam uma melhor fixação entre a bactéria e a célula hospedeira (MATTHYSSE et al., 2000). Os genes envolvidos na interação agrobactéria-célula vegetal estão localizados no cromossomo da agrobactéria e incluem chvA, chvB, pscA, att, chvD, chvE, miaA, ros, chvG, chvI e acvB (GELVIN, 2000; ZUPAN; ZAMBRYSKI, 1995).

Figura 1. A) Esquema do processo natural de infecção de uma planta por Agrobacterium tumefaciens. As bactérias presentes no solo são atraídas por moléculas-sinal, liberadas pela planta após um ferimento. (B) Os genes vir, presentes no plasmídio Ti das bactérias patogênicas, são então induzidos, iniciando assim a síntese de uma cópia da região-T em forma de fita simples (fita-T), que, com a proteção de sua extremidade 5’ pela proteína VirD2, é liberada do plasmídio, formando o complexo-T imaturo. (C) Esse complexo atravessa o sistema secretório, composto pelo canal VirB/VirD4, para chegar ao citoplasma da célula vegetal. (D) Uma vez no citoplasma, o complexo-T maduro é formado pela associação com a proteína VirE2 e se integra de maneira estável ao genoma nuclear da célula hospedeira, na qual genes presentes no T-DNA serão então expressos, sintetizando opinas e hormônios vegetais (citocininas e auxinas). A ocorrência da galha-da-coroa é o resultado do desequilíbrio hormonal provocado pela síntese desses hormônios nas células transformadas.

Ilustração: Francisco J. L. Aragão e Ana C. M. Brasileiro.

Os filamentos de celulose formados permitem a formação de agregados de células bacterianas em volta das células vegetais próximas ao tecido ferido. Acredita-se que existam receptores específicos para Agrobacterium na superfície da célula da planta, já que um número finito de agrobactérias é capaz de se ligar a essas células (GELVIN, 2000; MATTHYSSE; MCMAHAN, 1998). Alguns potenciais receptores de Agrobacterium e algumas proteínas da planta hospedeira, importantes para a fixação bactéria-célula, já foram identificados, tais como os receptores tipo vitronectina ou de ligação à ricadesina, além de diversas proteínas vegetais que interagem com as proteínas bacterianas (CITOVSKY et al., 2007). Recentemente, demonstrou-se que a infecção por Agrobacterium ativa a expressão de vários genes de defesa da planta, como, por exemplo, a via de sinalização MAPK (mitogen-activated protein kinase), durante os estágios iniciais do processo infeccioso (DAFNY-YELIN et al., 2008). Essas proteínas de defesa serão utilizadas pela bactéria para auxiliar o seu processo de transformação genética, em um belo exemplo de utilização abusiva de desvio do sistema biológico de defesa vegetal a seu favor. Quando não mais necessários, nos estágios mais avançados da infecção (formação do tumor), esses genes de defesa terão sua expressão reprimida pela bactéria.

O plasmídio Ti

Uma vez que a ligação inicial bactéria-planta esteja estabilizada, as moléculas-sinal sintetizadas em resposta ao ferimento da planta vão ativar a expressão de genes de virulência que estão localizados em um plasmídio de alto peso molecular (200 kb a 800 kb), conhecido como plasmídio Ti (do inglês tumor-inducing). Em determinadas linhagens, o plasmídio Ti pode representar 50% do genoma (ALLARDET-SERVENT et al., 1993). Esse plasmídio está presente somente em linhagens patogênicas de Agrobacterium, em um baixo número de cópias, e de poder ser transferido, via conjugação, para outras bactérias (VAN LAREBEKE et al., 1974; WATSON et al., 1975).

Duas importantes regiões funcionais no plasmídio Ti, que estão envolvidas diretamente no processo de indução tumoral, foram identificadas: a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência, ou região vir, que contém genes que codificam enzimas responsáveis pela excisão e transferência da região-T (STACHEL; NESTER, 1986; VAN LAREBEKE et al., 1974).

O plasmídio Ti possui, além da região-T e da região vir, outras três regiões funcionais que não estão diretamente envolvidas com o processo de indução tumoral. Essas regiões são conhecidas como: a) região de transferência conjugativa (loci tra e trb), responsável pela transferência conjugativa do plasmídio Ti entre linhagens de Agrobacterium spp. ou para outras bactérias Gram-negativas; b) região de absorção e catabolismo de opinas (região opc), envolvida na síntese de mais de 40 enzimas específicas responsáveis pela absorção das opinas para dentro da célula e pelo seu posterior catabolismo pela bactéria; c) região de replicação (região rep), que é necessária para a replicação e para as funções ligadas à manutenção do plasmídio Ti dentro da bactéria (estabilidade), ao controle do número de cópias durante a divisão celular e à incompatibilidade entre bactérias. A maioria dessas regiões é conservada entre os diferentes tipos de plasmídio Ti, principalmente aquelas pertencentes à mesma classe de opina.

Essas cinco regiões cobrem aproximadamente dois terços do plasmídio Ti. No restante, identificaram-se outros genes ligados à determinação do espectro de hospedeiro, aos genes reguladores (repressores, antagonistas, ativadores, etc.) da expressão de outros genes do plasmídio Ti e às outras funções ainda desconhecidas, as quais, aparentemente, não estão diretamente envolvidas na formação de tumores (ZHU et al., 2000).

A ativação do regulon vir

A região vir, que é ativada pelas moléculas-sinal durante a ligação Agrobacterium-hospedeiro, é formada por um conjunto de seis ou mais operons (conhecido como regulon vir), que contém 34 genes conhecidos. Os operons da região vir são corregulados por duas proteínas da própria região vir (VirA e VirG), que são induzidas, de maneira coordenada, em resposta a estímulos químicos (moléculas-sinal). Isso significa que, após o reconhecimento extracelular, o sinal químico é convertido em uma reposta intracelular (MCCULLEN; BINNS, 2006).

As proteínas VirA e VirG pertencem a uma classe de proteínas conhecidas como two-component regulatory system. Em tal sistema, a proteína VirA funciona como uma proteína sensora, enquanto a proteína VirG age como um ativador transcricional por ligar-se a regiões promotoras dos operons vir, iniciando assim o processo de transferência da região-T (HOOYKAAS; BEIJERSBERGEN, 1994; WINANS et al., 1994). Na presença das moléculas-sinal, a proteína VirA – uma histidina quinase presente na membrana da bactéria – vai se autofosforilar e, subsequentemente, transfosforilar a proteína VirG, localizada no citoplasma bacteriano. Uma vez fosforilada, a proteína VirG passa de sua forma inativa para uma forma ativa. Assim, além da sua própria transcrição, ativa a dos demais operons vir (HOOYKAAS; BEIJERSBERGEN, 1994; WINANS et al., 1994). Essa proteína interage com a região vir box, uma sequência específica e altamente conservada de 12 pb, presente na região promotora de cada operon vir, o que permite uma regulação e uma expressão coordenada desses genes (JIN et al., 1990). Uma vez que todos os genes da região vir forem ativados, inicia-se o processo de transferência da região-T para a célula vegetal.

A síntese da fita-T

A região-T é definida e delimitada por duas sequências repetidas de 23 pb, conhecidas como extremidades direita e esquerda. O processo de reconhecimento, de clivagem e de transferência da região-T inicia-se graças à atividade dos operons virD e virC, que reconhecem e clivam dentro desses 23 pb que delimitam a região-T.

As proteínas VirD1 e VirD2 parecem atuar em duas etapas no processo de corte da região-T (Figura 1B). Assim, VirD1 poderia reconhecer as extremidades da região-T e, ao mesmo tempo, converter o DNA para a forma relaxada, por meio de sua atividade topoisomerase. Isso expõe as sequências específicas de clivagem para a proteína VirD2, uma proteína com atividade endonucleásica, que também reconhece, especificamente, os 23 pb de cada extremidade da região-T (YANOSFSKY et al., 1986).

Após a clivagem, a proteína VirD2 mantém-se covalentemente ligada à extremidade 5’ da região-T (HERRERA; ESTRELA et al., 1988; PANSEGRAU et al., 1993), enquanto uma segunda clivagem ocorre na extremidade 3’ esquerda, o que leva a liberação da fita inferior da região-T. Durante essa liberação, uma cópia da fita é sintetizada a partir da extremidade direita, na direção 5’→ 3’, utilizando-se a fita de DNA superior da região-T como molde, o que mantém assim a fita superior em forma duplex. A síntese da fita inferior continua até atingir o sítio de clivagem da extremidade 3’ esquerda. A molécula de DNA linear, fita simples, gerada a partir do deslocamento da fita inferior da região-T foi denominada de fita-T. Dessa forma, o deslocamento da fita-T ocorre na direção 5’ → 3’ da fita inferior da região-T, iniciando na extremidade direita e terminando na extremidade esquerda, o que indica a existência de polaridade no processamento da fita-T (ZAMBRYSKI et al., 1989).

As proteínas VirC1 e VirC2, codificadas pelo operon VirC, ligam-se a uma sequência conservada, localizada próxima à extremidade direita, denominada overdrive (ou região ode). Acredita-se que essa ligação favoreça a correta orientação do complexo proteico VirD1/VirD2 para o reconhecimento dos sítios de clivagem, e, dessa forma, aumenta a eficiência no processo de clivagem e de transferência da fita-T (TORO et al., 1989). Várias outras enzimas, como helicases, polimerases e enzimas de reparo, são também necessárias para a produção da fita-T e são codificadas, provavelmente, por genes do cromossomo bacteriano (ZAMBRYSKI, 1992).

O movimento intercelular do complexo-T

Após sua formação, a fita-T deixa a célula bacteriana, penetra na célula vegetal e integra-se ao DNA nuclear da planta (Figura 1C). Para isso, a fita-T precisa atravessar a membrana interna bacteriana, seu periplasma e a membrana externa bacteriana. Supõe-se que a fita-T é transportada da bactéria para a célula vegetal, como um complexo nucleoproteico conhecido como complexo-T imaturo, que é formado pela fita-T protegida na extremidade 5’ pela VirD2 (CITOVSKY et al., 1989).

O transporte do complexo-T da agrobactéria para o citoplasma da célula vegetal indica a necessidade de se formar uma estrutura funcionalmente similar a um pilus, ou poro celular, e ocorreria por meio da interação das proteínas do operon virB com o complexo-T (WARD et al., 1988; ZUPAN et al., 1998). O operon virB contém 11 genes, e a maioria das proteínas VirB está localizada nas membranas interna e externa da bactéria, além de estar diretamente ligada à formação do canal VirB ou ao fornecimento de energia (atividade ATPase), que é necessária tanto para a formação do canal VirB quanto para o processo de exportação das moléculas (CASCALES; CHRISTIE, 2004; MCCULLEN; BINNS, 2006).

A proteína VirD4, uma proteína ancorada na membrana interna da bactéria, seria o produto que intermediaria a ligação do complexo-T ao canal VirB, auxiliando na translocação entre a bactéria e a célula hospedeira. O complexo proteico formado por VirB e VirD4, associado às membranas da bactéria, vai permitir a translocação do complexo-T imaturo para o citoplasma da célula vegetal por meio de um sistema secretório do tipo IV (T4SS) (CHRISTIE, 2004). As proteínas VirB2, VirB5 e, provavelmente, VirB7 formam o pilus-T, que é um filamento extracelular que intermedeia a ligação do canal VirB/VirD4 à parede (ou membrana) da célula vegetal (MCCULLEN; BINNS, 2006).

Além do complexo-T imaturo, o canal VirB/VirD4 é responsável pelo transporte de outras proteínas Vir, como VirE2, VirE3, VirF e VirD5, que são exportadas de forma independente para a célula vegetal (VERGUNST et al., 2005). Essas proteínas efetoras participam também do processo celular necessário tanto para a infecção quanto para a transformação genética por Agrobacterium, mas sua verdadeira função ainda não está completamente desvendada.

Sabe-se que, uma vez no citoplasma, a maturação do complexo-T é finalizada por sua associação com as proteínas efetoras exportadas pela bactéria, em particular com VirE2 (GELVIN, 2003). A proteína VirE2 é uma Single Strand Binding (SSB) Protein e liga-se covalentemente e de maneira não específica à fita-T (CHRISTIE et al., 1988; GIETL et al., 1987). Por ocorrer com certa abundância e por apresentar alta afinidade com DNA fita simples, sugere-se que a ligação da proteína VirE2 à fita inferior do T-DNA, além de evitar o seu dobramento, poderia protegê-la da degradação de nucleases durante seu transporte através dos poros nucleares (CITOVOSKY et al., 1989).

O movimento intracelular do complexo-T

Uma vez superada a membrana da agrobactéria, a segunda etapa da transferência do complexo-T é atravessar os espaços intercelulares, a parede celular e a membrana plasmática vegetal até o nucleoplasma. É provável que existam receptores na membrana celular vegetal que auxiliem na entrada do complexo-T no citoplasma da célula vegetal, que é feito de forma ativa (CITOVSKY; ZAMBRYSKI, 1993; HOWARD et al., 1992). Essa ativação é mediada por uma sequência-sinal de localização nuclear (NLS), presente na própria molécula a ser transportada, ou em moléculas associadas a ela. Como a fita-T não possui seus próprios sinais de direcionamento, sua importação para o núcleo da célula vegetal é, provavelmente, mediada pelas proteínas da agrobactéria que a acompanham nessa odisseia, tais como as proteínas VirD2 e VirE2 (ZIEMIENOWICZ et al., 2001).

Continuando seu caminho, o complexo-T deve viajar dentro do citoplasma para atingir o núcleo da célula hospedeira. A densa estrutura do citoplasma – composta por microtúbulos encruzilhados, pela actina e pela rede de filamentos intermediários – impede a difusão Brownian de macromoléculas, o que indica um mecanismo ativo de transporte intracelular do complexo-T (TZFIRA, 2006). O grande tamanho do complexo-T (estimado em 50 kD) e a sua estrutura solenoidal (do tipo fio de telefone) reforçam a hipótese do envolvimento de proteínas motoras associadas aos microtúbulos durante seu transporte intracitoplasmático (ABU-ARISH et al., 2004; SUH et al., 2003).

Enquanto muitas proteínas de Agrobacterium envolvidas no processo de transferência do complexo-T já foram caracterizadas, pouco se conhece sobre os fatores celulares vegetais que participam desse processo. Tanto as proteínas vegetais pertencentes às famílias das carioferinas e das cicloferinas quanto as importinas e as proteínas VIP (VirE-interacting protein) podem atuar como mediadoras e protetoras do transporte do complexo-T (GELVIN, 2003).

Várias evidências dão suporte à hipótese de que há uma relação evolucionária comum entre a transferência de DNA para plantas, mediada por Agrobacterium, e a transferência conjugativa de plasmídios entre bactérias. Entre os processos comuns dos dois sistemas, encontram-se o contato célula-célula, o início de transferência de DNA e o transporte através das membranas. Essas semelhanças incluem proteínas com sequências de aminoácidos similares e/ou equivalência de funções, organização gênica e propriedades físicas das enzimas envolvidas, além de sugerir que o aparato de transferência do complexo-T tenha evoluído de um sistema de transferência conjugativa (ZHU et al., 2000).

A integração da fita-T no genoma da planta

A última etapa no processo de importação e de transferência da fita-T culmina em sua integração no genoma nuclear da célula hospedeira (Figura 1D). Entretanto, os mecanismos moleculares envolvidos nas etapas de passagem pela membrana nuclear, de transporte intranuclear e de direcionamento para a cromatina ainda são poucos conhecidos. O diâmetro do complexo-T (aproximadamente 15 nm) excede o tamanho limite do complexo do poro nuclear, ou Nuclear Pore Complex (NPC), de aproximadamente 9 nm, indicando que o complexo-T entra no núcleo por um mecanismo ativo, mediado pela maquinaria de importação nuclear da célula hospedeira, que envolve também as proteínas VirD2, VirE2 e VirE3 (CITOVSKY et al., 2006).

Sabe-se que pelo menos parte da fita-T deve estar “descoberta” das suas proteínas acompanhantes (VirE2 e VirD2) para que possa se expor à maquinaria de reparo de DNA (proteólises) da célula hospedeira. Recentemente, propôs-se o envolvimento de VirF, uma das proteínas efetoras, na remoção da proteína VirE2 do complexo-T (TZFIRA et al., 2004b). Essa maquinaria irá então completar a fita-T em forma dupla para, dessa forma, ser integrada ao genoma nuclear. Outra etapa importante é o direcionamento do complexo-T para o local da sua futura integração na cromatina da célula hospedeira. Esse processo envolve tanto proteínas associadas à cromatina quanto enzimas de modificação de histonas (LACROIX et al., 2006a).

Diferentemente de outros elementos móveis, como transposons e retrovírus, a fita-T não codifica nenhuma proteína requerida para sua integração. Dessa forma, a integração da fita-T no genoma da planta pode ser mediada pelas proteínas VirD2 e VirE2, em combinação com vários fatores e mecanismos moleculares da própria célula hospedeira (TZFIRA et al., 2000, 2004a). Os fatores da planta são necessários para a complementação da molécula de fita-T para DNA dupla fita (dsDNA), para a produção de quebras no genoma do hospedeiro e para a ligação da molécula do T-DNA nessas quebras.

Estudos realizados em plantas transgênicas de Arabidopsis indicam que os sítios de integração da fita-T ocorrem geralmente dentro das regiões transcricionalmente ativas do genoma e de descondensação da cromatina; entretanto, não há nessas regiões uma preferência por cromossomo ou sequência (LACROIX et al., 2006a). A integração da fita-T geralmente ocorre em quebras da fita dupla, ou double strand breaks (DSBs), no DNA do genoma eucariota, e isso se dá por dois caminhos: via recombinação ilegítima ou não homóloga (NHR) ou via recombinação homóloga (HR), que necessita homologia entre o DNA integrante e o DNA-alvo. No sistema NHR, o DNA integrante está geralmente em forma de fita dupla, e sua integração envolve enzimas de junção de pontas não homólogas, também chamadas de nonhomologous end-joining (NHEJ). Por sua vez, o sistema HR necessita de um DNA integrante que esteja, pelo menos parcialmente, em forma de fita simples e, geralmente, envolve um mecanismo de reparo de lacuna de fita simples, ou single-strand gap repair (SSGR) (LACROIX et al., 2006a).

Em qualquer dos casos, a integração das extremidades 5’ e 3’ parece ser assistida pela maquinaria da planta. Dessa forma, a maquinaria de replicação do DNA e as enzimas de reparo da planta são as prováveis candidatas para auxiliar na integração da fita-T no genoma vegetal.

A expressão dos genes do T-DNA

Uma vez transferida para o genoma da célula vegetal e integrada a ele, a fita-T passa a ser denominada T-DNA (para DNA transferido). Essa integração é estável, e o T-DNA é transmitido para as células-filhas após a divisão mitótica e durante a meiose e a singamia. Os genes presentes no T-DNA, embora apresentem origem procariota, possuem sequências regulatórias que são reconhecidas pelo sistema eucarioto vegetal, o qual permite sua expressão após a integração. Um grupo desses genes, também conhecidos como oncogenes, codifica a síntese de enzimas envolvidas não somente na via de biossíntese de hormônios vegetais (auxinas e citocininas), mas também na regulação do balanço auxina/citocinina. A expressão desses genes causa um desequilíbrio hormonal nas células transformadas, e isso resulta na sua proliferação desordenada, o que leva à formação de tumores nos sítios infectados da planta (ANDRADE et al., 2003; ZUPAN et al., 2000). Dessa forma, a produção endógena de hormônios pelas células transformadas explica por que esses tumores, uma vez isolados da planta, são capazes de crescer indefinidamente em meio de cultura, mesmo na ausência de reguladores de crescimento (HOOYKAAS; SCHILPEROORT, 1992).

Outros genes presentes na região-T codificam enzimas envolvidas na via da biossíntese de opinas, que são compostos formados pela condensação de aminoácidos ou de carboidratos modificados. As opinas produzidas nos tumores (células transformadas) são secretadas nas regiões intercelulares do tumor e metabolizadas especificamente pela linhagem de Agrobacterium indutora do tumor (PETIT et al., 1983). As opinas sintetizadas servem como fonte de carbono e de nitrogênio para linhagem de Agrobacterium infectante, e, dessa forma, criam um nicho favorável para o desenvolvimento da bactéria (DESSAUX et al., 1993). As opinas também estimulam a transferência conjugativa do plasmídio Ti para linhagens de Agrobacterium não patogênicas, isto é, sem o plasmídio Ti, o que aumenta a população de Agrobacterium que utiliza essas opinas como fonte de carbono. Até hoje, mais de 20 tipos diferentes de opinas já foram identificadas. Assim, as linhagens de Agrobacterium podem ser classificadas de acordo com o tipo de opina sintetizada pelo seu T-DNA, como octopina, nopalina, agropina, succimanopina, cucumopina, etc. (DESSAUX et al., 1993).

Como resultado do processo infeccioso, a linhagem de Agrobacterium indutora da galha faz a célula vegetal parasitada produzir um tipo específico de opina. Somente a linhagem indutora é capaz de catabolizar essa opina como fonte de energia, de carbono e de nitrogênio. Dessa forma, as células transformadas pelo T-DNA continuam dividindo-se incontroladamente em virtude da produção de citocininas e de auxinas e, quanto mais elas se dividem, mais elas produzem opinas que, por serem utilizadas pela bactéria, formam um nicho extremamente favorável a ela.

Essa pressão seletiva favorece a multiplicação da linhagem indutora da galha que, por sua vez, irá infectar de novo as células vegetais que ainda não foram transformadas. A síntese de opinas pelas células vegetais infectadas e seu catabolismo pela bactéria indutora da galha tiveram provavelmente um papel muito importante na disseminação do plasmídio Ti na natureza. A teoria que propõe a atuação das opinas como intermediárias químicas do parasitismo é conhecida como o “conceito de opinas” (DESSAUX et al., 1993).

O sistema de infecção de plantas pelas agrobactérias representa, assim, uma situação única na natureza: a transferência de um elemento genético, o T-DNA, de um organismo procariota para um organismo eucariota superior, com sua subsequente integração e expressão no genoma hospedeiro. A demonstração de que a causa da proliferação celular da galha é a transferência de informação genética da bactéria para a célula vegetal (CHILTON et al., 1977) foi o ponto de partida para pesquisas intensivas visando à utilização desse sistema natural de transferência de genes para a obtenção de plantas transgênicas (ZAMBRYSKI, 1992).

Agrobacterium como vetor de transformação de plantas

O conhecimento dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos no processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium permitiu a utilização dessa bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas. O ponto de partida para pesquisas intensivas nessa área foi a demonstração de que nenhum gene presente na região-T, exceto os 23 pb de suas extremidades, é necessário ao processo de transferência e de integração da fita-T
no genoma da planta infectada (HOEKEMA et al., 1983; ZAMBRYSKI et al., 1983). Assim, os genes presentes na região-T podem ser eliminados e substituídos por genes de interesse, com sinais para expressão e regulação em plantas, sem que isso afete o processo de transferência. Além das extremidades da região-T, a região vir do plasmídio Ti é fundamental para o processo de transferência. Entretanto, a remoção dos oncogenes do T-DNA faz-se necessária, pois a expressão desses genes interfere no balanço hormonal de auxinas e de citocininas nas células transformadas e induz sua multiplicação descontrolada. Por esse motivo, as células transformadas pelo T-DNA selvagem não são capazes de regenerar plantas normais. Uma linhagem de Agrobacterium, cujos oncogenes foram removidos do seu plasmídio Ti, é denominada “linhagem desarmada”, pois não é mais capaz de induzir a formação de galhas em plantas.

Concluiu-se então que o desenvolvimento de vetores baseados no sistema Agrobacterium requer que se conservem as extremidades direita e esquerda da região-T, mantendo também intacta a região vir, e que se removam os oncogenes. Dessa maneira, qualquer outra nova sequência de DNA, inserida entre as extremidades da região-T, pode ser transferida e integrada no genoma vegetal, sem afetar a regeneração da célula transformada em uma planta.

Após a obtenção da linhagem desarmada de Agrobacterium, a próxima etapa é a clonagem na região-T do gene (ou dos genes) a ser transferido para a planta. Entretanto, o grande tamanho do plasmídio Ti (aproximadamente 200 kb) dificulta sua manipulação. Assim, o sistema binário foi desenvolvido para que os genes presentes na região vir do plasmídio Ti funcionem in trans para processar e transferir a região-T (HOEKEMA et al., 1983). A região-T, que contém os genes de interesse entre suas extremidades, deverá estar clonada em pequenos plasmídios (de 10 kb a 30 kb), denominados vetores binários. Esses vetores são capazes de replicar-se de maneira autônoma tanto em Escherichia coli como em Agrobacterium (BRASILEIRO; CARNEIRO, 1998).

Sistema de transformação via Agrobacterium

A partir do desenvolvimento de vetores binários e de sua introdução em linhagens desarmadas de Agrobacterium (Figura 2), foi possível a transferência de genes exógenos para plantas, por meio da utilização dessa bactéria como vetor natural de transformação. Os primeiros estudos de transformação genética de plantas envolveram a inoculação de tecidos de fumo (Nicotiana tabacum) com linhagens engenheiradas de Agrobacterium (HERRERA ESTRELLA et al., 1983; ZAMBRYSKI et al., 1983). A partir de então, o sistema de transformação via Agrobacterium vem sendo utilizado para transformar um grande número de plantas. A alta eficiência de transformação, o baixo custo operacional, assim como a simplicidade dos protocolos de transformação e de seleção, são as principais razões para a universalidade do uso do sistema Agrobacterium (BRASILEIRO; LACORTE, 2000; TZFIRA; CITOVSKY, 2006).

Atualmente, diversas características de interesse socioeconômico já foram introduzidas em diferentes espécies vegetais por transformação genética, principalmente por intermédio do sistema Agrobacterium e do método biobalístico (BRASILEIRO, 2001; BRASILEIRO; CANÇADO, 2000; GUIMARÃES et al., 2003). Essas características visam principalmente ao melhoramento do desempenho em campo das plantas cultivadas, por meio da resistência a estresses bióticos e abióticos. Características relacionadas ao desenvolvimento da planta e à qualidade do produto também podem ser modificadas em plantas transgênicas. A tendência é que cada vez um maior número de características possa ser manipulado via engenharia genética, de forma que haja um aumento da gama de produtos a serem disponibilizados para o agricultor e para o consumidor. Em um futuro breve, as plantas transgênicas desempenharão também o papel de biofábricas, e serão desenvolvidas para a produção de produtos de interesse por parte das indústrias de medicamentos, de alimentos e de rações.

Figura 2. Esquema geral das etapas da transformação de plantas por cocultura com uma linhagem desarmada de Agrobacterium.

Ilustração: Rodolfo Bezerra Batista.

Além de todas as implicações para a agricultura e para outros setores da economia, as plantas transgênicas constituem também um excelente sistema para estudos básicos em diferentes campos da biologia, como fisiologia, genética, botânica, biologia molecular e celular.

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Notas

Capítulo 1

1 Foot-candle = 10,7 lux.

Capítulo 3

1 Don Durzan em comunicação pessoal.

Capítulo 5

1 Um método para detectar fragmentação de DNA em consequência de apoptose.

Capítulo 7

1 Unidade encapsulável é qualquer tipo de explante, embriogênico ou não, que apresente tamanho reduzido (até 7 mm) e tenha a capacidade de manter a viabilidade e converter-se em planta normal, sob condições adequadas, mesmo depois de ter sido encapsulado por meio de uma matriz de encapsulamento. São exemplos de unidades encapsuláveis: embriões somáticos, embriões zigóticos, ápices caulinares, brotos, gemas axilares (microestacas), células em suspensão, etc.

2 Endosperma artificial é uma matriz de encapsulamento biodegradável, constituída pela mistura de um agente geleificante (alginato de sódio) dissolvido em água ou que contenha elementos minerais, fonte(s) de carbono, vitaminas, aminoácidos e/ou reguladores de crescimento, entre outros elementos necessários à correta manutenção da viabilidade do material vegetal encapsulado (STANDARDI; PICCIONI, 1998; MALABADI; STADEN, 2005), o que irá depender do tipo de explante e da espécie vegetal utilizada.

3 Esta fase consiste na formação propriamente dita das sementes sintéticas e decorre da troca iônica dos íons sódio (Na+) pelos íons cálcio (Ca2+), resultando na produção de cápsulas firmes e isodiamétricas, as quais são insolúveis, exceto na presença de nitrato de potássio (KNO3) (NAIK; CHAND, 2006).

4 Consiste na utilização de uma solução de nitrato de potássio (KNO3), com o objetivo de enfraquecer a cápsula de hidrogel, favorecendo assim, o rompimento da cápsula pelo explante. Tal enfraquecimento decorre do fato de que os íons potássio (K+) do nitrato de potássio substituem os íons cálcio (Ca2+), e com isso há um “amolecimento” da cápsula (ONISHI et al., 1994).

5 Existem também trabalhos que não recomendam essas lavagens, alegando possíveis perdas de certas substâncias vitais.

6 Fase que objetiva induzir ou modificar a tolerância dos explantes à desidratação.

7 Tem a vantagem de ser mais preciso e reproduzir taxas de dessecação (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

8 Nesta fase, podem ser necessárias condições ambientais específicas, além da adição de reguladores de crescimento no meio de cultura, ou, ainda, de tratamentos que promovam rompimento das cápsulas, ou mesmo a retirada dos explantes destas. Ademais, o ideal é que o restabelecimento dos explantes ocorra sem a intervenção da fase de calos (WITHERS; ENGELMANN, 1998).

9 A sigla significa Plant Vitrification Solution. A mais comumente empregada é derivada da solução proposta por Sakai et al. (1990), que consiste de glicerol (22% w/v), etileno glicol (15% w/v), propileno glicol (15% w/v), DMSO (7% w/v) e sorbitol (0,5 M).