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Unidade responsável pela edição (e-book)

Embrapa Informação Tecnológica

Coordenação editorial: Fernando do Amaral Pereira, Lucilene Maria de Andrade e Juliana Meireles Fortaleza

Revisão de texto: Maria Cristina Ramos Jubé

Normalização bibliográfica: Márcia Maria Pereira de Souza e Iara Del Fiaco Rocha

Capa: Paula Cristina Rodrigues Franco

Foto da capa (da esquerda para a direita): Júlia Kuklinsky Sobral, Márcia do Vale Barreto Figueiredo, Marisângela Viana Barbosa e Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos

Conversão e editoração do e-book: WOC Tecnologia da Informação Ltda

1ª edição

1ª impressão (2010): 2.000 exemplares

2ª edição

E-book (2012)

Todos os direitos reservados

Para uso exclusivo de #NOME#. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Embrapa Informação Tecnológica

Biotecnologia aplicada à agricultura : textos de apoio e protocolos experimentais / editores técnicos, Márcia do Vale Barreto Figueiredo, Hélio Almeida Burity, José de Paula Oliveira, Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos, Newton Pereira Stamford. – 2. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2012.

E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.

ISBN 978-85-7035-011-4

1. Bioética. 2. Biossegurança. 3. Controle biológico. I. Figueiredo, Márcia do Vale Barreto. II. Burity, Hélio Almeida. III. Oliveira, José de Paula. IV. Santos, Carolina Etienne de Rosália e Silva. V. Stamford, Newton Pereira. VI. Embrapa Agrobiologia. VII.

CDD 631.5233

© Embrapa 2012

Editores Técnicos

Márcia do Vale Barreto Figueiredo

Bióloga, D.Sc. em Microbiologia, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA/Dipap-CARHP) e professora membro permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
marcia.figueiredo@ipa.br

Hélio Almeida Burity

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Microbiologia Aplicada, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) e professor membro permanente da Rede Nordeste de Biotecnologia (Renorbio), Recife, PE
halmeida@ipa.br

José de Paula Oliveira

Zootecnista, D.Sc. em Biotecnologia, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
jose.paula@ipa.br

Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos

Zootecnista, D.Sc. em Microbiologia do Solo, pesquisadora do Departamento de Agronomia, professora membro permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
etienne@depa.ufrpe.br

Newton Pereira Stamford

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas, professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
newtonps@depa.ufrpe.br

Autores

Adália Cavalcanti do Espírito Santo Mergulhão

Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
adalia.mergulhao@ipa.br

Ademir Sérgio Ferreira de Araújo

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Ecologia de Agroecossistemas, professor da Universidade Federal do Piauí (Ufpi), Teresina, PI
asfaruaj@yahoo.com.br

Amaro de Castro Lira Neto

Biólogo, M.Sc. em Genética, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
amaro.castro@ipa.br

Ana Dolores Santiago de Freitas

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Tecnologias Energéticas Nucleares, pesquisadora do Departamento de Agronomia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
ana.freitas@depa.ufrpe.br

Ana Maria Benko Iseppon

Bióloga, Ph.D. em Ciências Naturais, professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
ana.iseppon@gmail.com

Andréa Guimarães Vieira de Vasconcelos

Engenheira-agrônoma, M.Sc. em Zootecnia, aluna do Programa Integrado de Doutorado em Zootecnia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
andreaguimaraes@bnb.gov.br

Antonio Felix da Costa

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia (Fitopatologia), pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
felix.antonio@ipa.br

Arminda Saconi Messias

Química, D.Sc. em Ciências da Engenharia Ambiental, professora da Universidade Católica de Pernambuco (Unicap) e pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
saconi@unicap.br

Aurenívia Bonifacio Lima

Bióloga, M.Sc. em Botânica, doutoranda do Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
aurenivialima@bol.com.br

Bartolomeu Acioli-Santos

Biólogo, D.Sc. em Biologia Molecular, pesquisador da Fundação Oswaldo Cruz, Recife, PE
bartacioli@hotmail.com

Carlos Henrique Madeiros Castelletti

Biólogo, M.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
henrique@castelletti.com.br

Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos
Zootecnista, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora do Departamento de Agronomia e professora membro permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
etienne@depa.ufrpe.br

Christine Lamenha Luna Finkler

Engenheira química, D.Sc. em Engenharia Química, professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
chrislluna@yahoo.com.br

Cláudia Elizabete Pereira de Lima

Bióloga, D.Sc. em Biologia de Fungos, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
claudiaell@hotmail.com

Cristiane Figueira da Silva

Engenheira florestal, D.Sc. em Produção Vegetal, professora da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (Uenf), Campos dos Goytacazes, RJ
cristiane@uenf.br

Darcy Mayra Furtado Gondim

Bióloga, M.Sc. em Bioquímica, doutoranda em Bioquímica pela Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
darcymayra@hotmail.com

Deise Maria Fontana Capalbo

Engenheira de alimentos, D.Sc. em Engenharia de Alimentos, pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP
daise@cnpma.embrapa.br

Deise Maria Passos da Silva

Bióloga, M.Sc. em Fitopatologia, doutoranda em Biotecnologia na Renorbio, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA/Dipap-CARHP), Recife, PE
deise.passos@ipa.br

Djair dos Santos de Lima e Souza

Biólogo, D.Sc. em Ciências Biológicas, profissional autônomo
djairsouza@yahoo.com.br

Ed Paschoal Carrazzoni

Químico, livre-docente, professor da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e da Universidade Católica de Pernambuco (Unicap), Recife, PE
edcarrazzoni@hotmail.com

Éderson Akio Kido

Engenheiro agrônomo, D.Sc. em Ciências, professor da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
ederson.kido@gmail.com

Edma Carvalho de Miranda

Zootecnista, D.Sc. em Produção e Nutrição Animal, professora da Universidade Federal de Alagoas (Ufal), Maceió, AL
edmacdm@qui.ufal.br

Eduardo Romano

Biólogo, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
romano@cenargen.embrapa.br

Eidy Simões de Souza

Zootecnista, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
eidysimoes@yahoo.com.br

Elaine Malosso

Bióloga, Ph.D. em Ecologia Microbiana, professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
elainemalosso@yahoo.com.br

Eliana Maria Gouveia Fontes

Bióloga, Ph.D. em Entomologia, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
eliana@cenargen.embrapa.br

Eliane Maria Ribeiro da Silva

Engenheira Florestal, D.Sc. em Agronomia, pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, Brasília, DF
eliane@cnpab.embrapa.br

Ely Nahas

Biólogo, D.Sc. em Bioquímica, professor da Universidade Estadual Paulista (Unesp), São Paulo, SP
enahas@fcav.unesp.br

Everardo Valadares de Sá Barretto Sampaio

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, professor da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
esampaio@ufpe.br

Fabiano de Carvalho Balieiro

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, pesquisador da Embrapa Solos, Rio de Janeiro, RJ
balieiro@cnps.embrapa.br

Fatima Maria de Souza Moreira

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), professora da Universidade Federal de Lavras (Ufla),
Lavras, MG

fmoreira@dcs.ufla.br

Fernando Gomes Barcellos

Biólogo, D.Sc. em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), Petrópolis, RJ
fgbarcel@yahoo.com.br

Fernando Gomes da Silva

Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Botânica, pesquisador da Secretaria de Agricultura, Abastecimento, Pesca e Desenvolvimento Rural (Seagri), Maceió, AL
gomes_opuntia@yahoo.com.br

Gabriel Maurício Peruca de Melo

Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, professor da Universidade Camilo Castelo Branco (Unicastelo), Descalvado, SP
gmpmelo@terra.com.br

Geraldo Pereira de Arruda

Biólogo, M.Sc. em Entomologia, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
arrudagp@oi.com.br

Hugo Bruno Correa Molinari

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, pesquisador da Embrapa Agroenergia, Brasília, DF
hugo.molinari@embrapa.br

Ilka Maria Vasconcelos

Farmacêutica, D.Sc. em Ciências Biológicas (Química Biológica), professora da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
imvasco@ufc.br

Janete Magali de Araújo

Química, D.Sc. em Ciências Biológicas (Genética e Melhoramento de Plantas), professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
janetemagali@yahoo.com.br

Jean Luiz Simões de Araújo

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
jean@cnpab.embrapa.br

Joaquim Albenisio Gomes Silveira

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia (Solos e Nutrição de Plantas), professor da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
silveira@ufc.br

José Nildo Tabosa

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Tecnologias Energéticas Nucleares, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
tabosa@ipa.br

José de Paula Oliveira

Zootecnista, D.Sc. em Biotecnologia, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
jose.paula@ipa.br

José Tadeu Abreu Oliveira

Biólogo, Ph.D. em Bioquímica, professor da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
jtaolive@ufc.br

José Teodorico de Araújo Filho

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Zootecnia, professor da Universidade Federal de Alagoas (Ufal), Maceió, AL
hircus4@gmail.com

Júlia Kuklinsky Sobral

Biomédica, D.Sc. em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Garanhuns (UFRPE/UAG), Garanhuns, PE
jksobral@uag.ufrpe.br

Júlio Zoé de Brito

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Botânica, presidente do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
zoe@ipa.br

Karina Patrícia Vieira da Cunha

Bióloga, Doutora em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
cunhakpv@yahoo.com.br

Kátia Regina dos Santos Teixeira

Bióloga, D.Sc. em Biologia Celular e Molecular, pesquisador da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
katia@cnpab.embrapa.br

Krystyna Gorlach-Lira

Bióloga, Ph.D. em Agronomia (Microbiologia do Solo), professora da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB
krysgl@dbm.ufpb.br

Laureen Michelle Houllou-Kido

Bióloga, D.Sc. em Ciências (Energia Nuclear na Agricultura), pesquisadora do Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene), Recife, PE
laureenhk@yahoo.com

Leda Cristina Mendonça Hagler

Química industrial, D.Sc. em Ciências (Microbiologia), professora da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ
leda@mls.com.br

Liane Maria de Almeida Castro Maranhão

Bióloga, M.Sc. em Fitossanidade, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
liane.maranhao@ipa.br

Ligiane Aparecida Florentino

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Ciências (Microbiologia Agrícola), doutoranda em Ciência do Solo pela Universidade Federal de Lavras (Ufla), Lavras, MG
ligiflorentino@yahoo.com.br

Lílian Vieira de Medeiros

Bióloga, M.Sc. em Biologia de Fungos, pesquisadora bolsista do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
lilivmedeiros@yahoo.com.br

Luc Felicianus Marie Rouws

Biólogo, D.Sc. em Química Biológica, profissional autônomo
rouws@bioqmed.ufrj.br

Márcia do Vale Barreto Figueiredo

Bióloga, D.Sc. em Microbiologia, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA/Dipap-CARHP), professora membro permanente do Programa de Pós- graduação em Ciências do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
marcia.figueiredo@ipa.br

Márcia Vanusa da Silva

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Biologia Celular e Molecular, professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
marcia.vanusa@ufpe.br

Márcio José Rossi

Engenheiro químico, D.Sc. em Engenharia Química, professor da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC
marcio@enq.ufsc.br

Marcio de Oliveira Martins

Biólogo, M.Sc. em Botânica, doutorando em Bioquímica, pela Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
momartins@yahoo.com.br

Maria do Carmo Silva Barreto

Bióloga, M.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora bolsista (BCT-Facepe) do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
helenbio2000@yahoo.com.br

Maria Fátima Grossi-de-Sa

Bióloga, D.Sc. em Ciências, professora da Universidade Católica de Brasília e pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
fatimasa@cenargen.embrapa.br

Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva

Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
maria.luiza@ipa.br

Mariangela Hungria

Engenheira-agrônoma, D.S.c. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora da Embrapa Soja, Londrina, PR
hungria@cnpso.embrapa.br

Mario de Andrade Lira

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
mariolira@terra.com.br

Mario de Andrade Lira Junior

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Ciências de Planta, professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
mario.lira@depa.ufrpe.br

Meiriana X. Vila Nova

Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora bolsista (Fixação de Recursos Humanos, CNPq) do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
novax62@yahoo.com.br

Michel Eduardo Beleza Yamagishi

Matemático, D.Sc. em Matemática Aplicada, pesquisador da Embrapa Informática Agropecuária, Campinas, SP
michel@cnptia.embrapa.br

Natália Florêncio Martins

Bióloga, D.Sc. em Bioquímica e Imunologia, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
natalia@cenargen.embrapa.br

Newton Pereira Stamford

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas, professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
newtonps@depa.ufrpe.br

Olivia Márica Nagy Arantes

Farmacêutica e bioquímica, D.Sc. em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), professora da Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR
onarantes@gmail.com

Paula Regina Kuser-Falcão

Física, PhD. Em Cristalografia de Proteínas, pesquisadora da Embrapa Informática Agropecuária, Campinas, SP
paula@cnptia.embrapa.br

Philip C. Brookes

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Ciências do Solo, pesquisador do Rothamsted Research Institute, Harpenden, Hertfordshire, Reino Unido
philip.brookes@bbsrc.ac.uk

Rinaldo Luiz Caraciolo Ferreira

Engenheiro florestal, D.Sc. em Ciência Florestal, professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
rinaldo@dcfl.ufrpe.br

Romualdo Camelo Sena

Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Agronomia (Fitossanidade), pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
romualdo@ipa.br

Sérgio Crovella

Biólogo, D.Sc. em Antropologia Molecular, professor da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
crovelser@gmail.com

Sérgio Luiz Ferreira-Silva

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Bioquímica, professor da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
agrosergol@yahoo.com.br

Sergio Miana de Faria

Engenheiro florestal, PhD em Ciências biológicas, pesquisador da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
sdefaria@cnpab.embrapa.br

Stefan Schwab

Bioquímico, D.Sc. em Ciências (Bioquímica), pesquisador da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
sschwab@cnpab.embrapa.br

Tânia Lucia Montenegro Stamford

Nutricionista, D.Sc. em Nutrição, professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
tlmstamford@yahoo.com.br

Teresa Cristina Soares de Lima Grisi

Bióloga, M.Sc. em Ciência e Tecnologia de Alimentos, doutoranda em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia, Fortaleza, CE
tcris.lima@gmail.com

Thatiana Montenegro Stamford Arnaud

Odontóloga, M.Sc. em Ciências de Materiais, doutoranda em Química Fundamental pela Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
thatianaarnaud@hotmail.com

Thayza Christina Montenegro Stamford

Odontóloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, professora da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB
thayzastam@hotmail.com

Valdinar Bezerra dos Santos

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, professor da Universidade Federal do Piauí (Ufpi), Teresina, PI
santosvb@bol.com.br

Valéria Peruca de Melo

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Produção Vegetal), professora do Centro Universitário de Formiga (Unifor), Formiga, MG
vpmelo@uniformg.edu.br

Vanildo Alberto L. B. Cavalcanti

Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Fitossanidade, diretor de Pesquisa e Desenvolvimento do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
vanildo.leal@ipa.br

Veronica Massena Reis

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
veronica@cnpab.embrapa.br

Virginia Maria Tenório Sabino Donato

Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Botânica, professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
vmtsdonato@uol.com.br

Wanderley José de Melo

Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas, professor da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV/Unesp), Jaboticabal, SP
wjmelo@fcav.unesp.br

Zaida Inês Antoniolli

Bióloga, Ph.D. em Aspectos Ecológicos e Molecular de Micorriza, professora da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS
zaida@ccr.ufsm.br

Agradecimentos

Ressaltamos que esta obra resultou do esforço conjunto de autores de várias instituições, que atenderam a nossa solicitação com grande empenho e venceram o desafio de adequar textos de apoio e protocolos à dinâmica dos novos conhecimentos na área de forma clara e objetiva. A eles nossos mais sinceros agradecimentos.

Estendemos nossos agradecimentos ao Dr. José Geraldo Eugênio de França (Diretor-Executivo da Embrapa), que não mediu esforços para a realização desta obra. Agradecemos também ao Dr. Eduardo Francia Carneiro Campelo (Chefe-Geral da Embrapa Agrobiologia), ao Dr. Júlio Zoé de Brito (Presidente do Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA), ao Dr. Vanildo Alberto Leal B. Cavalcanti (Diretor de Pesquisa e Desenvolvimento do IPA), ao Dr. Élcio Oliveira Tenório de Lima (Presidente da CARHP), ao Dr. Josival Gomes de Almeida (Diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Rural da Dipap/Seagri), ao Dr. Fernando do Amaral Pereira (Gerente-Geral da Embrapa Informação Tecnológica), à Dra. Mayara Rosa Carneiro (Gerente-Adjunta de Projetos Editoriais da Embrapa Informação Tecnológica) e a toda a sua equipe de editoração.

Apresentação

Uma nova agricultura se faz necessária. Questões atuais, como mudanças climáticas globais, excesso de uso de agroquímicos, degradação do ecossistema, não são fatos isolados ou passageiros, fazem parte de uma agenda permanente incorporada às discussões das políticas necessárias para suporte ao desenvolvimento sustentável do negócio agrícola e às discussões sobre segurança alimentar e nutrição.

O planeta espera por mudanças radicais, desde que tais mudanças tragam sustentabilidade e o equilíbrio dos sistemas naturais. Fundamentos científicos associados ao desenvolvimento de uma biotecnologia segura e aplicada às demandas e necessidades da sociedade são sempre bem-vindos.

Um dos grandes desafios ao desenvolvimento de uma agricultura com práticas sustentáveis se dá exatamente na incorporação, no dia a dia de laboratórios, escolas, empresas e campos, das práticas atuais de biotecnologia voltadas ao melhoramento genético, ao controle biológico, ao uso eficiente de microrganismos na fixação biológica de nitrogênio, na biorremediação, nos processos fermentativos industriais, como o de produção de etanol, a partir de práticas comprovadamente seguras.

É nesse escopo que o conteúdo desta obra é fundamental, não apenas como uma atualização das técnicas e procedimentos biotecnológicos, mas como um convite à reflexão de formuladores de políticas públicas, cientistas, professores e gestores, no sentido de incorporarem às suas instituições projetos e programas que deem suporte à biotecnologia como agente inovador e transformador para a agricultura, a pecuária e a indústria de alimentos, insumos e matérias-primas neste século.

A obra mostra o envolvimento de inúmeras áreas do conhecimento e a oportunidade de utilização de disciplinas básicas como a enzimologia, a bioquímica, a química, a biologia e a bioinformática que em conjunto possibilitam o desenvolvimento de uma biotecnologia avançada, ainda pouco reconhecida pelo setor produtivo nacional.

José Geraldo Eugênio de França

Diretor-Executivo

Prefácio

A biotecnologia envolvendo a atuação de microrganismos vem merecendo destaque especial no desenvolvimento da ciência, na produção e eficiência de novas tecnologias, bem como em avanços dos conhecimentos modernos. O termo biotecnologia refere-se a um conjunto amplo de tecnologias que envolvem a utilização, alteração controlada e a otimização de organismos vivos, células e moléculas para a geração de produtos e processos. Seus resultados são aplicáveis e utilizados por setores de diversas áreas do conhecimento, como microbiologia, biologia molecular, fisiologia, bioquímica, química, genética, entre outras. Nesse sentido, faz-se da maior importância a edição de um livro que forneça as linhas básicas para a real qualificação de profissionais e estudantes da área, principalmente com vistas à divulgação e ao desenvolvimento de novos métodos e práticas de processos biotecnológicos.

A ideia de escrever este livro deveu-se principalmente à escassez de protocolos atualizados na maioria dos laboratórios de microbiologia e biotecnologia, o que gera muita dificuldade na execução de análises que usam técnicas mais recentes. Portanto, o livro é proposto com o intuito de facilitar o trabalho de pesquisadores, professores, técnicos e alunos de graduação e pós-graduação nas áreas de microbiologia, agronomia e biotecnologia.

O conteúdo deste livro procura refletir os diferentes temas da biotecnologia e contemplar técnicas recentes, e está dividido em 5 partes – Biossegurança e bioética; Enzimas; Técnicas moleculares e aplicação da genética nas áreas agrícolas; Microrganismos promotores do crescimento de plantas; e Técnicas biotecnológicas aplicadas à agricultura –, de modo que as investigações em cada capítulo são dirigidas a aspectos relacionados aos processos biológicos.

Espera-se que esta publicação sirva de estímulo para que surjam, cada vez mais, interessados em desenvolver pesquisas e aplicá-las em benefício do meio ambiente.

Os Editores

Parte 1
Biossegurança
e bioética

Capítulo 1
Panorama brasileiro de biossegurança e bioética

Leda Cristina Mendonça Hagler
Deise Maria Fontana Capalbo
Olivia Márica Nagy Arantes
Eliana Maria Gouveia Fontes

1. Introdução

A agricultura tem grande relevância para a economia brasileira. O setor gera um terço das exportações e do produto interno bruto (PIB) e emprega um quinto da mão de obra ativa. O melhoramento de plantas e sua adaptação aos diferentes ambientes foram conduzidos no Brasil como nos demais países de agricultura avançada, baseados em tentativa e erro. Com os avanços nas técnicas de melhoramento no início do século 20, foi possível desenvolver variedades que combinavam as prévias características a outras, como tolerância a estresses bióticos e/ou abióticos (COOK, 1999). Esse histórico de melhoramento demonstrou segurança dos produtos dele derivados: ensaios de campo antes do lançamento comercial foram usados, e as decisões quanto às variedades a serem lançadas comercialmente se mostraram adequadas, e/ou as práticas de manejo em uso se mostraram suficientes para mitigar qualquer risco associado com a nova variedade.

Nos últimos 30 anos, a aplicação das ferramentas de biologia molecular permitiu o desenvolvimento de plantas com novas características que não podiam ser introduzidas pelas técnicas de melhoramento convencional. Isso expandiu o cenário das características genéticas que podem ser agregadas às plantas; e apesar de a técnica não ter inerentemente um caráter menos seguro do que as anteriores (NAS 1987; NRC 1989), elas geraram a percepção mundial da necessidade de regulamentação que hoje é aplicada para análise da segurança de tais plantas. O mesmo se repetiu no Brasil, não apenas por ser detentor de reconhecida vantagem competitiva na agricultura tropical, mas especialmente em decorrência de políticas públicas, voltadas para o desenvolvimento tecnológico e formação de recursos humanos em biologia molecular e ciências agrícolas (SILVEIRA et al., 2004). E, nesse cenário, a biotecnologia tem sido considerada uma das áreas prioritárias para investimentos em pesquisa e inovação.

A pesquisa brasileira é majoritariamente desenvolvida em universidades e instituições públicas. Estima-se que apenas um terço dos recursos aplicados em pesquisa e desenvolvimento seja proveniente do setor privado (BRASIL, 2009a; SILVEIRA et al., 2004). A genômica representa uma área de considerável avanço no País, após a implantação de redes genômicas, seguindo o pioneirismo do Instituto Virtual Onsa de São Paulo, que sequenciou o genoma da bactéria Xylella fastidiosa (SIMPSON et al., 2000).

Nesse contexto, o governo federal lançou um programa ambicioso visando desenvolver a biotecnologia moderna aplicada à saúde, agricultura e ao meio ambiente (BRASIL, 2009a). Os principais tópicos focalizados no citado programa foram: genômica, proteômica, organismos geneticamente modificados, terapia gênica, células-tronco, biocombustíveis e nanotecnologia. O Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT) implementou o programa nacional em genômica, com a incumbência de sequenciar genomas de plantas e microrganismos (BRASIL, 2009a; VASCONCELOS et al., 2003). Recentemente, a rede Riogene, RJ, sequenciou o genoma da bactéria endofítica diazotrófica denominada Gluconoacetobacter azotofixans (EMBRAPA, 2009).

Apesar da existência desse cenário nacional favorável ao desenvolvimento da biotecnologia agrícola, a adoção de plantas transgênicas foi tardia em comparação com outros países de agricultura forte. Um dos fatores determinantes dessa morosidade foi a oposição interna organizada de grupos ambientalistas, explorando as lacunas jurídicas que existiam na legislação.

No presente capítulo, apresentamos o panorama atual sobre a legislação brasileira de biossegurança e a comercialização de plantas transgênicas, discutindo as questões de bioética e as perspectivas para o desenvolvimento da biotecnologia moderna aplicada ao setor agrícola.

2. Marco regulatório de biossegurança

Biossegurança é o termo usado para descrever os estudos e esforços para reduzir ou eliminar potenciais riscos resultantes da biotecnologia moderna e ou de seus produtos, dentro do escopo de manejo de riscos biológicos (ZAID et al., 2001). Ele envolve também regulamentações que se destinam à análise e ao manejo dos riscos potenciais para o alimento, a saúde humana e animal, o desenvolvimento saudável de plantas e também para o ambiente. Esse é um conceito holístico que remete à relevância do tema para a sustentabilidade da agricultura e dos produtos alimentares, proteção ambiental (incluindo a biodiversidade), sendo especialmente aplicado aos organismos vivos geneticamente modificados (OGMs) e seus derivados, além do manejo de espécies invasoras exóticas. Para fins desse capítulo, o termo será empregado nos aspectos associados com plantas transgênicas e agricultura.

Várias áreas da ciência e disciplinas relevantes são, portanto, parte integrante desses estudos e informações, como a biologia molecular, o melhoramento de plantas, a genética, a agronomia e a ecologia, entre outras. O processo de integração, de forma lógica, entre informações multidisciplinares é complexo, bem como a credibilidade para estabelecer uma visão balanceada da situação antes e depois da inserção da nova tecnologia ou seu produto no ambiente de produção e consumo.

2.1. Esforços internacionais em biossegurança

Pela crescente percepção das alterações ambientais globais e preocupação com a acelerada degradação ambiental durante o último quarto do século 20, a comunidade internacional impulsionou as questões ambientais para o topo da agenda política dos governos. Já em 1993, a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD) publicou princípios gerais que os estados membros deveriam aplicar à produção e comercialização em larga escala de plantas geneticamente modificadas (GM) ou transgênicas, como são conhecidas no Brasil (OECD, 1993).

Durante a Conferência das Nações Unidas (Unced), realizada em 1992 no Rio de Janeiro, foram assinados protocolos importantes, como a Agenda 21 e a Convenção sobre Diversidade Biológica (CBD), ratificados por mais de 170 países. A biossegurança possui interfaces com esses instrumentos normativos. O artigo 15 da Declaração do Rio de Janeiro (DECLARAÇÃO..., 1992) estabelece o Princípio da Precaução, com o fim de proteger o meio ambiente e assim postulado: “quando houver ameaças de danos graves ou irreversíveis, a ausência de certeza científica absoluta não será utilizada como razão para o adiamento de medidas economicamente viáveis para prevenir a degradação ambiental”.

A CBD preconiza a preservação e o uso sustentável da biodiversidade e reconhece o direito soberano dos países sobre seus recursos genéticos e a justa e equitativa partilha dos benefícios gerados pelo uso da biodiversidade. O texto da CBD faz referência ao uso seguro da biotecnologia moderna, no artigo 8 (g), que expressa a necessidade de regulamentar o uso e liberação de OGM. As negociações efetuadas durante as reuniões dos países membros da CBD resultaram em recomendações de biossegurança, propostas pelo Pnud (Programa das Nações Unidas para o Meio Ambiente) (UNEP, 1995) e aceitas pelos países membros da CBD. Outro artigo da CBD (artigo 19-3) contempla o movimento de OGM entre fronteiras e trata da necessidade de desenvolvimento de um protocolo estabelecendo os procedimentos para sua importação e uso, evitando efeitos adversos sobre a biodiversidade. Este instrumento legal, denominado Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança (PCB), foi negociado pelos países membros da CBD, passando a vigorar desde 2002, tendo sido posteriormente ratificado pelo Brasil. O PCB inclui um mecanismo denominado Acordo Prévio Informado (AIA) que garante ao país importador de OGM a realização de análise de risco, anterior à importação, seguindo metodologia descrita no anexo III do PCB. O OGM importado para cultivo e comercialização, destinado à alimentação humana, animal ou processamento, deve ser acompanhado de documentação informativa sobre seu conteúdo e transportado em consonância com as regras internacionais de segurança. Os fármacos estão excluídos do referido protocolo, porque estão incluídos em outros instrumentos legais.

As informações sobre OGMs comercializados entre os países signatários do protocolo e suas respectivas legislações de biossegurança devem ser disponibilizadas em um banco de dados – Biosafety Clearing House (BCH). O PCB enfatiza a colaboração entre os países membros em ações para capacitação de recursos humanos e estimula a participação da opinião pública nas discussões sobre biossegurança, visando à conservação e ao uso sustentável da biodiversidade e proteção à saúde humana (PROTOCOLO... 2003).

2.2. O marco regulatório brasileiro

É importante mencionar que o Brasil tem adotado uma série de políticas públicas voltadas para a conservação e uso sustentável de seu rico manancial de recursos genéticos. Dentre as principais ações, destacamos a instituição do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN), do Programa Nacional da Diversidade Biológica (Pronabio) e da Comissão Nacional da Biodiversidade (Conabio), refletindo a preocupação do governo com o patrimônio genético da nação (BRASIL, 2009b).

A legislação brasileira de biossegurança adotou o modelo de avaliação específica para os OGMs, efetuada por um colegiado multidisciplinar e pluri-institucional, com competência para regulamentar todas as atividades que envolvem DNA recombinante, denominado Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). A legislação de biossegurança foi instituída pela Lei n° 8.974 de 5/1/1995, alterada pela Medida Provisória nº 2.191-9/01, posteriormente regulamentada por instruções normativas. Esse marco legal gerou um sistema operacional excessivamente burocratizado em decorrência de conflitos na interpretação de textos legais ambíguos em relação à definição de competências entre o disposto no texto da Lei de Biossegurança e legislações pré-existentes no âmbito da vigilância sanitária, agrotóxicos e meio ambiente. A exigência de avaliações múltiplas nas diversas instâncias de governo gerou situações conflituosas para análise dos processos envolvendo OGMs no Brasil, resultando em ações judiciais que prejudicaram significativamente o avanço da biotecnologia moderna (FONTES, 2003; MENDONÇA-HAGLER; ALEIXO, 2002). Esse cenário motivou o governo federal a enviar ao congresso um novo projeto de Lei de Biossegurança, que resultou na Lei n° 11.105 de 28/3/2005, regulamentada pelo Decreto n° 5.591 de 22/11/2005, atualmente em vigor (LEGISLAÇÃO... 2009).

A nova Lei de Biossegurança eliminou a polêmica associada à interpretação legal de que qualquer liberação de OGMs constituía uma atividade potencialmente poluidora, sendo obrigatória a realização de licenciamento ambiental, independente do resultado da avaliação da CTNBio. Atualmente, o cumprimento da Resolução nº 305, de 2002, do Conselho Nacional do Meio Ambiente (Conama), pode ser exigido somente no caso de atividade considerada pela CTNBio como potencialmente degradadora do meio ambiente.

A nova legislação eliminou também o conflito em relação à Lei n° 9.782/1999 que criou a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) e que atribui competências à agência para regulamentar, controlar e fiscalizar produtos oriundos da engenharia genética que possam apresentar riscos à saúde humana. A Lei n° 11.105 estabeleceu claramente a competência da CTNBio para identificar as atividades e produtos decorrentes do uso de OGMs e seus derivados que possam causar riscos à saúde humana.

Outra modificação na legislação feita com fins de harmonização do arcabouço legal da biossegurança no Brasil foi a mudança da definição do termo agrotóxico da Lei dos Agrotóxicos (Lei nº 7.802/89), que incluía nessa categoria os organismos geneticamente modificados para resistência a vírus ou insetos, destinados à alimentação humana e animal. O novo texto isentou estes OGMs dos procedimentos previstos na Lei nº 7.802/89, com exceção de OGM usado na produção de agrotóxicos.

Outras modificações significativas são apresentadas a seguir.

Modificações promovidas pela Lei n° 11.105 de 28/3/2005, regulamentada pelo Decreto n° 5591 de 22/11/2005.

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Criação do Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS) vinculado à Presidência da Repúblicca e encarregado de formulação e implementação da Política Nacional de Biossegurança.

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Reestruturação da CTNBio, delegando à comissão a competência para aprovar os OGMs para fins de pesquisa e comercialização, autorizar as pesquisas, inclusive as de campo, e identificar as atividades que necessitem de estudo de impacto ambiental.

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Criação, no âmbito do MCT, do Sistema de Informações em Biossegurança (SIB).

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Permissão para uso de células-tronco embrionárias humanas para fins de pesquisa e terapia e proibição de tecnologias genéticas de restrição de uso que resultam em OGMs com estruturas reprodutivas estéreis (tecnologias Gurts).

Foram mantidas as exigências sobre a constituição de Comissão Interna de Biossegurança (Cibio), o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB), a proibição da clonagem humana e o uso de engenharia genética em célula germinal, zigoto ou embrião humanos. Esse arcabouço legal de biossegurança e as interfaces com outros instrumentos legais foram discutidos em detalhes por Mendonça-Hagler et al. (2006a).

3. Avaliação de risco ambiental de organismos geneticamente modificados

Durante a obtenção de dados para análise de risco, é fundamental a comparação entre a cultivar transgênica e seu parental isogênico. Basicamente, a avaliação de risco utiliza as informações sobre o grau de risco do organismo parental, as características dos novos genes inseridos, o processo de inserção, o fenótipo do OGM resultante e as características do ambiente receptor. A avaliação de risco segue a sistemática de análise, caso a caso, e em etapas crescentes de escala de desenvolvimento da tecnologia. Inicia-se em experimentos de laboratório para obtenção e seleção do evento de transformação, passando para testes em casas de vegetação e posteriormente para os testes de campo. A comercialização é licenciada quando os resultados dos experimentos prévios, estruturados sobre os tópicos relevantes e que identificam a presença ou ausência dos principais impactos das plantas GMs, indicam alta probabilidade de segurança do OGM:

Tópicos relevantes para a biossegurança de plantas GMs.

Riscos à saúde humana e animal: toxicidade (alimentar e para rações); qualidade dos alimentos e rações derivados de plantas GMs; alergenicidade; patogenicidade; resistência a drogas (antibióticos, por exemplo); mercado seletivo (risco econômico).

Riscos ao ambiente: persistência do gene ou transgene (plantas voluntárias, vigor, invasividade); suscetibilidade aos organismos não alvo; mudanças no uso de produtos químicos agrícolas; alterações na biodiversidade por interações tritróficas; alterações na fertilidade do solo ou na degradação de material orgânico.

Riscos à agricultura: resistência/tolerância dos organismos alvo; desenvolvimento de plantas invasoras ou superinvasoras; alteração do valor nutricional; alterações de prática de manejo; poluição genética pela dispersão de pólen ou sementes; transferência de genes a microrganismos ou geração de novos tipos de vírus por recombinação.

Principais impactos avaliados para liberação de OGMs no ambiente.

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Possibilidade de fluxo gênico.

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Vantagem competitiva (possibilidade de surgirem superinvasoras, por exemplo).

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Possibilidade de desenvolvimento de resistência em insetos.

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Riscos de OGMs resistentes a vírus.

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Possibilidade de ocorrência de erosão genética.

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Impactos em ecossistemas e organismos não alvo da tecnologia.

A liberação de um OGM em regiões diferentes requer a obtenção de dados regionais, considerando as diferentes respostas resultantes da interação genótipo versus ambiente. O monitoramento periódico deve ser feito após a liberação em novo ambiente, permitindo avaliar respostas inesperadas no campo. O monitoramento pós-comercialização tem sido exigido para cultivo de plantas GMs no País. A base científica desses possíveis impactos é discutida a seguir.

A possibilidade de fluxo gênico do OGM para espécies sexualmente compatíveis é uma questão fundamental na avaliação de risco ambiental, particularmente para OGMs que serão cultivados nas proximidades dos centros de origem e de diversidade das respectivas espécies. A probabilidade de fluxo gênico depende de muitos fatores, como a dinâmica das populações envolvidas, os mecanismos de polinização e de dispersão das sementes e o ambiente da liberação. A formação de híbridos entre plantas transgênicas e seus parentes silvestres tem sido bem documentada (BERGELSON et al., 1998; DALE; SCHEFFLER, 1996; ELSTRAND, 2003). A localização geográfica da liberação é um dado importante, particularmente quando estão presentes no ambiente espécies sexualmente compatíveis com o OGM. A próxima etapa da avaliação de risco considera as consequências da introgressão do transgene, analisando a possível vantagem competitiva conferida às cultivares não transgênicas. No Brasil existem diversas cultivares de várias plantas de importância econômica (ex.: algodão, arroz, batata, entre outras), fato que deve ser considerado na análise de risco dos respectivos OGMs antes da liberação em território nacional. Os procedimentos para evitar ou minimizar os riscos de fluxo gênico são apresentados a seguir.

Procedimentos recomendados para o manejo de risco de fluxo gênico.

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Isolamento espacial ou temporal entre espécies sexualmente compatíveis.

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Retirada de florescências das plantas.

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Uso de plantas macho estéril.

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Uso de bordaduras de plantas incompatíveis com a planta transgênica.

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Procedimentos apropriados de descarte do material transgênico.

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Monitoramento pós-colheita para eliminação de plantas voluntárias.

A transferência horizontal de genes pode ocorrer no ambiente entre organismos procariontes, pelos processos de conjugação, transdução e transformação. Genes de origem bacteriana são comumente inseridos nas plantas transgênicas, tais como os que conferem resistência a antibióticos. A transferência horizontal de genes de plantas para microrganismos, quando detectável, ocorre com baixa frequência (KAY et al., 2002; SMALLA, 2000). Os genes de resistência aos antibióticos, comumente usados como marcadores em OGMs, existem naturalmente nos microrganismos, e sua disseminação, a partir das plantas transgênicas, representa um risco pouco significativo, particularmente na ausência de pressão seletiva (DEMANÈCHE et al., 2008).

O aumento de área cultivada com plantas tolerantes a herbicida pode favorecer o aparecimento de plantas com tolerância múltipla aos herbicidas de amplo espectro, resultantes de vários eventos de transferência gênica e sob elevada pressão seletiva, podendo apresentar o comportamento de planta daninha, superinvasoras (SANVIDO et al., 2007). Esse tipo de risco pode ser reduzido por modificações na construção do OGM, dificultando a introgressão de genes em espécies sexualmente compatíveis (GRESSEL, 2000).

O amplo uso e a expressão contínua de genes de resistência a insetos, representado atualmente pelo gene cry obtido da bactéria Bacillus thuringiensis, podem aumentar a pressão seletiva exercida pela presença contínua de tal característica inseticida, favorecendo a seleção de insetos resistentes às toxinas bioinseticidas. Os mecanismos de resistência e as diferentes estratégias para manejar esse risco foram recentemente revisados por Bravo e Soberón (2008). As associações de diferentes toxinas Bt, oriundas dos pesticidas denominados biológicos (CAPALBO et al., 2004), já são largamente usadas na agricultura orgânica, manejo que dificulta o aparecimento de resistência. Também o uso de refúgios, possuindo insetos sensíveis, permite o cruzamento destes com insetos resistentes, resultando em populações vulneráveis à toxina. Os cultivos de milho e algodão Bt nos EUA incluem refúgios que variam geralmente de 20% a 50% da área plantada com OGMs. A CTNBio aprovou a comercialização de plantas Bt (ver destaque adiante), exigindo a inclusão de áreas de refúgio.

A introdução de genes de resistência a vírus também pode apresentar riscos, como a recombinação entre os vírus de RNA presentes na planta transgênica, podendo originar novos patógenos. Os riscos decorrentes da formação de novos vírus, por recombinação e encapsidação heteróloga, precisam ser investigados para aplicação segura da tecnologia, de grande importância no controle de infecções virais em plantas (FUCHS; GONSALVES, 2007; TEPFER, 2002).

Poucas espécies de plantas comestíveis são usadas na alimentação humana, e destas poucas variedades são cultivadas, o que coloca em risco as variedades não comerciais que foram evoluindo ao longo do tempo de domesticação da planta, contribuindo para a chamada erosão genética. A expansão da biotecnologia agrícola, em escala global, pode reduzir ainda mais a diversidade dos cultivos e contribuir para a redução de diversidade genética.

As plantas transgênicas resistentes aos insetos (plantas Bt) podem causar impactos diretos, como a deposição de pólen no ambiente ou efeitos indiretos em organismos não alvo, no entanto os impactos detectados em vários estudos foram pouco significativos. (SANVIDO et al., 2007).

Os possíveis efeitos de plantas GMs sobre os ecossistemas de solo foram recentemente discutidos (ICOZ; STOTZKY, 2008; MENDONÇA-HAGLERet al., et al. 2006b; SAXENA et al., 1999). Algumas plantas Bt podem potencialmente afetar a diversidade microbiana do solo, alterando os ciclos do carbono e nitrogênio com implicações para a fertilidade do solo. Flutuações na estrutura das comunidades microbianas de solos, cultivados com plantas GMs, foram detectadas em vários estudos, no entanto essas tiveram efeito passageiro e foram menores que a variação natural detectada em diferentes solos, independente de transgenia (DUNFIELD; GEMIDA, 2004).

Experimentos com cultivo de transgênicos em larga escala foram desenvolvidos em duas centenas de campos na Europa, para avaliar os efeitos de OGMs tolerantes a herbicida sobre os agroecossistemas. Os impactos sobre a biodiversidade entre as diferentes cultivares testadas foram muito variáveis, excedendo as diferenças entre os cultivos transgênicos e convencionais. No início do cultivo, as lavouras transgênicas de milho, canola e beterraba tolerantes a herbicida apresentaram maior biomassa e número de plantas daninhas. No entanto, em estágios mais avançados de crescimento, as lavouras de beterraba e canola apresentaram menos sementes de plantas daninhas e menor biomassa no solo, bem como uma redução no número de abelhas e borboletas. No caso do milho tolerante a herbicida, foram observados maior mortalidade das plantas daninhas e maior número de invertebrados e pássaros, com benefícios para a biodiversidade. Todas as lavouras com plantios transgênicos apresentaram maior biodiversidade de organismos no solo por causada maior concentração de detritos nestes cultivos decorrente da eliminação das plantas daninhas. Os resultados desses estudos foram avaliados e sumarizados por Firbank (2003) e Ammann (2004). As mudanças na estrutura das comunidades podem não resultar em grandes alterações nos ecossistemas em razão da dinâmica compensatória de espécies funcionalmente similares que atuam como tampão.

4. Segurança alimentar e rotulagem de OGMs e derivados

A CTNBio avalia a biossegurança de OGMs importados e comercializados no Brasil bem como de produtos contendo OGMs e derivados produzidos para o mercado interno. Basicamente, a análise de risco emprega o conceito de equivalência substancial, que compara a composição nutricional entre os OGMs e derivados com os similares convencionais não transgênicos (TOMLISON, 2000). A metodologia para determinação da composição química de OGM tem sido atualizada e segue as recomendações emanadas do Codex Alimentarius (WHO, 2003). Durante a escassez de milho no mercado interno, a CTNBio aprovou a importação de milho transgênico comercializado em outros países, após avaliação criteriosa da segurança alimentar dos eventos comercializados. Houve forte oposição de grupos ambientais a esta importação. As cargas de milho transgênico foram transportadas, sob a jurisdição do Ministério de Agricultura, do porto de entrada para a fábrica de moagem, como medida de segurança. A CTNBio também aprovou ingredientes alimentares e enzimas produzidos por microrganismos GMs. Esses derivados, quando não contêm DNA recombinante e constituem substâncias quimicamente definidas, estão isentos da regulamentação aplicada a OGMs.

Os produtos alimentícios que contêm OGMs e derivados, em concentração de 1% ou mais, devem ser rotulados (Decreto nº 4680/2003). O símbolo designado para indicar conteúdo de transgênicos é representado por um triângulo com um T em fundo amarelo. O regulamento também aborda a presença não intencional de OGMs em alimentos. A rotulagem é entendida, nesse contexto legal, como direito do consumidor à informação, não estando relacionada às questões de biossegurança, que são avaliadas em etapa anterior à comercialização (CTNBio, 2009). Poucos produtos no mercado, contendo transgênicos, são rotulados em conformidade com a legislação em vigor.

5. Plantas transgênicas no Brasil

Experimentos de campo – Um total aproximado de 2.000 petições foi aprovado pela CTNBio, desde seu funcionamento em 1996, com o objetivo de liberação planejada de plantas transgênicas em campo. A avaliação de risco dessas solicitações foi efetuada caso a caso, com base em critérios reconhecidos pela comunidade científica internacional (EDMONDS INSTITUTE, 1998; PROTOCOLO... 2003; UNEP, 1995). As principais liberações planejadas foram: milho (85%), feijão-soja (7%), algodão (5%), cana-de-açúcar (2%), feijão, eucalipto, batata, arroz, mamão e tabaco (~1%). As principais características genéticas inseridas nessas plantas foram tolerância a herbicida (HT) 55%, resistência a insetos (IR) 42%, eventos múltiplos (HT+IR) 2% e resistência a vírus (VR) 1% (MENDONÇA-HAGLERet al., 2008). Plantas GMs, ditas de segunda e terceira gerações, que expressam características de enriquecimento nutricional, redução de lignina, resistência para solos secos ou salinos, cana com sacarose aumentada, produção de fármacos e outras, estão em desenvolvimento (CTNBio, 2009).

Comercialização de cultivos transgênicos – O período de grande atividade política em relação à proteção ambiental coincidiu com o aumento das áreas plantadas com OGMs. Desde as primeiras lavouras de plantas GMs, a área tem crescido mais de 10% ao ano, passando de 1,7x106 ha em 1996 para 125x106 ha em 2008 (JAMES, 2009). Cerca de metade da área mundial cultivada está localizada nos países: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Índia, Canadá e China. Vale ressaltar que desses apenas Brasil e China ratificaram o Protocolo de Cartagena.

Apenas quatro culturas representam praticamente toda a área de plantas GMs no mundo: soja (53% da área cultivada com variedades transgênicas), milho (30%), algodão (12%) e canola (5%). Esses percentuais são maiores nos Estados Unidos, onde mais de 90% da soja plantada, 80% do algodão e 50% do milho são transgênicos. Em menor escala, são plantados abobrinha, alfafa e papaia transgênicas nos Estados Unidos; papaia, álamo, tabaco, tomate e pimenta doce são cultivados na China; e arroz no Irã, entre outros produtos em pequenas áreas.

O Brasil cultiva atualmente 15,8 milhões de hectares representando 16% das lavouras mundiais de transgênicos, sendo 87% de soja tolerante a glifosato, com menor participação de algodão Bt e milho (Bt e tolerante a herbicida) (JAMES, 2009). A primeira aprovação comercial de uma planta transgênica no Brasil data de 1998, ocasião em que a CTNBio aprovou a soja tolerante ao glifosato, sob condição de monitoramento ambiental, uma exigência inovadora. Essa aprovação foi questionada em longas batalhas jurídicas. Estima-se que a soja transgênica representou 64% da safra brasileira de soja em 2008. O algodão Bt, resistente a inseto, foi aprovado em 2005, sob exigências de zonas de exclusão (BARROSO et al., 2005), uso obrigatório de áreas de refúgio, cultivadas com algodão convencional, e medidas adicionais de contenção. Recentemente, dois eventos de algodão foram aprovados, ambos tolerantes a herbicida. O milho transgênico foi sempre alvo de calorosas discussões relacionadas à preocupação com a preservação da rica diversidade genética de raças crioulas encontradas no Brasil. Os processos para comercialização de milho GM ficaram vários anos sob avaliação, tendo sido recentemente aprovados seis eventos de milho transgênico. Os cultivos transgênicos comercializados no Brasil e respectivos anos de aprovação estão listados a seguir (CTNBio, 2009).

Comercialização de plantas geneticamente modificadas no Brasil.

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Soja tolerante a glifosato (epsps) (RoundUp Ready) evento GTS 40.3-2 (1998).

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Algodão resistente a inseto (cry1Ac) evento 531 (2005).

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Algodão tolerante a glufosinato (bar) evento LL Cotton 25 (2008).

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Algodão tolerante a glufosato (cp4 epsps) evento MON 1445 (2008).

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Algodão resistente a insetos e tolerante a glufosinato (Widestrike) (cry1F+cry1Ac+pat) evento 281-24-236/3006-210-23 (2009).

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Algodão resistente a insetos (Cry1Ac+Cry2Ab2+NptII+aad+uidA) (Bolgard II) evento 15985 (2009).

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Algodão resistente a insetos e tolerante a glifosato (cry1Ac+cp4epsps) evento MON 531 x MON 1445 (2009).

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Milho Bt resistente a inseto (Cry1Ab) evento MON 810 (2007).

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Milho tolerante a glufosinato (bar) evento T-25 (2007).

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Milho resistente a insetos e tolerante a glifosinato (cry1Ab+bar) evento Bt-11 (2008).

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Milho tolerante a glifosato (cp4 epsps) evento NK603 (2008).

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Milho tolerante a glifosato (m epsps) evento GA21 (2008).

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Milho resistente a insetos e tolerante a glufosinato (cry 1F+bar) evento TC1507 (2008).

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Milho resistente a insetos e tolerante a glifosato (Cry1Ab+bar+m epsps) evento Bt 11 x GA21 (2009).

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Milho resistente a insetos e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1Ab) evento MON810 x NK603 (2009).

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Milho resistente a insetos (Vip 3 Aa) evento MIR 162 (2009).

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Milho resistente a insetos (cry1A.105 + cry2Ab2) evento MON 89034 (2009).

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Milho resistente a inseto e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1F+pat) evento TC1507 x NK 603 (2009).

As plantas transgênicas liberadas para comercialização são também cultivadas em outros países, existindo familiaridade quanto à biossegurança dos respectivos eventos genéticos (SANVIDO et al., 2007). Excepcionalmente, para suprir o mercado interno, foi importado o milho GM comercializado em outros países, para processamento e uso como ração. Antes da aprovação para comercialização no País, o milho GM foi testado experimentalmente em regiões brasileiras, resultando dados complementares sobre o comportamento ambiental das cultivares. Tipicamente, esses estudos mostraram a eficiência de milho de Bt no controle de insetos alvo no campo, sem causar mudanças significativas na diversidade de outros insetos (FERNANDES et al., 2007; FERNANDES, 2003; FRIZZAS, 2003; MARTINELLI, 2001). A comercialização de milho transgênico foi condicionada a um programa de monitoramento ambiental e ao cumprimento de normas visando assegurar a coexistência entre os diferentes sistemas de cultivo. É importante mencionar que nenhum cultivo de plantas transgênicas é permitido em áreas de preservação ambiental e nas reservas indígenas (CTNBio, 2009).

Os possíveis impactos socioeconômicos associados à comercialização dos três primeiros eventos de milho foram avaliados em instância superior (CNBS), que ratificou as decisões da CTNBio, sinalizando um cenário positivo para a adoção de lavouras transgênicas no País. As questões associadas à coexistência entre as distintas tecnologias agrícolas têm sido discutidas em vários países (FONTES, 2007; JANK et al., 2006; SCHIEMANN, 2003).

6. Perspectivas para a biotecnologia agrícola

As plantas transgênicas tiveram um grande desenvolvimento nos últimos 15 anos, com um crescente em área cultivada e em representatividade na produção mundial de soja, milho, algodão e canola. A primeira geração de plantas GMs autorizadas para plantio comercial em diversos países buscou a melhoria das características agronômicas, como tolerância a herbicidas e resistência ao ataque de insetos. A segunda geração foi pesquisada buscando a melhoria de valor nutricional, porém não atingiu ainda a expectativa comercial desejada; mas, por suas características de interesse para uso em países onde há carência de alimentos, continua sendo alvo de desenvolvimento.

Uma terceira geração das plantas GMs está em vias de entrar no mercado e foi/está sendo desenhada como biofábrica para produção de grande variedade de componentes de alto valor farmacológico e industrial. O aumento de produtividade e valor nutricional, novas características de interesse para saúde, pode não ser atraente para os consumidores em países desenvolvidos, no entanto essas características são importantes para melhorar as condições de vida em países com problemas de disponibilidade de alimento. Tais países precisam migrar do grupo de fornecedores de matéria-prima para o de gerador de tecnologia, seja pela venda de suas sementes ou pela transferência de conhecimentos. Os produtos da biotecnologia devem ser desenvolvidos e estabelecidos em todos os países e serem aplicados às necessidades locais para resolver problemas específicos e, sempre que necessário, serem apoiados por organismos internacionais ou organizações sem fins lucrativos. Estão listadas, a seguir, algumas vantagens das plantas de terceira geração para as quais os tópicos de biossegurança são ainda mais importantes, pois muitas são plantas usadas na alimentação dos seres humanos, como o arroz e o milho, que são visualmente iguais aos seus equivalentes não transgênicos (FONTES, 2007).

Vantagens de uso da terceira geração de OGMs (biofábricas) em relação à produção atual.

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Facilidade para estabelecer e manter a um custo relativamente menor, uma vez que utilizam sistemas agrícolas já em uso.

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Facilidade de adaptação, em escala de produção, às demandas de mercado; o que não é o caso de produção em reatores.

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Facilidade de estocagem, transporte e distribuição dos produtos derivados, pois a síntese do novo produto ocorre diretamente em partes específicas da planta; por exemplo, na semente ou na raiz.

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Geração de produto sem necessidade de purificação, como é o caso de algumas vacinas; ou esse produto é mais fácil de purificar, quando necessário, uma vez que os métodos de expressão das novas moléculas são muito específicos, por exemplo, em corpos oleosos, no caso da proteína oleosina.

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Geralmente apresenta o novo produto na sua forma bioativa, o que não acontece atualmente com culturas de microrganismos.

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Gera produto isento de risco de contaminação por agentes patogênicos ao ser humano (viroses animais, príons, entre outros) como seria o caso de sistemas em cultura de células animais.

Alguns episódios de mistura de material não transgênico com transgênico, no campo ou durante o transporte, estocagem e processamento, foram identificados para as plantas da primeira geração e demonstram a importância da regulamentação e mecanismos de controle que não estão sendo aplicados de forma rigorosa. Portanto, a rastreabilidade dos OGMs, desde sua origem até a comercialização ao final da cadeia industrial, é ainda mais essencial no caso das plantas transgênicas.

As características de aumento de rendimento e as oportunidades para obtenção e geração de novos produtos fazem dos organismos transgênicos um campo que ainda oferece muitos territórios a explorar, muito além das três gerações mencionadas. Uma dessas áreas, que já está se tornando realidade, é a manipulação de plantas e microrganismos para a geração de energia (FAO, 2006). Esse é um campo bastante promissor para o Brasil, uma vez que o País é a maior fronteira agrícola do mundo e o mais experiente na produção de biocombustíveis. Os combustíveis renováveis, como o etanol, são produzidos à base do açúcar como única matéria-prima. O Brasil possui abundância de açúcar e tem preços competitivos; seus cientistas conhecem a tecnologia da produção podendo facilmente transformar as pesquisas em negócios.

Um exemplo do desenvolvimento da biotecnologia verde é a instalação de uma empresa americana no País para transformar o caldo de cana primeiramente em diesel, depois em gasolina e querosene de aviação. As leveduras transgênicas dessa empresa funcionam nas condições controladas dos laboratórios da Califórnia, mas foi o conhecimento dos cientistas e produtores brasileiros que permitiu que a produção do diesel de açúcar tivesse escala comercial.

Caso semelhante aconteceu em 2007 quando a Basf e a Embrapa anunciaram o desenvolvimento comercial de uma variedade de soja GM; a multinacional isolou, em seu laboratório nos Estados Unidos, um gene que amplia a resistência a herbicidas. Já sua aplicação à variedade de soja mais adaptada ao Brasil – segundo maior produtor do grão do mundo – foi realizada pela Embrapa. Os royalties do produto final, quando comercializado, serão divididos entre as duas empresas (REVISTA EXAME, 2008).

Apesar dos avanços alcançados, nossa nação ainda precisa investir muito em biotecnologia. Além de competir com outros setores da economia, as organizações brasileiras concorrem também com outros países, mais ousados e experientes. É necessário criar novas empresas e explorar mais os recursos disponíveis no País, para que um dia possamos nos tornar protagonista mundial neste setor.

Assim, poderíamos resumir que as grandes áreas que se apresentam com boas perspectivas para que sejam desenvolvidos OGMs são: área das ciências da vida, buscando novos reagentes e novos genes; área agrícola, focada no melhoramento de plantas e a busca de receptores para expressão heteróloga; área verde, tendo como meta as energias renováveis, por exemplo, produção de celulase e estudos de metabolômica e de biossistemas; área industrial, enfatizando o aprimoramento na produção de enzimas, bioprospecção de novos microrganismos e novas moléculas fitoquímicas; e área farmacológica, com desenvolvimento de conhecimentos em antibiose, terapia com enzimas, síntese de novas drogas, entre outros.

Como mencionado anteriormente, várias outras características políticas e científicas são necessárias para que haja avanços significativos no setor de transgênicos: desenvolvimento de capacitação de recursos humanos; apoio às publicações internacionais; bem estabelecidos e respeitados marcos legais de biossegurança para transgênicos, de acesso a recursos genéticos e sistema de propriedade intelectual; articulação de cooperação internacional de fronteira; estruturação de uma rede de informação e comunicação, alargando a compreensão mútua e contribuição para que a cooperação regional se fortaleça no campo da biotecnologia e biossegurança. Valle (2005) sugere ainda perenização, continuidade e políticas públicas mais seletivas, que contribuam para maior vinculação dos atores nele circunscritos; instituição de mecanismos que contribuam para o incremento do investimento público e privado; criação de condições mais favoráveis para o empreendedorismo privado, mediante a instituição de linhas de financiamento privilegiadas, dinamização de mercados de capitais, instrumentos de intermediação financeira.

Enquanto alianças dentro do setor privado concentram no avanço das novas tecnologias, o setor público deve concentrar esforços nas culturas e características desejáveis nas quais o outro setor não está atento ou não fará investimentos. Certamente a priorização dada à biotecnologia em relação a outras pesquisas deve estar vinculada às prioridades e objetivos agrícolas do País e às suas preocupações e características ambientais (LUIJBEN; COHEN, 2000). Com certeza investimentos para dar suporte a uma boa governança, à infraestrutura do setor rural e acesso ao mercado são requeridos anteriormente aos resultados que a biotecnologia possa prover; mas se as políticas visam ao crescimento econômico e à redução de fome e pobreza, certamente elas terão uma parcela significativa para as pesquisas biotecnológicas (WHO, 2005).

7. Comunicação e conhecimento: interfaces entre bioética e biossegurança

Como apresentado ao longo deste capítulo, a biossegurança de OGMs é uma área de interesse crescente, caracteristicamente de cunho multidisciplinar que envolve ciência, ética e sociedade, além de aspectos regulatórios, de fiscalização e manejo de riscos à saúde animal e humana e ao meio ambiente.

Como anteriormente ressaltado, apesar da existência de um cenário nacional favorável ao desenvolvimento da biotecnologia agrícola, a adoção de cultivos transgênicos tem sido lenta em comparação com outros países produtores de commodities agrícolas. A percepção pública nacional está dividida entre a imprensa sensacionalista e a opinião completamente oposta entre algumas ONGs e segmentos da comunidade científica. Isso tem levado a sociedade ao desinteresse e incerteza sobre avanços nessa área. Esta é, hoje, a principal questão ética que permeia a biotecnologia agrícola: a responsabilidade na fala pública.

Sendo a bioética o exercício da reflexão ética sobre as questões que se apresentam durante o desenvolvimento tecnocientífico da sociedade, ela é dinâmica e está presente nas angústias, dúvidas e discussões dos diferentes segmentos da sociedade. Nesse sentido, a bioética tem muito a contribuir na melhoria do debate público sobre as plantas transgênicas. Como ponte entre ciência e vida, a bioética estimula a responsabilidade da participação dos atores sociais e produtivos nesse diálogo (GTZ, 2006). A informação é um requisito imprescindível para aumentar o poder decisório dos cidadãos, mas não suficiente para diminuir o fosso entre o público em geral e os setores de interesse, tanto favoráveis quanto contrários aos transgênicos (GUIVANT, 2006). A informação técnica não é o único elemento responsável pela formação de opinião do público em geral e também dos tomadores de decisão. A autonomia para escolher, portanto, necessária a uma tomada de decisão, é resultante da informação e do padrão cultural que cada indivíduo possui (ARANTES, 2003).

Com a democratização dos meios de comunicação, cada um e todos podem proclamar aquilo que tem como verdade e fazer previsões. No entanto, informar exige clareza, exatidão e transparência. Ações orientadas para o êxito são diferentes de ações orientadas para o entendimento. Aquele que fala publicamente necessita ser responsável no discurso. Ter o cuidado de não usar o outro, que ouve como instrumento para alcançar seu objetivo, pois admitir o valor incondicional da pessoa é fim e não meio justificativo. O respeito pela autonomia do indivíduo tomar decisões informadas é central no diálogo bioético. O público deve sim ouvir, mas também pesquisar, refletir, ponderar, e formar, moldar e modificar suas opiniões. Esse deve ser o processo da escolha e da tomada de decisão.

A confusão que foi estabelecida no diálogo público sobre as plantas transgênicas chegou ao seu grau máximo onde quem é a favor está colocado ao lado das grandes corporações e quem é contra é colocado como tendo uma posição ideológica; no entanto, o bem comum não é um presente de alguém, mas sim uma construção, um produto de negociações, alianças e conflitos sociais. Só a transparência promove a legitimidade aos olhos do público. Em relação ao debate entre os prós e contras, a credibilidade passa pela explicitação dos argumentos de cada grupo, que tem origem na sua escala de valores culturais.

As autoridades responsáveis pelos processos regulatórios almejam a confiança do público exercitando a deliberação: cada um envolvido no processo de decisão sobre as plantas transgênicas deve clara e sinceramente explicitar todos os argumentos da sua opinião, se considerando um agente moral, mostrando as reais razões do seu ponto de vista e ouvindo as razões dos outros (GRACIA, 2003; HABERMAS, 1989). O processo deliberativo tenta aproximar pessoas com convicções, crenças e valores distintos.

A CTNBio é uma forma democrática de participação pública e pode, pelo exercício dessa deliberação, ser a oportunidade de resgate de credibilidade de instituições nacionais aos olhos do público. A confiança resgatada será o suporte enriquecedor do processo da tomada de decisão (CAPALBO et al., 2006; HAILS; KINDERLERER, 2003). Este é um dos grandes desafios da bioética do século 21: respeitar as diferenças, a diversidade e exercitar a tolerância. Para os envolvidos no debate sobre as plantas transgênicas é oportunidade de exercício da deliberação.

8. Considerações finais

A sociedade brasileira está aceitando, com certa benevolência, as novas tecnologias na área médica e industrial, como a fertilização assistida, o uso de células-tronco, fármacos e enzimas recombinantes, entre outras, em decorrência da associação com os possíveis benefícios direcionados aos consumidores. Entretanto, a percepção pública nacional, sensibilizada pela imprensa e pelo posicionamento de grupos ambientalistas, tem sido bastante negativa quanto à biotecnologia agrícola, apesar da incontestável relevância para o agronegócio global e das evidências científicas indicando a segurança dos cultivos comerciais.

O País implantou, desde 1995, um marco legal de biossegurança moderno. Esse foi posteriormente aperfeiçoado com a entrada em vigor da Lei nº 11.105/2005, confirmando a competência da CTNBio para deliberar sobre as atividades efetuadas com OGMs, em harmonia com outros instrumentos legais. Atualmente, algumas centenas de instituições brasileiras, que desempenham estas atividades, foram cadastradas e credenciadas pelo Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB). Além disso, um significativo programa de capacitação de recursos humanos em biossegurança vem sendo desenvolvido com a participação das universidades, associações científicas, CTNBio e agências de fomento (ODA et al., 2008; MENDONÇA et al., 2008).

Apesar desse esforço e de consideráveis investimentos em biotecnologia, a adoção de cultivos transgênicos foi demorada. Atualmente encontra-se em crescimento acelerado a cada nova safra, com a comercialização de soja, algodão e milho GM. A cana-de-açúcar possivelmente será a próxima lavoura transgênica. O tema continua suscitando posições polarizadas, muitas vezes no âmbito do próprio governo. A legislação em vigor exige a avaliação de risco dos transgênicos e define também o espaço adequado para a consideração de impactos socioeconômicos, avaliados no âmbito do CNBS. A legislação anterior não deixava espaço para essas questões, tendo ocorrido cobranças da sociedade dirigidas à CTNBio, ao colegiado técnico, que não possui competência legal para avaliar esses aspectos.

A riqueza de recursos genéticos dos biomas brasileiros representa um rico manancial de genes com potencialidade para importantes aplicações biotecnológicas. A multiplicidade de aplicações da biotecnologia desperta o fascínio e ao mesmo tempo o medo de riscos desconhecidos. Nesse cenário, além dos riscos, devem ser também considerados os benefícios da biotecnologia agrícola, tais como o aumento de produtividade agrícola, a conservação de biodiversidade com redução da fronteira agrícola, a redução do uso de pesticidas, alimentos enriquecidos e menor vulnerabilidade de novas plantas transgênicas aos estresses ambientais.

Finalizando, podemos afirmar que a área de biossegurança de OGMs tem apresentado avanços significativos. Muitos países possuem marcos regulatórios implantados e são signatários do Protocolo de Cartagena, favorecendo o uso seguro dessa poderosa tecnologia. Atualmente, 25 países cultivam plantas transgênicas. Vislumbramos um panorama mundial favorável à biotecnologia moderna com inserção efetiva do País; no entanto, ressaltamos como medida de precaução que seja mantida a vigilância sobre os transgênicos comercializados e que os novos OGMs sejam submetidos às avaliações de biossegurança embasadas no conhecimento científico.

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Parte 2
Enzimas

Capítulo 1
Ensaios enzimáticos de proteínas e inibidores de proteases envolvidos com a defesa de plantas a patógenos

José Tadeu Abreu Oliveira
Darcy Mayra Furtado Gondim
Ilka Maria Vasconcelos

1. Introdução

Durante o curso de sua coevolução, plantas e patógenos vêm estabelecendo relações intrínsecas, resultado de contínuas trocas de informações moleculares. Em decorrência desse diálogo molecular, os patógenos, hoje, possuem uma série de estratégias para parasitar plantas, e estas, por sua vez, desenvolveram diversos mecanismos de defesa, incluindo eventos constitutivos e induzidos (GOHRE; ROBATZEK, 2008; JONES; DANGL, 2006).

Mecanismos de defesa pré-existentes envolvem barreiras estruturais, tais como ceras, calose, cutina, lignina e compostos antimicrobianos pré-formados, como fitoanticipinas, que previnem a colonização do tecido. As plantas também possuem respostas de defesa ativa que podem ser induzidas por todas as classes de patógenos vegetais e por moléculas eliciadoras tanto do próprio hospedeiro como do patógeno. A resposta induzida envolve mecanismos como: (a) a explosão oxidativa, quando ocorre aumento rápido e transitório de espécies reativas de oxigênio; (b) resposta hipersensitiva (HR), caracterizada por morte celular rápida e localizada no sítio de infecção; (c) acúmulo de metabólitos secundários, por exemplo, de fitoalexinas; (d) produção de moléculas sinalizadoras, tais como ácido salicílico, ácido jasmônico e etileno; (e) indução de enzimas hidrolíticas; (f) deposição de lignina para reforçar a parede celular; (g) formação de papila; e (g) biossíntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR-proteínas) (BERGER et al., 2007; BRUCE; PICKETT, 2007; COLLINGE, 2009; GARCIA-BRUGGER, 2006; JEANDET et al., 2002; UNDERWOOD; SOMERVILLE, 2008; LOON et al., 2006).

Na explosão oxidativa, o excesso de produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), tais como peróxido de hidrogênio (H2O2), íon superóxido (O2-) e radicais hidroxilas (-OH), constitui-se num importante mecanismo de defesa vegetal (TORRES et al., 2006). De fato, quando atacadas por patógenos, plantas ativam uma série de mecanismos que inclui o rápido acúmulo dessas espécies. As EROs podem funcionar na defesa vegetal por ação tóxica direta contra o patógeno, formação de lignina, produção de fitoalexinas e reação hipersensitiva, que restringe o desenvolvimento do patógeno (HAMMERSCHIMIDT, 2005; TOMÁNKOVÁ et al., 2006). Quando em excesso, as EROs podem levar à oxidação de proteínas, ácidos graxos insaturados e DNA, causando danos celulares e eventual morte da célula (HALLIWELL, 2006; SHULAEV; OLIVER, 2006). Para evitar tais danos, as plantas possuem eficientes sistemas antioxidantes. Participando desses sistemas, estão as enzimas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato (APX).

A via dos fenilpropanoides é uma das mais importantes vias do metabolismo secundário vegetal que produz uma variedade de compostos fenólicos relacionados à defesa. A fenilalanina amônia liase (FAL) é a enzima-chave do metabolismo de fenilpropanoides. Ela catalisa a formação do ácido trans-cinâmico, precursor de vários compostos de defesa das plantas (WEN et al., 2005). Vários trabalhos relacionam a indução dessa enzima e aumento da defesa vegetal (BARRETO et al., 2007; BAYSAL et al., 2005; YAO; TIAN, 2005).

Outra classe de proteínas envolvidas com a defesa vegetal engloba as PR-proteínas. Essas proteínas estão ausentes ou presentes em pequenas quantidades em plantas saudáveis, mas se acumulam em grandes quantidades após reconhecimento, pela planta, da presença do agressor (FERREIRA et al., 2007; LOON et al., 2006). Dentre as PR-proteínas, as peroxidases de fenóis (POX) estão associadas com processos ligados à parede celular, tais como oxidação de fenóis e lignificação de células vegetais hospedeiras durante a reação de defesa contra agentes patogênicos (ALMAGRO et al., 2009). Restrição à infecção por patógenos tem sido correlacionada com o aumento da atividade de POX por vários pesquisadores (BAYSAL et al., 2005; FERNANDES et al., 2006; YAO; TIAN, 20056). Outras importantes PR-proteínas são as β-1,3-glucanases e quitinases, consideradas proteínas genuinamente antifúngicas (LOON et al., 2006). Há evidências de que essas enzimas exercem, no mínimo, duas funções no controle de doenças. Elas são capazes de catalisar a degradação da parede celular de fitopatógenos, compostas por β-1,3-glucanos e quitina, e de liberarem oligossacarídeos biologicamente ativos (elicitores), capazes de regular o estado de imunização da planta (AMBORABÉ et al., 2008; CAVALCANTI et al., 2008; DUTSADEE; NUNTA, 2008). Vários trabalhos correlacionam aumento da expressão dessas enzimas com mecanismos de defesa vegetal (CAVALCANTI et al., 2007; COTA et al., 2007; RESENDE et al., 2007).

Os patógenos produzem proteinases extracelulares tendo papel ativo no desenvolvimento de doenças nas plantas. Em resposta à ação dessas proteinases, as plantas sintetizam inibidores de proteinases serínicas, cisteínicas, aspárticas e metalo-proteinases (HAQ et al., 2004; SAWANO et al., 2008). Esses inibidores têm sido estudados na perspectiva de serem usados no controle não só de fitopatógenos, mas, também, de nematoides e insetos (BENCHABANE et al., 2008; MOSOLOV; VALUEVA, 2008) que atacam as plantas. As fitocistatinas são inibidores de proteases cisteínicas que ocorrem em plantas, já tendo sido isolados de várias fontes e tecidos vegetais (GIANOTTI et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2003). Além da função protetora nas plantas, há evidências de que esses inibidores regulam a ação de proteinases cisteínicas endógenas durante o desenvolvimento e germinação da semente e na morte celular programada (GIANOTTI et al., 2006).

De maneira geral, uma resposta de defesa apropriada das plantas vem da percepção de sinais extracelulares e sua transdução entre as células vegetais. Especificamente para interação plantas e patógenos, esses são ainda fenômenos pouco compreendidos, e sua elucidação representa uma importante tarefa da patologia vegetal (NIMCHUK et al., 2001). O conhecimento do comportamento das enzimas antioxidativas e das PR-proteínas envolvidas com os mecanismos de defesa ajudam a entender como as plantas reagem frente ao ataque de agressores.

Neste capítulo, ensaios quantitativos de algumas das proteínas envolvidas com os mecanismos de defesa das plantas, corriqueiramente usados no nosso laboratório, são apresentados. Atenção especial deve ser dada à faixa operacional do espectrofotômetro a ser usado, na qual a linearidade é mantida.

2. Protocolos enzimáticos

2.1. Dismutases de superóxido (SOD; EC 1.15.1.1)

As dismutases de superóxido (SODs) são metaloenzimas que catalisam a formação de peróxido de hidrogênio a partir do íon superóxido, constituindo a primeira linha de defesa celular contra as EROs. O excesso de peróxido de hidrogênio deverá ser, também, rapidamente eliminado das células (BIAN; JIAN, 2009; FOYER; NOCTOR, 2005). Em plantas, as SODs são encontradas, principalmente, nos cloroplastos, mitocôndrias, citosol e peroxissomos, sob diferentes isoformas.

2.1.1. Princípio do ensaio

O ensaio para detecção e quantificação de SODs descrito, aqui, envolve a excitação fotoquímica da riboflavina, seguida de sua redução pela L-metionina para uma semiquinona, que doa um elétron para o oxigênio, formando, assim, o radical superóxido (Figura 1). O superóxido formado converte, por sua vez, o nitro azul de tetrazólio (NBT) para formazana azul. Essa reação final é, então, inibida pela SOD (PIACHAM et al., 2003).

Figura 1. Fotorredução do NBT a formazana.
Fonte: adaptado de Piacham et al. (2003).

2.1.2. Reagentes

A. Tampão fosfato de potássio 1 M, pH 7,8.

B. EDTA 1 mM.

C. Triton X-100 0,25%.

D. L-Metionina 130 mM.

E. Amostra em teste.

F. Água deionizada de alta qualidade.

G. Nitro azul de tetrazólio (NBT) 750 µM.

H. Riboflavina 100 mM.

2.1.3. Procedimento (ROSSUM et al., 1997)

O ensaio foi adaptado para ser feito em micropoços de placas tipo ELISA. Sendo realizado à temperatura ambiente (25 ºC), os reagentes devem estar nessa condição antes do início do ensaio.

Nos poços da microplaca adicionar, nesta ordem, e em triplicata:

• 10 µL do reagente A.

• 20 µL do reagente B.

• 10 µL do reagente C.

• 20 µL do reagente D.

• 0 µL a 100 µL de E (amostra).

• 0 µL a 100 µL de F (E + F = 100 µL).

• 20 µL do reagente G.

• 20 µL do reagente H (com a adição da riboflavina a reação se inicia).

A adição dos reagentes G e H deve ser feita em ambiente com baixa luminosidade. Imediatamente após adição de H, deve-se cobrir a microplaca com papel alumínio, mantê-la no escuro e proceder com as leituras de absorbância a 630 nm, em leitora de ELISA, após 5 minutos em repouso. As absorbâncias determinadas no escuro se referem àquelas inerentes à mistura reacional e não à reação propriamente dita. Após a etapa no escuro, deve-se transferir a microplaca para uma câmara com luz fluorescente de 32 W ou 40 W e fazer leituras a 630 nm, a intervalos de 1 minuto, até completar o tempo de 5 minutos de reação. Após cada leitura de absorbância, a placa deve voltar, imediatamente, para a câmara luminosa.

2.1.4. Cálculo da atividade

A atividade da SOD é determinada de acordo com a capacidade da enzima em inibir a produção da formazana azul. Uma unidade de atividade (1 UA) é definida como a quantidade da amostra necessária para inibir 50% da fotorredução, em relação ao controle positivo, do NBT à formazana azul.

Para avaliar a constância da velocidade de reação, deve-se fazer, inicialmente, um gráfico de absorbância (ordenada) versus tempo (abscissa). Confirmada a linearidade, calcula-se o percentual máximo (100%) de fotorredução do NBT/min, na ausência da amostra, considerando 5 minutos de reação, da seguinte maneira:

Para calcular o percentual de fotorredução na presença da amostra, procede-se:

Se Absmax/min corresponde a 100% de fotorredução; então, para a amostra, Absamostra/min corresponde a X% de fotorredução. Logo, o percentual de inibição (I%) da fotorredução, pela amostra, será (I%) = 100 - X%.

Para calcular a unidade de atividade (UA), definida como a quantidade da amostra necessária para inibir 50% da fotorredução do NBT à formazana azul, usa-se a correspondência:

Se 50% de inibição corresponde a 1 UA, logo (I%) corresponderá a Y UA.

Como o Y calculado é a unidade de atividade (UA) presente no volume da amostra utilizado no ensaio, padroniza-se Y para 1,0 mL de amostra (UA/mL). Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio foi de 10 µL, multiplica-se Y por 100.

Para expressar UA por mg de proteína (UA/mg P) (atividade específica), divide-se o valor de Y, extrapolado para o volume de 1,0 mL da amostra, pela sua concentração de proteína (mg/mL) (BRADFORD, 1976).

Para expressar UA por grama de massa fresca (UA/g MF), multiplica-se o valor Y, expresso em UA/mL, pelo volume de tampão de extração das proteínas do tecido (UA total) e divide-se pela massa (g) do tecido utilizado.

2.2. Catalases (CAT; EC 1.11.1.6)

Estas enzimas estão associadas com a defesa vegetal, protegendo as células dos danos oxidativos oriundos da acumulação excessiva do peróxido de hidrogênio. As plantas possuem várias isoformas de catalase, encontradas nos peroxissomos, glioxissomos, citosol e mitocôndrias. São as principais enzimas de detoxificação do peróxido de hidrogênio em plantas e podem dismutar, diretamente, o peróxido ou oxidar substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido fórmico (BREUSEGEM et al., 2001). Comparadas às peroxidases de ascorbato, as CATs possuem baixa afinidade pelo substrato (H2O2), porém apresentam alta atividade catalítica. Essa diferença de propriedade cinética é atribuída à necessidade da ligação simultânea de duas moléculas de peróxido de hidrogênio ao sítio catalítico da CAT para que ocorra a reação (NOCTOR; FOYER, 1998).

2.2.1. Princípio do ensaio

As CATs catalisam a dismutação do H2O2 em água e oxigênio molecular, conforme reação abaixo:

2H2O2 → 2H2O + O2

2.2.2. Reagentes

A. Tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,0.

B. Água deionizada de alta qualidade.

C. Peróxido de hidrogênio 112,5 mM preparado momentos antes do ensaio.

2.2.3. Procedimento (HAVIR; MCHALE, 1987; PEIXOTO et al., 1999)

Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:

• 600 µL do reagente A. Incubar tubos a 30 ºC por 10 minutos.

• ≤ 300 µL da amostra diluído previamente caso necessário.

• Volume do reagente B em quantidade suficiente para (q.s.p) completar 900 µL da mistura reacional.

• 100 µL do reagente C.

Em cubeta de quartzo, deve-se zerar o espectrofotômetro com água e ler as absorbâncias das amostras a 240 nm. Faz-se uma primeira leitura após 10 segundos da adição do reagente C (considerar como branco). Em seguida, acompanha-se decréscimo da absorbância ao longo do tempo; por exemplo, em intervalos de 10 segundos até 60 segundos após o início da reação. Esse tempo poderá ser reduzido ou aumentado dependendo da intensidade de atividade presente na amostra. Para comprovar a linearidade da velocidade de reação no intervalo de tempo usado no ensaio, plotam-se as absorbâncias (ordenada) obtidas versus tempo (segundo) de reação (abscissa).

2.2.4. Cálculo da atividade

A atividade da CAT poderá ser estimada utilizando-se o coeficiente de absortividade (extinção) molar de 36 M/cm (ANDERSON et al., 1995) e expressa em µmolar de H2O2 consumido. Segue o cálculo da ∆Abs das amostras:

∆Abs240nm = Abs240nm (10 s) - Abs240nm (60 s, por exemplo)

No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs240nm refere-se ao intervalo de 50 segundos de reação. Deve-se extrapolar o resultado obtido de ∆Abs240nm para o tempo de reação de 1 minuto (∆Abs240nm x 60/50).

Nesse caso, o valor foi obtido para o volume da alíquota da amostra usada. Esse valor deve ser corrigido para o volume de 1 mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não diluída previamente, foi de 50 µL, multiplica-se o valor de ∆Abs240nm/min por 20. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição. O resultado final estará expresso em ∆Abs240nm/mL/min.

Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de ∆Abs240nm (ordenada) versus tempo (s) para vários intervalos, sendo a tangente da reta obtida equivalente à variação da absorbância por segundo (∆Abs240nm/s). Converte-se o resultado para ser expresso por mL/min (∆Abs240nm/mL/min).

De posse desse valor (média das triplicatas), usa-se a lei de Lambert-Beer: A = ε x l x c, sendo A = absorbância; ε = coeficiente absortividade molar (36 M/cm); l = caminho óptico; c = concentração (M) da amostra.

Após calcular o valor de c, deve-se convertê-lo para μmolar. Esse valor (atividade da CAT) corresponde a μmolar de H2O2 consumido/min.

Para expressar μmolar de H2O2 consumido/min/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado anterior (μmolar de H2O2 consumido/min) pela concentração de proteína da amostra (BRADFORD, 1976), expressa em mg/proteína/mL.

Para expressar em μmolar de H2O2 consumido/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (μmolar de H2O2 consumido/min) pelo volume do tampão usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.3. Peroxidase do ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)

As peroxidases do ascorbato (APXs) são importantes oxirredutases, componentes do sistema antioxidante das plantas superiores. São encontradas, principalmente, nos cloroplastos, mitocôndrias, citosol e peroxissomos, ocorrendo sob várias isoformas. Porém, todas as APXs utilizam o ascorbato como doador específico de elétrons (ASADA et al., 1992).

2.3.1. Princípio do ensaio

As APXs catalisam a redução do H2O2 em água, pela oxidação do L-ascorbato.

2 L-ascorbato + H2O2 → 2 monodehidroascorbato + 2H2O

2.3.2. Reagentes

A. Tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5 mM de ácido L-ascórbico (adicionar o ácido ascórbico momentos antes da realização do ensaio, em tampão 2x concentrado e diluir para 50 mM, pH 6,0).

B. Peróxido de hidrogênio 2 mM (preparar momentos antes do ensaio).

2.3.3. Procedimento (KOSHIBA, 1993; PEIXOTO et al., 1999)

Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:

• 800 µL do reagente A.

• 100 µL da amostra (diluir, previamente, caso necessário). Incubar os tubos a 30 ºC, por 10 minutos.

• 100 µL do reagente B.

Ajustar comprimento de onda no espectrofotômetro para 290 nm. Zerar o aparelho com a cubeta de quartzo contendo água deionizada. Iniciar a leitura de absorbância logo após colocar o H2O2. Acompanhar o decréscimo da absorbância ao longo do tempo, por exemplo, em intervalos de 30 segundos, para averiguar a linearidade da velocidade de reação.

2.3.4. Cálculo da atividade

O decréscimo na leitura da absorbância é mensurado como índice de oxidação do ascorbato. A atividade da APX pode ser determinada, também, utilizando-se a curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de ácido L-ascórbico (de 0,1 μmol/mL a 1,0 μmol/mL). Segue o cálculo da ∆Abs das amostras:

∆Abs290nm = Abs290nm (10 s) - Abs290nm (190 s, por exemplo)

No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs290nm é para o tempo de 180 segundos. Deve-se extrapolar o resultado para ser expresso por minuto (∆Abs290nm/min).

No ensaio, o valor foi obtido para o volume da alíquota da amostra usada. Esse valor deve ser corrigido para o volume de 1 mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não diluída previamente, foi de 100 µL, multiplica-se o valor de ∆Abs290nm/min por 10. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição. O resultado final estará expresso em ∆Abs290nm/mL/min.

Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de ∆Abs290nm (ordenada) versus tempo (s) (abscissa) para vários intervalos, sendo a tangente da reta obtida equivalente à variação da absorbância por segundo (∆Abs290nm/s). Converte-se o resultado para ser expresso por minuto e extrapola-se para o volume de 1 mL da amostra, não diluída (∆Abs290nm/mL/min).

Para obtenção da curva padrão, deve-se plotar Abs290nm (ordenada) versus μmol L-ascorbato/mL (abscissa) e calcular a cotangente da reta [fator de conversão (Fc)].

Em seguida, calcula-se a atividade da amostra ensaiada, já corrigida para mL e minuto, como segue:

∆Abs290nm/mL/min da amostra x Fc = resultado expresso em μmol ascorbato consumido/mL/min

Para expressar em μmol ascorbato consumido/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado anterior, expresso em μmol ascorbato consumido/mL/min, pela concentração de proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.

Para expressar em μmol ascorbato consumido/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido, expresso em μmol ascorbato consumido/mL/min, pelo volume usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.4. Peroxidase de fenóis (POX; EC 1.11.1.7)

As peroxidases, encontradas em diversos compartimentos celulares como o citosol, vacúolo e parede celular, compõem uma super família de enzimas envolvidas com diversos papéis nas plantas, dentre os quais se destacam a participação no processo de lignificação da parede celular, regulação do crescimento, biossíntese do etilieno e resposta a vários estresses (CAVALCANTI et al., 2007), além de atividade antifúngica (GHOSH, 2006).

2.4.1. Princípio do ensaio

A POX catalisa a seguinte reação:

4 guaiacol + 4 H2O2 → Tetraguaiacol + 8 H2O

2.4.2. Reagentes

A. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.

B. Guaiacol 20 mM (manter essa solução em vidro escuro).

C. Peróxido de hidrogênio 60 mM (preparar momentos antes do ensaio).

2.4.3. Procedimento (URBANEK et al., 1991)

Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:

• 800 µL do reagente A.

• 500 µL do reagente B.

• 500 µL do reagente C. Incubar os tubos a 30 ºC por 10 minutos.

• 200 µL da amostra (diluir, previamente, caso necessário).

Em cubeta de plástico ou vidro, deve-se zerar o espectrofotômetro com água e ler absorbância a 480 nm. Iniciam-se leituras imediatamente após colocar a amostra. Acompanha-se o aumento da absorbância ao longo do tempo, por exemplo, em intervalos de 30 segundos até 3 minutos. Esse tempo poderá ser reduzido ou aumentado na dependência da intensidade de atividade presente na amostra. A leitura no tempo de 10 segundos é tomada como branco.

2.4.4. Cálculo da atividade

O aumento da absorbância, no curso da reação, indica formação do tetraguaiacol. Uma unidade de atividade peroxidásica (1 UA) é definida como a variação de uma unidade de absorbância por mL/min. Segue o cálculo da ∆Abs480nm da amostra:

∆Abs480nm amostra = Abs480nm amostra (tempo escolhido, p.ex.: 100 s) - Abs480nm amostra (10 s)

No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs480nm amostra foi para o intervalo de tempo de 90 segundos. Extrapola-se para ser expresso em ∆Abs480nm amostra/min.

No ensaio, o valor foi obtido para o volume da alíquota da amostra usada. Este valor deve ser corrigido para o volume de 1 mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não diluída previamente, foi de 10 µL, multiplica-se o valor de ∆Abs480nm amostra/s por 100. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição. O resultado final estará expresso em ∆Abs480nm amostra/mL/min.

Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de ∆Abs480nm amostra (ordenada) versus tempo (s) (abscissa) para vários intervalos, sendo a tangente da reta obtida equivalente à variação da absorbância por segundo (∆Abs480nm amostra/s). Converte-se o resultado para ser expresso por mL e por minuto, como indicado anteriormente (∆Abs480nm/mL/min). Para expressar em UA proceder da seguinte forma:

Se a variação de uma unidade de absorbância/mL/min corresponde a 1 UA, ∆Abs480nm amostra/mL/min corresponde a X UA.

Para expressar em UA/mg de proteína (atividade específica), divide-se a UA obtida pela concentração de proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.

Para expressar em UA/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o valor de UA pelo volume do tampão usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.5. Fenilalanina amônia liase (FAL; EC 4.3.1.5)

A FAL é uma importante enzima envolvida no mecanismo de defesa de plantas ao ataque de patógenos. Essa enzima é responsável pela conversão de L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico, um intermediário-chave para produção de vários fenilpropanoides, como a lignina, flavonoides (fitoalexinas) e coumarinas, e também do ácido salicílico, um sinalizador químico de repostas de defesa vegetal contra patógenos (EL-SHORA, 2002; PAPARU, 2007; ZHAO et al., 2005).

2.5.1. Princípio do ensaio

A FAL atua catalisando a desaminação não oxidativa da fenilalanina pela seguinte reação:

L-fenilalanina → ácido trans-cinâmico + NH3

2.5.2. Reagentes

A. Ácido trans-cinâmico 1 mM.

B. Tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,8.

C. β-Mercaptoetanol 50 mM.

D. Solução L-Fenilalanina 40 mM.

E. HCl 6 M.

2.5.3. Procedimento (EL-SHORA, 2002; MORI et al., 2001)

Para obtenção da curva padrão de ácido trans-cinâmico, deve-se adicionar, em tubos tipo eppendorf, à temperatura de 30 ºC, nesta ordem:

• De 0 µL a 900 µL (em alíquotas de 100 µL) do reagente A diluído 15x.

• De 0 µL a 900 µL do reagente B (A + B = 900 µL).

• 100 µL do reagente E.

Em cubeta de quartzo, deve-se zerar o espectrofotômetro com o branco, sem ácido trans-cinâmico, e medir leituras de absorbância a 290 nm. Deve-se construir a curva padrão [Abs290nm (ordenada) versus μmol/mL de ácido trans-cinâmico (abscissa)] e calcular a cotangente da reta [fator de conversão (Fc)]. Para determinação da atividade enzimática (em triplicata), adiciona-se, nesta ordem:

• 20 µL do reagente C.

• 100 µL da amostra, diluída previamente caso necessário.

• 580 µL do reagente B.

• 200 µL do reagente D. Incubar a 30 ºC, por 60 minutos.

• 100 µL do reagente E.

No controle em branco para cada amostra, coloca-se o reagente D somente após a interrupção da reação com o reagente E. Devem-se centrifugar todos os tubos a 10.000 g/10 minutos e ler absorbância, zerando antes o espectrofotômetro com água deionizada.

2.5.4. Cálculo da atividade

Segue o cálculo da absorbância corrigida:

Abscorrigida amostra = Absamostra - Absbranco

Calcula-se a média das triplicatas. No ensaio, o valor foi obtido para o volume da alíquota da amostra usada. Esse valor deve ser corrigido para o volume de 1 mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não diluída previamente, foi de 100 µL, multiplica-se o valor de Abs290nm por 10. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição. O resultado estará expresso em Abs290nm amostra/mL/hora. Em seguida, calcula-se a atividade da amostra, já corrigida para mL, como segue:

Abs290nm amostra/mL/h x Fc = resultado expresso em μmol de ácido trans-cinâmico gerado por mL/h

Para expressar em μmol de ácido trans-cinâmico gerado/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado anterior (μmol de ácido trans-cinâmico gerado/mL/h) pela concentração de proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.

Para expressar em μmol ácido trans-cinâmico gerado/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (μmol ácido trans-cinâmico gerado/mL/h) pelo volume de tampão usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.6. β-1,3-glucanase (GLU; EC 3.2.2.6 ou 3.2.1.39)

As β-1,3-glucanases são enzimas hidrolíticas largamente distribuídas no reino vegetal. Elas se apresentam sob diferentes isoformas e estão localizadas tanto no vacúolo como nos espaços extracelulares. O mecanismo de ação dessas glucanases envolve degradação de paredes celulares de agentes patogênicos das plantas, já que β-1,3-glucanos são componentes essenciais dessas estruturas. Como consequência da sua ação hidrolítica, essas enzimas, além de desestruturarem paredes celulares diversas, podem liberar oligossacarídeos biologicamente ativos (elicitores) capazes de regular o estado de imunização da planta (CHARLES et al., 2009; LOON et al., 2006).

2.6.1. Princípio do ensaio

O método de quantificação da β-1,3-glucanase, aqui descrito, baseia-se na capacidade da amostra que contenha a enzima de liberar glucose, a partir da degradação da laminarina, polissacarídeo usado como substrato. Uma vez liberados, os monômeros de glucose irão reduzir sais de cobre, em solução alcalina, que irão produzir um composto de coloração azul passível de ser quantificado por colorimetria. A concentração de laminarina aqui utilizada deve ser adequada para a maioria dos ensaios com plantas. Entretanto, é sugerido que se faça a reação ao longo do intervalo de tempo sugerido (30 minutos) para verificação da linearidade da reação.

2.6.2. Reagentes

A. Solução padrão de glucose (300 µg/mL = 1,7 x 106 nM). Preparar em azida a 0,02%.

B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.

C. Composição:

Na2CO3 (anidro): 25 g

KNaC4H4O6·4H2O: 25 g

NaHCO3 : 20 g

Na2SO4 (anidro): 200 g

H2O deionizada (q.s.p.): 1.000 mL

D. Composição:

CuSO4 5H2O : 15 g

H2SO4 (concentrado): 1 a 2 gotas

H2O deionizada (q.s.p.): 100 mL

E. Misturar 1,0 mL do reagente D + 25,0 mL do reagente C (preparar minutos antes do ensaio).

F. Composição:

H2O deionizada: 450 mL

H2SO4 (concentrado): 21 mL

(NH4)6Mo7 O24.4H2O: 25 g

Obs.: adicionar o ácido sulfúrico sobre a água, em banho de gelo, estando protegido com óculos e vestimenta adequada. Dissolver o molibdato de amônio nessa solução, agitando.

G. Composição:

Na2HAs04.7H20: 3 g

H2O deionizada: 25 mL

H. Misturar as soluções F e G, agitando. Deixar em repouso por 24 horas, 37 ºC, ou por 30 minutos, 55 ºC.

Obs.: manter a solução em vidro escuro.

I. Solução de laminarina (2 mg/mL). Dissolver a laminarina em água deionizada. Aquecer a 60 ºC por 10 minutos. Dialisar, exaustivamente, contra água para remover glucose livre.

Obs.: essa solução deverá ser utilizada até 3 dias após ser preparada.

2.6.3. Procedimento (BOLLER, 1993)

Para obtenção da curva padrão de glucose, deve-se adicionar em tubos de ensaio (20 mL), à temperatura ambiente, nesta ordem:

• 0, 10 µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL, 50 µL, 60 µL, 80 µL e 100 µL do reagente A.

• 1.000 µL, 990 µL, 980 µL, 970 µL, 960 µL, 950 µL, 940 µL, 920 µL e 900 µL, respectivamente, do reagente B.

• 1.000 µL do reagente E. Incubar a 100 ºC, por 20 minutos. Resfriar, em água, por 5 minutos.

• 1.000 µL do reagente H. Agitar tubos em vortex, até completa remoção dos gases. Deixar em repouso por 5 minutos.

Em cubeta de vidro ou plástico, deve-se zerar o espectrofotômetro com água deionizada e ler absorbância a 520 nm. Constrói-se a curva padrão [Abs520nm (ordenada) versus concentração (μg/mL) de glucose (abscissa)] e calcula-se a cotangente da reta para obtenção do fator de conversão (Fc).

Para determinação da atividade da β-1,3-Glucanase nas amostras, deve-se misturar, à temperatura ambiente, nesta ordem:

• 100 µL da amostra (diluída, previamente, com o reagente B, caso necessário).

• 900 µL do reagente I. Incubar a 50 ºC, por 30 minutos.

• 1.000 µL do reagente E. Incubar a 100 ºC, por 30 minutos. Resfriar em água por 5 minutos.

• 1.000 µL do reagente H. Agitar tubos em vortex, até completa remoção dos gases. Deixar em repouso por 5 minutos.

Obs.: em nosso laboratório, a experiência tem mostrado a necessidade de se fazer os seguintes controles:

a) Branco dos reagentes: substituir a alíquota da amostra e da laminarina pelo reagente B (1 mL); b) Branco da laminarina: substituir somente a alíquota da amostra pelo reagente B (100 µL); c) Branco correspondente a cada amostra ensaiada (branco amostra): substituir a laminarina da mistura reacional pelo reagente B.

2.6.4. Cálculo da atividade

A quantidade de glucose liberada pela ação da enzima sobre a laminarina é calculada com base na curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas do açúcar. A atividade da enzima pode ser expressa em nanokatal (nkat). Um nkat equivale a 1 nmol de glucose liberado por mL da amostra por segundo. Segue o cálculo da absorbância corrigida em relação aos brancos:

Abs520nm amostra corrigida = [(Absamostra - Absbranco amostra) - (Absbranco laminarina - Absbranco reagente)]

Calcula-se a média das triplicatas. Padroniza-se a média obtida para mL, levando em conta o volume da amostra utilizada, bem como sua diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.

Corrige-se o valor obtido para ser expresso por segundo. Divide-se por 1.800, já que o tempo de reação é de 30 minutos.

Multiplica-se o resultado do valor de absorbância/segundo pelo fator da curva para converter a absorbância em µg de glucose produzida por mL, por segundo (µg de glucose liberada/mL/s).

Converte-se este valor para nmol de glucose liberada/mL/s. 1 nmol de glucose liberada/mL/s equivale a 1 nkat.

Para expressar em nkat/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado (nkat) pela concentração de proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL. Para expressar em nkat/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (nkat) pelo volume do tampão usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.7. Quitinase (CHI; EC 3.2.1.14)

As quitinases são enzimas capazes de hidrolisar ligações tipo β-1,4 que unem os resíduos de N-acetil-D-glucosamina (NAG) que formam a quitina, composto presente na parede celular de diversos fungos fitopatogênicos, em nematoides parasitas de planta e na membrana peritrófica de alguns insetos herbívoros. Além de sua ação direta contra patógenos, essas enzimas também são capazes de potencializar respostas de defesa vegetal ativa ao liberarem oligômeros de açúcares, que funcionam como moléculas elicitoras (LOPEZ; GÓMEZ-GÓMEZ, 2009; LOON et al., 2006).

2.7.1. Princípio do ensaio

A determinação da atividade desta enzima consiste na capacidade da amostra em liberar NAG, a partir da sua ação hidrolítica sobre a quitina coloidal. A enzima glucoronidase é adicionada a esse ensaio para que os oligômeros resultantes da ação endoquitinolítica sejam clivados. Após liberação dos monômeros, ocorrerá o coramento dos mesmos em duas etapas independentes envolvendo os reagentes tetraborato de potássio e p-dimetilaminobenzaldeído (DMAB). Primeiramente, ocorre a formação de um composto intermediário, uma glucoxazolina e, em seguida, sua reação com o DMAB para a produção da cor em meio ácido (REISSIG et al., 1955). A quitina coloidal é preparada a partir de quitosana de carapaça de caranguejo (MOLANO et al., 1970), usando anidrido acético não radioativo (MARTINS-MIRANDA, 2002).

2.7.2. Reagentes

A. NAG 1 mM. Preparar em água deionizada, contendo azida 0,02%. Diluir o reagente A para concentrações de 100 µM, 200 µM, 300 µM, 400 µM, 500 µM e 600 µM, momentos antes de construir a curva padrão.

B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.

C. Tetraborato de potássio 0,6 M.

D. DMAB 10%. Dissolver 10 g em 100 mL de ácido acético glacial contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. Essa solução deverá ser diluída duas vezes (1:2) com ácido acético glacial, no momento de ser utilizada.

E. Quitina coloidal (10 mg/mL).

F. β-Glucoronidase (EC 3.2.1.31; 132.000 unidades/mL). Diluir 10x.

2.7.3. Procedimento (BOLLER, 1993; MARTINS-MIRANDA, 2002; REISSIG et al., 1955)

Para obtenção da curva padrão, deve-se adicionar, em tubos tipo eppendorf (tampa rosqueada), à temperatura ambiente, nesta ordem:

• 100 µL do reagente A (NAG) previamente diluído.

• 400 µL do reagente B.

• 100 µL do reagente C. Incubar a 100 ºC, por 5 minutos. Resfriar, imediatamente, em banho de gelo.

• 1.000 µL do reagente D. Homogeneizar e incubar a 37 ºC, por 20 minutos precisamente.

Imediatamente, em cubeta de vidro ou plástico, deve-se zerar o espectrofotômetro com água deionizada, ou com o branco dos reagentes, e ler absorbância a 585 nm. As leituras têm que ser feitas no menor tempo possível, pois, a cada 5 minutos passados após o tempo de incubação, a absorbância cai, aproximadamente, 1,5% (RESSIG et al., 1955).

Deve-se construir a curva padrão [Abs585nm (ordenada) versus concentração (nmoles/1.600 µL) de NAG (abscissa)] e calcular a cotangente da reta para obtenção do fator de conversão (Fc).

Para determinação da atividade da quitinase, deve-se adicionar em tubos tipo eppendorf (tampa rosqueada), à temperatura ambiente, nesta ordem:

1ª etapa:

• 250 µL da amostra. Diluir, previamente, com o reagente B, caso necessário.

• 250 µL do reagente E. Homogeneizar e incubar a 37 ºC por 60 minutos sob leve agitação. Em seguida, incubar a 100 ºC por 5 minutos e resfriar, imediatamente, em banho de gelo. Centrifugar os tubos a 10.000 g por 10 minutos.

2ª etapa:

• 300 µL do sobrenadante final da etapa anterior, após centrifugação, para um novo tubo tipo eppendorf (tampa rosqueada, 2 mL), ao qual se deve adicionar:

• 10 µL do reagente F. Incubar a 37 ºC, por 60 minutos, sob leve agitação. Em seguida, incubar a 100 ºC por 5 minutos e resfriar, imediatamente, em banho de gelo.

• 190 µL do reagente B.

• 100 µL do reagente C. Incubação a 100 ºC, por 5 minutos, precisamente. Resfriar, imediatamente, em banho de gelo, por 5 minutos.

• 1.000 µL do reagente D. Homogeneizar e incubar a 37 ºC, por 20 minutos, precisamente.

Da mesma forma como indicado para construção da curva padrão, deve-se ler absorbância a 585 nm, imediatamente após a incubação final. Observe que o volume da mistura da 2ª etapa, em que será mensurada a liberação de NAG, é de 1.600 µL, à semelhança do volume da curva padrão.

Obs.: neste protocolo, a atividade mensurada é a total, ou seja, engloba a ação endoquitinolítica e exoquitinolítica da enzima.

2.7.4. Cálculo da atividade

A quantidade do açúcar liberado é calculada com base na curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de NAG (10 nmoles a 60 nmoles) contidas no volume de reação (1.600 µL). A atividade quitinásica é expressa em nanokatal (nkat). Um nkat equivale a 1 nmol de NAG liberado/s nas condições do ensaio.

Segue o cálculo da absorbância corrigida em relação aos respectivos brancos:

Abs585nm = Absamostra - Absbranco amostra

Calcula-se a média das triplicatas. Extrapola-se a média obtida para mL, levando em conta o volume da amostra utilizada no ensaio, bem como sua diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.

Corrige-se o valor obtido para ser expresso por segundo (divide-se por 3.600, já que o tempo de reação é de 60 minutos).

Multiplica-se pelo fator da curva (Fc) para converter a absorbância em nmoles de NAG liberados por mL da amostra por segundo (nmoles de NAG liberado/mL/s). 1 nmol de NAG liberada/mL/s equivale a 1 nkat.

Para expressar em nkat/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado (nkat) pela concentração de proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL. Para expressar em nkat/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (nkat) pelo volume usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.8. Inibidor de proteinase cisteínica

Os inibidores de proteinases cisteínicas (fitocistatinas) estão presentes em mono e dicotiledôneas e são encontrados em sementes, raízes, tubérculos, folhas e frutos. Possuem massa molecular variando, aproximadamente, de 5 kDa a 87 kDa e são, em geral, resistentes a altas temperaturas e extremos de pH (OLIVEIRA et al., 2003). As fitocistatinas exercem seu efeito inibitório interagindo com as proteinases na região adjacente ao seu centro catalítico, bloqueando o acesso do substrato (RZYCHON et al., 2004).

2.8.1. Princípio do ensaio

No ensaio não inibido, a enzima atua sobre o substrato sintético cromogênico N-α-benzoil-arginina-ρ-naftilamida (BANA), liberando arginina e ρ-naftilamina. Esta última reage com 4-dimetilaminocinamaldeído (DMACA) formando um produto colorido, lido a 540 nm. A intensidade da coloração varia com o nível de atividade da protease. Na presença do inibidor, essa intensidade estará diminuída.

Equação 1. BANA → L-arginina + ρ-naftilamina
Equação 2. ρ-naftilamina + DMACA → produto colorido (vermelho)

2.8.2. Reagentes

A. Tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,0.

B. Papaína (1 mg/mL de água deionizada). Diluir 50x com reagente A.

C. Solução ativadora, constituída por 2 mM de EDTA (ácido etileno diaminotetracético) e 3 mM de DTT (ditiotreitol), preparada no reagente A.

D. Substrato sintético (BANA). Preparar, na concentração de 1 mM, dissolvendo-o em 1 mL de DMSO (dimetilsulfóxido) e ajustando volume final com o reagente A.

E. HCl 2% preparado em etanol.

F. DMACA 0,06%, preparado em etanol.

2.8.3. Procedimento (ABE et al., 1992)

Adicionar em tubos de ensaio, em triplicata, nesta ordem, em banho de gelo (etapas 1 a 4):

• 20 µL do reagente B.

• 40 µL do reagente C.

• 240 µL do reagente A.

• 200 µL da amostra (diluir, previamente, com o reagente A, caso necessário).

• Incubar, em banho-maria, a 37 ºC, por 10 minutos.

• 200 µL do reagente D. Continuar incubando a 37 ºC, por mais 20 minutos.

• 500 µL do reagente E. Deixar em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente (≈ 25 ºC).

• 500 µL do reagente F. Incubar por 30 minutos. Ler absorbâncias a 540 nm.

Obs.: a) Para mensuração da atividade papainásica (100% de atividade enzimática), os 200 µL da amostra contendo inibidor devem ser substituídos por 200 µL do reagente A; b) Nas provas em branco (controle), feitas para cada amostra, a reação será interrompida com o reagente E (HCl) antes da adição do substrato (BANA) e etapas subsequentes.

2.8.4. Cálculo da atividade

Deve-se calcular a absorbância corrigida da amostra, em relação ao branco correspondente, como abaixo:

Abs540nm corrigida = Absamostra - Absbranco amostra

Calcula-se a média aritmética das triplicatas, a variação de absorbância (∆Abs540nm) entre o controle positivo (reação da papaína na ausência do inibidor, 100% ativa) e a amostra contendo o inibidor:

∆Abs540nm = Abspapaína corrigida - Absamostra corrigida

Extrapola-se o valor obtido para o volume de 1 mL da amostra, levando em conta o volume usado no ensaio, bem como sua diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.

Deve-se expressar o resultado em unidade arbitrária de atividade antipapainásica (UI), sendo esta definida como a diminuição de 0,01 na absorbância (corrigida) do controle positivo (100% atividade da papaína), por 1 mL de volume da amostra, na ausência do inibidor.

Para expressar a atividade inibitória em UI/mg de proteína (atividade específica), divide-se o resultado pela concentração de proteína da amostra, expressa em mg proteína/mL. Para expressar em UI/grama de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (UI/mL da amostra) pelo volume do tampão usado para extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

Caso queira expressar em atividade residual (% de inibição da papaína), deve-se usar a relação % de inibição = (Abscontrole positivo - Absamostra) x (100/Abscontrole positivo), estando os valores já corrigidos dos respectivos brancos.

Para verificar a cinética de inibição, devem-se usar volumes crescentes da amostra (50 µL, 100 µL, 150 µL, 200 µL, 300 µL e 400 µL, por exemplo) no ensaio descrito acima e plotar os valores de absorbância a 540 nm já corrigidos (ordenada) versus volumes ou concentrações de proteína da amostra (abscissa).

3. Considerações finais

A grande maioria dos ensaios enzimáticos é realizada utilizando-se métodos espectrofotométricos que permitem quantificar a formação de um produto final ou o desaparecimento do substrato sob ação da enzima. Há vários protocolos para mensuração de atividades enzimáticas citados na literatura que podem ser seguidos ou mesmo adaptados para as condições de cada laboratório, em particular, desde que obedecidas algumas regras básicas, como manutenção das condições ótimas de pH, temperatura, concentração do substrato e linearidade da velocidade de reação.

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Capítulo 2
Redução de nitrato e assimilação da amônia em sistemas vegetais: mensuração de atividade enzimática e metabólitos

Joaquim Albenisio Gomes Silveira
Marcio de Oliveira Martins
Aurenívia Bonifacio Lima
Sérgio Luiz Ferreira-Silva

1. Introdução

A via metabólica da redução assimilatória do nitrato e assimilação primária da amônia ocorre em sistemas vegetais e em microrganismos, possibilitando a conversão do N-NO-3 em aminoácidos, conforme esquema geral da Figura 1. O processo é um dos mais importantes por ser limitante para a transformação do N inorgânico em proteínas (SILVEIRA et al., 2001a). Primariamente, a via envolve a participação sequencial de quatro enzimas: redutase do nitrato (NR), redutase do nitrito (NRi), sintetase da glutamina (GS) e sintase do glutamato (GOGAT), sendo que as duas últimas atuam de forma cíclica perfazendo o ciclo GS/GOGAT. O envolvimento da atividade aminante da desidrogenase do glutamato (GDHA) ainda é controverso, sendo que as evidências mais recentes têm apontado que essa enzima esteja envolvida na assimilação secundária da amônia.

Sob o ponto de vista do controle metabólico, a redutase do nitrato é a enzima mais importante por catalisar a reação passo limitante até a conversão do N inorgânico em proteínas. O esquema da Figura 1 mostra também que as reações de assimilação estão associadas com a formação de outros aminoácidos por meio da atividade das transaminases do grupo amino (AT) que utilizam α-cetoácidos, como 2-oxoglutarato (2-OG), como doadores de esqueletos de carbono.

Figura 1. Esquema global da via de redução assimilatória do nitrato e assimilação da amônia.

2. Determinação das atividades enzimáticas

2.1. Atividade da redutase do nitrato (NR; EC 1.7.1.1)

a) Características gerais da enzima

A redutase do nitrato (NR) é largamente encontrada em plantas, algas e em muitos tipos de bactérias, fungos e leveduras. Ela permite que esses organismos possam utilizar o nitrato como fonte única de nitrogênio para o crescimento. Em plantas superiores, a enzima apresenta uma estrutura de homodímero, com massa molecular de cada subunidade de 100 kDa a 115 kDa, sendo constituída por um complexo enzimático com multicomponentes (Flavina Adenina Dinucleotídeo – FAD, citocromo b e molibdênio), os quais constituem uma minicadeia de transporte de elétrons, doados inicialmente por NAD(P)H (VIÉGAS; SILVEIRA, 2002), conforme mostra a Figura 2.

A NR de plantas é localizada no citosol nas proximidades dos cloroplastos (folhas) ou de plastídios (raízes). A enzima apresenta uma rápida taxa de renovação (turnover), sendo sua concentração e atividade dependentes da presença de seu substrato, o nitrato. NR apresenta mecanismos de transcrição, pós-tradução e de regulação de sua atividade extremamente complexos, os quais são controlados por diversos fatores metabólicos endógenos e por vários outros de origem ambiental. A enzima é extremamente sensível aos procedimentos de extração e purificação, fato que tem limitado muito os estudos sobre sua estrutura. Quando extraída da célula (dentro do extrato bruto, livre de células), a NR sofre rápido ataque de proteases que causam perda na atividade da enzima.

Figura 2. Esquema de transporte de elétrons que ocorre durante a reação processada pela enzima redutase do nitrato.

b) Princípio do método

O método mais utilizado para a determinação da atividade de NR se baseia na mensuração da quantidade do produto da reação, o NO2-. Cuidados são tomados para evitar a redução enzimática e não enzimática no nitrito o qual é muito instável. A quantidade de nitrito é usualmente determinada por meio do método colorimétrico clássico de Snell e Snell (1949), que se baseia na reação do NO2- com a sulfanilamida em meio ácido, com formação de um sal de diazônio. Em seguida, esse sal reage com N-1-naftiletilenodiamina (NNEDA), resultando num complexo de cor rosa-vermelha estável, com máximo de absorção em 540 nm. Esse complexo possui um coeficiente de absortividade molar igual a 55 (E1mM = 55). Significa que uma solução 1 mM de NO2- (a reação apresenta uma estequiometria de 1:1 entre NO2- e o complexo formado) formará uma solução com uma absorbância teórica de 55. Esse índice é importante em duas situações: (1) para checar se os cálculos da curva padrão estão corretos e (2) para calcular a concentração de NO2- em situações que não que existe a curva padrão.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

Método in vivo

Neste caso, a enzima não é extraída, pois a mensuração é feita no tecido intacto. O método foi melhorado por Hageman e Hucklesby (1971) e posteriormente sofreu algumas pequenas modificações. Segmentos de tecidos intactos, usualmente de 100 mg a 200 mg de massa fresca de discos de folhas de 10 mm de diâmetro, segmentos de raízes, nódulos, etc., são colocados em presença de 5 mL de um meio tamponado (tampão fosfato 100 mM pH 7,5 contendo KNO3 (substrato) a 50 mM + isopropanol 1% – um detergente que facilita a infiltração da solução). O meio e o tecido devem sofrer uma sucção do ar por uma bomba de vácuo, de aproximadamente -1,0 MPa, durante 2 minutos seguida de infiltração com N2 por igual período. Esse processo permite a infiltração do nitrato no tecido ao mesmo tempo em que elimina o O2 com a finalidade de estabilizar o NO2- formado e minimizar a respiração que consome NADH endógeno – o que pode limitar a atividade de NR no tecido. Em seguida, o meio deve ser incubado numa temperatura adequada (≈ 30 ºC) de 15 a 30 minutos no escuro, para minimizar a redução do NO2-. Posteriormente, a solução deve ser aquecida em banho-maria por 5 minutos, para paralisar as reações enzimáticas e também extrair todo NO2- formado dentro do tecido. Alíquotas adequadas (de 0,1 mL a 1 mL, completada para 1 mL com água destilada q.s.p.) da solução, contendo o nitrito, devem ser transferidas para tubos de reação contendo 1 mL de sulfanilamida 1% dissolvida em HCl 2,4 N + 1 mL de NNEDA 0,02% (m/v). Deve-se deixar a reação estabilizar após 15 minutos à temperatura ambiente e fazer as leituras a 540 nm, usando como controle as leituras das alíquotas no tempo zero de incubação, a fim de subtrair o NO2- residual contido nos tecidos.

Método in vitro

O método in vitro segue o princípio dos demais métodos enzimáticos. Diferentemente do in vivo, as células são rompidas, e a enzima é extraída no extrato bruto livre de células. Após centrifugação, esse extrato conterá essencialmente uma fração composta por citosol, vacúolos e matrizes das demais organelas. Como a NR está localizada na fração do citosol, pode-se obter uma boa estimativa de sua atividade total ou potencial, uma vez que, neste caso, as condições são mais artificiais, e os protocolos procuram aperfeiçoar as condições do ensaio (concentrações ótimas do substrato e de NAD(P)H, presença de FAD e de várias substâncias protetoras). O método tem sofrido grandes mudanças no sentido de maximizar a atividade e separá-la em atividade do estado ativo e atividade máxima e ainda estimar o percentual de ativação da enzima, como descrito por Kandlbinder et al. (2000).

O protocolo de extração apresentado aqui pode ser simplificado em termos da quantidade de agentes de proteção, na dependência do tipo de material e testes prévios. Durante a extração, cuidados especiais devem ser tomados em relação aos riscos de degradação e inibição da NR, principalmente em razão da ação de proteases e fenóis. Para isso, certa quantidade de tecido fresco imediatamente coletado deverá ser macerada sob baixa temperatura (de 0 °C a 4 °C) sob banho de gelo ou em câmara fria e adição de N2 líquido na presença de tampão, uma relação de aproximadamente 1 g/5 mL, contendo em seu interior um coquetel extremamente rico na proteção enzimática: tampão Tris-HCl pH 7,5 contendo FAD 10 µM (grupo prostético da enzima) + EDTA 20 mM (evita a ação de proteases dependentes de íons metálicos e a passagem da NR para a forma inativa) + DTT 5 mM (fonte de grupos -SH redutores para evitar oxidação da enzima e de fenóis que formam quinonas que podem desnaturar a enzima) + BSA 0,5 - 1% (uma proteína em excesso para sofrer ataque de proteases, protegendo a enzima) + caseína 0,02% (função idêntica a da BSA) + PVP 1% (remove fenóis por adsorção, precipitando-os) + mistura de inibidores de proteases (PMSF 0,1 mM + leuptina 10 µM + benzidina 1 mM). Após maceração, o extrato deve ser filtrado em duas camadas de tecido de musseline e centrifugado a 20.000 g (de 2 °C a 4 °C) durante 10 minutos. Opcionalmente, o extrato obtido pode ser passado numa coluna de Sephadex G-25, para eliminação de sais e possíveis contaminantes de baixa massa molecular. Após extração/purificação parcial, o extrato será utilizado para determinação da atividade do estado ativo e/ou atividade máxima.

Para determinação da atividade máxima (ROBIN, 1979), alíquota do extrato, de 100 µL a 500 µL, será adicionada num meio tamponado com Tris-HCl ou Fosfato 100 mM pH 7,5 contendo EDTA 10 mM + NADH 0,15 mM + KNO3 5 mM. É interessante adicionar também DTT 5 mM + FAD 10 µM no meio de reação. A reação deve ser iniciada pela adição do KNO3 5 mM. Deve-se incubar o meio de reação a 30 °C por 30 minutos. Parar a reação com adição de 200 µL de acetato de zinco 0,5 M (também favorece a precipitação de pigmentos). Se houver turvação, deve-se centrifugar a 3.000 g e usar o sobrenadante contendo o nitrito formado para mensuração de sua concentração seguindo os mesmos procedimentos anteriores para determinação da atividade in vivo e usar um branco sem a presença do NO3- no meio de reação.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

Para calcular a atividade de NR é necessário quantificar o NO2- produzido pela reação enzimática. A maneira mais usual e mais correta é determinar a quantidade de nitrito a partir de uma curva padrão previamente determinada com concentrações conhecidas de NO2-, obtido a partir de KNO2 ou NaNO2 PA. A reação de Snell e Snell (1949), forma um complexo colorido róseo-vermelho com uma relação absorbância versus concentração linear na faixa de 1 nmol NO2-/mL a 50 nmol NO2-/mL (concentração na alíquota/amostra). A reta obtida deverá passar próxima da origem (na prática, após visualizar a equação, usa-se a opção de passar na origem) e deverá ter uma inclinação de aproximadamente 0,02 (y = 0,02x e r2 = 0,9975), em que y é a absorbância, e x é a concentração de nitrito (nmol/mL). Deve-se observar que o valor do coeficiente angular (0,02) não deve variar entre as curvas obtidas no laboratório (no máximo 10%). A partir dessa equação pode ser calculada a quantidade de nitrito na alíquota utilizada nas amostras. Considere um exemplo prático para a atividade in vivo com uma alíquota de 1 mL da amostra diluída 1:1 (0,5 mL do extrato + 0,5 mL de água destilada) e uma leitura de 0,5 de absorbância. Pela equação acima, essa leitura corresponderá a x = 0,5/0,02 = 25 nmol/mL do extrato. Corrigindo a diluição (fator diluição = 2), têm-se 25 x 2 = 50 nmol/mL do extrato. Como essa alíquota (1 mL) foi retirada de um volume total de 5 mL (meio de reação), o total de nitrito produzido será 50 x 5 = 250 nmol/5 mL do extrato. Como a esse volume foi adicionado 100 mg de massa fresca de tecido, ficará 250 nmol/100 mg ou 2.500 nmol/g de MF. Esse nitrito foi produzido num intervalo de 30 minutos de reação; então se pode escrever: 2.500 nmol NO2- produzido/g MF/30 minutos ou 5.000 nmol NO2- produzido/g MF/h ou 5,00 µmol NO2- produzido/g MF/h. Essa é uma forma final de representar uma atividade de NR. O procedimento para a atividade in vitro é semelhante. Os resultados finais deverão ser expressos nas seguintes formas: µmol NO2-/g MF/h, µmol NO2-/mg proteína/h ou em katal. Um katal (kat) é definido como a atividade enzimática que causa a conversão de 1 mol de substrato/s. Para expressar na base de proteína, deve inicialmente ser calculada a quantidade de proteína no mesmo extrato da NR, em mg proteína/mL, a partir de uma curva padrão, por exemplo pelo método de Bradford, conforme descrito neste capítulo. Em seguida, a quantidade de proteína é calculada na base de mg/g de MF, e a conversão da atividade de NR em µmol NO2-/mg proteína/h é feita facilmente. A expressão na base de massa fresca é mais utilizada quando não ocorre variação de umidade no tecido. Quando ocorre variação de umidade entre os tecidos estudados, deve-se usar µmol NO2-/g MS/h, corrigindo a umidade. A expressão na base de proteína é utilizada quando não ocorrem grandes flutuações nos níveis de proteínas solúveis dos tecidos entre tratamentos. O katal, apesar de ser a unidade recomendada pelo Sistema Internacional (SI), ainda tem seu uso restrito principalmente na fisiologia e microbiologia.

2.2. Atividade da redutase do nitrito (NRi; EC 1.7.2.1)

a) Características gerais da enzima

A redutase do nitrito (NRi) é uma enzima também largamente distribuída em plantas e microrganismos. Ela é bastante ativa nas células, indicado pelos baixos níveis de nitrito encontrados nos tecidos. Está localizada dentro dos cloroplastos e nas raízes dentro de plastídios. NRi possui massa molecular de aproximadamente 60 kDa e aparentemente possui somente uma subunidade. Ela contém um centro Fe-S tetra nuclear (Fe4-S4) e um siroheme (um tipo especial de grupo heme). O centro siroheme atua como um intermediário para a transferência dos elétrons da ferredoxina reduzida para o nitrito. Nas raízes e tecidos aclorofilados o NADPH parece ser o doador elétron para a reação. A redução do NO2- até NH4+ ocorre sem a formação de intermediários. A reação catalisada por NRi também envolve uma minicadeia de transporte de elétrons envolvendo a transferência de 6e- por Ferredoxina reduzida conforme Figura 3.

Figura 3. Esquema de transporte de elétrons que ocorre durante a reação processada pela enzima redutase do nitrito.

b) Princípio do método

O princípio do método é a medida do consumo do NO2- no meio de reação por ação de NRi. Utiliza-se o mesmo método de Snell e Snell (1949) previamente descrito no item 2.1 (b).

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

O procedimento de extração de NRi pode ser o mesmo utilizado para NR. O ensaio enzimático pode ser conduzido de acordo como descrito por Losada e Paneque (1971), com adaptações. Neste método, o metil violageno substitui a ferredoxina reduzida como doadora de elétron. Adicionar 0,3 mL do extrato enzimático em 1,5 mL da mistura tamponada de reação (Tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,5 contendo NaNO2 15 mM + metil violageno 5 mM) correndo em paralelo um branco sem a enzima. A reação deve iniciar pela adição de 0,2 mL de uma solução recém preparada de ditionito de sódio 86 mM dissolvida numa solução de NaHCO3 190 mM. Após incubação a 30 ºC durante 15 minutos, paralisar a reação por meio de agitação muito vigorosa em agitador do tipo vórtex. Estimar a quantidade de nitrito pelo método de Snell e Snell (1949), semelhante ao reportado para a atividade de NR. O nitrito reduzido enzimaticamente é calculado a partir da quantidade de nitrito na presença da enzima com aquele no meio sem a presença do extrato enzimático.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

O procedimento é semelhante ao apresentado para a atividade de NR. Inclusive as formas de expressão são iguais, diferindo apenas que no caso da NRi o NO2- é consumido (µmol NO2-/g MF/h ou µmol NO2-/mg proteína/h) enquanto que na NR ele é produzido.

2.3. Atividade da sintetase de glutamina (GS; EC 6.3.1.2)

a) Características gerais da enzima

A GS é largamente encontrada em animais, microrganismos e vegetais. As plantas possuem isoformas da enzima presentes em cloroplastos (GS2) e no citosol (GS1) e formas específicas de raízes e nódulos (VIÉGAS; SILVEIRA, 1999). Em plantas superiores, é uma octamérica com massa molecular de 350 kDa a 400 kDa. A enzima catalisa a entrada de amônia em aminoácidos por meio da conversão dependente de ATP do glutamato em glutamina:

NH3 + Glutamato + ATP → Glutamina + ADP + Pi

A GS apresenta afinidade elevada por amônia (Km = 3-5 µM), mas pode também usar hidroxilamina como substrato, produzindo ɣ-glutamil-hidroxamato.

b) Princípio do método

O método para mensurar a atividade de GS que mais se aproxima das condições fisiológicas é o método sintetase ou método biossintético do hidroxamato que utiliza hidroxilamina no lugar da amônia, conforme mostrado a seguir:

Glutamato + NH2OH + ATP → ɣ-glutamil-hidroxamato + ADP + Pi

É importante observar que GS apresenta valores de Km e Vmax semelhantes entre NH3 e NH2OH. O método se baseia na formação de um complexo de cor marrom entre o ɣ-glutamil-hidroxamato e o Fe+3, sendo a absorbância (540 nm) desse complexo diretamente proporcional à concentração do ɣ-glutamil-hidroxamato.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

O ensaio enzimático pode ser conduzido de acordo com o método de Elliott (1955), com adaptações de Silveira et al. (2003). Amostras de tecido vegetal fresco (proporção de 2 g/5 mL) são maceradas na presença de N2 líquido sob banho de gelo (0 °C a 4 °C), com adição de um meio contendo tampão de extração (fosfato de potássio 0,1 M, pH 8,0 contendo EDTA 5 mM, β-mercaptoetanol 10 mM, DTT 10 mM, e PVP 1%. Posteriormente, o extrato será submetido a uma centrifugação a 15.000 g, durante 10 minutos, a 4 °C. No sobrenadante obtido foi determinada a atividade enzimática da GS. Alíquotas do extrato (100 µL a 500 µL) serão adicionadas em tubos de ensaio contendo tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,0 + ATP 6 mM, MgSO4 50 mM + hidroxilamina-NaOH 0,25 M (1:1) + glutamato de sódio 0,5 M. A reação será iniciada pela adição da alíquota do extrato enzimático. O volume final da solução de reação poderá ser de 3 mL. Após incubação em banho-maria, por 30 minutos, a 30 °C, a reação será paralisada pela adição de uma solução 1:1:1 contendo FeCl3 10% (m/v) em HCl 0,2 M + TCA 24% (m/v) + HCl 50% (m/v) (solução férrica ácida). Após o desenvolvimento da reação (aparecimento de uma coloração marrom), a solução será centrifugada a 3.000 g, por 10 minutos, à temperatura ambiente para precipitar as proteínas e tornar a solução colorida mais translúcida. Em seguida, fazer a leitura de sua absorbância a 540 nm em espectrofotômetro. Em paralelo com as amostras, correr dois controles: um sem adição do extrato enzimático mas com todos os reagentes para zerar o aparelho e outro sem adição do substrato hidroxilamina. A atividade GS será determinada a partir de uma reta padrão com concentrações crescentes de ɣ-glutamil-hidroximato (GGH).

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de uma faixa de concentrações conhecidas ɣ-glutamil-hidroxamato (a faixa linear é obtida com concentrações de GGH de 0,05 µmol/mL a 3,0 µmol/mL na alíquota). Essa reta deverá passar pela origem e possuir um r2 muito próximo de 1,0. Por exemplo, com uma alíquota de 500 µL e um volume de reação de 3 mL, pode-se obter uma relação linear com uma equação y = 0,474x e r2 = 0,9997, em que y representa a absorbância e x a concentração de GGH na alíquota em µmol/mL. Como exemplo prático, considere-se uma extração com 2 g de MF e um volume de extração (extrato) de 5 mL e uma alíquota de reação de 0,5 mL. Após a reação, a amostra deu uma leitura de 0,52 de absorbância. Com base na equação da reta, a concentração na alíquota será x = 0,52/0,474 = 1,097 µmol/mL de GGH na alíquota (0,5 mL). Extrapolando para o volume da alíquota, será 1,097 x 0,5 = 0,548 µmol de GGH/0,5 mL (isto representa quantidade e não concentração). Como o volume do extrato foi de 5 mL, então a quantidade total de GGH será = 0,548 x 5/0,5 = 5,48 µmol de GGH/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato foram obtidos a partir de 2 g de MF, implica que terá 5,48 µmol de GGH/2 g MF ou 2,74 µmol de GGH/g MF. Como o tempo de reação foi de 30 minutos, levando a atividade para minuto, teremos 2,74 x 60/30 = 5,48 µmol de GGH/g MF/h. Caso haja mudanças por efeito de tratamento na umidade do tecido, expressa-se a atividade como GGH/g massa seca/h. No caso de expressar a atividade na base de proteínas solúveis, determina-se a concentração das mesmas no extrato (mg de proteína/mL) e depois converte-se em mg/g MF, usando o mesmo artifício adotado anteriormente. Assim, a atividade final poderá ser expressa como µmol de GGH/mg proteína/h.

2.4. Atividade da sintase de glutamato (GOGAT; EC 1.4.1.14)

a) Características gerais da enzima

GOGAT é responsável pela transferência do grupo amida da glutamina para o 2-cetoglutarato para formar duas moléculas de glutamato. A proteína é largamente distribuída em plantas, algas e bactérias. Duas formas diferentes de GOGAT estão presentes em plantas superiores: uma que utiliza ferredoxina como doador de elétron e outra que utiliza o NADH. A GOGAT dependente de ferredoxina está presente em concentrações elevadas em folhas e é localizada dentro dos cloroplastos. A enzima é uma flavo proteína Fe-S com uma cadeia peptídica simples de massa molecular de 140 kDa a 160 kDa. A GOGAT dependente de NADH está presente em baixas concentrações nas folhas, mas parece ter um papel fundamental em raízes e nódulos. A enzima de nódulos (duas isoformas) também apresenta uma única subunidade de 200 kDa.

b) Princípio do método

A atividade da GOGAT dependente de NADH (raízes, nódulos, frutos) pode ser determinada pelo decréscimo na absorbância de NAD(P)H (340 nm), conforme a reação:

glutamina + 2-cetoglutarato + NAD(P)H → 2 glutamato + NAD(P)+

No caso da GOGAT dependente de ferredoxina, o método mais usual é medir o incremento na concentração do glutamato formado por cromatografia de papel ou por HPLC:

glutamina + 2-cetoglutarato + Ferredoxina (red) → 2 glutamato + Ferredoxina (oxi)

Usualmente, no laboratório se utiliza o redutor metil violageno em substituição à ferredoxina por ser mais barato e de mais fácil armazenagem.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

O método de extração pode ser o mesmo adotado para a GS, sendo a proporção de massa fresca para volume de extração de 1 g/5 mL. A determinação da atividade de GOGAT dependente de NAD(P)H é realizada pelo método de Suzuki et al. (1994). Em tubos de ensaio contendo 3 mL do meio tamponado com Tris-HCl 100 mM pH 7,4 + EDTA 1 mM + glutamina 10 mM + α-cetoglutarato 20 mM + 0,25 mM de NADH. A reação deve ser iniciada com adição de 0,1 mL a 0,4 mL de extrato no meio de reação. Deve-se monitorar a 25 ºC a oxidação do NADH por meio da redução da absorbância a 340 nm, a cada minuto. A atividade será proporcional ao decréscimo na absorbância. Utiliza-se um controle sem a presença de glutamina e testa-se a presença de atividade de oxidases de NAD(P)H incubando o extrato na presença do tampão e monitorando a absorbância.

Para a atividade de GOGAT dependente de ferredoxina, deve-se alterar o meio de reação adicionando metil violageno 5 mM em substituição ao NADH. Inicia-se a reação adicionando 0,6 mL de uma solução contendo 90 mg de ditionito de sódio + 90 mg de bicarbonato de sódio por mL, preparada imediatamente antes da reação. Após incubação por 15 minutos, a reação é paralisada pela adição de 1 mL de etanol seguida de violenta agitação para oxidar o metil violageno e o ditionito. Um branco com ausência de ditionito deve correr em paralelo. A vantagem do uso do metil violageno em substituição à ferredoxina é que ele é mais barato, mais estável no armazenamento e mostra uma cor azul quando reduzido que desaparece após a sua completa oxidação. A quantificação do glutamato consumido na reação pode ser feita por meio de três métodos: cromatografia líquida de alta performance (HPLC), que é mais rápida e mais precisa, porém mais cara. Por cromatografia de papel, mais demorada e menos precisa, porém mais barata. Finalmente, por meio de colunas Dowex-1 (troca iônica), também mais demorado, menos preciso e mais barato. Nos dois últimos métodos, o glutamato, após separação, será eluído e quantificado por meio de reação com ninhidrina com auxílio de curva padrão. Esses dois últimos métodos estão descritos em Coombs e Hall (1982).

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

Atividade de GOGAT dependente de NADH

O primeiro passo é fazer uma curva padrão com NADH (como para os demais métodos espectrofotométricos existe a opção de utilizar o coeficiente de absortividade molar (E) ao invés da curva). Esse índice é um valor padrão encontrado em Handbooks. No caso do NAD(P)H (340 nm), é igual a 6,3. Significa que uma solução de 1 mM de NADH, numa cubeta com distância interna de 1 cm, apresentará uma absorbância estimada igual a 6,3. É recomendado usar esse índice somente quando não há condição de fazer a curva padrão no laboratório. O gráfico para concentração de NADH (x) versus absorbância (y) é linear entre 0,001 µmol/mL e 0,1 µmol/mL de NADH (na alíquota) e um volume final de reação de 3 mL, com uma equação de y = 5,079x e r2 = 0,997. A atividade da enzima será diretamente proporcional ao decréscimo da absorbância (A) num certo intervalo de tempo (ΔA). Esse ΔA deverá apresentar uma variação linear em função do tempo. No caso de GOGAT-NADH, ele é linear entre 0 e 10 minutos. Pode-se então padronizar o tempo de reação de 2 minutos. Como exercício, considere-se uma extração com 1 g MF para 5 mL de extrato, um tempo de reação de 2 minutos e uma alíquota de extrato de 0,1 mL. Para uma determinada amostra a variação de A em 2 minutos foi igual a 0,2. Então, substituindo na equação 0,2 de A corresponde a x = 0,2/5,079 = 0,04 µmol/mL de NADH. Convertendo para o volume do extrato (0,1 mL), x = 0,04x1/0,1 = 0,4 µmol de NADH/0,1 mL de extrato. Extrapolando para o volume total de extrato (5 mL), x = 0,4x5/0,1 = 20 µmol de NADH/5 mL. Como esse volume corresponde a uma massa de 1 g de MF, x = 20 µmol de NADH/g MF. Levando a atividade para a base de minuto, x = 20x1/2 = 10 µmol de NADH reduzido/g MF/min. Essa atividade poderá ser expressa na base de µmol de NADH reduzido/mg de proteína/h, determinando a quantidade de proteína na alíquota conforme indicado no subitem d do item 2.1 deste capítulo.

Atividade de GOGAT dependente de ferredoxina

A forma de cálculo será essencialmente semelhante às anteriores. Será necessário determinar a variação na síntese de glutamato com auxílio de uma curva padrão no caso da cromatografia de papel ou da separação por coluna de troca iônica. No caso do HPLC, será mais simples, pois o equipamento já fornece diretamente a concentração final de glutamato e, por diferença com a inicial, calcula-se a quantidade produzida. Na verdade, deve-se correr no HPLC amostras com o glutamato na concentração inicial junto com os padrões e as amostras dos extratos depois de ocorrida a reação enzimática. A forma de expressar o resultado é semelhante, sendo, neste caso, µmol glutamato produzido/g MF/h.

2.5. Atividade da desidrogenase de glutamato aminante (GDH; EC 1.4.1.2)

a) Características gerais da enzima

A desidrogenase de glutamato (GDH) é largamente encontrada em todos os seres vivos, incluindo as plantas superiores. A GDH pode estar localizada em mitocôndrias, cloroplastos e possivelmente no citosol. Existem evidências de que a GDH de plantas apresenta massa molecular entre 210 kDa e 230 kDa, possivelmente com uma estrutura tetramérica ou hexamérica. A enzima catalisa de forma reversível a aminação do α-cetoglutarato (atividade aminante) e a desaminação do glutamato (atividade desaminante), envolvendo a oxidação e a redução de NAD(P)H/NAD(P)+, respectivamente, conforme reação a seguir:

α-cetoglutarato + NH3 + NAD(P)H ↔ glutamato + NAD(P)+

Em virtude de seu elevado Km para amônia, a importância na assimilação primária da NH3 oriunda do nitrato perdeu valor a partir da década de 1970, a despeito de seu real papel nas plantas ser ainda bastante controvertido. A importância de GDH aminante é maior durante a reciclagem da amônia, especialmente nos processos de fotorespiração e senescência.

b) Princípio do método

A determinação da atividade aminante de GDH se baseia na medida do decréscimo da absorbância do NAD(P)H a 340 nm, na presença de NH3 e α-cetoglutarato, conforme equação mostrada acima.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

A técnica de extração de GDH em tecidos vegetais pode ser a mesma utilizada para GOGAT. O ensaio para determinação da atividade da GDH aminante é feita pela mensuração da oxidação de NADH (COOMBS; HALL, 1982). O meio de reação tamponado (5 mL) pode ser constituído por tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) contendo α-cetoglutarato 7 mM + cloreto de amônio 10 mM + CaCl2 2 mM + 0,25 mM de NADH. A reação é iniciada pela adição do extrato enzimático (0,1 mL a 0,2 mL). Deve-se monitorar a 25 ºC a oxidação do NADH por meio da redução da absorbância a 340 nm, a cada minuto. A atividade será proporcional ao decréscimo na absorbância. Utiliza-se um controle na ausência de NH4Cl e testa-se a presença de atividade de oxidases de NAD(P)H incubando o extrato com o tampão e monitorando a absorbância a 340 nm.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

Neste caso, o procedimento é igual ao desenvolvido para calcular a atividade de GOGAT dependente de NADH.

3. Determinação da concentração de substratos e/ou produtos

3.1. Determinação da concentração do nitrato total e do metabolicamente disponível

a) Características gerais

Sob condições normais de aeração no solo, o nitrato é a principal fonte de nitrogênio, sendo, portanto, a forma inorgânica nitrogenada mais absorvida preferencialmente pelas plantas. Uma vez absorvido pelos vegetais, o nitrato é convertido em amônio e então incorporado em aminoácidos e outros compostos nitrogenados que vão levar a formação de proteínas e outras diversas macromoléculas ou ainda pode ser armazenado nos vacúolos. O nitrato na célula pode estar contido no citosol (pool de nitrato metabolicamente ativo) ou armazenado nos vacúolos (pool de reserva). A primeira fração, a despeito de ser muito menor, é a mais importante como substrato – indutor da redutase do nitrato (SILVEIRA et al., 2001c). Na realidade, em termos de indução de NR, o fator mais importante é o fluxo de nitrato no citosol, o qual é de difícil mensuração.

b) Princípio dos métodos

NO3- total

Existem três métodos principais para a determinação de nitrato que são o método proposto por Cataldo et al. (1975), o de Cawse (1967) e o do eletrodo seletivo, no entanto o primeiro é o mais utilizado na determinação de nitrato em tecido vegetal. A metodologia proposta por Cataldo et al. (1975) baseia-se na nitração do ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzoico) pelos íons NO3-, numa relação molar de 1:1, que ocorre em pH alcalino (acima de 12) e resulta em um nitro-composto de cor amarela, o ácido 5-nitrossalicílico (Figura 4).

Figura 4. Reação da nitritação do ácido salicílico formando ácido 5-nitrosalicílico.

c) Marcha analítica para extração e determinação

Para o preparo do extrato, são necessários cerca de 50 mg a 100 mg de tecido vegetal liofilizado com 5 mL de água deionizada a quente em banho-maria por 1 hora. Em seguida, após a solução atingir a temperatura ambiente, deve-se centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos e recolher o sobrenadante. O extrato irá conter o NO-3 total no tecido. Caso o extrato esteja pigmentado, devem-se eliminar os pigmentos com acetona ou clorofórmio. Alíquotas de 0,1 mL devem ser misturadas com 0,2 mL da solução de ácido salicílico 5% (m/v) e então agitadas. Posteriormente, o volume deve ser completado para 5 mL com NaOH 2N, e a solução novamente agitada. A adição do NaOH à solução garante a formação de um pH altamente básico, condição necessária para que ocorra a reação entre o nitrato e o ácido salicílico. Em razão do calor causado pela dissolução da NaOH, é necessário aguardar que a solução volte à temperatura ambiente para que, então, as leituras possam ser realizadas em espectrofotômetro ajustado a 410 nm e zerado com o branco. O branco deve conter água deionizada como substituinte do extrato e passar pelas mesmas condições das amostras. Na construção da curva padrão, recomenda-se a utilização da solução de KNO3 numa faixa de concentração de 0,1 μmol NO3-/mL a 5 μmol NO3-/mL (na alíquota). Após a obtenção das leituras referentes às soluções dos padrões com diferentes concentrações, deve-se calcular a curva padrão (reta), que deve cruzar a origem e possuir coeficiente de correlação (r2) muito próximo de 1. Com base nesta curva padrão pode-se proceder ao cálculo da concentração do nitrato nas amostras analisadas.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados

Como exemplo para o cálculo da concentração de nitrato nas amostras, vamos utilizar a equação y = 0,14679x (r2 = 0,9998) obtida pela construção da curva padrão, onde y representa a absorbância e x a concentração de NO3- em µmol/mL. Utilizando-se 0,05 g de tecido vegetal para 5 mL de água deionizada na extração e alíquota de reação de 0,1 mL, foi obtida uma leitura de 0,108. Procedendo-se os cálculos, tem-se x = 0,108/0,14679 = 0,736 µmol/mL, que ajustando para o volume da alíquota (0,1 mL) fica 0,0736 µmol de NO3-/0,1 mL. Como foram utilizados 5 mL para a obter o extrato, então a quantidade total de NO3- será de 0,0736 x 5/0,1, ou seja, 3,678 µmol de NO3-/5 mL do extrato. Ajustando-se para a quantidade de massa seca utilizada (0,05 g), teremos 3,678 µmol de NO3-/0,05 g MS ou 73,6 µmol de NO3-/g MS. Note que, para o cálculo, considerou-se que a amostra não sofreu diluição. Assim, caso haja utilização da amostra diluída o fator de diluição deve ser incluído no cálculo.

NO3- metabolicamente ativo

O método é baseado na mensuração da concentração do nitrato a partir do NO2- acumulado no tecido intacto, sem a presença de NO3- exógeno no meio de reação (SILVEIRA et al., 2001b) . Essencialmente, o método é semelhante ao da determinação da atividade in vivo da NR, aumentando para 90 minutos o tempo de incubação. O princípio é que sob essas condições todo nitrito acumulado no tecido será originado a partir do nitrato endógeno do pool metabolicamente ativo ou do citosol. Portanto, a marcha analítica é semelhante àquela descrita para atividade in vivo de NR, com as seguintes diferenças: o meio de reação não contém KNO3, e o tempo de incubação deverá ser de no mínimo 90 minutos quando ocorre saturação na acumulação de nitrito. O cálculo dos resultados também é igual, e a forma de expressão usual é nmol NO3-/g MF ou nmol NO3-/g MS.

3.2. Determinação da concentração de nitrito

a) Características gerais

Em células vegetais, o nitrito (NO2-) é o produto da redução do nitrato pela NR. As plantas também podem adquirir o nitrito do meio externo, em pequena proporção. Em ambos os casos, por ser altamente tóxico, o nitrito, assim como a sua forma ácida, o ácido nitroso (HNO2), não se acumula em altas concentrações. O nitrito é produzido no citosol pela NR citosólica. Depois de formado, o nitrito é imediatamente transportado para dentro dos cloroplastos ou plastídios e reduzido a amônio pela NRi e, por essa razão, é encontrado em baixíssimas concentrações nos tecidos. A utilização do nitrito in vivo é evitada pela anaerobiose, e sob aeração o nitrito é rapidamente convertido em amônia.

b) Princípio do método

O método de Snell e Snell (1949) é uma modificação do método descrito por Griess em 1879. Este se baseia na formação de sal diazônio durante uma reação em meio ácido, do nitrito com a sulfanilamida, e o posterior estabelecimento de um complexo colorido quando o sal diazônio reage com N-(1-naftil)etilenodiamina (NNEDA) (Figura 5). O complexo resultante tem coloração rosa-vermelho e tem um pico de absorção a 540 nm.

Figura 5. Formação do sal diazônio durante a reação em meio ácido do nitrito com a sulfanilamida, e posterior estabelecimento de um complexo colorido quando o sal diazônio reage com NNEDA.

c) Marcha analítica para extração e ensaio

O problema para a determinação da concentração de nitrito livre em amostras vegetais é o de sua extração uma vez que ele é muito instável na presença de O2 e luz, por exemplo. Um procedimento razoável é congelar 5 g de material fresco em N2 líquido e liofilizar imediatamente. A seguir, fazer uma extração a frio com etanol 80% sob maceração (500 mg de MS/5 mL). Centrifugar a 3.000 rpm e utilizar o sobrenadante imediatamente. Fazer todas as operações ao abrigo da luz. Do extrato obtido, tomar uma alíquota de 3 mL e misturar em tubo de ensaio contendo 1 mL da solução de sulfanilamida 1% (dissolver 1 g de sulfanilamida em HCl 2,4N e completar para 100 mL) + 1 mL do NNEDA (pesar cerca de 0,02 g do dicloridrato N-(1-naftil)etilenodiamina). Agitar e deixar 15 minutos, para em seguida realizar a leitura em espectrofotômetro a 540 nm.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados

Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de uma faixa de concentrações conhecidas de KNO2, a qual deve variar entre 1 nmol/mL e 50 nmol/mL. Por exemplo, com uma alíquota de 3 mL e um volume de reação de 5 mL, pode-se obter uma relação linear com uma equação y = 0,0304x e r2 = 0,9996, em que y representa a absorbância e x a concentração de NO2- na alíquota em nmol/mL. Como exemplo prático, considere-se uma extração com 500 mg de MS e um volume de extração (extrato) de 5 mL e uma alíquota de reação de 3 mL. Após a reação, a amostra apresentou leitura de 0,5 de absorbância. Com base na equação da reta, a concentração na alíquota será: x = 0,5/0,0304 = 16,447 nmol/mL de NO2- para cada mL da alíquota. Extrapolando para o volume da alíquota, será: 16,447 x 3 = 49,34 nmol/3 mL (isso representa quantidade e não concentração). Como o volume do extrato foi de 5 mL, então a quantidade total de NO2- será = 49,34 x 5/3 = 82,24 nmol de NO2-/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato foram obtidos a partir de 500 mg de MS, implica que ter-se-ão 82,24 nmol de NO2-/500 mg MS ou 164,48 nmol de NO2-/g MS.

3.3. Determinação da concentração de amônio

a) Características gerais

O metabolismo que transforma amônio em aminoácidos e amidas é o principal mecanismo de assimilação e detoxificação de amônio nas plantas. A formação de glutamato e glutamina é a porta de entrada da amônia oriunda do nitrato e da reciclagem do N que envolve processos importantes, como fotorespiração, ciclo da ureia, senescência, etc. Portanto, apesar de o amônio não ser acumulado nas células em virtude de sua toxicidade elevada (acima de 5 mM), sua reciclagem é intensa. Sob certas condições metabólicas, durante a reciclagem parte do amônio é eliminada ou perdida para a atmosfera.

b) Princípio do método

O método baseia-se na formação de um composto de coloração azulada, o indofenol, após a reação da amônia com fenol e hipoclorito em pH alcalino, induzido pela adição de NaOH na solução de reação (FELKER, 1977; WEATHERBURN, 1967) demonstrada na Figura 6. O indofenol pode ser quantificado em espectrofotômetro com um máximo de absorção a 640 nm.

Figura 6. Formação do indofenol a partir da reação da amônia com fenol e hipoclorito em pH alcalino induzido pela adição de NaOH.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade

Para a extração, deve-se pesar 100 mg de tecido vegetal liofilizado, adicionar 5 mL de água deionizada em tubos de ensaio lacrados. Colocar os tubos em banho-maria por 1 hora a 100 ºC e centrifugar por 10 minutos a 3.000 rpm. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante (extrato) para recipiente adequado e guardar em freezer. Do extrato obtido, transferir uma alíquota de 0,4 mL para tubos de ensaio contendo 2,5 mL da solução de reação A (dissolver 5 g de fenol e 25 mg de nitroprussiato de sódio em água deionizada e completar o volume para 500 mL. Guardar em refrigerador e utilizar em 30 dias, no máximo). Após agitar em vórtex, acrescentar 2,5 mL da solução de reação B (dissolver 2,5 g de NaOH e 12,6 mL de hipoclorito de sódio comercial e completar o volume para 500 mL. Guardar em refrigerador e utilizar em 30 dias, no máximo) e agitar. Colocar os tubos em banho-maria por 20 minutos a 37 ºC; após 30 minutos, ler as absorbâncias em espectrofotômetro a 625 nm. A concentração de amônio livre será determinada utilizando-se uma curva padrão ajustada com concentrações crescentes de sulfato de amônio (NH4)2SO4.

d) Cálculos da concentração e formas de expressão dos resultados

Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de uma faixa de concentrações conhecidas de sulfato de amônio (NH4)2SO4. A faixa deve variar entre 0 e 0,4 µmol NH4+/mL (faixa linear). Por exemplo, com uma alíquota de 0,4 mL e um volume de reação de 5,4 mL, pode-se obter uma relação linear com uma equação y = 1,2896x (r2 = 0,9995), em que y representa a absorbância e x a concentração de NH4+ na alíquota em µmol/mL. Como exemplo prático, considere-se uma extração com 100 mg de MS e um volume de extração (extrato) de 5 mL e uma alíquota de reação de 0,4 mL. Após a reação, a amostra deu uma leitura de 0,3 de absorbância. Com base na equação da reta, a concentração na alíquota será: x = 0,3/1,2896 = 0,232 µmol/mL de NH4+ na alíquota (0,4 mL). Extrapolando para o volume da alíquota, será: 0,232 x 0,4 = 0,093 µmol de NH4+/0,4 mL. Como o volume do extrato foi de 5 mL, então a quantidade total de NH4+ será: 0,093x5/0,4 = 1,16 µmol de NH4+/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato foram obtidos a partir de 100 mg de MS, implica que ter-se-á 1,16 µmol de NH4+/100 mg MS ou 11,61 µmol de NH4+/g MS.

3.4. Determinação da concentração de aminoácidos livres totais (N α-amino livre)

a) Características gerais

Os aminoácidos são os produtos primários da assimilação da amônia oriunda da redução assimilatória do nitrato. Após formação dos primeiros aminoácidos (glutamato, glutamina, aspartato e asparagina), ocorre intensa interconversão, principalmente catalisada pela transferases do grupo amino. Com decorrer do metabolismo, duas frações de aminoácidos se estabelecem: um grupo que segue a via de síntese proteica e de outras biomoléculas nitrogenadas, e uma fração que permanece na forma livre, constituindo um pool importante, envolvido com vários processos fisiológicos. Na realidade, esses dois pools, ou seja, as frações de aminoácidos, se interligam metabolicamente com a mediação dos α-cetoácidos, que fornecem os esqueletos de carbono para a síntese de novos aminoácidos e síntese proteica.

b) Princípio do método

O método se baseia na reação de um α-aminoácido livre com duas moléculas de ninhidrina, sendo uma por vez. Inicialmente, uma molécula de ninhidrina (agente fortemente oxidante) ocasiona a oxidação descarboxilativa dos aminoácidos resultando em amônio e hidridantina que então reagem com uma segunda molécula de ninhidrina produzindo um composto de cor púrpura (YEMM; COCKING, 1955) (Figura 7). Quando a reação ocorre com a prolina e/ou hidroxiprolina, as quais não possuem o seu α-aminogrupo livre, o produto resultante é um composto de cor amarela característica. A intensidade de cor formada, assim como a absorbância, não é igual para todos os aminoácidos. Portanto, o método apenas estima a concentração dos aminoácidos livres totais, dependendo, portanto, da composição da amostras.

Figura 7. Formação de um pigmento púrpuro a partir da ligação de duas moléculas de ninhidrina com um aminoácido.

c) Marcha analítica para extração e determinação

Para a extração, deve-se pesar 50 mg de tecido vegetal liofilizado, adicionar 5 mL de água deionizada e realizar extração à quente em banho-maria por 1 hora e, então, centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante (extrato) para recipiente adequado e guardar em freezer. Alíquotas de 0,1 mL a 0,5 mL (completadas até 0,5 mL com água destilada q.s.p.) devem ser misturadas com 0,25 mL de tampão citrato 0,2 M (pH 5,0) + 0,6 mL solução de ninhidrina 5% (m/v) e KCN 0,2 mM na proporção de 1:5. A solução de ninhidrina 5% deve ser dissolvida nos solventes metilcelosolve, metoxi-etanol ou ultrasolve. Agitar em vórtex e levar ao banho-maria (100 °C por 15 minutos) para o desenvolvimento da cor característica (azul-violeta). Ao final desse período, os tubos devem ser resfriados em banho de gelo e então 0,65 mL de etanol 60% deve ser adicionado. O etanol garante a estabilidade da cor desenvolvida por cerca de 1 hora. As leituras devem ser realizadas em espectrofotômetro a 570 nm zerado com o branco. O branco deve ser feito substituindo-se o extrato por água deionizada.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados

Na construção da curva padrão, recomenda-se a utilização de uma solução de glicina que varie de 0,05 nmol de glicina a 0,5 nmol de glicina/0,1 mL. A reta obtida deve cruzar a origem e possuir coeficiente de correlação (r2) muito próximo de 1. Como exemplo para o cálculo da concentração de aminoácidos livres nas amostras, vamos utilizar a equação y = 0,0024x (r2 = 0,9983) obtida pela construção da curva padrão, em que y representa a absorbância e x a concentração de glicina em µmol/mL. Utilizando-se 0,05 g de tecido vegetal para 5,0 mL de água deionizada e alíquota de reação de 0,5 mL (com uma diluição 1:1), foi obtida uma leitura de 0,272. Procedendo-se os cálculos, tem-se x = 0,272/0,0024 = 113,33 nmol de AA/0,1 mL. Como foram utilizados 5 mL para a obter o extrato, então a quantidade total de AA será de 113,33 x 5/0,1, ou seja, 5666,5 nmol de AA para 5 mL do extrato. Ajustando-se para a quantidade de massa seca utilizada (50 mg), teremos 5,666 µmol de AA/50 mg MS ou 5,666 x 20 = 113,33 µmol de AA/g MS. Fazendo a correção pelo fator diluição (2x) o resultado final será de 226,66 µmol de AA/g MS.

3.5. Determinação da concentração de proteínas solúveis

a) Características gerais

Historicamente, as proteínas vegetais são classificadas com base em sua solubilidade em vários solventes. Existem as albuminas, solúveis em água e em solução salina; globulinas, insolúveis em água, mas solúveis em soluções salinas; glutelinas, insolúveis em água e em soluções salinas, mas solúveis em ácidos e bases diluídas; e as prolaminas, insolúveis em água, solução salina ou ácida diluída e solúvel em etanol 70% a 80%. As proteínas também podem ser classificadas em solúveis e proteínas insolúveis, dependo de sua localização celular. As primeiras estão presentes no citosol e matrizes organelares e são extraídas após ruptura das membranas e separadas por centrifugação. Nessa fração localizam-se a maioria das enzimas. A fração insolúvel compreende as proteínas ligadas às membranas, de extração e separação mais difícil.

b) Princípio do método

O método desenvolvido por Bradford (1976) baseia-se numa reação de adsorção de peptídeos, por meio principalmente dos aminoácidos básicos, no corante coomassie brilliant blue. A forma aniônica do corante fixa preferencialmente os grupamentos catiônicos das proteínas por meio de interações eletrostáticas. A reação produz um complexo de coloração azulada que pode ser mensurada pela absorbância a 595 nm. O complexo proteína-corante possui alto coeficiente de extinção molar, e isso confere grande sensibilidade ao método. Apesar de existirem outros métodos como o de Lowry (1951), o de Bradford se destaca pela sua sensibilidade, simplicidade e rapidez. Entretanto, como os demais, apresenta limitações, tais como interferências, baixa especificidade, diferentes coeficientes de absortividade molar para diferentes proteínas, além de não reagir diretamente somente com as proteínas. A estrutura final do complexo proteína-corante é mostrada na Figura 8.

Figura 8. Complexo proteína-corante formado na reação de Bradford.

c) Marcha analítica para extração e determinação

Na extração de proteínas solúveis para determinação de atividade enzimática, tecido vegetal fresco ou liofilizado deve ser macerado na presença de N2 líquido sob banho de gelo (0 °C a 4 °C) seguido da adição de uma solução tampão, por exemplo, fosfato de potássio 100 mM. Após a centrifugação do extrato (20.000 g por 15 minutos), deve-se recolher 0,1 mL do sobrenadante e adicionar 2,5 mL do reagente de Bradford (o produto colorido formado permanece estável por cerca de 1 hora). Após a adição do reagente, aguardar 15 minutos (necessário para a reação se estabilizar), realizar a leitura em espectrofotômetro a 595 nm. Para a construção da curva padrão, recomenda-se a utilização de uma solução de albumina sérica bovina (BSA) que varie de 10 μg de proteína/mL a 100 μg de proteína/mL. Após a obtenção das leituras referentes às soluções padrão é necessário calcular a curva padrão que deve cruzar a origem e possuir coeficiente de correlação (r2) muito próximo de 1. Como observação, deve-se atentar para que as leituras de absorbância não ultrapassem a faixa de 0,4, visto que até este ponto de absorbância o método é mais linear. Portanto, antes de iniciar a reação nas amostras, fazer um teste de diluição.

O reagente de Bradford pode ser preparado da seguinte forma: pesar 0,11 g de Coomassie Brilliant Blue 90% ou 0,154 g de Coomassie 65% e dissolver em 50 mL de etanol 95%, mantendo sob agitação constante por 1 hora. Após a dissolução, adicionar 100 mL de H3PO4 concentrado (85%), completar o volume para 1 L com água deionizada e realizar duas filtrações consecutivas em papel de filtro qualitativo. É de extrema importância que o reagente de Bradford apresente cor castanha e seja guardado em frasco escuro, protegido com papel alumínio, à temperatura ambiente.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados

Como exemplo para o cálculo da concentração de proteínas nas amostras, vamos utilizar a equação y = 0,0164x (r2 = 0,9944) obtida pela construção da curva padrão, em que y representa a absorbância e x a concentração de proteína em µmol/mL. Utilizando-se 0,5 g de tecido vegetal fresco para 1,5 mL de tampão de extração e alíquota de reação de 0,1 mL (diluída 40x) foi obtida uma leitura de 0,124. Procedendo-se os cálculos, tem-se x = 0,124/0,0164 = 7,56 µg de proteína/0,1 mL ou 75,6 µg de proteína/mL. Como foram utilizados 1,5 mL de tampão para obter o extrato, então a quantidade total de proteína será de 75,6 x 1,5/1, ou seja, 113,41 µg de proteína/1,5 mL do extrato. Ajustando-se para a quantidade de massa seca utilizada (0,5 g), teremos 113,41 µg de proteína/500 mg de massa fresca ou seca (liofilizada) ou 0,2268 µg de proteína/mg de MF ou MS. Nota-se que, no cálculo, o fator de diluição (40) ainda não foi inserido, então a concentração de proteína será de 0,2268 x 40 resultando em 9,073 mg de proteína/g de MF.

4. Considerações finais

A metodologia para determinação de atividades enzimáticas e concentrações de metabólitos em tecidos vegetais representa um passo fundamental para o sucesso de uma pesquisa e/ou controle de qualidade de produtos biotecnológicos. Existe uma dificuldade natural na qualidade daquelas mensurações imposta pela própria complexidade da estrutura dos vegetais. Dessa maneira, a maioria dos resultados obtidos reflete mais uma estimativa feita in vitro em relação aos dados reais na situação in situ. Em virtude disso, a interpretação dos resultados não é simples. Portanto, é necessário ter a clareza dessa limitação e incentivar o aperfeiçoamento e surgimento de novos métodos analíticos químicos e bioquímicos. Essa é uma área da pesquisa que requer mais progresso como se pode deduzir pela idade de muitos dos métodos clássicos ainda em pleno uso. Como essa área envolve, muitas vezes, aspectos essencialmente empíricos, é essencial que cada laboratório busque adaptar e otimizar seus métodos antes de usá-los como uma receita pronta. Especificamente no caso da assimilação do N inorgânico, apesar da imensa quantidade de pesquisa realizada, muito ainda precisa ser feito para possibilitar uma melhor compreensão dos mecanismos a fim de possibilitar utilização biotecnológica desse processo para o desenvolvimento de produtos de maior valor agregado.

5. Referências

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Capítulo 3
Enzimas hidrolíticas extracelulares em microrganismos

Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva
Eidy Simões de Souza
Maria do Carmo Silva Barreto
José de Paula Oliveira

1. Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos que permitem as reações metabólicas de organismos vivos realizadas de forma eficiente em condições compatíveis com a atividade celular, sendo capazes de aumentar algumas reações, sem requerer condições extremas de pH, pressão e temperatura. Além de formarem a base do sistema metabólico dos organismos vivos, essas proteínas proporcionam enormes oportunidades às indústrias por efetuarem conversões biocatalíticas finas, eficientes e mais econômicas (GODFREY; WEST, 1996).

Apesar de as enzimas ocorrerem amplamente em plantas e animais, as de origem microbiana representam as melhores fontes em razão de sua ampla diversidade bioquímica e susceptibilidade à manipulação genética (ALTAMIRANO et al., 2000). Também possuem muitas vantagens sobre as equivalentes de origem animal ou vegetal, como o menor custo de produção, a possibilidade de produção em larga escala em fermentadores industriais, além de oferecer um amplo espectro de características físico-químicas (MANFIO, 2003). Apesar disso, enzimas com o mesmo perfil de atuação sobre o substrato podem apresentar funcionamento ótimo em pH, temperatura e concentração iônica diferentes, o que requer a triagem de enzimas adequadas às condições nas quais serão utilizadas. Portanto, a identificação de novas fontes microbianas, principalmente não tóxicas ao organismo humano, é de grande interesse estratégico, pois além de garantir o suprimento de enzimas aos mais variados processos industriais, tornam possível o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos que não podem ser obtidos de plantas ou animais (ALVES et al., 2002).

Atualmente, as enzimas hidrolíticas são as mais utilizadas nos processos industriais, sendo aplicadas na degradação de várias substâncias naturais. De forma geral, elas são usadas em grande escala nas indústrias têxteis (amilase, celulase, pectinase, oxidorredutase), de detergentes (celulase, lipase, protease, oxidorredutase), alimentícia (celulase, lactase, lipase, pectinase, protease, oxidorredutase), de papel (lipase, oxidorredutase, xilanase) e de couro (lipase, protease) (KIRK et al., 2002; NIELSEN; OXEMBOLL, 1998; VANBEILEN, 2002;). Uma propriedade singular das enzimas hidrolíticas é a sua grande especificidade pelo substrato, hidrolisando um substrato específico.

Em virtude da sua vasta aplicação nesses setores industriais, assim como no campo farmacêutico (RAO et al., 1998), as proteases formam o grupo mais estudado das hidrolases. Por outro lado, as amilases e celulases, comumente utilizadas nas indústrias de amido, têxtil e detergente, representam o segundo maior grupo de enzimas (GODFREY; WEST, 1996). Segundo Hartzell e Hsieh (1998) e Tzanov et al. (2001), as celulases, lipases, pectinases e proteases podem ser utilizadas eficientemente nos processos de limpeza de fibras de algodão.

As enzimas microbianas extracelulares podem ser produzidas em meio líquido ou sólido. O uso de meio sólido, ao contrário do meio líquido, permite a triagem de uma grande quantidade de microrganismos (SANOMIYA; NAHAS, 2003), além de possibilitar uma rápida detecção de enzimas específicas (STAMFORD et al., 1998; STRAUSS et al., 2001). Os suportes mais utilizados são a própria fonte de carbono de alto peso molecular, tais como celulose, amido, pectina e hemicelulose, entre outros.

2. Pectinases (E.C. 3.2.1.15)

As pectinases são responsáveis pela degradação das substâncias pécticas para fins nutricionais e são produzidas principalmente por fungos filamentosos, leveduras, bactérias e plantas superiores, não sendo sintetizadas por células animais, exceto por alguns insetos (PARDO et al., 1991). Essas enzimas têm muitas aplicações industriais, especialmente na área de alimentos, em operações como extração, clarificação e remoção de pectina de sucos de frutas e vinhos, maceração de vegetais e frutas e extração de óleos vegetais (KASHYAP et al., 2001; KAUR et al., 2004). Podem ainda ser encontradas em aplicações na indústria de papel e têxtil, bem como na produção de produtos unicelulares, que tem o intuito de preservar a integridade de células de plantas, por hidrolise seletiva de polissacarídeos presentes na lamela média (KASHYAP et al., 2001).

A síntese dessas enzimas sofre influência dos componentes do meio de cultura, particularmente da fonte de carbono, presença de indutores (pectina e derivados) (GUMMADI; PANDA, 2003) e das condições de cultivo, como pH, temperatura, aeração, agitação e tempo de incubação e escolha de linhagens apropriadas (SOUZA et al., 2003). Com relação às técnicas de fermentação, a fermentação em estado sólido geralmente é preferida por permitir a produção de enzimas brutas mais concentradas e, consequentemente, com menores custos de extração e purificação (GREGORIO et al., 2002).

2.1. Atividade pectinolítica

Na determinação da atividade pectinolítica é utilizado o meio M9, tendo a pectina como fonte de carbono, segundo Miller (1974).

Meio M9 (MILLER, 1974): Sacarose 2,0 g/L; Na2HPO4 6,0 g/L; KH2PO4 3,0 g/L; NaCl 0,5 g/L; NH4Cl 1,0 g/L; Ágar 15 g/L; completar com água destilada para 1.000 mL. Complementar com 1,2 g de extrato de levedura e 4 g de pectina por litro. Adicionar 10 mL da solução de CaCl2 0,01 M e 1 mL da solução de MgSO4.7H2O 1 M, autoclavados separadamente.

Procedimentos

– Transferir os microrganismos para placas contendo o meio M9 com pectina.

– Após 2 a 4 dias de incubação a 28 °C–30 °C, retirar as colônias com Swab e adicionar a solução de HCl 2 N até cobrir completamente o meio.

– Após a reação ácida, são consideradas produtoras de pectinase as colônias que formam halo claro.

– Como esse método é destrutivo, recomenda-se fazer a transferência simultânea para duas placas (‘replica plate’), em que uma delas não recebe o tratamento ácido, servindo assim para recuperar os microrganismos positivos.

2.1.1. Determinação da atividade pectinolítica

Para a determinação da atividade pectinolítica em meio líquido, utiliza-se 1% de pectina cítrica (Sigma) como fonte de carbono.

Meio (Soares et al., 1999): pectina cítrica 10 g/L; (NH4)2SO4 1,4 g/L; K2HPO4 6 g/L; KH2PO4 2 g/L; MgSO4 7H2O 0,1 g/L; completar para 1.000 mL com água destilada. Ajustar o pH para 6,0 com NaOH 1 M.

2.1.1.1. Determinação da atividade da enzima poligalacturonase (PG)

A determinação da atividade de poligalacturonase (endo e exo) é determinada pela reação com ácido 3’, 5’ dinitrosalicílico (DNS), descrito por Miller (1959).

Procedimentos

– Inocular o meio com a suspensão contendo 106 células/mL.

– Incubar em frascos de Erlenmeyers de 125 mL com 25 mL de meio em agitador rotatório a 150 rpm por 30 °C.

– Após 48 horas de crescimento, separar a biomassa por centrifugação a 1.000 g durante 20 minutos.

– O sobrenadante obtido será utilizado para a determinação da atividade pectinolítica.

– Uma mistura de 250 μL de amostra enzimática é incubada com 250 μL da solução de polipectato de sódio 1% dissolvida em tampão acetato de sódio 100 mM, inicialmente em pH 6,0.

– Incubar a 37 °C por 10 minutos e paralisar a reação com a adição de 1 mL de solução de DNS.

– Manter a solução em ebulição por 8 minutos, resfriar em banho de gelo e adicionar 8 mL de solução 50 mM de tartarato duplo de sódio-potássio.

– A absorbância é medida em espectrofotômetro a 540 nm contra o branco que representa o tempo zero da reação, no qual a hidrólise espontânea do substrato é mínima.

Obs.: uma unidade de atividade poligalacturonásica é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 μmol de açúcar redutor, por minuto, nas condições de ensaio, utilizando uma curva padrão obtida a partir do ácido monogalacturônico e a atividade específica como sendo U total/mg de proteína total.

2.1.1.2. Determinação da atividade da enzima polimetilgalacturonato liase (PMGL)

A atividade da pectina liase é determinada segundo método de Ayers et al. (1966), descrito por Pitt (1988), em que é medida a reação entre os produtos insaturados finais da degradação da pectina e o ácido tiobarbitúrico.

Procedimentos

– Misturar 5,0 mL da solução de pectina 1,0% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,5; 1,0 mL da solução de CaCl2 0,01 M; 1,0 mL de solução enzimática e 3,0 mL de água destilada.

– Incubar por 2 horas a 30 ºC, adicionar 0,6 mL de uma solução de ZnSO4 7.H2O 9%, em seguida 0,6 mL de NaOH 0,5 M.

– As proteínas precipitadas do substrato não consumido são removidas por centrifugação a 3.000 g por 10 minutos.

– Ao sobrenadante é adicionado uma mistura de 3,0 mL do ácido tiobarbitúrico 0,04 M; 1,5 mL de HCl 0,1 M e 0,5 mL de água destilada.

– A mistura é fervida em banho-maria por 30 minutos e resfriada em banho de gelo.

– A absorbância é medida a 550 nm contra um branco, que contém os mesmos reagentes da mistura de reação, acrescidos de ZnSO4 e NaOH imediatamente após a adição da enzima.

Obs.: uma unidade da atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que causa a mudança de 0,1 na absorbância a 550 nm, nas condições do ensaio.

3. Celulases (E.C. 3.2.1.4)

Celulase, o componente mais abundante encontrado na natureza, quase que exclusivamente nas paredes das células vegetais, também é produzida por alguns animais como os tunicados e por algumas bactérias (LYND et al., 2002). É um polissacarídeo composto de unidades de β-D-glicopiranosil unidas por ligações β-1,4-glicosídicas (GILKES et al., 1991). Na maioria dos casos, a celulose não está presente num estado puro e sim formando fibras que estão embebidas numa matriz de outros biopolímeros como hemiceluloses e lignina (ROBSON; CHAMBLISS, 1989).

Há uma diferença entre as estratégias de utilização da celulose em organismos aeróbios e anaeróbios. Microrganismos anaeróbios não liberam as enzimas no meio extracelular e sim mantêm um sistema enzimático complexo (celulossoma) em suas paredes, produzindo pequenas quantidades da enzima, e o resultado da degradação são produtos de fermentação como etanol, ácidos orgânicos, CO2 (LYND et al., 2002).

Microrganismos com metabolismo oxidativo produzem grandes quantidades de enzimas que são secretadas para o meio de cultura e podem ser recuperadas nos sobrenadantes, além de terem altas produções, característica do metabolismo aeróbio. É importante notar que a maioria das bactérias celulolíticas do solo (Bacillus, Micromonospora, Themobifida) também são produtoras de metabólitos secundários e endósporos, habilidades importantes que conferem vantagens seletivas na natureza (LYND et al., 2002).

3.1. Atividade celulolítica em meio sólido

Para a atividade celulolítica, os microganismos devem ser cultivados em ágar contendo carboximetilcelulose (CMC) como fonte de carbono.

Meio de Cultura (ARIFFIN et al., 2006): KH2PO4 1,0 g/L; MgSO4.7H2O 0,5 g/L; NaCl 0,5 g/L; FeSO4.7H2O 0,01 g/L; MnSO4.H2O 0,01 g/L; NH4NO3 0,3 g/L; CMC 10 g/L; Ágar 12 g/L. O pH deve ser ajustado em 7,0 com NaOH 1 M.

Procedimentos

– As placas contendo o meio são incubadas a 30 °C por 96 horas para permitir a secreção de celulase.

– Ao final da incubação, o ágar é coberto com solução de vermelho do congo (1,4 g/L) em tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 durante 30 minutos.

– A solução de vermelho congo é descartada, e as placas são novamente cobertas com NaCl 0,5M por 30 minutos.

– Em torno da colônia crescida, forma-se um halo descolorido em razão da ausência da celulose original.

– As medições do diâmetro do halo produzido são realizadas com paquímetro em três dimensões distintas, tanto da colônia crescida quanto do halo formado.

Obs.: a atividade enzimática foi determinada segundo Anagnostakis et al. et al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1.

IEA =

diâmetro do halo descolorido (cm)

(1)

diâmetro da colônia (cm)

3.2. Determinações da atividade celulolítica

3.2.1. Atividade da carboximetilcelulose (CMCase)

Para determinar a atividade da CMCase é utilizado o método descrito por Wood e Bhat (1998), com algumas modificações, citado por Ariffin et al. et al. (2006).

Meio de Cultura (ARIFFIN et al., 2006): KH2PO4 1,0 g/L; K2HPO4 1,145 g/L; MgSO4.7H2O 0,4 g/L; (NH4)2SO4 5,0 g/L; CaCl2.2H2O 0,05 g/L; FeSO4.7H2O 0,00125 g/L; CMC 10 g/L. O pH deve ser ajustado em 7,0 com NaOH 1 M.

Procedimentos

– Incubar em frascos de Erlenmeyer de 125 mL com 25 mL do meio em agitador rotatório a 150 rpm por 30 °C.

– Retirar mostras de 5 mL e centrifugar a 3.000 g durante 15 minutos a 4 °C.

– Em seguida adicionar 0,1 mL do sobrenadante (solução enzimática) em 2,0 mL de CMC (10 g/L) em tampão acetato 0,2 M, pH 5,2 e colocar em banho termostático a 45 °C e 60 °C por 10 minutos.

– A reação é finalizada adicionando 3,0 mL de DNS (ácido dinitrosalicílico) e posterior banho fervente por 5 minutos, seguido de banho de gelo.

– Às amostras são adicionados 8,0 mL de tartarato de sódio e potássio 0,05 M.

– Os açúcares redutores liberados são medidos a 540 nm (MILLER, 1959). Também deve ser coletada alíquota de 1 mL no tempo zero da reação para eventuais interferências caso haja açúcar redutor na solução enzimática.

Obs.: uma unidade de atividade de CMC é determinada como a capacidade da enzima em liberar 1 μmol de glicose por minuto a partir da CMC original nas condições do ensaio.

3.2.2. Atividade de celobiase

– Um volume de 0,1 mL da solução enzimática é adicionado em uma mistura de 0,1 mL de solução de celobiose 20 mM em tampão acetato 0,2 M, pH 5,2.

– A mistura é colocada em banho termostático a 45 °C por 30 minutos.

– A reação é paralisada depois de 30 minutos de incubação em banho fervente por 5 minutos, seguido de banho de gelo.

– O teor de glicose formado é determinado pelo método da glicose-oxidase (HENRY et al., 1974).

Obs.: uma unidade de atividade de celobiase é definida como a capacidade da enzima em produzir 1 μmol de glicose por minuto a partir da celobiose original nas condições do ensaio.

3.2.3. Atividade de hidrólise em papel de filtro (FPase)

Procedimento Mandels et al. (1976) com algumas alterações

– Pesar 50 mg de papel de filtro Whatman número 1 (fonte de celulose).

– Adicionar a solução a tubos de ensaio contendo 2 mL de tampão acetato 0,2 M e pH 5,5.

– Um volume de 1 mL da solução enzimática é adicionado ao tubo em banho termostático a 45 °C por 1 hora.

– As amostras devem ser incubadas em banho em ebulição por 5 minutos e depois em banho de gelo.

– Os açúcares redutores liberados serão medidos com ácido dinitrosalicílico em leitura espectrofotométrica a 540 nm (MILLER, 1959).

Obs.: uma unidade de atividade de FPase é determinada como a capacidade da enzima em liberar 1 μmol de glicose por minuto a partir do papel de filtro original.

4. Lipase (E.C. 3.1.1.3)

As lipases são glicerol éster hidrolases que catalisam a quebra de triglicerídeos em diglicerídeos, monoglicerídeos, glicerol e ácidos graxos (SOMMER et al., 1997), agindo nas ligações éster carboxil presentes nos acilgliceróis (JAEGER et al., 1994).

A lipase acontece exclusivamente na interface lipídeo-água, e a concentração de substrato é que determina a taxa de quebra (JAEGER; REETZ, 1998). As lipases de origem microbiana são as mais versáteis e conseguem fazer um grande número de reações, como hidrólise, esterificação, alcoólise (HAKI; RAKSHIT, 2003).

Dentre as bactérias produtoras de lipases, comercialmente estão disponíveis as enzimas de Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Bulkholderia (anteriormente Pseudomonas) cepacia para a aplicação em síntese quiral, e as lipases de Burkholderia sp. e Arthrobacter sp. utilizadas na determinação diagnóstica de triacilgliceróis. O rápido crescimento celular, em relação aos fungos, é uma das vantagens das fontes bacterianas como produtoras dessas enzimas (JAEGER et al., 1999).

4.1. Produção de lipases

O método de Rodamina B (HABA et al., 2000) evidencia microrganismos lipolíticos em razão da presença da enzima extracelular lipase.

Meio Luria Bertani (LB): cloreto de sódio 10,0 g/L; extrato de levedura 5,0 g/L e triptona bacteriologica 10,0 g/L. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 1 M.

Procedimentos

– Dissolver os componentes do meio em água destilada e autoclavar, resfriar a 60 °C e adicionar 25 mL/L de óleo de oliva estéril e 10 mL/L de solução de Rodamina B (Synth) 0,001%.

– Os microrganismos são inoculados em placas de Petri a 30 °C por 24 a 48 horas.

– Após este período, as colônias são submetidas à luz U.V. (300 nm), e as que apresentarem um halo de coloração laranja-fluorescente formado ao redor das colônias serão identificadas como microrganismos lipolíticos, evidenciando a produção de lipase extracelular que degrada lipídeo.

Obs.: a atividade enzimática é determinada segundo Anagnostakis et al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1 (item 3.1).

4.2. Produção do extrato lipolítico bruto (BARON, 2008)

Composição do meio: KNO3 3,54 g/L; K2HPO4 1,0 g/L; MgSO4. 7H2O 0,5 g/L; NaCl 0,38 g/L; FeSO4. 7H2O 0,01 g/L; extrato de levedura 5 g/L e 10 mL de óleo de oliva comercial.

1. Solução A: palmitato de p-nitrofenila (Sigma) em isopropanol, em uma concentração de 3 mg/mL.

2. Solução B: 2 g de Triton X-100 e 0,5 g de goma arábica, em 450 mL de tampão fosfato 0,05 mol/L pH 7,0.

Procedimentos

– O pré-inóculo é preparado em Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL do meio LB (item 4.1), em agitador orbital com agitação de 150 rpm a 30 °C até as células atingirem a concentração de 108 células/mL.

– Após esse período, 1 mL do pré-inóculo (108 células/mL) é inoculado em Erlenmeyers de 500 mL contendo 150 mL de meio.

– Incubar os cultivos em agitador orbital com agitação de 150 rpm a 30 °C por 72 horas.

– Centrifugar as células a 8.500 g por 20 minutos a 4 °C.

– Adicionar ao sobrenadante (em banho de gelo) sulfato de amônio até 80% de saturação, com agitação branda.

– Manter o extrato a 4 °C por 12 horas, com agitação branda, depois centrifugar a 8.500 g por 10 minutos.

– O sobrenadante é removido, e o precipitado ressuspendido em um volume mínimo de tampão fosfato 0,05 M, pH 7,0.

– Essa suspensão é dializada contra esse mesmo tampão a 4 °C, com 2 trocas.

– A fração dialisada é liofilizada e delipidada pela extração líquido-líquido e extração sólido-líquido.

– O extrato lipolítico bruto é liofilizado e tratado com isopropanol 30% (v/v).

4.3. Determinação da atividade lipolítica em meio aquoso

a) Método da hidrólise do pNPP

Este método espectrofotométrico foi inicialmente descrito por Winkler e Stukmann (1979), sendo modificado conforme Krieger (1995).

Procedimentos

– Em 1 mL da solução A, misturar 10 mL da solução B, lentamente e sob contínua agitação.

– A mistura é feita imediatamente antes da determinação da atividade, pois o substrato é instável quando em meio aquoso.

– Desta solução é colocado 0,9 mL em cubeta. Estabilizada a temperatura a 37 °C, é adicionada a solução de enzima (0,1 mL) ou de tampão, quando se prepara o branco.

– A reação é feita em cubeta de 1,0 mL, e faz-se a leitura sempre contra um branco contendo o substrato e o tampão sem a enzima, a 37 °C e pH 8,0.

– Medir a absorbância a 410 nm.

Obs.: uma unidade de atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto a 37 °C, nas condições de ensaio.

b) Método titulométrico

A determinação da atividade de lipases por titulometria é baseada no método titulométrico, realizado de acordo com o método empregado por Watanabe et al. (1977).

Procedimentos

– A reação enzimática é realizada em frascos Erlenmeyer de 125 mL de capacidade, em banho-maria a 30 °C, sob agitação (150 ciclos/min) durante 10 minutos.

– A mistura da reação: emulsão de óleo de oliva (25%, v/v) em solução de álcool polivinílico a 2% p/v (5,0 mL); solução-tampão Tris-HCl 0,02M pH 8,0 (4,0 mL-1) ou solução-tampão fosfato pH 6,0 (4,0 mL-1); preparação enzimática (1,0 mL-1).

– A reação é paralisada pela adição de 20 mL de solução acetona/álcool etílico (1:1).

– Em paralelo fazer como controle (branco) a enzima inativada, ou seja, a preparação enzimática deverá ser colocada em banho-maria fervente durante 10 minutos.

– Em seguida, adicionar 5 gotas de solução indicadora de timolftaleína a 0,2%.

– Após homogeneização da mistura em reação, fazer a titulação dos ácidos graxos liberados com uma solução padronizada de hidróxido de sódio 0,05 M, até o ponto de viragem, caracterizada pelo aparecimento da coloração azul clara, sendo registrado o volume de hidróxido de sódio gasto em cada titulação.

Obs.: uma unidade de atividade lipásica é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido graxo por minuto nas condições de ensaio.

A atividade (em U/mL) é calculada multiplicando-se a diferença de volumes gastos (mL) (reação e controle) de solução de hidróxido de sódio pelo fator de diluição, dividido pelo tempo de incubação. O resultado é multiplicado por 50 (fator aplicado para expressar o resultado em micro moles de ácido graxo por mL da amostra).

5. Protease (E.C. 3.4)

Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas. São enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptídeo-hidrolases ou peptidases. Estas enzimas constituem uma grande família (EC 3.4), dividida em endopeptidases ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica. As endopeptidases podem ser ainda subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22), aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de ação não está completamente elucidado são classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.

As proteases microbianas têm sido extensivamente estudadas, havendo necessidade de descobrir novas proteases com diferentes características para atender o crescimento rápido das indústrias baseadas na tecnologia da produção de enzimas, bem como a otimização dos métodos empregados para a sua purificação (RAZAK et al., 1994).

5.1. Atividade proteolítica

A habilidade dos microrganismos em hidrolisar proteínas é testada em meio contendo caseína como única fonte de carbono.

Procedimentos

– Crescer os microrganismos em meio com caseína 1%.

– Para melhor visualização do halo de proteólise, incubar as placas por 72 a 96 horas a 30 ºC.

– As colônias nas placas são reveladas usando solução de ácido acético a 5%.

– Uma região transparente ao redor da colônia em contraste com a superfície opaca do meio na placa indica atividade proteolítica.

A atividade enzimática foi determinada segundo Anagnostakis et al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1 (item 3.1).

5.2. Determinação da atividade proteolítica

O método para determinação da atividade proteolítica de enzimas que utiliza a azocaseína foi inicialmente desenvolvido por Charney e Tomarelli (1947).

Procedimentos

– Crescer o microrganismo em meio de cultura (consulte o meio adequado ao microrganismo estudado) até a fase exponencial.

– Após o tempo de crescimento que pode variar, dependendo do microrganismo testado, fazer a densidade ótica a 560 nm.

– Centrifugar as células a 15.500 g por 15 minutos a 4 °C, o sobrenadante livre de células é utilizado para dosagem da atividade da enzima.

– Preparar uma solução de azocaseína 0,2% (p.v -1) em tampão Tris/HCl (pH 8,5) e manter sob refrigeração por um período máximo de três semanas.

– Adicionar alíquota de 100 μL de azocaseína 0,2% e adicionar 200 μL de solução tampão fosfato 0,2 mM pH 8,0. Após 2 minutos de homogeneização na temperatura de 50 °C em banho de água, adicionar 100 μL de amostra.

– O ensaio é conduzido com um período de incubação de 15 minutos. A reação é finalizada com a adição de 800 μL de solução de ácido tricloroacético (TCA) 20% (MITIDIERI et al., 2002).

– Para cada ponto de amostragem preparar um branco mediante a adição de 100 μL de azocaseína, 200 μL de solução tampão fosfato e de 800 μL de solução TCA (20%).

– Por último, adicionar 100 μL de amostra e incubar por 15 minutos.

– Centrifugar as amostras a 15.000 g durante 15 minutos, realizando-se imediatamente a leitura de absorbância do sobrenadante a 400 nm.

– Para a leitura, é utilizada cubeta de acrílico de 1 mL com caminho ótico de 10 mm.

Obs.: uma unidade de atividade proteásica é definida como sendo a quantidade de enzima requerida para produzir um aumento de 0,01 unidades na absorvância a 400 nm por hora de incubação, sendo expressa em U/mL. A atividade proteásica específica é calculada pela razão entre a atividade proteásica total e a quantidade de proteínas contidas em 1 mL da amostra (U/mg).

6. Quitinase (E.C. 3.2.1.14)

Quitinases, enzimas que catalisam a conversão de quitina (homopolímero linear insolúvel, formado por ligações do tipo β-l,4 de monômeros de 2-acetoamino-2-desoxi-D-glicopiranose N-acetilglicosamina – NAcGlc ou NAG) a componente monomérico amplamente distribuído na natureza (GOODAY, 1999).

Elas são produzidas por uma grande variedade de organismos que degradam quitina, incluindo bactérias, fungos, insetos, plantas e animais (GOODAY, 1990). Entre as bactérias, os gêneros Streptomyces, Bacillus, Vibrio possuem as maiores atividades quitinolíticas (TRACHUK et al., 1996). A produção de quitinases é normalmente regulada pela presença do substrato, pois sua síntese é reprimida quando a bactéria cresce em um meio rico e só induzida quando cresce em meio mínimo suplementado com quitina como única fonte de carbono (FOLDERS et al., 2001).

As aplicações biotecnológicas de enzimas constituem um vasto campo de possibilidades nas mais diversas áreas, como agricultura e o setor industrial. Nos últimos anos, várias quitinases derivadas de diversos microrganismos foram isoladas, clonadas e expressas na forma recombinante.

6.1. Determinação da atividade de quitinase

A atividade de quitinase é determinada conforme a metodologia descrita por Rèissig et al. (1955) e Sandhu et al. (1989) utilizando quitina coloidal como substrato (FLEURI, 2003).

Procedimentos

– Crescer o microrganismo em meio de cultura (consulte o meio adequado ao microrganismo estudado), até a fase exponencial.

– Após o tempo de crescimento que pode variar, dependendo do microrganismo testado, fazer a densidade ótica a 560 nm.

– Centrifugar as células a 13.000 g, a 4 °C , por 10 minutos.

– O sobrenadante é utilizado como fonte de enzima para determinação das características de atividade das quitinases.

– Preparar 20 g de quitina da carapaça de caranguejo em pó (Practical Grade, Sigma) dissolvida em 200 mL HCl concentrado, precipitada como quitina coloidal em água gelada e enxaguada por filtração até pH 5,5 (KANG et al., 1999).

– Alíquotas de 0,5 mL do sobrenadante é incubado com 1 mL de quitina coloidal preparada a 1% em de tampão acetato 100 mM pH 5,0 a 50 °C.

– Incubar com agitação 37 °C por 24 horas.

– A quitina residual é separada por centrifugação a 2.000 g por 15 minutos.

– Alíquotas de 250 µL do sobrenadante são incubadas com 50 µL de tetraborato de sódio 0,8 M pH 9,1.

– Ferver por 3 minutos e interromper a reação em gelo por 1 minuto.

– Adicionar 1,5 mL de DMAB (ρ-dimetilbenzaldeído 1,0% p/v / HCl 1,25% v/v em ácido acético glacial).

– Incubar em banho-maria a 37 °C por 15 minutos.

– O produto formado a partir da reação é determinado pela medida da absorbância a 585 nm.

Obs.: uma unidade de atividade enzimática é definida como μg de N-acetilglicosamina liberado por mL da solução da enzima nas condições da reação.

6.2. Ensaio da atividade de quitinolítica

A atividade enzimática de quitinase é determinada pela quantificação de N-acetil glicosamina (NAcGlc) formada a partir da degradação dos substratos sintéticos N,N’-diacetilquitobiose (dímero), N,N’,N’’- triacetilquitotriose (trímero) e N,N’,N’’,N’’’-tetraquitotetrose (tetrâmero) segundo modificações do método descrito por Reissig et al. (1955).

Procedimentos

– Adicionar 40 µL de tampão acetato 200 mM pH 5,5/10 µL de substrato 4 mM dissolvido em água Milli-Q (N,N'-diacetilquitobiose N,N’,N’’-triacetilquitotriose ou N,N’,N’’,N’’’-tetraquitotetrose) e 120 µL do sobrenadante.

– Incubar a 37 °C por 1 hora.

– Adicionar 30 µL de tetraborato de sódio 0,8 M pH 9,1.

– Ferver a mistura por 3 minutos e resfriar em gelo.

– Adicionar 1 mL de DMAB (ρ-dimetilbenzaldeído 1,0% p/v/ HCl 1,25% v/v em ácido acético glacial).

– Incubar a mistura a 37 °C por 10 minutos para o desenvolvimento e estabilização da coloração.

– O produto formado a partir da reação é determinado pela medida da absorbância a 585 nm.

Obs.: uma unidade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1 µmol de NAcGlc por min/mL a 37 °C.

6.3. Zonas de hidrólise em substrato

Para se verificar a hidrólise enzimática em substrato, a degradação de quitina produz um halo claro que é visualizado sob ultravioleta, e o diâmetro das zonas de hidrólise é medido.

Procedimentos

– Preparar as placas de gel de difusão com 1,6% de agarose em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, adicionar 0,5% da solução de glicol quitina a 10% (TRUDEL; ASSELIN, 1989) após temperatura de 50 °C a 60 °C.

– Depois de solidificada a solução, fazer poços (2 mm) e, em cada poço, adicionar 10 µL do sobrenadante.

– Como padrão, utilizar marcador de quitinase Serratia marcescens (Sigma).

– Incubar as placas a 30 °C por 16 horas.

– Realizar coloração com calcofluor (Sigma) a 0,1% (p/v) em tampão Tris-HCL 0,5 M pH 8,9) por 10 minutos.

– Lavar as placas várias vezes em água destilada.

– Visualizar os halos de degradação de quitina sob luz ultravioleta (300 nm).

6.4. Gel de atividade quitinásica

A eletroforese é em SDS-PAGE, de acordo com Laemmili (1970), pelo método vertical com placas de 20 cm x 20 cm, com gel de separação a 12% e gel de empilhamento a 4% com glicol quitina 0,01%. Como padrão, utiliza-se marcador de proteína de quitinase Serratia marcescens (Sigma).

Procedimentos

– Adicionar ao sobrenadante da amostra em tampão (Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8, SDS 2,5%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,001%) na proporção (1:1).

– Incubar por 30 minutos a 30 °C.

– A corrida eletroforética será a 100 V e 5 °C.

– Agitar o gel suavemente por 24 horas a 30 °C em tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,5.

– Corar o gel um uma solução recém-preparada de calcofluor White M2R 0,1% em tampão Tris-HCL 0,5 M, pH 8,9 por 10 minutos.

– Descorar em água por 2 horas, a temperatura ambiente.

– Visualizar a atividade quitinolítica sob luz ultravioleta e fotodocumentar.

7. Amilase

Amilases são responsáveis pela degradação da molécula de amido e encontram-se na natureza. O amido é encontrado principalmente em sementes de cereais como milho, cevada, trigo e arroz, e em tubérculos ou raízes como batata e mandioca cujo tamanho e forma dos grãos são específicos para os distintos cereais (MORAES, 2004). O amido possui em sua constituição amilose (25%) e amilopectina (75%). Amilose é um polímero linear constituído de cerca de 6.000 resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas do tipo α-1,4. Amilopectina consiste de pequenas cadeias laterais de 15 a 45 resíduos unidos por ligações do tipo α-1,6 (BULÉON et al., 1998).

Segundo Gupta et al. (2003), as amilases são divididas em dois grupos, as endoamilases e exoamilases.

As endoamilases catalisam hidrólises de forma aleatória no interior da molécula do amido. Essa ação causa a formação de ramos lineares de oligossacarídeos de cadeias de vários comprimentos e dessa forma quebram as ligações glicosídicas α-1,4 presentes na parte interna (endo) das cadeias de amilose ou amilopectina. A α-amilase (E.C. 3.2.1.1) é a endoamilase mais conhecida. As exoamilases hidrolisam exclusivamente ligações glicosídicas α-1, 4, como a β-amilase (E.C. 3.2.1.2) ou ambas as ligações α-1,4 e α-1, 6, como amiloglicosidase (E.C. 3.2.1.3) e glicosidase (E.C. 3.2.1.20). Outros exemplos de exoamilases são a ciclodextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19) e a α-amilase maltogênica (glicano 1,4-α-glicanohidrolase, E.C. 3.2.1.133).

7.1. Determinação da atividade amilolítica

A atividade amilolítica poderá ser determinada por dois métodos diferentes, utilizando amido como substrato. O primeiro, denominado de atividade dextrinizante, baseia-se na variação da intensidade da cor do complexo iodoamido (FUWA, 1954). O segundo, denominado de método sacarificante, baseia-se na produção de açúcares redutores (MILLER, 1959).

7.1.1. Atividade amilolítica dextrinizante

A quantidade de amido consumido é calculada de acordo com uma curva padrão construída com quantidades crescentes de amido solúvel (de 0 mg/mL a 0,5 mg/mL).

Procedimentos

- Adicionar 80 μL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5, em 20 μL de amostra enzimática e 100 μL de solução de amido (0,5%).

– Incubar a mistura a 50 ºC por 20 minutos.

– Interromper a reação com a adição de 200 μL de ácido acético 1,0 M e 200 μL da solução de iodo/iodeto (1% iodo em etanol absoluto, 10% iodeto de potássio e água destilada na proporção de 1v:1v:3v). O volume é completado para 10 mL com água destilada.

– Homogeneizar e ler a absorbância determinada a 660 nm.

Obs.: uma unidade (U) de atividade amilolítica dextrinizante é definida como sendo a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 0,1 mg de amido por minuto de reação (FUWA, 1954).

7.1.2. Atividade amilolítica sacarificante

A quantidade de açúcares redutores formados é calculada de acordo com uma curva padrão de glicose (MILLER, 1959).

Procedimentos

– Adicionar 80 μL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5, em 20 μL de amostra enzimática e 100 μL de solução de amido (0,5%).

– Incubar a mistura a 50 ºC por aproximadamente 12 horas.

– Após este tempo, 100 μL da mistura de reação são coletados e adicionados em tubo de ensaio contendo 1,0 mL do reagente ácido dinitrosalicilico (10 g/L ácido dinitrosalicilico (DNS), 100 mL de NaOH 2 mM, 300 g/L de tartarato de sódio e potássio).

– A mistura é fervida por 5 minutos em banho-maria a 96 ºC.

– Homegeneizar e ler a absorbância determinada a 550 nm.

Obs.: uma unidade (U) de atividade sacarificante é definida como a quantidade de enzima que libera 0,1 mg de açúcar redutor por minuto de reação.

7.1.3. Determinação da atividade amilolítica em gel de poliacrilamida

Para determinação de atividade em gel de poliacrilamida (12%), as condições de corrida do gel são as mesmas descritas para a técnica de eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), conforme Laemmli (1970), exceto para o tampão de amostra que não contém o β-mercaptoetanol e a corrida é realizada a 4 ºC.

Procedimentos

– Concentrar as amostras por liofilização.

– As amostras concentradas são ressuspensas em tampão de amostra 1X (50 μL de tampão Tris-HCl 0,5 mM pH 6,8, 1,0 μL β – mercaptoetanol, 100 μL SDS 10%, 100 μL glicerol, 0,005 mg de azul de bromofenol e água destilada suficiente para 1,0 mL).

– Ferver as amostras por 5 minutos e aplicar no gel.

– A corrida é realizada utilizando-se uma voltagem inicial de 80 V, posteriormente aumentar para 100 V.

– Utilizar marcador para a determinação da massa molecular das proteínas.

– Após a corrida, o gel é incubado com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 por 1 hora.

– Em seguida, transferir o gel para um recipiente contendo uma solução de amido (0,5%).

– Incubar por 12 horas a 4 ºC.

– Após esse período, o gel é incubado por 2 horas a temperatura de 37 ºC e coberto com uma solução de iodo-iodeto para visualização das bandas de degradação do amido (LACKS; SPRINGHORN, 1980).

8. Considerações finais

As enzimas têm sido utilizadas pelo ser humano a milhares de anos de duas formas: direta, pelo emprego de extratos enzimáticos brutos de origem animal ou vegetal, e indiretamente, pelo aproveitamento da ação enzimática decorrente do crescimento microbiano sobre determinados substratos. A produção e o uso de enzimas de origem microbiana, sob uma forma controlada, têm tido um maior enfoque na indústria biotecnológica (JAEGER; EGGERT, 2002; NEIDLEMAN, 1991).

Aproximadamente 80% das enzimas produzidas por fermentação, em escala industrial, são hidrolíticas, e quase todas são extracelulares (ARBIGE; PITCHER, 1989). Dentre as indústrias que utilizam enzimas em larga escala incluem-se as de alimentos (laticínios, processamento de amido, cervejarias e padarias), de detergentes, de couro e têxteis (NIELSEN; BORCHERT, 2000; KIRK et al., 2002; NIELSEN et al., 2003).

O mercado mundial de enzimas é responsável por mais de 5 bilhões de dólares, sendo 2 bilhões de dólares pertencentes ao mercado de enzimas industriais (enzimas para a indústria de alimentos e enzimas para ração animal) e 3 bilhões de dólares ao de enzimas especiais (enzimas terapêuticas, enzimas para diagnósticos e enzimas para química quiral) (BON, 2006).

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Capítulo 4
Avaliação da atividade enzimática em amostras de solo

Wanderley José de Melo
Gabriel Maurício Peruca de Melo
Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Valéria Peruca de Melo

1. Introdução

O solo é um dos sistemas mais complexos do planeta e está constantemente recebendo e perdendo constituintes os mais variados possíveis.

Em um sistema natural em equilíbrio, as plantas estão continuamente retirando água e nutrientes do solo e, por meio da energia solar, do gás carbônico presente na atmosfera e das vias metabólicas C3 e C4, sintetizam substâncias orgânicas diversas, que são incorporadas ao solo pela queda de folhas, de galhos e de exudatos radiculares. A água da chuva, escorrendo pelas folhas, caules e troncos, leva ao solo substâncias particuladas em suspensão na atmosfera ou depositadas na superfície das folhas. E esse conjunto de substâncias que chega ao solo permite o desenvolvimento de uma gama de macro, meso e microrganismos, que ao usarem as fontes de C e de energia promovem a ciclagem dos elementos. É isso que permite a ocorrência da exuberante Floresta Amazônica sobre um solo pobre e ácido.

Os microrganismos que habitam o solo estão em constante disputa por água, nutrientes, fontes de carbono e de energia. Para sobreviverem, produzem e excretam substâncias como antibióticos e enzimas. Os antibióticos garantem a disputa pelo espaço, enquanto as enzimas catalisam a hidrólise de macromoléculas para sua absorção.

O homem, por meio de suas atividades, também leva ao solo substâncias que podem melhorar suas propriedades físicas, químicas e biológicas (impacto positivo) ou causar poluição e contaminação (impacto negativo), como metais pesados e produtos orgânicos tóxicos e muitas vezes de difícil degradação.

Para avaliar o nível de qualidade de um solo, tem-se buscado índices de qualidade que possam refletir alterações em função das atividades antrópicas. Entre os atributos utilizados está a atividade enzimática, que é rapidamente alterada em resposta a variações nas propriedades do solo.

Neste capítulo, far-se-á uma abordagem bastante prática sobre as metodologias para avaliação da atividade das enzimas mais frequentemente usadas como atributo de qualidade do solo.

2. Celulase (EC 3.2.1.4 β-glucan-4-glucanoidrolase)

2.1. Comentários

A celulose é um homopolissacarídeo formado por n moléculas de glicose em ligação glicosídica β 1,4. Pelo fato de ser uma molécula muito grande, possui poucas extremidades redutoras, sendo considerada como um carboidrato não redutor, ou seja, não é capaz de reduzir o cobre do licor de Fehling.

A celulase é uma enzima que catalisa a hidrólise da celulose em unidades de celobiose, que é um dissacarídeo formado por unidades de glicose em ligação glicosídica β 1,4. A celobiose é posteriormente hidrolisada pela β-glicosidase, de tal modo que a hidrólise total da celulose resulta em muitas moléculas de glicose. Tanto a glicose como a celobiose são capazes de reduzir o cobre do licor de Fehling, formando um precipitado de cor vermelho-tijolo, que é o óxido cuproso.

O princípio do método para estimar a atividade de celulase no solo é o da incubação da amostra de solo com o substrato da enzima (a celulose ou um substrato derivado, como a carboximetilcelulose), avaliando-se, então, a quantidade de açúcares redutores produzidos, expressos na forma de glicose (PANCHOLY; RICE, 1973).

2.2. Reagentes

Solução padrão de glicose a 50 mg/L: pesar 2,00 g de glicose previamente seca a 70 oC e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar cerca de 150 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 200 mL e completar o volume com a água desionizada. Pipetar 1 mL desta solução para balão volumétrico de 200 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de carboximetilcelulose (CMC) a 1%: pesar 1 g de carboximetilcelulose, colocar em béquer de 250 mL e adicionar cerca de 80 mL de água desionizada. Aquecer em bico de bunsen até dissolução. Deixar atingir temperatura ambiente, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

Tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH 5,5: pesar 73,1733 g de fosfato bibásico de sódio anidro (Na2HPO4) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada. Pipetar 28,90 mL de ácido acético para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada. Misturar as duas soluções em partes iguais no momento de usar.

O reagente de cobre é constituído de três soluções, aqui denominadas A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.

Solução A: pesar 50,00 g de carbonato de sódio anidro e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar 60 mL de solução de NaOH 1 mol/L e 700 mL de água desionizada. Dissolver, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução B: pesar 0,50 g de sulfato de cobre pentaidratado e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução C: pesar 1,00 g de tartarato duplo de sódio e potássio e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

Reagente de cobre: misturar, no momento de usar, 500 mL da solução A, 10 mL da solução B e 10 mL da solução C.

Solução de ácido fosfomolíbdio: em béquer de 1.000 mL, colocar 35,00 g de ácido molíbdico, 5,00 g de tungstato de sódio, 200 mL de solução de hidróxido de sódio 10% e 200 mL de água desionizada. Ferver por 20 a 40 minutos até remoção de toda amônia. Deixar atingir temperatura ambiente e adicionar água desionizada até volume de aproximadamente 350 mL. Adicionar 125 mL de ácido fosfórico 85%. Deixar atingir temperatura ambiente, transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada. Essa solução deve ser armazenada em frasco escuro.

2.3. Curva de calibração

Em 7 tubos de ensaio colocar, respectivamente, 0, 0,2 mL, 0,4 mL, 0,8 mL, 1,2 mL, 1,6 mL e 2,0 mL da solução padrão de glicose e completar o volume a 2,0 mL com água desionizada.

Adicionar a cada tubo 1 mL do reagente de cobre.

Vedar a boca do tubo de ensaio com papel laminado e colocar em banho-maria em ebulição por 20 minutos.

Deixar atingir temperatura ambiente e adicionar 2 mL da solução de ácido fosfomolíbdico.

Agitar intermitentemente até que cesse a efervescência.

Adicionar 2 mL de água desionizada, agitar, deixar em repouso por 15 minutos e realizar a leitura da absorbância em comprimento de onda de 420 nm.

Repetir este protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a curva de calibração com três repetições.

Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a obter a equação relacionando absorbância (eixo Y) com a concentração de glicose em mg/L (eixo X).

2.4. Marcha analítica

Pesar 10,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, colocar em frasco Erlenmeyer de 125 mL e adicionar 1 mL de toluol.

Agitar e deixar 15 minutos em repouso.

Adicionar 10 mL da solução de CMC a 1%, 10 mL da solução tampão acetato-fosfato e agitar.

Colocar para incubação a 30 oC por 24 horas.

Adicionar 30 mL de água desionizada, agitar e centrifugar por 10 minutos a 5.000 rpm.

Pipetar 2 mL do sobrenadante para tubo de ensaio e adicionar 1 mL do reagente de cobre.

Vedar a boca do tubo de ensaio com papel laminado e colocar em banho-maria em ebulição por 20 minutos.

Deixar atingir temperatura ambiente e adicionar 2 mL da solução de ácido fosfomolíbdico.

Agitar intermitentemente até que cesse a efervescência.

Adicionar 2 mL de água desionizada, agitar, deixar em repouso por 15 minutos e realizar a leitura da absorbância em comprimento de onda de 420 nm.

Fazer um branco para cada amostra de solo, seguindo a mesma marcha analítica acima descrita, porém adicionando a solução de CMC após o período de incubação.

2.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de celulase é dada a seguir:

em que

At = atividade de celulase, expressa em mg de glicose por kg de TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de CMC; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vh = volume, em mL, de água desionizada adicionada após o período de incubação; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa, em gramas, de solo usada na determinação da atividade enzimática; t = tempo de incubação, em horas.

3. Amilases (EC 3.2.1)

3.1. Comentários

A denominação amilase inclui um conjunto de enzimas que catalisam a hidrólise do amido até unidades de glicose.

O amido é um homopolissacarídeo formado por dois tipos de biomoléculas, a amilose, formada por muitas unidades de glicose unidas pela ligação glicosídica α-1,4, e a amilopectina, formada por unidades de glicose em ligação glicosídica α-1,4 e α-1,6. Do mesmo modo que a celulose, não é um açúcar redutor.

No solo, sob a ação de enzimas chamadas de amilases, as ligações glicosídicas da molécula de amido são hidrolisadas, liberando unidades de maltose e, no estádio final de hidrólise, moléculas de glicose. Assim, após a hidrólise, o amido transforma-se em açúcar redutor.

Há vários tipos de amilase, cada um promovendo a quebra da molécula em posições diferentes. As α-amilases ou endoamilases hidrolisam as ligações glicosídicas α-1,4 ao acaso, mas não são capazes de hidrolisar a ligação glicosídica α-1,6. Da sua ação resulta a liberação de uma mistura de glicose, maltose, maltotriose e dextrinas limites. As β-amilases removem unidades de maltose (duas glicoses em ligação glicosídica α-1,4) a partir de uma extremidade não redutora. Também não conseguem hidrolisar a ligação glicosídica α-1,6. Outras enzimas que hidrolisam o amido são as γ-amilases, fosforilases, enzima R e amilo-1,6-glicosidase (as duas últimas são capazes de promover a hidrólise da ligação glicosídica α-1,6).

Melo et al. (1983) adaptaram a metodologia para avaliação da atividade de amilases para solos da ordem Latossolos.

O princípio do método para avaliar a atividade de amilases no solo é a incubação de uma amostra de solo com o substrato da enzima, o amido, determinando a quantidade de açúcares redutores produzida.

A atividade de amilases diminui quando a amostra de solo é seca ao ar e durante armazenamento sob temperatura ambiente (21 oC) ou a -20 oC.

3.2. Reagentes

Solução tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH 5,5: ver item 2.2.

Solução de amido a 1%: pesar 10,00 g de amido solúvel (amido de batata não serve) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 800 mL de água desionizada e aquecer em bico de bunsen até que o amido forme uma solução. Aguardar atingir temperatura ambiente, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

3.3. Curva de calibração

A curva de calibração para determinação da atividade de amilases é a mesma acima descrita para a determinação da atividade da celulase (ver item 2.3).

3.4. Marcha analítica

Pesar 10,00 g de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, colocar em béquer de 125 mL e adicionar 2,5 mL de toluol, uniformemente distribuído na amostra.

Deixar em repouso por 15 minutos em temperatura ambiente.

Adicionar 20 mL da solução tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH 5,5, e 20 mL da solução de amido 1%.

Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado e colocar para incubação a 30 oC por 24 horas.

Adicionar 20 mL de água desionizada.

Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar e determinar o teor de açúcares redutores em 2 mL de extrato pelo método de Somogyi & Nelson, conforme acima descrito para determinação da atividade de celulase (ver item 2.4).

Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, adicionando a solução de amido após o período de incubação.

3.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de amilases é dada a seguir:

em que

At = atividade de amilases, expressa em mg de glicose por kg de TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de amido; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da curva de calibração; Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; a = coeficiente angular da curva de calibração; m = massa, em gramas, de solo usada na determinação da atividade enzimática; t = tempo de incubação, em horas.

4. Arilsulfatases (EC 3.1.6.1 arilsulfato sulfohidrolase)

4.1. Comentários

As arilsulfatases constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster de sulfato ligado ao radical aril.

A atividade de arilsulfatases correlaciona-se positivamente com o teor de matéria orgânica, mas não com o teor de enxofre.

O método para estimar a atividade de arilsulfatases de uma amostra de solo consiste na incubação desta com um substrato artificial, o p-nitrofenilsulfato de potássio, e um inibidor de crescimento microbiano, o toluol. Após o período de incubação, determina-se o teor de p-nitrofenol liberado, substância que apresenta coloração amarela.

A solução de p-nitrofenilsulfato de potássio é incolor, enquanto a solução de p-nitrofenol apresenta cor amarela, o que permite leitura direta em espectrofotômetro. Tabatabai e Bremner (1970) desenvolveram uma metodologia para determinação da atividade de arilsulfatases em amostras de solo com base neste princípio.

A atividade de arilsulfatase aumenta quando a amostra recém-obtida é seca a 22 oC–24 oC.

4.2. Reagentes

Solução de p-nitrofenil sulfato de potássio 25 mmol/L: pesar 0,312 g de p-nitrofenil sulfato de potássio e colocar em béquer de 100 mL. Dissolver com cerca de 30 mL de tampão acetato 0,5 mol/L, pH 5,8. Transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com tampão acetato. Essa solução pode ser armazenada em geladeira por 1 semana.

Solução de cloreto de cálcio 0,5 mol/L: pesar 73,50 g de CaCl2.2H2O e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 500 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de hidróxido de sódio 0,5 mol/L: pesar 20,00 g de NaOH e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 500 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução padrão de p-nitrofenol (PNF) 10 µg/mL: pipetar 10 mL de uma solução de p-nitrofenol 0,1% para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada. Armazenar a 4 oC.

Solução tampão ácido acético-acetato 0,5 mol/L, pH 5,8: pesar 68,00 g de acetato de sódio tri-hidratado e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e ajustar o pH com ácido acético concentrado. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

4.3. Curva de calibração

Em 6 tubos de ensaio adicionar, respectivamente, 0, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL e 2,5 mL da solução de PNF 10 µg/mL e completar o volume a 5,0 mL com a solução tampão.

Adicionar a cada tubo 0,25 mL de toluol, 1 mL da solução de CaCl2.2H2O 0,5 mol/L e 4 mL da solução de NaOH 0,5 mol/L.

Agitar por alguns segundos e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.

Ler a absorbância em comprimento de onda de 400 nm.

Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter uma curva de calibração com três repetições.

Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se obter a equação, relacionando concentração de p-nitrofenol em µg/mL (eixo X) com absorbância (Y).

4.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em Erlenmeyer de 125 mL.

Adicionar 4 mL da solução tampão acetato, 0,25 mL de toluol e 1 mL da solução de p-nitrofenil sulfato de potássio 25 mmol/L.

Agitar para homogeneização, vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado e incubar a 37 oC por 1 hora.

Retirar da estufa, adicionar 1 mL da solução de cloreto de cálcio 0,5 mol/L e 4 mL da solução de hidróxido de sódio 0,5 mol/L.

Agitar por alguns segundos e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.

Proceder à leitura da absorbância em comprimento de onda de 400 nm.

Para cada amostra de solo deve ser feito um branco, aplicando-se a mesma sequência acima descrita, sendo a solução de p-nitrofenil sulfato de potássio (substrato) adicionada ao Erlenmeyer após o período de incubação.

4.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade da arilsulfatases é dada a seguir:

em que

At = atividade de arilsulfatases, expressa em mg de PNF por kg TFSE e por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs = volume, em mL, da solução de p-nitrofenil sulfato de potássio; Vc = volume, em mL, da solução de CaCl2.2H2O; Vh = volume, em mL, da solução de NaOH; Aa = leitura da absorbância da amostra; Ab = leitura da absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; m = massa, em gramas, de solo usada para determinação da atividade enzimática; t = tempo de incubação, em horas; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração.

5. Urease (EC 3.5.1.5 ureia amidohidrolase)

5.1. Comentários

A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da molécula de ureia com produção de amônia e gás carbônico.

É uma enzima de grande importância no solo, ao se considerar que a ureia é hoje uma das principais formas de fertilizante nitrogenado. Se a atividade da urease for alta, há formação rápida de amônia, que pode ser perdida para a atmosfera se não for adsorvida pelo complexo coloidal do solo. No solo, a amônia vai se transformar no íon amônio, que pode ser absorvido pelas plantas ou nitificado, correndo o risco de se perder por lixiviação. Se a atividade ureolítica for baixa, a produção de N-amoniacal pode ser menor que as exigências nutricionais da planta.

A urease é uma enzima relativamente persistente no solo. Alguns autores admitem que isso se deve ao fato de ficar protegida da ação de outras proteases por permanecer no interior de agregados do solo, onde o substrato (ureia) consegue penetrar, mas não moléculas de maior peso, que é o caso das proteases. Alguns autores têm encontrado que a secagem ao ar da amostra de solo (22 oC por 48 horas) ou em estufa (55 oC por 24 horas) e que o armazenamento de amostras secas ao ar em temperatura ambiente por até 1 ano não afetam a atividade da enzima de modo significativo.

O princípio do método modificado por Longo e Melo (2005) para avaliação da atividade de urease em amostras de solo consiste na incubação da amostra em presença de ureia e determinação do N-amoniacal liberado.

5.2. Reagentes

Solução de ureia 3,5 g/L: pesar 3,5 g de ureia e colocar em béquer de 1.000 mL. Dissolver em cerca de 800 mL de água desionizada, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de cloreto de potássio 2 mol/L: pesar 149,00 g de KCl p.a. e colocar em béquer de 600 mL. Adicionar cerca de 400 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de ácido bórico com indicadores vermelho de metila e verde de bromocresol: pesar 20,00 g de ácido bórico e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 600 mL de água desionizada. Aquecer em bico de bunsen até total dissolução. Aguardar atingir temperatura ambiente e transferir para balão volumétrico de 1.000 mL. Adicionar 200 mL de etanol, 6,6 mL de solução alcoólica de vermelho de metila 0,1%, 13,2 mL de solução alcoólica de verde de bromocresol 0,1% e 2,5 mL de solução de NaOH 0,05 mol/L. Completar volume com água desionizada. A solução apresenta coloração vermelho-escura.

Solução alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v): pesar 0,0500 g de vermelho de metila p.a. e colocar em béquer de 50 mL. Adicionar cerca de 30 mL de álcool etílico (etanol) p.a. e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar volume com etanol p.a.

Solução padrão de carbonato de sódio 0,1 mol/L: pesar 10,5990 g de carbonato de sódio anidro p.a. previamente seco e colocar em béquer de 600 mL. Adicionar cerca de 500 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução padrão de ácido sulfúrico 0,1 mol/L: adicionar cerca de 300 mL de água desionizada a um béquer de 600 mL. Adicionar ao béquer, cuidadosamente, 5,54 mL de H2SO4 p.a. (d = 1,84 g/L, pureza = 96%). Aguardar atingir temperatura ambiente e transferir para balão volumétrico de 1.000 mL. Completar o volume com água desionizada. Pipetar 25 mL da solução padrão de carbonato de sódio 0,1 mol/L para béquer de 100 mL. Adicionar 1 mL da solução alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v). Colocar a solução de ácido sulfúrico a ser padronizada em uma bureta de 50 mL. Adicionar, gota a gota, sob agitação a frio, a solução de ácido sulfúrico a ser padronizada ao béquer contendo a solução de carbonato de sódio, até que a solução fique levemente vermelha. A concentração da solução de H2SO4, expressa em mol/L, será calculada pela equação M = VcxNc/Va, em que M = concentração do ácido em mol/L, Vc = volume, em mL, da solução de carbonato de sódio, Nc = concentração da solução de carbonato de sódio em mol/L, Va = volume, em mL, da solução de H2SO4 gasto na titulação.

Solução padrão de ácido sulfúrico 0,01 mol/L: pipetar 10 mL da solução padrão de H2SO4 0,1 mol/L para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

5.3. Marcha analítica

Pesar 30,00 g da amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 125 mL.

Adicionar 0,5 mL de toluol, homogeneizar e deixar 5 minutos em repouso.

Adicionar 12 mL de água desionizada e incubar por 10 minutos a 30 oC.

Retirar da incubadora e adicionar 3 mL da solução de ureia 3,5 g/L.

Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado e voltar à incubadora por 1 hora.

Retirar da incubadora, adicionar 15 mL da solução de KCl 2 mol/L, contendo acetato de fenil mercúrio, agitar por 5 minutos e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.

Pipetar 10 mL do filtrado para a câmara de destilação do microdestilador Kjeldahl e proceder à determinação do teor de N-amoniacal por destilação a vapor (BREMNER; KEENEY, 1965) ou outro método disponível.

Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, da mesma forma acima descrita, adicionando-se a solução de ureia após o período de incubação.

5.4. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de urease no solo é dada por

em que

At = atividade de urease, expressa em mg N-NH4 por kg de TFSE por hora; N = normalidade da solução de ácido sulfúrico usada na titulação do destilado; Vh = volume, em mL, de água desionizada; Vs = volume, em mL, da solução de ureia; Ve = volume, em mL, da solução de KCl; Va = volume, em mL, da solução de ácido sulfúrico gasto na titulação da amostra; Vb = volume, em mL, da solução de ácido sulfúrico gasto na titulação do branco; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; m = massa, em gramas, de solo usada na incubação; Vd = volume, em mL, do extrato usado para destilação; t = tempo de incubação, em horas.

6. Proteases

6.1. Comentários

Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de proteínas, liberando, no estádio final de hidrólise, uma mistura de aminoácidos.

Os aminoácidos liberados são passíveis de sofrer desaminação, liberando o nitrogênio na forma amoniacal. Assim, a hidrólise das proteínas constitui o primeiro passo na mineralização do nitrogênio proteico que chega ao solo pela incorporação dos restos culturais, fertilizantes orgânicos ou pela morte de organismos.

Para se estimar a atividade de proteases em uma amostra de solo, pode-se incubá-la, na presença de toluol, com um substrato natural, como a caseína, ou com um substrato sintético, como o Bapna (benzoilarginina p-nitroanilida).

O princípio do método que faz uso de substrato natural consiste na avaliação do aminoácido tirosina, liberada durante o período de incubação, pela reação com o reagente de Folin-Ciocateau (cor amarela), que dá origem à formação de um complexo de cor azul. Quando o substrato é o Bapna (incolor), o princípio do método consiste na avaliação do p-nitrofenol, liberado durante o período de incubação, o qual apresenta cor amarela e cuja concentração pode ser facilmente determinada pela leitura da absorbância.

6.2. Reagentes

Solução padrão de tirosina 500 mg/L: pesar 0,050 g de tirosina e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de tampão Tris, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com tampão Tris.

Solução de caseinato de sódio 2%: pesar 10,00 g de caseinato de sódio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar 200 mL de tampão Tris. Acertar o pH para 8,1 com solução de NaOH. Transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução tampão Tris 50 mmol/L, pH 8,1: pesar 6,05 g de Tris e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar 700 mL de água desionizada e dissolver. Acertar o pH para 8,1 com solução de NaOH ou HCl. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de ácido tricloroacético (TCA) 15%: pesar 75,00 g de TCA e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar 300 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada.

O reagente alcalino é constituído de três soluções, aqui denominadas A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.

Solução A: pesar 50,00 g de carbonato de sódio anidro e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar 60 mL de solução de NaOH 1 mol/L e 700 mL de água desionizada. Dissolver, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução B: pesar 0,50 g de CuSO4.5H2O e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução C: pesar 1,00 g de tartarato duplo de sódio e potássio e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

O reagente alcalino deve ser preparado no momento de usar, colocando em béquer de 1.000 mL e homogeneizando 500 mL da solução A, 10 mL da solução B e 10 mL da solução C.

Reagente Folin-Ciocateau 33%: pipetar 167 mL de reagente de Folin, adquirido no mercado, para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada.

6.3. Curva de calibração

A 7 tubos de ensaio adicionar, respectivamente, 0, 0,1 mL, 0,2 mL, 0,4 mL, 0,7 mL, 1,4 mL e 2,1 mL da solução de tirosina 500 mg/L e completar o volume a 10 mL com solução tampão Tris.

Adicionar a cada tubo 5 mL da solução de caseína e 5 mL da solução de TCA.

Agitar, filtrar para tubos de ensaio por meio de papel de filtro Whatman n° 1 ou similar, adicionar 7,5 mL do reagente alcalino e deixar em repouso em temperatura ambiente por 15 minutos.

Adicionar 5 mL do reagente de Folin 33%, agitar e deixar em repouso por 1 hora.

Ler a absorbância em comprimento de onda de 700 nm.

Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a curva de calibração com três repetições.

Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se obter a equação, relacionando concentração de tirosina em mg/L (eixo X) com absorbância (eixo Y).

6.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 250 mL.

Adicionar 5 mL da solução tampão Tris, 5 mL da solução de caseinato de sódio e incubar, sob agitação, por 2 horas a 50 oC.

Adicionar 50 mL da solução de TCA, agitar manualmente e filtrar para tubo de ensaio, utilizando-se papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.

Adicionar 7,5 mL do reagente alcalino e deixar em repouso em temperatura ambiente por 15 minutos.

Adicionar 5 mL do reagente de Folin 33%, deixar em repouso por 1 hora e ler a absorbância em comprimento de onda de 700 nm.

6.5. Cálculos

A fórmula para cálculo da atividade de proteases é dada pela equação a seguir:

em que

At = atividade de proteases, expressa em mg de tirosina por kg de TFSE por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs = volume, em mL, da solução de caseinato de sódio; Vp = volume, em mL, da solução de TCA; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração. Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; m = massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em horas.

7. Fosfatases

7.1. Comentários

As enzimas genericamente chamadas de fosfatases catalisam a hidrólise da ligação éster de fosfato. Há três grupos de fosfatases, de acordo com o tipo de ligação fosfórica que hidrolisam: fosfomonoesterases, fosfodiesterases e fosfotriesterases.

As fosfomonoesterases (EC 3.1.3) recebem nomes vulgares de acordo com o substrato sobre o qual atuam (fitase, nucleotidase, açúcar fosfatase, glicerofosfatase) e catalisam a seguinte reação:

R - O - PO2-3 + H2O → HPO2-4 + R - OH

As nucleases, que catalisam a hidrólise dos ácidos nucleicos para seus nucleotídeos, e as fosfolipases, que catalisam a hidrólise dos fosfolipídeos, pertencem ao grupo das diéster fosfórico hidrolases (EC 3.1.4). Ao grupo das triéster fosfórico hidrolases (EC 3.1.5) pertencem as enzimas que atuam sobre grupos fosforil, contendo anidrido (EC 3.6.1) e as que atuam sobre a ligação P-N, caso das fosfoamidases (EC 3.9.1.1).

As fosfomonoesterases têm sido muito estudadas, pois transformam o fósforo orgânico em inorgânico, que pode ser absorvido pelas plantas. As enzimas desse grupo classificam-se em ácidas, neutras e alcalinas, dependendo do pH ótimo para a hidrólise. Tanto as fosfatases ácidas (pH ótimo = 4,0–6,5) como as alcalinas (pH ótimo = 9,0–10,0) têm sido encontradas no solo.

O princípio do método para avaliar a atividade das fosfomonoesterases em amostras de solo consiste em determinar o teor de p-nitrofenol (cor amarela) liberado durante a incubação das amostras com o substrato p-nitrofenilfosfato de sódio (incolor), segundo metodologia desenvolvida por Eivazi e Tabatabai (1977).

O uso do p-nitrofenilfosfato de sódio como substrato deve ser cauteloso em solos ácidos, pois o p-nitrofenilfosfato de sódio é rapidamente hidrolisado a p-nitrofenol. Em solos ricos em matéria orgânica ou em Fe e Al extraíveis, pode ocorrer extração incompleta do p-nitrofenol.

Quando o tempo de incubação for de 1 a 2 horas, o tolueno pode ser omitido sem grandes alterações nos resultados.

O cloreto de cálcio tem por finalidade evitar a dispersão da argila pelo NaOH, utilizado para extrair o p-nitrofenol.

É preciso tomar cuidado na escolha do tampão a ser usado na avaliação da atividade de fosfatases em amostras de solo, pois alguns dos tampões podem causar inibição da enzima. Os tampões acetato e citrato-fosfato, por exemplo, causam inibição da atividade.

7.2. Reagentes

Solução padrão de p-nitrofenol 1 g/L: pesar 1,00 g de p-nitrofenol e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 70 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução padrão de p-nitrofenol 10 mg/L: pipetar 1 mL da solução padrão de p-nitrofenol 1 g/L para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução estoque do tampão universal modificada (MUB), pH 11,0: pesar 12,1 g de Tris, 11,6 g de ácido maleico, 14,0 g de ácido cítrico, 6,3 g de ácido bórico e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 500 mL de solução de NaOH 1 mol/L e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada. Armazenar a 4 oC.

Solução tampão MUB, pH 6,5: pipetar 200 mL da solução estoque de MUB para béquer de 500 mL e adicionar solução de HCl 0,1 mol/L até atingir pH 6,5, sob contínua agitação. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de CaCl2.2H2O 0,5 mol/L: ver item 4.2.

Solução de NaOH 0,5 mol/L: ver item 4.2.

7.3. Curva de calibração

A 6 frascos Erlenmeyers de 50 mL, adicionar, respectivamente, 0,1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL e 5 mL da solução de p-nitrofenol 10 mg/L e completar o volume a 5 mL com água desionizada.

Ler a absorbância das soluções de p-nitrofenol em comprimento de onda de 400 nm.

Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter uma curva de calibração com três repetições.

Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a obter a equação da curva de calibração, relacionando absorbância (eixo Y) com concentração de p-nitrofenol em mg/L (eixo X).

7.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 50 mL.

Adicionar 0,25 mL de toluol, 4 mL do tampão MUB pH 6,5 para o caso da fosfatase ácida (ou pH 11 para a fosfatase alcalina) e 1 mL da solução de p-nitrofenilfosfato de sódio.

Homogeneizar, vedar a boca do frasco com papel laminado e incubar a 37 oC por 1 hora.

Adicionar 1 mL da solução de CaCl2.2H2O 0,5 mol/L e 4 mL da solução de NaOH 0,5 mol/L.

Agitar e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou equivalente.

Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 400 nm.

Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, adicionando a solução de p-nitrofenilfosfato de sódio após a adição da solução de NaOH 0,5 mol/L.

7.5. Cálculos

O cálculo da atividade de fosfatases é feito pela equação a seguir:

em que

At = atividade, em mg, de p-nitrofenol por kg de TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão; Vs = volume, em mL, de p-nitrofenilfosfato de sódio; Vc = volume, em mL, de CaCl2.2H2O; Vh = volume, em mL, de NaOH; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em horas.

8. Desidrogenases

8.1. Comentários

As desidrogenases são enzimas que catalisam a oxidação de substratos orgânicos pela remoção de elétrons e hidrogênios, os quais são recebidos por uma coezima como NAD+ ou FAD+. As desidrogenases são enzimas ligadas às células e não enzimas extracelulares.

Um dos métodos mais frequentemente usados para avaliar a atividade de desidrogenases do solo tem como princípio usar o TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) como o aceptor dos elétrons e H+ (THALMANN, 1968), reduzindo-se a TPF (trifenilformazan), que apresenta coloração vermelha, podendo ser facilmente determinado por espectrofotometria na região do visível (Figura 1).

Figura 1. Reação de redução do cloridrato de trifeniltetrazólio (TTC) a trifenilformazan (TPF).

O TTC pode ser adsorvido pela matéria orgânica e pelos coloides inorgânicos do solo, de tal modo que é recomendável um estudo prévio para se ter ideia da concentração ideal de TTC a se usar como substrato.

Tanto o TTC como o TPF sofrem alteração na presença da luz, motivo pelo qual se recomenda que as determinações sejam feitas na ausência de luz.

O TPF é insolúvel em água e permanece no sítio onde ocorreu a redução. Dessa forma, é preciso extrai-lo da amostra de solo por meio de um solvente adequado como acetona ou metanol.

Os íons nitrato, nitrito e Fe+3 inibem a atividade de desidrogenases, enquanto P-inorgânico, Fe+2, sulfato e Mn estimulam a redução do TTC (BREMNER; TABATABAI, 1973).

É preciso evitar o contato do meio de incubação com o oxigênio do ar, pois o TTC é reduzido pelo oxigênio. Para que os resultados de diferentes amostras sejam comparáveis, é necessário que os tubos de ensaio tenham a mesma área de exposição ao oxigênio (BENEFIELD et al., 1977), o que se consegue com o menor diâmetro possível.

A atividade de desidrogenases mantém-se relativamente constante, quando a amostra de solo é armazenada úmida em sacos de polietileno sob temperatura ambiente (CASIDA et al., 1964). É inibida pela presença do clorofórmio e pelo aquecimento em temperaturas acima de 65 oC.

Na presença do Zn em pó, o TTC é reduzido a TPF.

Em solos ácidos (pH < 5), a atividade de desidrogenases é muito baixa.

A atividade de desidrogenases avalia a respiração associada à atividade metabólica, não sendo, necessariamente, a medida do número de microrganismos presentes.

Tem sido observada diferença entre a atividade de desidrogenases, avaliada pelo método do TTC, e a atividade respiratória do solo, o que tem sido atribuído ao fato de o TTC servir como aceptor de elétrons apenas quando outros aceptores presentes no solo já foram utilizados.

O TTC é um indicador muito sensível de alterações na atividade microbiana do solo causada por diferentes tipos de manejo do solo, entre eles os métodos de cultivo (TIWAN et al., 1989). Não serve, contudo, para estimar a atividade microbiana em solo contaminado com cobre (CHANDER; BROOKES, 1991).

8.2. Reagentes

Solução padrão de trifenilformazan (TPF) 500 mg/L: pesar 0,0500 g de TPF e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 80 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com acetona. Armazenar em frasco de cor âmbar.

Solução tampão Tris-HCl, pH 7,6: pesar 12,10 g de Tris (hidroximetilaminometano) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver. Adicionar HCl até pH 7,6. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) a 3%: pesar 3,00 g de TTC e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 80 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com o tampão Tris-HCl. Armazenar em frasco de cor âmbar.

8.3. Curva de calibração

Pipetar 0, 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL da solução padrão de TPF 500 mg/L para balões volumétricos de 50 mL.

Adicionar a cada balão 8,3 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e completar o volume com água desionizada.

Ler a absorbância em comprimento de onda de 546 nm.

Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter uma curva de calibração com três repetições.

Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com concentração de TPF em mg/L (eixo X).

8.4. Marcha analítica

Pesar 5,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em tubo de ensaio.

Adicionar 5 mL da solução de TTC (a solução deve conter de 1,0 g/100 mL a 1,5 g/100 mL para solo argiloso ou orgânico e 0,1 g/100 mL para solo arenoso ou pobre em matéria orgânica).

Vedar os tubos, misturar muito bem o conteúdo e incubar por 24 horas a 30 oC.

Adicionar 40 mL de acetona, agitar energicamente e manter em temperatura ambiente por 2 horas, com agitação periódica. Essa incubação deve ser feita no escuro, e todas as outras operações sob luz difusa.

Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou equivalente.

Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 546 nm.

Para cada amostra de solo, realizar um branco, substituindo a solução de TTC por 5 mL de solução tampão Tris-HCl, pH 7,6.

8.5. Cálculos

A atividade de desidrogenases é calculada pela equação a seguir:

em que

At = atividade de desidrogenases, expressa em mg de TPF por kg de TFSE por hora; b = constante da equação da curva de calibração; Va = volume, em mL, de acetona; Vs = volume, em mL, da solução de TTC; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; t = tempo de incubação, em horas; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco.

9. Hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA)

9.1. Comentários

A hidrólise do 3,6 diacetilfluoresceína (FDA) não expressa a atividade de uma enzima específica, mas a de um grupo de enzimas que são capazes de realizá-la. Neste grupo estão lipases, esterases, proteases. O FDA pode ser hidrolisado por algas, protozoários e tecidos animais, mas não por esporos e células microbianas na fase estacionária de crescimento, de tal modo que a reação pode ser usada para colorir células microbianas ativas.

Os ésteres da fluoresceína são apolares e conseguem atravessar com facilidade a membrana celular, enquanto os produtos da hidrólise são polares e permanecem no interior da célula.

O pH ótimo para a hidrólise do FDA situa-se na faixa de 7 a 8. Em pH 8,5 já ocorre a hidrólise química do FDA.

A solução de diacetato de fluoresceína é incolor, enquanto a solução de fluoresceína apresenta-se fluorescente e pode ser estimada quantitativamente por espectrofotometria (Figura 2). Esse é o princípio do método para avaliação do potencial de hidrólise do FDA em amostras de solo (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982).

Figura 2. Diacetato de fluoresceína e fluoresceína.

De um modo geral, 2,00 g de amostra, peso equivalente à amostra seca em estufa a 105 oC, são suficientes para avaliar a atividade de hidrólise do FDA. Para solos com muita atividade, pode-se usar 1,00 g, enquanto para solos com baixa atividade, 4,00 g podem ser necessários. Em qualquer dos casos, deve-se reajustar os volumes da solução tampão e de diacetato de fluoresceína, de tal modo que a concentração final de FDA fique em torno de 10 µg/mL.

A adição de acetona após o período de incubação até atingir concentração de 50% (v/v) tem por finalidade parar a reação de hidrólise do FDA e extrair a fluoresceína produzida durante a hidrólise.

A hidrólise química do FDA ocorre em temperatura ambiente ou mesmo a 8 oC, de tal modo que é recomendado o armazenamento do sal e das soluções a -20 oC.

9.2. Reagentes

Tampão fosfato de sódio 60 mmol/L, pH 7,6: misturar 800 mL de uma solução de Na2HPO4, contendo 11,9 g/L, com 200 mL de uma solução de KH2PO4, contendo 9,08 g/L. Se necessário, acertar o pH com HCl.

Solução estoque de diacetato de fluoresceína 2 g/L: pesar 0,2000 g de diacetato de fluoresceína e colocar em béquer de 50 mL. Adicionar 10 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com acetona. Armazenar a -20 oC. No momento de uso, diluir a solução estoque na proporção 1:18 com água destilada (solução de trabalho). Na marcha analítica, para cada mL de tampão, adicionar 100 µL da solução de FDA diluída (solução de trabalho).

Solução estoque de fluoresceína 5 g/L: pesar 0,5000 g de fluoresceína e colocar em béquer de 50 mL. Adicionar 10 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com acetona. Armazenar a -20 oC. Para o estabelecimento da curva de calibração, diluir a solução estoque na proporção 1:50 com solução tampão (solução de trabalho a 100 mg/L).

9.3. Curva de calibração

Para 7 balões volumétricos de 50 mL, pipetar, respectivamente, 0, 0,25 mL, 0,50 mL, 1,0 mL, 2,5 mL, 5,0 mL e 10,0 mL da solução de trabalho de fluoresceína (100 mg/L).

Completar o volume com a solução tampão fosfato de sódio 60 mmol/L, pH 7,6.

Ler a absorbância em comprimento de onda de 490 nm.

Executar esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a curva de calibração com três repetições.

Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com a concentração de fluoresceína em µg/mL (eixo X).

9.4. Marcha analítica

Pesar 2,00 g (equivalente em peso seco) de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm. A amostra pode ter sido armazenada a 5 oC.

Colocar em frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicionar 25 mL de tampão fosfato 60 mmol/L, pH 7,6, e 2,5 mL da solução de trabalho de diacetato de fluoresceína (concentração final de FDA de 10 µg/mL).

Misturar muito bem e incubar por 1 hora a 24 oC sob agitação.

Adicionar 50 mL de acetona (a concentração final de acetona deve atingir 50% v/v).

Centrifugar por 10 minutos a 4.000 rpm e ler a absorbância do sobrenadante em comprimento de onda de 490 nm.

Para cada amostra de solo, realizar uma prova em branco, adicionando a solução de FDA após o período de incubação.

9.5. Cálculos

A atividade de hidrólise do FDA é calculada pela equação a seguir:

em que

At = atividade, em mg de fluoresceína por kg de TFSE por hora; Aa = absorbância da amostra. Ab = absorbância do branco; b = constante da equação de regressão da curva de calibração; Vf = volume, em mL, de FDA; Vt = volume, em mL, de tampão; Va = volume, em mL, de acetona; m = massa, em gramas, de solo; a = coeficiente angular da equação de regressão da curva de calibração; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de correção de umidade para amostra seca a 105 oC.

10. Beta-glicosidase (EC 3.2.1.21 β-glicosídeo glicoidrolase)

10.1. Comentários

A β-glicosidase é a enzima que realiza a hidrólise limite da celulose (Figura 3) e tem sido detectada em animais, plantas e microrganismos. Logo, ela catalisa a hidrólise de um dissacarídeo que possui ligação glicosídica β-1,4, a celobiose.

Figura 3. Reação de hidrólise da celobiose, catalisada pela β-glicosidase.

O substrato utilizado para avaliar a atividade da β-glicosidase em amostras de solo tem sido o ρ-nitrofenil-β-D-glicosídeo (EIVAZI; TABATABAI, 1988), cujo método baseia-se no fato de que este substrato é incolor, enquanto o produto da hidrólise, o p-nitrofenol, apresenta cor amarela, sendo facilmente determinado por espectrofotometria na região do visível.

A β-glicosidase tem se relacionado positivamente com o teor de matéria orgânica do solo e é uma enzima que perde atividade, quando aquecida acima de 70 oC.

10.2. Reagentes

Toluol: usar reagente p.a.

Solução estoque do tampão universal modificado (MUB): ver item 8.2.

Solução tampão MUB, pH 6,5: ver item 7.2.

Solução de CaCl2 0,5 mol/L: ver item 4.2.

Solução tampão Tris-hidróxido de sódio 0,1 mol/L, pH 12: pesar 12,20 g de Tris (também denominado Tham) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 800 mL de água desionizada e dissolver. Adicionar solução de NaOH 0,5 mol/L até atingir pH 12. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada. Essa solução funciona como extrator.

Solução estoque de p-nitrofenol 1 g/L: ver item 7.2.

Solução tampão Tris 0,1 mol/L, pH 10: pesar 12,20 g de Tris (também denominado Tham) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 800 mL de água desionizada e dissolver.

Solução padrão de p-nitrofenol 10 mg/L: Transferir 10 mL da solução estoque de p-nitrofenol para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada. Essa solução funciona como diluente.

Solução de p-nitrofenil-β-D-glicosídeo (PNG) 25 mmol/L: pesar 0,377 g de PNG e colocar em béquer de 100 mL. Adicionar 30 mL da solução de tampão universal (MUB) e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com a solução de tampão universal.

10.3. Curva de calibração

A 6 frascos Erlenmeyers de 50 mL, adicionar, respectivamente, 0, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL e 5 mL da solução padrão de p-nitrofenol 10 mg/L e completar o volume a 5 mL com água desionizada.

Ler a absorbância em comprimento de onda de 400 nm.

Repetir esse protocolo por duas vezes, de modo a obter a curva de calibração com três repetições.

Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com concentração de p-nitrofenol em mg/L (eixo X).

10.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 50 mL.

Adicionar 0,25 mL de toluol, 4 mL de solução tampão MUB, pH 6,5, e 1 mL da solução de PNG.

Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado, misturar bem e incubar por 1 hora a 37 oC.

Adicionar 1 mL da solução de CaCl2 0,5 mol/L, 4 mL do tampão Tris, pH 12, agitar vigorosamente e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.

Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 400 nm. Se a cor for muito intensa, diluir o filtrado com solução tampão Tris, pH 10, e ler a absorbância novamente.

Para cada amostra de solo, preparar um branco, adicionando a solução de p-nitrofenil-β-D-glicosídeo após a incubação, antes da adição da solução de CaCl2.

10.5. Cálculos

A atividade da β-glicosidase é calculada pela equação a seguir:

em que

At = atividade da β-glicosidase, expressa em mg de p-nitrofenol por kg de TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão MUB; Vs = volume, em mL, de PNG; Vc = volume, em mL, da solução de CaCl2; Ve = volume, em mL, do tampão Tris; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de correção de umidade para amostra seca em estufa a 105 oC.

11. Sacarase ou invertase (EC 3.2.1.26 β-D-frutofuranosídeo frutohidrolase)

11.1. Comentários

A sacarose é um dissacarídeo formado por unidades de glicose e frutose em ligação glicosídica β-2,1. É um carboidrato amplamente distribuído na natureza e mais facilmente hidrolisado que outros dissacarídeos. Pelo fato de não apresentar hidroxila glicosídica livre (as duas hidroxilas glicosídicas participam da ligação glicosídica), não apresenta mutarrotação e não é um açúcar redutor.

A sacarose é hidrolisada a D(+)-glicose e D(-)-frutose pela enzima denominada sacarase ou invertase. O nome invertase se deve ao fato que, após a hidrólise, há alteração no sentido do desvio da luz polarizada, uma vez que a sacarose possui [α]D20 = +66o, enquanto a frutose possui um [α]D20 = -92,40o, e a glicose, um [α]D2 = + 52,7o, de tal modo que a mistura equimolecular resultante da hidrólise desvia o plano de luz polarizada para a esquerda.

O pH ótimo para a atividade da invertase em amostras de solo situa-se na faixa de 5,0 a 5,6, enquanto a temperatura ótima é de 50 oC (FRANKENBERGER; JOHANSON, 1983). O KM da reação tem variado entre 16,3 mmol/kg e 42,1 mmol/kg. A secagem da amostra causa diminuição na atividade da enzima. O toluol e a esterilização por raios gama não afetam a atividade da invertase.

Alguns autores têm encontrado correlação entre atividade de invertase e teor de C-orgânico.

O princípio do método para avaliação da atividade da invertase em amostras de solo consiste na determinação do teor de açúcares redutores liberados, quando a amostra é incubada na presença de sacarose (SCHINNER; VON MERSI, 1990).

11.2. Reagentes

Solução tampão ácido acético-acetato 2 mol/L, pH 5,5: pesar 164,08 g de acetato de sódio anidro e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver. Ajustar o pH para 5,5 pela adição de ácido acético concentrado. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução de sacarose 1,2%: pesar 12,00 g de sacarose e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de tampão ácido acético-acetato e aquecer, sob agitação, a 45 oC por 2 horas. Aguardar atingir temperatura ambiente, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com tampão acetato. Essa solução pode ser armazenada a 4 oC por uma semana.

O reagente de cobre é constituído de três soluções, aqui denominadas de A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.

Solução A: pesar 16,00 g de carbonato de sódio anidro e 0,90 g de cianeto de potássio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar cerca de 400 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução B: pesar 0,50 g de hexacianeto férrico de potássio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar cerca de 400 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução C: pesar 1,50 g de sulfato férrico de amônio, 1,00 g de dodecil sulfato de sódio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar cerca de 300 mL de água desionizada a 50 oC, 4,2 mL de H2SO4 concentrado e dissolver. Aguardar atingir temperatura ambiente, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução estoque de glicose 2,8 g/L: pesar 2,8 g de glicose anidra e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 100 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

Solução padrão de glicose 28 mg/L: pipetar 10 mL da solução estoque de glicose a 2,8 g/L para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água desionizada.

11.3. Curva de calibração

A 6 tubos de ensaio, adicionar, respectivamente, 0, 0,2 mL, 0,4 mL, 0,6 mL, 0,8 mL e 1,0 mL da solução padrão de glicose 28 mg/L e completar o volume a 1,0 mL com água desionizada.

Adicionar a cada tubo 1 mL da solução A e 1 mL da solução B.

Homogeneizar, vedar a boca dos tubos e aquecer em banho-maria a 100 oC por exatamente 15 minutos.

Resfriar em banho-maria a 20 oC por 5 minutos e adicionar 5 mL da solução C.

Agitar e deixar em repouso a 20 oC por 1 hora para desenvolvimento da cor.

Ler a absorbância em um período de 30 minutos em comprimento de onda de 690 nm.

Repetir o protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a curva de calibração com três repetições.

Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, correlacionando a absorbância (eixo Y) com a concentração de glicose em mg/L (eixo X).

11.4. Marcha analítica

Pesar 5,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 100 mL.

Adicionar 15 mL da solução de sacarose 1,2% e 15 mL do tampão acetato.

Vedar a boca dos frascos com papel laminado e incubar a 50 oC por 3 horas.

Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar, transferir 1,2 mL do filtrado para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com água desionizada.

Pipetar 1 mL do filtrado diluído para tubo de ensaio, adicionar 1 mL da solução A, 1 mL da solução B e homogeneizar.

Vedar a boca do tubo de ensaio e aquecer em banho-maria a 100 oC por exatamente 15 minutos.

Resfriar em banho-maria a 20 oC por 5 minutos e adicionar 5 mL da solução C.

Agitar e deixar em repouso a 20 oC por 1 hora para desenvolvimento da cor.

Ler a absorbância em um período de 30 minutos em comprimento de onda de 690 nm.

Para cada amostra, realizar um branco, no qual a solução de sacarose é adicionada após o período de incubação, imediatamente antes da filtração.

11.5. Cálculos

O cálculo da atividade da invertase é feito pela equação a seguir:

em que

At = atividade da invertase, expressa em mg, de glicose por kg de TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão acetato; Vs = volume, em mL, da solução de sacarose; Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de calibração; Vc = volume, a mL, em que foi diluído o filtrado; a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa, em gramas, da amostra de solo; Ve = volume de filtrado, em mL, usado para diluição antes da determinação dos açúcares redutores; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de correção de umidade para amostra seca em estufa a 105 oC até peso constante.

12. Referências

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Parte 3
Técnicas moleculares e aplicação da genética nas áreas agrícolas

Capítulo 1
Técnicas moleculares aplicadas ao estudo da diversidade e à identificação de bactérias e fungos de interesse agrícola

Fernando Gomes Barcellos
Mariangela Hungria

1. Introdução

A identificação correta de microrganismos, como fungos e bactérias, é fundamental em diversas áreas de importância na agricultura e em estudos ambientais, por exemplo, no conhecimento da biodiversidade microbiana do solo, no diagnóstico de doenças de plantas, entre outros (ANDERSON; CAIRNEY, 2004; MCCARTNEY et al., 2003). Os métodos convencionais para a identificação de bactérias e fungos, como os existentes na rizosfera das plantas, no solo, bem como aqueles associados a plantas, como endofíticos e simbióticos, entre outros, dependem do isolamento, do cultivo em meios apropriados e da caracterização morfofisiológica e bioquímica (GARRO et al., 1999; VANDAMME et al., 1996). No entanto, a caracterização com base nesses atributos pode resultar, em muitos casos, na identificação errônea de isolados, por ser passível de sofrer influência ambiental.

A utilização das metodologias moleculares de análise do DNA (ou ADN, ácido desoxirribonucleico), principalmente aquelas com base no uso da PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) (SAIKI et al., 1988) e das técnicas de sequenciamento direto do DNA amplificado (INNES et al., 1988; WINSHIP, 1989), permitiu o estabelecimento de estratégias de identificação mais precisas dos isolados, baseadas no genótipo, o qual não está sob influência ambiental. Com a utilização dessas metodologias, a caracterização e a identificação de microrganismos vêm adquirindo um papel cada vez mais relevante, por permitir ações rápidas na identificação e profilaxia de patógenos humanos. Também nas ciências agrícolas e ambientais, a adoção dessas metodologias vem crescendo exponencialmente. Neste capítulo serão discutidas as principais metodologias utilizadas para a caracterização molecular de fungos e bactérias, com ênfase nos grupos de maior importância agrícola e ambiental.

2. Técnicas moleculares aplicadas em estudos de diversidade e identificação de microrganismos

2.1. Técnicas aplicadas em estudos de taxonomia e filogenia de microrganismos

Inicialmente, é importante estabelecer algumas definições. A sistemática é definida como o estudo científico da diversidade e inter-relações entre os organismos, com o objetivo de caracterizá-los e arranjá-los de uma maneira ordenada (TRUPER; SCHLEIFER, 1991). A taxonomia é, frequentemente, usada como um sinônimo para sistemática e consiste na classificação, identificação e nomenclatura de um organismo (COWAN, 1968). A classificação consiste no arranjo dos organismos em grupos (táxons), com base em similaridades, enquanto que a nomenclatura consiste na determinação de nomes para os grupos taxonômicos, de acordo com as regras internacionais descritas pelo International Code of Nomenclature of Bacteria (LAPAGE et al., 1992). Já a identificação é o uso prático da classificação, a fim de determinar a identidade de um isolado como membro, ou não, de uma unidade. Uma poderosa ferramenta para a taxonomia de um determinado organismo é o estudo da filogenia, utilizado para determinar as relações existentes entre os organismos, indicando seu possível grupo, suas relações com outros grupos e seu lugar nas famílias e reinos, bem como auxiliando no reconhecimento dos ancestrais.

Na década de 1980 e início da década de 1990, o emprego de técnicas de biologia molecular resultou em uma verdadeira revolução na taxonomia das bactérias e fungos. Nessa época, alguns estudos passaram a ser conduzidos com os genes RNA ribossomais (RNAr), e a análise desses genes resultaram na escolha preferencial dos mesmos para estimar tanto relações filogenéticas como a posição taxonômica de microrganismos (ATKINS; CLARK, 2004; BRIDGE; ARORA, 1998; GARRITY et al., 2001; MCCARTNEY et al., 2003; WEISBURG et al., 1991; WOESE, 1987; WOESE et al., 1990). Como as análises em geral são feitas com DNA e não com RNA, também é usual se referir a elas como DNAr.

Os genes ribossomais apresentam uma série de características favoráveis a sua utilização em filogenia: i) são encontrados em todos os organismos vivos, uma vez que a síntese de proteínas ribossomais é obrigatória; ii) expressam estruturas secundárias altamente conservadas, que são importantes para o alinhamento correto das sequências destes genes; iii) são componentes principais da estrutura dos ribossomos e, portanto, abundantes nas células, facilitando a sua identificação; iv) diferenças nas sequências desses genes evoluem em taxas diferentes, permitindo que análises filogenéticas sejam realizadas em vários níveis de resolução taxonômica (GARRITY et al., 2001; VANDAMME et al., 1996; WOESE, 1987; WOESE et al., 1990).

Nas bactérias, a escolha recaiu no 16S DNAr para estimar relações filogenéticas e taxonômicas (GARRITY et al., 2001; VANDAMME et al., 1996; WEISBURG et al., 1991; WOESE, 1987; WOESE et al., 1990). Contudo, em alguns gêneros, como Burkholderia (COENYE et al., 2001) e Bradyrhizobium (GERMANO et al., 2006; MENNA et al., 2006), a variabilidade no 16S DNAr é muito baixa, dificultando a definição clara das espécies. Outra limitação no uso exclusivo do 16S DNAr surgiu com a quebra de um dogma evolucionário em procariotos, com a constatação de que podem ocorrer taxas elevadas de transferência horizontal de genes entre microrganismos, produzindo genomas extremamente dinâmicos, com quantidades substanciais de DNA que são incorporadas ou perdidas do genoma (GEVERS et al., 2005). Desse modo, a análise adicional de outros genes, em complementação ao 16S rDNA, gera maior confiabilidade à classificação, como exemplo, o 23S rDNA e o espaço intergênico 16S-23S rRNA (IGS, região intergênica), que apresentam maior divergência entre as espécies, diferem quanto à taxa de evolução, e, no caso do 23S rRNA, apresenta maior número de bases (GERMANO et al., 2006).

No caso dos fungos, a região do DNAr nuclear consiste de três genes que codificam para os RNAs ribossomais (25-28S, 18S e 5,8S), sendo separados pelas regiões espaçadoras internas (ITS1 e ITS2), em uma unidade contendo em torno de 200 repetições em tandem (ATKINS; CLARK, 2004; BERBEE; TAYLOR, 2001; BRIDGE; ARORA, 1998). As unidades repetidas do DNAr são separadas por regiões denominadas de espaçadores intergênicos (IGS). As sequências dos genes 25-28S, 18S e 5,8S são conservadas evolutivamente e têm sido utilizadas em estudos de filogenia (principalmente o gene ribossomal 18S) envolvendo espécies diferentes de fungos (BERBEE; TAYLOR, 2001; BRIDGE; ARORA, 1998). As regiões espaçadoras ITS1, ITS2 e IGS possuem sequências mais variáveis e têm sido utilizadas em estudos para discriminar espécies intimamente relacionadas em alguns gêneros e na identificação de espécies (BRIDGE; ARORA, 1998). Além dos genes ribossomais, outros genes (geralmente genes conservados evolutivamente e denominados, genericamente, de housekeeping) também têm sido utilizados como alvo na identificação de isolados fúngicos, como os genes que codificam a síntese de proteínas como a ß–tubulina, a histona e a calmodulina (BRADSHAW et al., 2006; MCCARTNEY et al., 2003).

Nos primeiros estudos com os genes ribossomais, utilizava-se o sequenciamento parcial dos genes (YOUNG et al., 1991) ou, então, uma combinação de métodos, como o PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição) dos genes ribossomais, que consiste na amplificação por PCR das regiões do DNA que codificam os genes ribossomais (ou o espaço intergênico), seguida pelo corte com enzimas de restrição e eletroforese dos fragmentos amplificados (ALBERTON et al., 2006; FERNANDES et al., 2003; GERMANO et al., 2006; GRANGE; HUNGRIA, 2004; KASCHUK et al., 2006; PINTO et al., 2007). Contudo, com as facilidades e redução no custo do sequenciamento, esse é, hoje, o método de preferência (BINDE et al., 2009; MENNA et al., 2006, 2009a).

Para a identificação taxonômica ou das relações filogenéticas de uma determinada estirpe de bactéria, a sequência do gene ribossomal 16S em estudo pode ser comparada por similaridade com sequências ribossomais das estirpes tipo type strain (ou de referência) das espécies bacterianas depositadas em bancos de dados (como o GenBank do National Center for Biotechnology Information1 (NCBI), e o Ribosomal Database Project2 (RDP). Alternativamente, podem-se construir árvores filogenéticas onde a sequência do gene ribossomal 16S da bactéria em estudo é analisada em conjunto com sequências ribossomais de estirpes tipo e/ou de referência das espécies bacterianas representativas do estudo. O mesmo se aplica ao caso dos fungos.

É importante mencionar, também, outra metodologia mais recente que vem sendo cada vez mais empregada, o Multilocus Sequence Typing (MLST), tipagem por sequenciamento de lócus múltiplos, a qual consiste no sequenciamento e análise conjunta, como uma única sequência concatenada, de vários genes housekeeping, em geral cinco (BAIN et al., 2007; ENRIGHT; SPRATT, 1999; MCCARTNEY et al., 2003; WOO et al., 2007). De acordo com Zeigler (2003), os genes utilizados como marcadores filogenéticos alternativos, além de serem conservados para o grupo em estudo, precisam obedecer alguns critérios: i) distribuição no genoma com uma distância mínima entre os genes de 100 kb; ii) presença no genoma em uma única cópia; iii) extensão nucleotídica suficiente que permita o sequenciamento; iv) conter informações suficientes para as análises; e v) os dados obtidos com o uso destes genes devem ser correlacionados com os dados obtidos com o gene ribossomal 16S e com os percentuais de similaridade obtidos por hibridização DNA-DNA. O MLST visa, basicamente, à caracterização genotípica em nível infraespecífico (GEVERS et al., 2005) e foi, inicialmente, desenvolvido e utilizado em estudos de diversidade e identificação em bactérias patogênicas ao homem (ENRIGHT; SPRATT, 1999), mas passou a ser utilizado também para a identificação de patógenos de plantas, inclusive fungos (BAIN 2007; MCCARTNEY et al., 2003).

Aplicando o mesmo princípio do MLST à taxonomia e filogenia, foi então desenvolvida a metodologia de Multilocus Sequence Analysis (MLSA) (STACKEBRANDT et al., 2002; STEPKOWSKI et al., 2003), com propósitos específicos que permitem a sua utilização para a definição de espécies e para elucidar relações taxonômicas entre espécies bacterianas (GEVERS et al., 2005; MARTENS et al., 2007; MENNA et al., 2009a; RIBEIRO et al., 2009) e espécies de fungos (WOO et al., 2007).

Em relação à taxonomia de procariotos, mais detalhes foram recentemente compilados em uma revisão de Barcellos et al. (2010). Finalmente, é importante mencionar que, apesar dos avanços nas técnicas moleculares, a abordagem de taxonomia polifásica, integrando diferentes tipos de dados e informações fenotípicas, genotípicas e filogenéticas, nunca deve ser esquecida, pois agrega informações valiosas que auxiliam no entendimento da diversidade e evolução dos microrganismos.

2.2. Outras técnicas moleculares aplicadas à caracterização genética de isolados e estirpes

Várias metodologias moleculares vêm sendo empregadas para a caracterização de isolados, linhagens e estirpes. A maioria dessas metodologias tem como base a análise com PCR (denominadas genericamente como PCR-based DNA fingerprinting techniques), sendo aplicadas a estudos de diversidade e identificação de estirpes de bactérias e isolados de fungos, e, até o presente momento, o maior número de trabalhos relata o uso dos marcadores Rapd, AFLP e rep-PCR (BRADSHAW et al., 2006; BRIDGE; ARORA, 1998; BRUIJN, 1992; MORTON et al., 2003). Referências a diversos outros marcadores podem ser encontradas em revisão recente (BARCELLOS et al., 2010).

O Rapd (Random Amplified Polymorphic DNA, DNA polimórfico amplificado ao acaso) utiliza como iniciadores primers únicos de sequências curtas (10 bases), os quais reconhecem regiões no genoma contendo sequências nucleotídicas curtas, repetidas e invertidas (BRIDGE; ARORA, 1998). Os produtos de amplificação por Rapd são submetidos à eletroforese em gel de agarose e geram perfis de bandas que são utilizados para discriminar estirpes ou isolados de bactérias, por exemplo, de rizóbios (HUNGRIA et al., 2000; NISHI et al., 1996), ou linhagens em determinadas espécies de fungos (BRIDGE; ARORA, 1998). Em geral o Rapd tem sido mais amplamente utilizado em nível infraespecífico, como na identificação de grupos de linhagens patogênicas, produtoras de toxinas, entre outros (BRIDGE; ARORA, 1998). Uma desvantagem que com frequência é atribuída a esse método reside na baixa reprodutibilidade nos perfis de bandas obtidos (BRADSHAW et al., 2006).

O AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados) envolve a ligação de adaptadores às extremidades de fragmentos de DNA clivados com enzimas de restrição, os quais fornecem sítios de anelamento de primers com alta restringência para as amplificações por PCR (BRADSHAW et al., 2006). Os produtos de amplificação por PCR são submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida e geram um grande número de fragmentos, os quais são resolvidos em um único gel (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Apesar de o AFLP ser uma técnica mais robusta que o Rapd, é tecnicamente mais laboriosa e, por isso, tem sido pouco utilizado na identificação de linhagens para fins de diagnóstico (BRADSHAW et al., 2006).

Uma das aplicações dos marcadores Rapd e AFLP é a identificação de bandas polimórficas, denominadas Sequence Characterized Amplified Regions (Scars), as quais são clonadas, sequenciadas e utilizadas no desenvolvimento de marcadores espécie específicos ou linhagem específicos (BRADSHAW et al., 2006; MCCARTNEY et al., 2003).

Os marcadores repetitive sequence based-PCR (rep-PCR) foram, originalmente, desenvolvidos para o estudo de diversidade e identificação de bactérias (BRUIJN, 1992; VERSALOVIC et al., 1991, 1994). Os elementos repetitivos parecem estar localizados em distintas posições intergênicas no genoma, em ambas as orientações, e supõe-se que, por serem associadas a graus elevados de polimorfismo, essas regiões gênicas tenham uma participação em processos de evolução adaptativa, mediando a interação dos microrganismos com ambientes hostis. Existem três famílias principais de elementos, incluindo as sequências Repetitive Extragenic Palindromic (REP), Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (Eric) e elementos BOX, para as quais foram desenvolvidos e otimizados primers (BRUIJN, 1992; VERSALOVIC et al., 1991, 1994), que vêm sendo amplamente utilizados desde então. Inclusive, esses primers também têm sido utilizados em fungos para a identificação de linhagens, permitindo a diferenciação de isolados intimamente relacionados de uma mesma espécie (ATKINS; CLARK, 2004; BRIDGE; ARORA, 1998; MORTON et al., 2003).

No Brasil, a caracterização de rizóbios por rep-PCR tem sido vastamente documentada (ALBERTON et al., 2006; BARCELLOS et al., 2007; BATISTA et al., 2007; BINDE et al., 2009; FERNANDES et al., 2003; GRANGE; HUNGRIA, 2004; HUNGRIA et al., 2000, 2006, 2008; KASCHUK et al., 2006; MENNA et al., 2009b; PINTO et al., 2007; SANTOS et al., 1999; STOCCO et al., 2008). Inclusive, em função da facilidade, alta reprodutibilidade e baixo custo da análise, BOX-PCR foi, recentemente, definido como método oficial do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) para a caracterização de estirpes de rizóbios autorizadas para a produção de inoculantes comerciais no Brasil (HUNGRIA et al., 2008). Os perfis de BOX-PCR dessas estirpes já estão disponíveis (BINDE et al., 2009; MENNA et al., 2009b).

3. Protocolos

A seguir serão descritos protocolos de algumas metodologias moleculares com base em PCR utilizadas em estudos de diversidade e na identificação de isolados de bactérias e fungos de interesse agrícola (isolados do solo, endofíticos, epifíticos, simbióticos, entre outros):

1) Estudos de diversidade e identificação de isolados fúngicos com base nas sequências ribossomais ITS1, 5,8S e ITS2 por PCR-RFLP.

2) Utilização dos marcadores Rapd em estudos de diversidade de isolados fúngicos, na diferenciação de linhagens e na obtenção de marcadores espécie específicos ou linhagem específicos.

3) Estudos de diversidade e identificação de isolados bacterianos com o uso dos marcadores rep-PCR (BOX-PCR).

4) Estudos de filogenia e taxonomia de bactérias por MLSA.

3.1. Estudos de diversidade e identificação de isolados fúngicos com base nas sequências ribossomais ITS1, 5,8S e ITS2 por PCR-RFLP (VIAUD et al., 2000)

Dentre as metodologias para o estudo da diversidade e para a identificação de isolados de fungos, será descrita a metodologia utilizada por Viaud et al. (2000). Essa metodologia pode ser aplicada tanto para a identificação de fungos isolados em meio de cultura, como para fungos não cultiváveis, identificados a partir do DNA total extraído de amostras de solo, pela amplificação por PCR com o uso de primers específicos para o DNA ribossomal e análise por RFLP.

3.1.1. Extração do DNA

Para a extração de DNA dos isolados de fungos pode-se utilizar o protocolo descrito no item 3.2.1, ou utilizar kits de extração de DNA disponíveis comercialmente, como o DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany), seguindo o protocolo descrito pelo fabricante. No caso das extrações de DNA total do solo, podem-se utilizar os kits disponíveis comercialmente, como o PowerSoil DNA Combo Kit (MO BIO, Carlsbad, USA), seguindo o protocolo descrito pelo fabricante.

3.1.2. Amplificações por PCR da região ITS1, 5,8S e ITS2 do DNAr

Para as amplificações por PCR da região ITS1 – 5,8S – ITS2, podem ser utilizados os primers listados na Tabela 1.

Tabela 1. Primers utilizados para a amplificação da região ITS1 – 5,8S – ITS2 de fungos.

Primer

Sequência

PN3

5’ – CCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATC – 3’

PN10

5’ – TCCGCTTATTGATATGCTTAAG – 3’

PN34

5’– TTGCCGCTTCACTCGCCGTT – 3’

Fonte: Viaud et al. (2000).

No caso das amplificações a partir do DNA extraído de isolados de fungos, são utilizados, para as reações de PCR, os primers PN3 e PN10. No caso das amplificações a partir do DNA extraído do solo, devem-se utilizar os primers PN3 e PN34.

Em todas as análises devem ser incluídos os DNAs de linhagens padrões ou referência das espécies ou gêneros em estudo, os quais serão utilizados nas análises comparativas dos perfis de bandas obtidos por RFLP.

Conforme descrito por Viaud et al. (2000), as reações de PCR podem ser realizadas da seguinte maneira: para um volume final de 50 µL utilizar, aproximadamente, 50 ng de DNA molde, 200 µmol de cada dNTP (desoxirribonucleotídeos fosfatados: dATP-desoxiAdenosina Trifosfatada; dCTP- desoxiCitidina Trifosfatada; dGTP-desoxiGuanosina Trifosfatada e dTTP-desoxiTimidina Trifosfatada), 1 unidade (U) de enzima Taq DNA polimerase e 0,2 µmol de cada primer. No caso das amplificações a partir de DNA extraído do solo, devem-se incluir, na mistura de reação de PCR, 2 µL de albumina de soro bovino (2,5 µg/mL) para evitar a atividade de substâncias inibitórias nas amostras de DNA.

Os ciclos de amplificação consistem de 30 ciclos de 60 segundos a 95 oC, 90 segundos a 50 oC e 60 segundos a 72 oC. Os produtos de amplificação devem ser submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% (peso/volume, p/v). Os géis podem ser corados com solução de brometo de etídio (ver o preparo no item 3.2.2) e fotografados em um transiluminador sob radiação ultravioleta (UV) de comprimento de onda curto. Em todas as reações de PCR, deve-se utilizar o controle negativo contendo todos os reagentes menos o DNA da amostra, para certificar-se que não ocorram amplificações em razão de contaminações com DNA exógeno, presente em algum dos reagentes utilizados.

Os produtos de amplificação obtidos a partir do DNA total extraído do solo devem ser clonados em vetor apropriado para clonagem de produtos de PCR, como o pGEM T easy vector (Promega) ou o TOPO TA cloning (Invitrogen), seguindo o protocolo descrito pelo fabricante. Cada clone obtido deve ser reamplificado com o uso da combinação de primers PN3/PN10 para a realização das análises de RFLP.

3.1.3. RFLP

Para as análises de RFLP são realizadas quatro reações de clivagem com as endonucleases HaeIII, HinfI, Hin6I e NdeII. Para as reações de clivagem devem-se utilizar 5 µL do produto de PCR e 10 U de enzima de restrição em 10 µL de tampão da enzima, fornecido pelo fabricante. As reações de clivagem devem ser incubadas por 1 hora (h) a 37 oC, posteriormente submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2%.

3.1.4. Análise dos resultados

Com base nos resultados obtidos por Viaud et al. (2000), espera-se que os produtos de amplificação por PCR obtidos a partir das amplificações com o uso de DNA obtido dos isolados de fungos (primers PN3 e PN10) tenham um tamanho aproximado entre 400 e 700 pares de bases (pb). No entanto, espera-se que os produtos de amplificação obtidos com o uso do DNA total extraído do solo (primers PN3 e PN34) tenham um tamanho aproximado entre 350 e 1.000 pb.

No caso das amplificações descritas por Viaud et al. (2000), a digestão dos produtos de amplificação com as enzimas de restrição (endonucleases de restrição) utilizadas, as quais apresentam sítio de reconhecimento de restrição de quatro bases, geraram de uma a quatro bandas visíveis.

Para a identificação dos isolados fúngicos ou dos clones obtidos a partir das amplificações do DNA total do solo, os perfis de bandas devem ser comparados com as linhagens padrões (ou linhagem tipo) da espécie/gênero em estudo. Sendo identificado um perfil de banda idêntico ao das linhagens padrões, a espécie ou gênero é identificado; caso contrário, alternativamente, pode-se realizar o sequenciamento da região amplificada (previamente clonada no vetor plasmidial apropriado, por exemplo, o pGEM T easy vector ou o TOPO TA cloning), e a sequência obtida pode ser utilizada em comparações e análise de similaridade com sequências ribossomais de isolados e linhagens de fungos depositadas em bancos de dados públicos, como o Genbank (NCBI), por meio de análises de similaridade, por exemplo, com o uso do programa Blast (NCBI).

3.2. Utilização dos marcadores Rapd em estudos de diversidade de isolados fúngicos, na diferenciação de linhagens e na obtenção de marcadores espécie específicos ou linhagem específicos

Será utilizado, como exemplo, o uso do Rapd em fungos filamentosos. Para isso, o método de extração de DNA utilizado nesse protocolo é o descrito por Raeder e Broda (1985).

3.2.1. Extração de DNA de fungos filamentosos (RAEDER; BRODA, 1985)

Para a extração de DNA, as linhagens devem ser crescidas em meio líquido adequado para cada espécie, por um período de 24 a 30 horas (este tempo varia conforme o crescimento de cada linhagem ou espécie), sob agitação (150 rotações por minuto, rpm), a 37 oC ou conforme a temperatura ótima de crescimento da espécie. Após esse período, o micélio deve ser filtrado em filtro Büchner, lavado em água destilada esterilizada e, em seguida, pesado. O micélio deve ser triturado em nitrogênio líquido e distribuído em tubos, sendo que para cada grama de micélio devem ser adicionados 2,1 mL de tampão de extração. Para um volume final de 200 mL, adicionar 40 mL de Tris [tris(hidroximetil)aminometano] 1 mol/L, pH 8,0; 10 mL de NaCl (cloreto de sódio) 5 mol/L; 10 mL de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) 0,5 mol/L, pH 8,0 e 20 mL de SDS (dodecil sulfato de sódio) 10%, completando o volume com água destilada e esterilizada. A solução deve ser preparada no momento do uso. Para o preparo da solução de Tris, devem-se adicionar 121,1 g de Trizma-base (Tris-base) para um volume final de 1.000 mL de água destilada e desionizada, e o pH deve ser ajustado para 8,0 com HCl concentrado. A solução deve ser autoclavada e mantida a 4 oC. Essa mistura deve ser incubada por 15 minutos a 65 oC. Após o período de incubação, adiciona-se um volume de fenol equilibrado de origem comercial, pH 8,0, misturam-se as fases e centrifugam-se a 12.000 rpm por 10 minutos em microcentrífuga. Despreza-se a fase fenólica e acrescenta-se, à fase aquosa, um volume de clorofane (mistura de fenol e clorofórmio na proporção 1:1, v/v). Misturam-se as fases e centrifuga-se como anteriormente. Despreza-se a fase fenólica e adiciona-se, à fase aquosa, um volume de clorofil (mistura de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1, v/v). Misturam-se as fases e centrifugam-se como nos passos anteriores. Após a centrifugação, retira-se a fase aquosa e adiciona-se NaCl 3 mol/L para uma concentração final de 0,3 mol/L. Adicionam-se dois volumes de etanol absoluto, resfriado a -20 oC. Mistura-se vagarosamente, até visualizar o DNA precipitado. Os tubos de microcentrífuga contendo o DNA precipitado são, então, submetidos à centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos. Após a secagem do DNA à temperatura ambiente, esse é ressuspenso em 200 µL de tampão TE. Para um volume final de 100 mL de tampão Tris-EDTA, adicionam-se 1 mL de Tris 1 mol/L, pH 7,6 e 0,2 mL de EDTA 0,5 mol/L, pH 8,0 e completa-se o volume para 100 mL com água destilada. A solução deve ser autoclavada e mantida a 4 oC. Por fim, os DNAs extraídos devem ser quantificados e sua integridade verificada em gel de agarose a 0,8%.

3.2.2. Amplificação de DNA por Rapd

As reações de amplificação devem ser preparadas para um volume final de 30 µL, contendo: tampão (Tris 20 mmol/L, pH 8,4; KCl 50 mmol/L); mistura de nucleotídeos (0,25 mmol/L); primer (0,4 µmol/L) (as sequências dos primers utilizados em Rapd podem ser obtidas a partir do endereço eletrônico da empresa Operon3; MgCl2 (3,4 mmol/L); enzima Taq DNA polimerase (2 U) e DNA genômico (15 ng). As reações controle devem consistir na adição de todos os componentes da reação, exceto o DNA genômico. A amplificação deve ser realizada em um termociclador programado para realizar uma desnaturação inicial a 94 oC por 5 minutos, seguida de 40 ciclos de 1 minuto a 92 oC, 1 minuto a 35 oC, 2 minutos a 72 oC e uma extensão final de 5 minutos a 72 oC.

Amostras de 20 µL dos produtos de amplificação devem ser misturadas com, aproximadamente, 3 µL de tampão da amostra (6X). Para um volume final de 100 mL do tampão de amostra, devem-se adicionar 0,25 g de azul de bromofenol e 15 g de Ficoll, completando-se o volume final com água destilada. O tampão deve ser estocado a 4 oC. Os fragmentos devem ser separados por eletroforese, a 3 V/cm, em gel de agarose a 1,4%. Para o preparo do gel de agarose 1,4%, deve-se adicionar, a 1,4 g de agarose, um volume de tampão TBE 1X, de forma a completar o volume final de 100 mL; a solução deve ser aquecida para dissolver a agarose e, em seguida, vertida na forma para a confecção do gel. Para o preparo do tampão TBE 10X, devem-se adicionar, para um volume final de 1.000 mL, 108 g de Trizma-base, 55 g de ácido bórico (H3BO3) e 40 mL de EDTA, 0,5 mol/L, ajustado em pH 8,0. A solução deve ser autoclavada e guardada à temperatura ambiente. No momento do uso devem ser feitas as diluições apropriadas para obter o TBE 1X. Como padrão de peso molecular pode ser utilizado, por exemplo, o marcador 100 pb DNA Ladder (Invitrogen). Após a eletroforese, o gel de agarose deve ser corado em solução de brometo de etídio (SAMBROOK et al., 1989). Para o preparo da solução de brometo de etídio, deve-se dissolver 1,0% de brometo de etídio (p/v) em água destilada. A solução deve ser agitada por várias horas e estocada à temperatura ambiente. No momento do uso, devem ser adicionados, a 800 mL de tampão TBE (1X), 40 µL dessa solução. Decorridos 15 minutos, o gel corado pode ser visualizado sobre um transiluminador sob radiação UV e fotodocumentado. Para a realização da eletroforese, deve-se utilizar o mesmo tampão utilizado na confecção do gel de agarose, no caso aqui descrito o tampão TBE 1X.

3.2.3. Análise dos dados

Para as análises de Rapd faz-se necessário que as reações de amplificação de cada amostra de DNA sejam: i) realizadas com, no mínimo, três repetições, para que se verifique a constância dos perfis de bandas obtidos; ii) que bandas que não estejam presentes em todas as repetições não sejam consideradas nas análises.

Nos estudos de diversidade, os perfis de bandas obtidos são analisados com o uso de programas de computação, como o NTSYS (Exeter software), Bionumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica), que usam algoritmos, os quais são utilizados para inferir a similaridade genética entre os isolados ou linhagens fúngicas e que geram dendrogramas, onde os isolados ou linhagens são agrupados de acordo com a similaridade (DEMEKE; ADAMS, 1994).

3.2.4. Obtenção de marcadores espécie específicos ou linhagem específicos (Scars)

Para o desenvolvimento de marcadores espécie específicos ou linhagem específicos, deve-se identificar, inicialmente, a existência de bandas presentes somente nas linhagens ou isolados de interesse e ausentes nos demais isolados. No caso de marcadores espécie específicos, as linhagens ou isolados utilizados devem ser representativos da espécie em estudo, e, também, devem-se utilizar isolados ou linhagens das outras espécies conhecidas do gênero nas comparações (DNYANESHWAR et al., 2006; SU et al., 2008).

Inicialmente, devem-se obter os perfis de bandas com o uso de diferentes primers. Em seguida, verifica-se a presença de bandas específicas somente na linhagem de interesse ou na espécie de interesse. Após a identificação da banda de interesse, esta deve ser isolada do gel de agarose com o uso de um estilete ou bisturi e purificada com o uso de kits comerciais para a purificação de DNA a partir de géis de agarose (como o QIAquik Gel Extraction kit da empresa Qiagen), seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Após a purificação do DNA, este deverá ser clonado em um vetor plasmidial específico para clonar produtos de PCR, como exemplo podemos citar o pGEM-T easy vector da Promega ou o TOPO TA cloning vector da Invitrogen, seguindo o protocolo do fabricante. Após a clonagem, o fragmento de DNA clonado deve ser sequenciado, e, com base na sequência de DNA obtida, devem-se construir primers para a amplificação específica dessa região no genoma da espécie ou linhagem de interesse. Os primers construídos devem ser testados para a amplificação por PCR utilizando a linhagem (ou espécie) de interesse e, como controle negativo, as outras linhagens da espécie ou, alternativamente, as outras espécies do gênero. Deve-se verificar a amplificação específica do fragmento de DNA de interesse somente na linhagem (ou espécie) de interesse e não nas outras linhagens (ou espécies) utilizadas como controles.

3.3. Estudos de diversidade e identificação de isolados bacterianos com o uso dos marcadores rep-PCR (BOX-PCR)

Será utilizado, como exemplo, o rep-PCR com o primer BOX. Conforme já comentado, essa metodologia tem sido utilizada com bastante sucesso em estudos de diversidade e identificação de isolados e estirpes de rizóbios. A metodologia descrita a seguir foi baseada em Hungria et al. (2008) e está sendo adotada oficialmente pelo Mapa para a identificação de estirpes de rizóbios.

3.3.1. Extração do DNA

As análises para a obtenção dos perfis de BOX-PCR são realizadas, preferencialmente, com o DNA das bactérias, havendo, para isso, vários métodos de extração de DNA. As análises também podem ser feitas diretamente, utilizando-se colônias puras ou meio líquido; contudo, os estudos de otimização e validação conduzidos por nosso grupo de pesquisa indicam que a utilização de DNA extraído e purificado resulta em melhor qualidade e repetibilidade dos resultados. As bactérias podem ser colocadas para crescer em meio extrato de levedura-manitol. YM, yeast-mannitol, também conhecido como Meio 79, contém, em 1 L, 10,0 g de manitol; 0,5 g de K2HPO4 (fosfato de potássico di-básico); 0,2 g de MgSO4.7H20 (sulfato de magnésio); 0,1 g de NaCl; 0,4 g de extrato de levedura, completado com água destilada e com pH ajustado a 6,8, mas modificado para conter 5,0 g/L de manitol, visando diminuir a produção de exopolissacarídeos. As bactérias também podem ser colocadas em outros meios que se mostrem adequados para o seu crescimento, por exemplo, o meio triptona-extrato de levedura. TY, tryptone-yeast, contém, em 1 L, 5,0 g de triptona; 3,0 g de extrato de levedura; CaCl2.H2O (cloreto de cálcio), 0,87 g; completado com água desionizada e pH ajustado de 6,8 a 7,2, útil no caso de bactérias apresentando grande produção de exopolissacarídeos.

Para a extração do DNA das bactérias, recomenda-se que as mesmas sejam colocadas para crescer em 15 mL a 20 mL do meio YM por 3 a 10 dias, dependendo da taxa de crescimento, com agitação de 150 rpm a 200 rpm, em temperatura adequada para cada espécie; no caso de rizóbios, aproximadamente 28 °C, com incubação no escuro. Todas as soluções utilizadas para a extração do DNA devem ser previamente autoclavadas. Após a incubação, centrifugar as suspensões bacterianas a, aproximadamente, 10.000 rpm, a 4 °C, durante 10 minutos e descartar o sobrenadante. Em seguida, ressuspender o pélete e lavar por 3 vezes, com 5 mL de solução salina (NaCl a 0,85%), podendo, ainda, no caso de bactérias com grande produção de exopolissacarídeos, fazer uma última lavagem com solução salina tamponada de fosfato [PBS 1 X, contendo, em 500 mL, 4,383 g de NaCl 150 mmol/L; 0,1793 g de NaH2PO4.H2O (fosfato de sódio monobásico) 2,6 mmol/L; 1,36 g de Na2HPO4.12H2O (fosfato de sódio dibásico) 7,6 mmol/L]. Centrifugar e descartar o sobrenadante. Depois da última lavagem, acrescentar 1 mL de solução salina ou PBS, homogeneizar e transferir o pélete para um tubo de ensaio de vidro ou outro recipiente. Ajustar a concentração de células a, aproximadamente, 109 células/mL, pela adição de solução salina e calibração, que pode ser efetuada utilizando diferentes métodos, incluindo leitura da densidade ótica em espectrofotômetro no comprimento de onda de 520 nm a 540 nm (caso a curva de crescimento da bactéria já tenha sido determinada), ou por leitura em câmaras de crescimento Petroff-Hausser ou Helber (SOMASEGARAN; HOBEN, 1994), ou, ainda, visualmente, utilizando padrões de soluções de McFarland de sulfato de bário (SOMASEGARAN; HOBEM, 1994). Transferir aproximadamente de 1,4 mL a 1,5 mL para um outro tubo de PCR de 1,7 mL ou 2 mL de capacidade (no tubo de 1,7 mL a visualização do pélete é mais fácil), centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente (sempre que se referir à temperatura ambiente, neste protocolo, ela será de 21 °C a 23 °C) e descartar o sobrenadante. Em seguida, ressuspender o precipitado em 400 µL de TE 50:20 (50 mmol/L de Tris, pH 8,0; 20 mmol/L de EDTA-Na2 pH 8,0), adicionar 50 µL de SDS a 10% (10 g de SDS em 100 mL de água), 10 µL de proteinase K (10 mg/mL, mantida no congelador a -20 oC), 10 µL de lisozima (5 mg/mL, mantida no congelador a -20 oC), 2 µL de RNAse (10 mg/mL, mantida conforme especificação do fabricante) e, então, incubar a 37 ºC por aproximadamente 1 hora (ou até que o material se torne mais claro). Na sequência, as amostras podem ser homogeneizadas com ponteiras de 1 mL com a ponta cortada (aspirar e soltar o material bem lentamente), por 3 vezes, para retirar a viscosidade. A seguir, acrescentar 30 µL de NaCl 5 mol/L (resultando em uma concentração final de 250 mmol/L), 70 µL de AcONa 3 mol/L (concentração final de 300 mmol/L) e 28 µL de água Milli-Q. As amostras devem ser bem homogeneizadas e deixadas em repouso por 1 hora na geladeira (aproximadamente 8 °C) e, em seguida, centrifugadas a 12.000 rpm durante 15 minutos, em temperatura ambiente. Recolher 300 µL do sobrenadante de cada amostra e adicionar 600 µL (ou 2 volumes, no caso de menor volume de sobrenadante) de etanol puro (95% a 99%), gelado (aproximadamente -20 ºC), armazenando-se, então, por uma noite, a -20 ºC. No dia seguinte, centrifugar as amostras a 12.000 rpm durante 15 minutos, em temperatura ambiente, descartar o etanol e adicionar 400 µL a 1 mL de etanol a 70% (temperatura ambiente), visando lavar bem o pélete e retirar o excesso de sais. Centrifugar novamente a 12.000 rpm durante 5 minutos, em temperatura ambiente, descartar o etanol e secar os precipitados, também em temperatura ambiente por, aproximadamente, 3 horas. Ressuspender os precipitados em 50 µL de água Milli-Q ou TE 10:1 (10 mmol/L Tris pH 8,0; 1 mmol/L EDTA, pH 8,0), ambos previamente esterilizados. As amostras podem ser armazenadas a -20 ºC, mas a qualidade do DNA sempre deve ser verificada antes de cada análise.

3.3.2. Verificação da qualidade do DNA

Para confirmar a concentração e pureza do DNA, as amostras podem ser submetidas à eletroforese em minigel de agarose de 10 cm x 11 cm a 1,0% (0,4 g de agarose em 40 mL de TBE 1X). Aplicar 2 µL da amostra adicionados a 2 µL de tampão de amostra (0,25% de azul de bromofenol e 40% de sacarose ou 30% de glicerol). Submeter à eletroforese durante 40 minutos a 80 Volts. Como essa é apenas uma etapa de verificação, outros tamanhos de géis, bem como o tempo e a voltagem, podem ser alterados. A concentração do DNA pode ser verificada por comparação com padrões de peso molecular conhecidos, por exemplo, LambdaTM (InvitrogenTM) ou Low DNA Mass Ladder (InvitrogenTM), ou outro padrão similar. A pureza e concentração do DNA devem ser verificadas após a coloração com brometo de etídio e visualização em um transiluminador sob radiação ultravioleta de comprimento de onda curto, ou pelo uso de outro corante que tenha a mesma finalidade, adequando os filtros e comprimentos de onda para esse corante. Equipamentos de quantificação de DNA também podem ser utilizados. A pureza do DNA pode ser verificada, no gel, pela análise de uma única banda de DNA, sem qualquer tipo de arraste; no caso de leitura em espectrofotômetro, a relação das leituras nos comprimentos de onda 260/280 nm deve ficar entre 1,8 e 2,0. A concentração do DNA deve ser ajustada para a concentração desejada, recomendando-se 50 ng/µL, usando água Milli-Q esterilizada como diluente.

3.3.3. Reação de BOX-PCR

Para as amplificações por BOX-, Eric- e REP-PCR são utilizados os primers descritos por Versalovic et al. (1991, 1994), Koeuth et al., (1995) e de Bruijn (1992) e listados na Tabela 2.

Tabela 2. Primers utilizados nas análise de rep-PCR de bactérias.

Primer

Sequência

BOX

5’— CTACGGCAAGGCGACGCTGACG – 3’

REP 1R

5’— IIIICGICGICATCIGGC – 3’

REP 2I

5’— ICGICTTATCIGGCCTAC – 3’

Eric 1R

5’— ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’

Eric 2

5’— AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’

Na reação de BOX-PCR, o primer BOX será utilizado para a amplificação seguindo a metodologia descrita por Versalovic et al. (1994) e Koeuth et al. (1995), com as modificações especificadas por Hungria et al. (2008). Visando à uniformização para a obtenção de perfis idênticos, a reação de amplificação deverá ser conduzida em um volume final de 25 µL, contendo água Milli-Q estéril, 13,8 µL; dNTPs, 5,0 µL (estoque com 1,5 mmol/L de cada base); tampão 10X (500 mmol/L KCl; 200 mmol/L Tris, pH 8,4), 2,5 µL; MgCl2, 1,5 µL (50 mmol/L); primer, 1,0 µL (50 pmol/µL); DNA, 1,0 µL (50 ng/µL); Taq, 0,2 µL (5 U/µL). As concentrações podem ser ajustadas no caso de reagentes com concentrações distintas.

A amplificação será realizada usando-se os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial a 95 °C por 7 minutos; 30 a 35 ciclos de desnaturação (1 minuto a 94 °C), anelamento (1 minuto a 53 °C) e extensão (8 minutos a 65 °C); 1 ciclo de extensão final a 65 °C por 16 minutos; manutenção a 4 °C. Para a análise com DNA, 30 ciclos são suficientes, enquanto que, para células ou colônias, recomendam-se 35 ciclos (VERSALOVIC et al., 1994).

Depois da amplificação, adicionar, aos 25 µL de cada reação, 5 µL de tampão de amostra (0,25% de azul de bromofenol e 40% de sacarose ou 30% de glicerol). Preparar um gel de agarose (low EEO, type I-A) a 1,5%, diluído em tampão TBE 1X. Adicionar 250 mL da solução a uma bandeja de cuba de eletroforese de, aproximadamente, 20 cm x 25 cm. Nas canaletas do gel, colocar 30 µL de cada amostra, com exceção da primeira canaleta, da última e, preferencialmente, também da central, nas quais devem ser colocados 5 µL de padrão, por exemplo, do padrão de peso molecular de 1 kb plus DNA LadderTM (InvitrogenTM), ou outro padrão similar. Para preparar o padrão de 1 kb plus DNA LadderTM, para cada 1 µL do marcador, deve-se adicionar 2 µL de tampão de amostra e 7 µL de água Milli-Q; desse modo, a aplicação de 5 µL corresponde a 0,5 µg de padrão. Incluir sempre tubos controle, contendo todos os reagentes da reação de PCR, exceto pelo DNA, para verificar possíveis contaminações. Aplicar a voltagem de 120 V (aproximadamente 5 V/cm) e correr à temperatura ambiente por, aproximadamente, 6 horas e 30 minutos (entre 6 e 7 horas), até que faltem cerca de 2 cm para o final do gel. Corar o gel com brometo de etídio, visualizar em transiluminador sob radiação UV e fotografar.

3.3.4. Estirpes apresentando perfis idênticos por BOX-PCR

No caso de estirpes apresentando o mesmo perfil de BOX-PCR, podem-se obter, se necessário, comprovação de identidade, os perfis de Eric-PCR ou REP-PCR. Para a reação de amplificação, devem-se utilizar as mesmas concentrações recomendadas para BOX-PCR, exceto que, pela utilização de 2 primers, adicionando 1 µL de cada um (50 pmol/µL), o volume final de 25 µL levará 1 µL a menos de água Milli-Q estéril.

A reação de amplificação será realizada segundo Bruijn (1992) e Versalovic et al. (1994), com as modificações efetuadas por Santos et al. (1999), resultando nos ciclos descritos a seguir: para REP 1R e REP 2I, 1 ciclo a 95 °C por 7 minutos; 30 a 35 ciclos a 94 °C por 1 minuto, a 45 °C por 1 minuto e a 65 °C por 8 minutos; 1 ciclo final de extensão a 65 °C por 16 minutos, mantendo-se, então, a 4 °C. Para os primers Eric 1R e Eric 2, os ciclos serão de 1 ciclo de 95 °C por 7 minutos; 30 a 35 ciclos a 94 °C por 1 minuto, a 52 °C por 1 minuto e a 65 °C por 8 minutos; 1 ciclo final de extensão a 68 °C por 16 minutos, mantendo-se, então, a 4 °C. A corrida em gel de eletroforese deverá ser realizada conforme descrito para BOX-PCR.

3.3.5. Análises dos dados

Como descrito para a técnica de Rapd, os produtos de amplificação pela técnica de BOX-PCR podem ser analisados em estudos de diversidade ou identificação de isolados, com o auxílio de programas de computação específicos para essa finalidade, como o NTSYS e Bionumerics, por exemplo. O programa Bionumerics permite a análise das bandas do gel e a construção de dendrogramas, por exemplo, com o uso do algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) (Sneath; Sokal, 1973) e o coeficiente de Jaccard (JACCARD, 1912).

Recomenda-se que bandas de peso molecular iguais ou superiores a 12.000 pb e inferiores a 300 pb não sejam consideradas, pois apresentam maior variabilidade e podem representar falsos produtos de PCR.

3.4. Estudos de filogenia e taxonomia de bactérias por MLSA

3.4.1. Reações de amplificação por PCR do DNA

Inicialmente, deve-se proceder à extração do DNA, conforme descrito no item 3.3.1. Para o estudo de MLSA, podem ser amplificados por PCR diversos genes housekeeping. Como exemplo, a Tabela 3 relaciona alguns primers utilizados em estudos conduzidos com rizóbios (MENNA et al., 2009a; RIBEIRO et al., 2009).

Tabela 3. Primers utilizados em análises por MLSA em rizóbios.

Gene (≈bp)

Primer

Sequência (5’ - 3’)

pb(1)

Referência

16S RNAr

(1,500)

fD1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1,422

(para fD. rD1)

Weisburg et al. (1991)

Y2

CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT

Young et al. (1991)

362f

CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG

Menna et al. (2006)

786f

CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG

Menna et al. (2006)

rD1

AAGGAGGTGATCCAGCC

Weisburg et al. (1991)

dnaK (1,900)

dnaK1466F

aaggarcancagatccgcatcca

305

Martens et al. (2007)

dnaK1777R

tasatsgcctsrccragcttcat

recA (1,090)

recA6F

cgkctsgtagaggayaaatcggtgga

498

Gaunt et al. (2001)

recA555R

cgratctggttgatgaagatcaccat

recA (outra opção)

BRdnaKf

TTCGACATCGACGCSAACGG

524

Menna et al. (2009a)

BRdnaKr

GCCTGCTGCKTGTACATGGC

gltA (1,290)

gltA428F

CSGCCTTCTAYCAYGACTC

644

Martens et al. (2007)

gltA1111R

GGGAGCCSAKCGCCTTCAG

glnII (1,040)

TSglnIIf

AAGCTCGAGTACATCTGGCTCGACGG

647

Stepkowski et al. (2005)

TSglnIIr

SGAGCCGTTCCAGTCGGTGTCG

rpoA (1,010)

RRrpoAf

GGAAATCGCCATCAAGATGG

637

Ribeiro et al. (2009)

RRrpoAr

GGAAATCGCCATCAAGATGG

atpD (1,460)

TSatpDf

TCTGGTCCGYGGCCAGGAAG

577

Stepkowski et al. (2005)

TSatpDr

CGACACTTCCGARCCSGCCTG

(1) Obtidos pela amplificação.

As condições de amplificação do DNA devem ser conduzidas conforme descrito anteriormente, para o 16S rRNA, recA, glnII e atpD (MENNA et al., 2006), e para dnaK, gltA e rpoA (RIBEIRO et al., 2009), conforme também pode ser visualizado na Tabela 4.

Tabela 4. Condições de amplificação por PCR para os genes 16S RNAr, dnaK, recA, gltA, glnII, rpoA e atpD com o uso dos primers relacionados na Tabela 3.

Gene

Ciclo de amplificação

16S RNAr

2 minutos 95 °C, 30 X (15 segundos 94 °C, 45 segundos 93 °C, 45 segundos 55 °C, 2 minutos 72 °C), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 °C

dnaK

1 minuto 94 °C, 35 X (1 minuto 94 °C, 1 minuto 64 °C, 40 segundos 72 °C), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 °C

recA

2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final de extensão de 7 minutos 72 °C

gltA

5 minutos 95 °C, 3 X (2 minutos 94 °C, 2 minutos 53 °C, 1 minuto 72 °C), 30 X (30 segundos 94 °C, 1 minuto 53 °C, 1 minuto 72 °C), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 °C

glnII

2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final de extensão de 7 minutos 72 °C

rpoA

2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 94 ºC, 45 segundos 55 ºC, 2 minutos 72 ºC), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 ºC

atpD

2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final de extensão de 7 minutos 72 °C

Os produtos amplificados deverão ser purificados, por exemplo, com o kit QIAquick PCR purification kit (Qiagen), segundo instruções do fabricante, e sequenciados diretamente, conforme especificação do fabricante para cada sequenciador.

3.4.2. Análise dos dados

Deve-se proceder ao alinhamento das sequências para cada gene. Para isso, pode-se utilizar, por exemplo, o programa Clustal_X (THOMPSON et al., 1997). Às sequências obtidas nos estudos devem ser adicionadas sequências de estirpes de referência, ou estirpes tipo. Primeiro, as sequências obtidas devem ser analisadas individualmente, considerando-se apenas o bloco de sequências alinhadas com todos os indivíduos estudados. As sequências individuais podem, então, ser unidas (concatenadas) e analisadas usando programas como o Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega) (KUMAR et al., 2004), por exemplo, com o modelo de distância K2P (KIMURA, 1980) e o algoritmo Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987). Recomenda-se, também, o teste de suporte estatístico de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985), com 1.000 ou 2.000 amostragens.

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Capítulo 2
Métodos moleculares na análise da diversidade de fungos micorrízicos

Adália Cavalcanti do Espírito Santo Mergulhão
Márcia Vanusa da Silva
Elaine Malosso

1. Introdução

A micorriza arbuscular é uma simbiose mutualística entre raízes da maioria das plantas e fungos do filo Glomeromycota (SCHÜBLER et al., 2001). A impossibilidade de crescimento dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA) em meios sintéticos na ausência de raízes metabolicamente ativas e a não caracterização da fase sexuada em seu ciclo de vida fazem com que a identificação e classificação desses fungos estejam baseadas, quase que exclusivamente, na morfologia e estrutura de seus esporos vegetativos (MORTON, 1993). A caracterização fenotípica pode ser influenciada por condições ambientais e pelo estádio de desenvolvimento dos esporos, introduzindo problemas para a identificação precisa de populações de FMA oriundas do campo, bem como para o acompanhamento de espécies introduzidas. É extremamente difícil distinguir as espécies de FMA durante a fase simbiótica micelial nos tecidos radiculares (SALLES; SOUZA, 1998), além do mais, várias espécies recentemente caracterizadas não coram com os procedimentos padrões (REDECKER et al., 2000). As dificuldades de cultivar os FMA in vitro representam um obstáculo ainda não superado, limitando os estudos de sua biologia e aplicação biotecnológica. A biologia molecular tem permitido identificar fungos a partir de esporos coletados diretamente do campo e também identificar FMA que estão colonizando as raízes (DICKIE; FITZJOHN, 2007; GAMPER; LEUCHTMANN, 2007; JOLLER; ROSENDAHL., 2000; KOWALCHUK et al., 2002; MERGULHÃO et al., 2008; RENKER et al., 2006,).

Considerável atenção tem sido dirigida para o aspecto genético das populações microbianas em uma tentativa de melhorar o conhecimento dos táxons microbianos (BRUNS et al., 1991) e suas relações filogenéticas (BILLS et al., 1999; HIBBETT et al., 2007). Como relativamente poucos microrganismos são cultiváveis (HEAD et al., 1998), os estudos envolvendo extração de DNA e análise de sequências de fragmentos de DNA têm aumentado significativamente desde o advento da reação em cadeia da polimerase (PCR) nos anos 80 (SAIKI et al., 1988). Os métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidos tão rapidamente que o sequenciamento comparativo de genes homólogos está rapidamente se tornando uma técnica padrão na sistemática e filogenética molecular.

A abordagem com uso de PCR não está livre de problemas em virtude da possibilidade da lise incompleta das células, extração incompleta do DNA do solo e vieses da PCR (MUYZER; SMALLA, 1998). Bruns e Gardes (1993) afirmam que a região ideal para realizar amplificações de PCR deve atender os seguintes critérios: a) estar presente em todos os fungos de interesse: b) ser fácil de amplificar; c) amplificar preferencialmente o DNA do fungo, quando este se encontra junto com o DNA da planta; d) ser suficientemente variável para permitir desenhar iniciadores para numerosas hierarquias taxonômicas. Os genes que codificam o rRNA atendem muitos desses critérios, por isso têm sido comumente utilizados neste tipo de estudo (GAMPER; LEUCHTMANN, 2007; GRIFONI et al., 1995; RENKER et al., 2003, 2006). Dentre estes genes, as regiões codificadoras (18S, 5.8S e 28S) são as mais conservadas, as regiões internas (ITS) mostram variações intraespecíficas, e as regiões intergênicas (IGS) são as mais variáveis (Figura 1) (LANFRANCO et al., 1998).

Com os avanços das técnicas de biologia molecular, várias análises como RFLP (ITS, IGS), AFLP, ARISA, LH-PCR, DGGE, TGGE e t-RFLP têm sido usadas em estudos direcionados à caracterização da diversidade e da dinâmica de comunidades microbianas, incluindo as de fungos micorrízicos. Este capítulo tem por objetivo revisar de forma sucinta os principais métodos moleculares empregados atualmente no estudo de FMA e apresentar alguns protocolos de execução destes métodos.

,

Figura 1. Representação de uma unidade de rDNA mostrando as regiões ITS (espaços internos transcritos) e a posição de anelamento dos principais iniciadores.
Fonte: White et al. (1990).

2. PCR-RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição)

Análises de fragmentos de restrição de DNA amplificados por PCR constituem uma ferramenta poderosa que permite a detecção de moléculas de ácidos nucleicos específicos presentes em pequenas quantidades e tem sido aplicada com sucesso na identificação de FMA. Os polimorfismos no comprimento de fragmentos, baseados na técnica PCR-RFLP, podem ser observados em gel de agarose após corte por enzimas de restrição dos fragmentos de DNA de fita dupla, possibilitando que o DNA de dois ou mais indivíduos sejam comparados. O polimorfismo ocorre porque o DNA de indivíduos geneticamente distintos difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita. Ao ser submetido à clivagem com uma enzima de restrição, o DNA de indivíduos geneticamente distintos é cortado nos sítios de restrição, gerando fragmentos de diversos tamanhos. A base genética do polimorfismo observado resulta de mutações nos sítios de restrição ou de inserções, deleções e rearranjos entre estes sítios.

2.1. Etapas envolvidas na análise do PCR-RFLP

-- Extração de DNA (método abaixo citado).

-- Amplificação do fragmento de interesse em termociclador (Tabela 1).

-- Corte do DNA com enzimas de restrição (Tabela 2).

-- Separação por eletroforese dos fragmentos em gel de agarose 1% (1 g de agarose em 100 mL de tampão TBE 1X).

Obs.: [TBE 5X: 54 g Tris-básico; 27 g de ácido bórico; 20 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) e completar para 1 L de água].

[TBE 1X: retirar 200 mL da solução de TBE 5X e completar para 1.000 mL de água].

-- Gel corado com SybrGold, visualizado em U.V. (ultravioleta) e fotografado.

Tabela 1. Modelo para preparo da reação de PCR.

Reagente (concentração estoque)

Quantidade para volume final de 25 µL

Água estéril

16,7 µL

Tampão (10X)

2,5 µL

MgCl2 (2,5 mM)

1,25 µL

dNTP (0,3 µM)

0,75 µL

Iniciadores (2 µM)

0,5 µL

Taq (1 U–5 U)

0,3 µL

DNA (20 ng–40 ng)

3,0 µL

Fonte: Ferreira e Grattapaglia (1998).

Tabela 2. Modelo para preparo da solução de digestão de DNA com enzima de restrição.

Reagente

Quantidade para
1 indivíduo

Quantidade para 100 indivíduos

10X tampão da enzima

2,0 µL

200 µL

RNAase A (5 µg/µL)

1,0 µL

100 µL

Água estéril

5,5 µL

550 µL

Enzima (10 U/µL)

1,5 µL

150 µL

DNA

1,0 µL

–

Obs.: colocar o tubo com os reagentes acima citados em banho-maria a 37 °C por 4 a 6 horas ou em termociclador.

Fonte: Ferreira e Grattapaglia (1998).

2.2. Extração de DNA

Extração de DNA dos esporos de FMA segundo Lanfranco et al. (2001) com algumas modificações:

2.2.1. Procedimento/Protocolo – Extração de DNA a partir de esporos de FMA

-- Separe 150 a 200 esporos de FMA com auxílio de uma lupa.

-- Lave várias vezes os esporos de FMA em água destilada estéril.

-- Transfira os esporos limpos com ajuda de uma pipeta para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.

-- Leve os tubos de microcentrífuga para um sonicador e execute de 3 a 4 ciclos por 30 segundos cada.

-- Macere os esporos com ajuda de um micropistilo em 50 µL de tampão de reação de PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,1 mM MgCl2).

-- Submeta as amostras a 10 choques térmicos (microtubo fechado) em nitrogênio líquido e banho-maria a 100 ºC, 1 minuto cada choque.

-- Incubar a 95 ºC por 15 minutos em banho-maria e centrifugue a 10.000 g por 5 minutos.

-- Coletar o sobrenadante e estocar a -20 ºC.

3. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

O termo AFLP significa polimorfismo de comprimentos de fragmentos amplificados, inicialmente descrito por Vos et al. (1995). A técnica associa o polimorfismo gerado por enzimas de restrição com a capacidade de detecção da técnica de PCR. Nesta técnica, o DNA genômico clivado por enzimas de restrição tem suas extremidades ligadas a pequenas sequências de DNA (adaptadores) que se anelarão com oligonucleotídeos específicos, durante a PCR. A técnica de AFLP apresenta vantagens, tais como a detecção de grande número de amplicons por reação, com ampla cobertura do genoma e considerável reprodutibilidade (DOUHAN; RIZZO, 2003; SPOONER et. al., 2005). O polimorfismo gerado por este tipo de marcador pode ser decorrente de mutações de ponto no sítio de corte da enzima, provocadas por deleções, inversões ou inserções de bases. Essa alteração pode levar a perda ou ganho de um sítio de restrição reconhecido pela enzima (MUELLER; WOLFENBARGER, 1999).

Os kits comerciais empregam as enzimas de restrição EcoRI e MseI simultaneamente, seguidas da ligação com os adaptadores específicos. Ver instruções do manual técnico do kit AFLP® Analysis System for Microorganisms (Invitrogen life technologies) e kit AFLP™ Microbial Fingerprinting (Applied Biosystems).

A visualização dos fragmentos gerados pela técnica de AFLP pode ser feita utilizando marcações radioativas, em que um dos oligonucleotídeos utilizados na amplificação é marcado por um isótopo (geralmente 32P). Um método de coloração alternativo, que utiliza nitrato de prata associado ao carbonato de sódio, tem sido utilizado com sucesso em vários laboratórios.

Abaixo segue descrito um protocolo otimizado baseado em Vos et al. (1995) para o marcador AFLP utilizando a coloração com prata adaptada de Creste et al. (2001) para revelação dos fragmentos.

3.1. Passo 1: digestão do DNA genômico

Componentes

Para uma amostra

H2O ultrapura

Completar volume para 50 µL

Enzima 1 (EcoRI)

5 unidades

Enzima 2 (MseI)

5 unidades

Tampão 10X OPA

5,0 µL

DNA (25 ng/µL)

10,0 µL

Ao se utilizar outras enzimas, deve-se verificar qual tampão é ideal para eficiente digestão. Incubar a 37 ºC por 2 a 3 horas. Inativar as enzimas a 70 ºC por 15 minutos. Estocar a -20 ºC.

3.2. Passo 2: ligação dos adaptadores

3.2.1. Preparo dos adaptadores

Adaptador EcoRI (suficiente para 120 ligações)

5,6 µL do adaptador EcoRI foward (600 ng/µL) (5’CTC GTA GAC TGC GTA CC3’)

4,8 µL do adaptador EcoRI reverso (600 ng/µL) (5’AAT TGG TAC GCA GTC TAC3’)

6,0 µL tampão OnePhorAll (OPA) (GE Healthcare Life Sciences)

103,6 µL de H2O ultrapura

Adaptador MseI (suficiente para 120 ligações)

64 µL do adaptador Mse I foward (500 ng/µL) (5’CGATGAGTCCTGAG3’)

56 µL do adaptador Mse I reverso 500 ng/µL) (5’TACTCAGGACTCAT3’)

7 µL tampão OnePhorAll (OPA) (GE Healthcare Life Sciences)

13 µL de H2O ultrapura

Imediatamente após o preparo, os adaptadores deverão ser submetidos, em termociclador, ao seguinte programa: 1) 65 ºC 10 minutos; 2) 37 ºC 10 minutos; 3) 25 ºC 10 minutos. Estocar os adaptadores a -20 ºC.

3.2.2. Reação de ligação

Componentes

Volume para uma amostra (µL)

H2O ultrapura

6,7

Adaptador EcoRI

1,0

Adaptador MseI

1,0

Tampão 10X da ligase

1,0

T4 DNA ligase (3 unid/µL)

0,33

Adicionar os 10 µL desse mix (reação de ligação) aos 50 µL do DNA já digerido, com as enzimas de restrição (passo 1); incubar a amostra a 20 ºC por 3 horas; estocar a -20 ºC.

3.3. Passo 3: pré-amplificação

Componentes

Volume para uma amostra (µL)

H2O ultrapura

11,4

Tampão 10X da taq polimerase

2,0

MgCl2 (25 mM)

1,2

Mix dNTP’s (10 mM)

0,8

Oligonucleotídeo EcoRI (25 ng/µL) (5’GACTGCGTACCAATCA3’)

1,0

Oligonucleotídeo MseI (25 ng/µL) (5’TGAGTCCTGAGTAAC3’)

1,0

Taq polimerase (5 unid/µL)

0,6

DNA ligado aos adaptadores*

2,0

* Passo 2.

3.3.1. Programa para pré-amplificação

Temperatura (ºC)

Tempo (min)

Número de ciclos

94

2

1

94

1

26

56

1

72

1

72

5

1

Após a pré-amplificação acrescentar 80 µL de água ultrapura. Estocar a -20 ºC.

3.4. Passo 4: reação de amplificação seletiva

Componentes

Volume para uma amostra (µL)

H2O ultrapura

12,5

Tampão 10X da taq polimerase

2,0

MgCl2 (25 mM)

1,2

Mix dNTP’s (10 mM)

0,4

Oligonucleotídeo EcoRI (25 ng/µL)

1,0

Oligonucleotídeo MseI (25 ng/µL)

1,0

Taq polimerase (5 unid/µL)

0,4

DNA pré-amplificado

1,5

3.4.1. Programa para amplificação seletiva

Temperatura (ºC)

Tempo (min)

Número de ciclos

94

2

1

94

0,3

12

65

0,3

72

1

94

0,3

23

56

0,3

72

1

72

2

1

Estocar a -20 ºC.

3.4.2. Sugestões de combinações dos oligonucleotídeos EcoRI e MseI a serem utilizados na reação de amplificação seletiva

Denominação

Sequência do par de oligos 5’- 3’

Oligo 1

E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG

Oligo 2

E-GACTGCGTACCAATCACA/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 3

E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 4

E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAT

Oligo 5

E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 6

E-GACTGCGTACCAATCAAG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAA

Oligo 7

E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAC

Oligo 8

E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG

3.5. Visualização dos produtos amplificados via AFLP

Os produtos das amplificações podem ser analisados em gel de poliacrilamida 6% em tampão TBE (89 mM Tris-base; 2 mM EDTA; 89 mM ácido bórico) em condições não desnaturante ou desnaturante.

3.6. Preparo da matriz de poliacrilamida (30%)

Atenção: acrilamida é tóxica e deve ser manipulada com cuidado. Usar luvas e máscara até a polimerização.

N,N’ metilenebisacrilamida

1,0 g

Acrilamida

29,0 g

H2O destilada

Completar volume para 100 mL

Aquecer a 37 ºC para dissolver. Manter a solução sob penumbra (evitar luz direta).

3.7. Protocolo de gel não desnaturante

Gel de poliacrilamida – gel protean pequeno 6%

H2O destilada

9 mL

Matriz de poliacrilamida (30%)

3 mL

TBE 5X

3 mL

Persulfato de amônia 10%

80 µL

Temed

40 µL

Total

15 mL

Preparo das amostras: carregar normalmente o gel empregando um tampão de carregamento com azul de bromofenol.

Eletroforese: 120 V em tampão TBE 1 X por 4 horas.

3.8. Protocolo de gel desnaturante

Eletroforese em cuba de sequenciamento

Tratamento das placas de vidro para facilitar a manipulação e coloração do gel: as placas de vidro devem ser tratadas, sendo a maior (42 cm x 42 cm) com 2 mL de Plus One Repel Silane (GE Healthcare Life Sciences). Após a secagem, o excesso do produto deve ser retirado com lenço de papel umedecido em água destilada. A outra placa de vidro (menor) de 39 cm x 42 cm deve receber solução de 2 mL de PlusOne Bind Silane. Após secagem, o excesso deve ser retirado com lenço de papel umedecido em etanol 95%.

Solução de poliacrilamida e 7 M ureia em TBE para gel de sequenciamento.

Matriz de poliacrilamida (30%)

100 mL

TBE 5 x

100 mL

Ureia

210 g

H2O destilada

Completar volume para 500 mL

Gel de poliacrilamida de sequenciamento 6%.

Gel de poliacrilamida de sequenciamento 6%

Solução de poliacrilamida e 7 M ureia em TBE

70 mL

Persulfato de amônia 10%

250 µL

Temed

100 µL

Total

70 mL

Carregar as placas de vidro com o gel com cuidado para evitar a formação de bolhas. A espessura do gel é de 0,2 mm a 0,5 mm.

Preparo das amostras: adicionar nas amostras de PCR, antes de carregar no gel, um volume na proporção de 1:1/2 de tampão de carregamento (95% formamida, 0,05% xylene cyanol, 0,05% bromophenol blue, 12,5% sacarose, 10 mM NaOH). As amostras são desnaturadas a 94 oC por 5 minutos e mantidas em gelo até o carregamento.

Eletroforese: pré-corrida – 65 V por 40 a 60 minutos, até aquecer o gel a 50 ºC–55 ºC; corrida – 50 V–60 V em tampão TBE 1 x por 2 horas.

3.9. Coloração do gel

Após a eletroforese, o gel deverá ser revelado sob agitação com as seguintes soluções:

A) Solução de fixação

B) Solução de pré-tratamento

1.780 mL de água ultrapura

2.000 mL de água ultrapura

20 mL de ácido acético glacial

30 mL de ácido nítrico

200 mL de etanol absoluto

Armazenar em geladeira.

Armazenar em geladeira.

C) Solução de impregnação

D) Solução reveladora

200 mL de água ultrapura

2.000 mL de água ultrapura

4 g de nitrato de prata

60 g carbonato de cálcio

Armazenar a temperatura ambiente em frasco escuro.

Agitar até dissolver completamente e deixar gelar. Na hora de utilizar, adicionar 1.080 µL de formaldeído.

E) Solução de bloqueio

1.900 mL de água ultrapura

100 mL de ácido acético glacial

Armazenar em geladeira.

Método para coloração com nitrato de prata

Procedimento

Solução

Tempo de agitação

Fixação

A

10 minutos

Lavagem

1 minuto

Pré-tratamento

B

2,40 minutos

Lavagem

1 minuto

Impregnação

C

20 minutos

Lavagem

2 x de 30 segundos

Revelação

D

Até aparecimento das bandas

Bloqueio

C

5 minutos

Lavagem

1 minuto

Fotografar o gel para realizar análise dos padrões amplificados.

4. Length heterogeneity polymerase chain reaction (LH-PCR)

Os genes do RNA ribossomal estão entre as sequências mais comuns e conservadas encontradas na natureza. Tipicamente os genes do rRNA de eucariotos são encontrados como unidades repetitivas em sequência (100 a 200 cópias), separadas por espaços não transcritos chamados NTS (Non Transcribed Spacers) (GUEVARA et al., 1992; RAMIREZ; GUEVARA, 1987; HERWERDEN et al., 2000). Cada unidade transcrita é composta pelos genes do rRNA 18S, 5,8S e 28S, bem como de várias regiões espaçadoras internas que são transcritas, chamadas ITS (Internal Transcribed Spacers), as quais são flanqueadas por sequências NTS.

Os ITS são regiões transcritas, porém não traduzidas dos genes do rRNA e demonstram uma ampla variabilidade, são relativamente pequenos e rodeados por segmentos altamente conservados, aos quais os iniciadores para PCR são direcionados (DÁVILA; MOMEN, 2000; FERNANDES et al., 1999; SOM et al., 2000). Essas sequências altamente variáveis são de grande importância para distinguir espécies fúngicas por análise da PCR. Uma das técnicas da PCR que utiliza a variabilidade das regiões ITS é LH-PCR que analisa a heterogeneidade de comprimentos dos amplicons da subunidade menor dos genes do RNA ribossomal (SSU rDNA). Fragmentos marcados com fluorescência são separados por eletroforese capilar e detectados a laser em sequenciador automático de DNA (MANTER; VIVANCO, 2007; RITCHIE et al., 2000; SUZUKI et al., 1998). Abaixo segue descrito um protocolo alternativo, em que os fragmentos gerados são clonados em vetor de clonagem e sequenciados, sem a utilização da marcação por fluorescência.

As etapas básicas para análise do LH-PCR são as seguintes:

Reação de amplificação.

Componente e concentração final na reação da PCR

Tampão 1X da taq polimerase

MgCl2 1,5 mM

Mix dNTP’s 1 mM

Oligonucleotídeo ITS1F 0,2 µM

Oligonucleotídeo ITS4 0,2 µM

Taq polimerase 2U

DNA molde 10 ng

H2O ultrapura para completar volume*

* O volume total da reação normalmente é de 25 µL.

Sequências dos oligonucleotídeos.

Denominação

Sequência do par de oligos 5’- 3’

ITS1F

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

ITS4

CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG

Programa para amplificação.

Temperatura (ºC)

Tempo

Número de ciclos

95

5 minutos

1

95

45 segundos

26

55

45 segundos

72

1 minuto

72

5 minutos

1

Estocar a -20 ºC.

4.1. Clonagem do fragmento gerado no PCR

O produto obtido por PCR será clonado em vetor T/A pCR2.1 Topo (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante, e será empregado na transformação em células de Escherichia coli DH5α.

4.2. Sequenciamento e análise das sequências

As sequências de nucleotídeos de cada inserto serão determinadas em sequenciador automático de DNA (ABI PRISM 377 Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), utilizando o kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems). Oligos convencionais, M13-Forward e M13-Reverse, serão utilizados para determinar as sequências de DNA. As sequências obtidas serão submetidas a uma análise de homologia/similaridade com sequências mantidas em banco de dados utilizando para tal o programa BlastX (ALTSCHUL et al., 1997), em bancos de dados National Center for Biotechnology Information1(NCBI), The Institute for Genomic Research2 (TIGR) e DNA Data Bank of Japan3(DDBJ).

5. Automated rRNA intergenic spacer analysis (Arisa)

Análise das regiões intergênicas do rRNA (Risa) é um método simples e confiável que explora a variabilidade no comprimento da região intergênica (IGS). Em fungos, a região analisada são os dois espaçadores internos transcritos e o gene 5.8S (ITS1-5.8S-ITS2) do operon rRNA de fungo. O Risa automatizado (Arisa) foi desenvolvido para melhorar a resolução e análise em escala em fungos (F-Arisa) (CARDINALE et al., 2004; FISCHER; TRIPLETT, 1999; RANJARD et al., 2000, 2001). Arisa envolve a utilização de um oligonucleotídeo marcado com fluorescência para PCR e posterior eletroforese em um sistema automatizado.

As etapas básicas para análise do F-Arisa são as seguintes:

Reação de amplificação.

Componente e concentração final na reação de PCR

Tampão 1X da taq polimerase

MgCl2 2,5 mM

Mix dNTP’s 200 µM

Oligonucleotídeo 2234C 1 µM*

Oligonucleotídeo 3126T 1 µM

Taq polimerase 2,5U

DNA molde 50 ng

H2O ultrapura para completar volume**

* Oligo 2234C 5’ marcado com 6-carboxifluoresceína (FAM).

** O volume total da reação normalmente é de 50 µL.

Sequências dos oligonucleotídeos.

Denominação

Sequência do par de oligos 5’- 3’

2234C

GTTTCCGTAGGTGAACCTGC

3126T

ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT

Programa para amplificação.

Temperatura (ºC)

Tempo

Número de Ciclos

94

2 min

1

94

15 s

30

55

15 s

72

45 s

72

5 min

1

Estocar a -20 ºC.

Preparo das amostras para sequenciamento: reações da PCR serão diluídos com 80 μL de água ultrapura. 2 μL da diluição serão adicionados a 13 μL de tampão de carregamento (12 μL de formamida, 0,5 μL de NaOH 0,3 M e 0,5 μL Genescan 2500 (Tamra)). A mistura deverá ser desnaturada a 95 °C por 5 minutos.

Sequenciamento: fragmentos Arisa serão resolvidos em gel poliacrilamida 6% em condições de desnaturação a 150 V por 12 horas em sequenciador ABI 373 (Applied Biosystems). Os dados serão analisados pelo programa GeneScan 3.1 (Perkin-Elmer). O software converte os dados de fluorescência em eletroforegrama. Os picos representam os fragmentos de tamanhos diferentes, e as alturas dos picos são proporções relativas dos fragmentos no produto total.

Análise das sequências: idem item das sequências do Length heterogeneity polymerase chain reaction (LH-PCR).

6. Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)

Uma variação da abordagem de PCR e clonagem, a eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE), foi introduzida por Muyzer et al. (1993). Na DGGE, fragmentos de DNA ribossomal amplificados por PCR, de mesmo comprimento, porém com sequências diferentes, são separados em géis de poliacrilamida. Essa separação é baseada na diminuição da mobilidade eletroforética de uma molécula de DNA de fita dupla parcialmente desnaturada ao longo de um gradiente linear de desnaturante de DNA (uma mistura de ureia e formamida). A desnaturação dos fragmentos de DNA ocorre nos chamados domínios de desnaturação, ou extensões de pares de bases com temperaturas de desnaturação idênticas. Assim que um domínio atinge sua temperatura de desnaturação (Tm) em uma posição particular do gradiente no gel desnaturante, uma modificação na molécula de DNA da forma helicoidal para parcialmente desnaturada ocorre, e a migração desse fragmento de DNA pelo gel praticamente para. Variações na sequência nesses domínios, principalmente no conteúdo de GC, implicam em diferenças na concentração de desnaturante que causará a perda da estrutura helicoidal, fazendo com que moléculas com sequências diferentes parem de migrar em diferentes posições no gel (MUYZER; SMALLA, 1998).

O uso da DGGE permite que muitas amostras coletadas em diferentes intervalos de tempo durante um estudo sejam simultaneamente analisadas. Essa é uma característica que faz da técnica uma poderosa ferramenta para o monitoramento do comportamento de comunidades após uma perturbação ambiental. Enquanto a maioria dos relatos sobre o uso da DGGE (e sua variante TGGE) é relacionada à análise do rDNA 16S de bactérias, em vários estudos têm sido usada essa abordagem para analisar comunidades fúngicas (KOWALCHUK et al., 1997; PENNANEN et al., 2001; SMIT et al., 1999).

Usando DGGE, aproximadamente 50% das sequências variantes podem ser individualizadas em fragmentos de DNA de até 500 bp embora a separação de fragmentos de até 1.650 bp já tenha sido relatada (PENNANEN et al., 2001). A porcentagem de bandas resolvidas em um gel desnaturante pode ser aumentada significativamente com a incorporação de uma sequência rica em GC (um GC-clamp) na extremidade 5’ de um dos iniciadores (MYERS et al., 1985 ). Este GC-clamp será coamplificado com a sequência alvo e, assim, introduzido nos fragmentos de DNA amplificados (SHEFFIELD et al., 1992). A sequência rica em GC age como um domínio de baixa desnaturação, evitando que as duas fitas de DNA se dissociem completamente em fitas simples (MUYZER et al., 1997). O uso de géis com gradiente crescente da concentração do desnaturante de cima para baixo, paralelo à direção da eletroforese, permite a análise de múltiplas amostras em um mesmo gel, facilitando comparações ecológicas (MUYZER, 1999).

Os fungos micorrízicos arbusculares também já foram estudados utilizando a técnica de DGGE (KOWALCHUK et al., 2002; LIANG et al., 2008; LIU et al., 2009; MA et al., 2005; ÖPIK et al., 2003; SOUZA et al., 2004, 2005). Nesse caso, porém, ainda não foi possível fazer inferências seguras sobre as comunidades de FMA pela simples análise do DNA total do solo em razão dos múltiplos núcleos geneticamente diferentes (PAWLOWSKA; TAYLOR, 2004) encontrados em um único esporo de FMA. Esses fungos apresentam, por assim dizer, uma população de núcleos (genomas) em seus esporos. Porém, genes como o rDNA, quando amplificado de amostras de DNA total do esporo, geram um perfil de bandas no gel de DGGE comparável ao obtido pela análise de amostras ambientais complexas, revelando a diversidade de sequências desse gene que podem ser encontradas em um único esporo.

6.1. Algumas vantagens e desvantagens do método de DGGE

Muyzer e Smalla (1998) afirmam que ao interpretar fingerprints de DGGE é necessário lembrar que bandas na mesma posição em um gel desnaturante têm o mesmo comportamento de desnaturação, mas não necessariamente a mesma sequência, e apenas o sequenciamento das bandas pode provar a identidade da sequência. A DGGE também apresenta duas outras limitações importantes: (1) é geralmente considerado possível separar apenas fragmentos relativamente pequenos, de até 500 bp, o que limita a quantidade de informação da sequência disponível para as inferências filogenéticas subsequentes quando as bandas são excisadas e sequenciadas, e (2) técnicas de DGGE e TGGE tendem a mostrar apenas os fragmentos de rDNA dos táxons predominantes na comunidade em razão dos vieses da PCR. Apesar dessas preocupações, a DGGE ainda é considerada um método confiável para a investigação da distribuição temporal e espacial das populações microbianas.

6.2. DGGE de fungos

Produtos de PCR de fungos, aproximadamente 400 bp), gerados por uma reação como a exemplificada na Tabela 3, podem ser separados em um gel de acrilamida a 6% com um gradiente desnaturante variando de 30% a 50% (MALOSSO et al., 2006). Os géis são preparados usando uma combinação proporcional de duas soluções desnaturantes. A primeira solução contém 3 mL de solução de acrilamida a 40% (v/v), 0,4 mL de tampão TAE 50× [0,04M Trisacetate (Tris (hydroxymethyl)aminomethane acetate), 0,01M EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), pH 8], 4 mL de solução de formamida e 4,2 g de ureia, preparados no volume de 20 mL com água desionizada. Isso resulta em uma solução de acrilamida a 6% (w/v) contendo 50% de desnaturante. A segunda solução, contendo 3 mL de solução de acrilamida a 40% (v/v), 0,4 mL de TAE 50×, 2,4 mL de solução de formamida e 2,52 g de ureia no volume final de 20 mL de água desionizada, resulta em acrilamida a 6% (w/v) contendo 30% de desnaturante. O gel é moldado verticalmente entre 2 placas de vidro previamente limpas e preparadas com uma solução de dimetildiclorosilano e separadas por 2 espaçadores de 1 mm. Imediatamente antes de verter o gel, 200 µL de solução de sulfato de amônio a 0,1% (w/v) e 20 µL de N, N, N’, N’-tetra metiletilenodiamina (Temed) são adicionados a cada 20 mL de solução como agentes polimerizantes. Os géis são vertidos com auxílio de um formador de gradiente que fará o gradiente mais forte no fundo, e um pente de dentes longos é inserido no topo, antes da polimerização, para formar os poços de amostras. Os géis podem ser colocados a 4 °C durante uma noite para garantir a completa polimerização. Recomenda-se a leitura do volume 68 da série Documentos da Embrapa (ABOIM et al., 2004).

Tabela 3. Exemplo de condições da PCR para um par de iniciadores, sendo um deles com GC-clamp, usados para amplificar a SSU rDNA de fungos para análise por DGGE.

Par de ini-

ciadores

Mistura

Condição da PCR no termociclador(2)

FR1(GC)/

FF390(1)

Componente
[Conc. estoque]

µL

Temperatura

1×

25x–30×

1×

10 × NH4

3

94 °C

10 minutos

1 minuto

-

10 mM dNTP

0,8

50 °C

-

45 segundos

-

FR1(GC) [10 pmol/µL]

3

72 °C

-

2 minutos

10 minutos

FF390 [10 pmol/µL]

3

50 mM MgCl2

1,6

Taq polimerase [10 U/µL]

0,2

DNA molde [100 ng/µL]

1–3

H2O para

30

(1) Fonte: Vainio e Hantula (2000).

(2) Fonte: Malosso et al. (2006).

O gel será carregado com uma mistura de 7 µL de tampão de aplicação de amostra contendo xileno cianol FF 0,25% (w/v), azul de bromofenol 0,25% (w/v), sacarose 40% (w/v) em água e a amostra (≅ 100 ng de produto de PCR), além de água para um volume total de 32 µL. As amostras correm lado a lado com 5 µL de um marcador de DNA a 0,05 mg/mL. A corrida se dá a 60 °C por aproximadamente 3 horas a 200 V em um sistema do tipo BioRad D GeneTM (BioRad, USA), alimentado por uma fonte de eletroforese. Após a eletroforese, o gel é corado com SYBR Green 1 (WANG et al., 2000) por 30 minutos sob uma leve agitação e digitalizado por 40 segundos sob luz UV em um sistema de foto-documentação de gel.

Bandas únicas, selecionadas do gel de DGGE, podem ser excisadas usando uma ponteira de pipeta estéril. A banda do gel será colocada em 12 µL de água ultrapura e o DNA eluído do gel pode ser usado como molde para reações de PCR e os produtos sequenciados para análises filogenéticas.

7. Eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE)

A eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE) é uma variação da técnica DGGE. Na TGGE (do inglês Temperature Gradient Gel Electrophoresis, MUYZER, 1999), o gel é preparado com uma solução de desnaturante sem a formação do gradiente químico. O aparelho de eletroforese, no entanto, é diferenciado gerando um gradiente de temperatura no gel, que corre na posição horizontal. O princípio da técnica é o mesmo da DGGE, ou seja, a molécula de DNA irá se desnaturar em uma dada combinação de temperatura e concentração de agente desnaturante (BIOMETRA, 2000). Como o gradiente de desnaturante e um gradiente de temperatura apresentam uma relação linear, as duas técnicas são de um ponto de vista teórico praticamente idênticas. Porém, os gradientes químicos tais como os usados em DGGE não são facilmente reprodutíveis, são difíceis de estabelecer e frequentemente não individualizam completamente os heteroduplexes (TSOLAKIDOU et al., 2003).

7.1. Condições recomendadas como ponto de partida para a otimização individual para a análise da diversidade microbiana

Composição do gel

Tampão TAE 1X

Poliacrilamida (37,5:1) 6%

Ureia 8 M

Glicerol 2%

Formamida 20%

Gradiente de temperatura

L1: 33 °C, L6 44 °C

Eletroforese

130 V, 2 horas

O preparo do gel é um passo que requer maior cuidado do pesquisador. Como um sistema tamponado deve ser escolhido, é importante que o sistema permaneça estável no contexto do aumento da temperatura. Assim, a ureia é tipicamente utilizada para o preparo do gel; entretanto, o pesquisador precisa estar atento ao fato de que a quantidade de ureia usada terá um impacto na temperatura geral requerida para desnaturar o DNA (BIOMETRA, 2000). Dependendo do tipo de TGGE que será realizada, perpendicular ou paralela, quantidades variáveis de amostras precisarão ser preparadas e carregadas. Quantidades maiores de uma amostra são usadas com gel perpendicular, enquanto uma quantidade menor de muitas amostras é usada em TGGE paralela. Uma desvantagem desta técnica, em relação à DGGE, é que o equipamento para a eletroforese com gradiente de temperatura é mais caro.

O uso da TGGE para fungos micorrízicos é muito mais restrito que o uso da DGGE. Um estudo empregou a técnica associada a uma variável temporal como ferramenta para a caracterização de FMA (CORNEJO et al., 2004). No entanto, a técnica foi proposta nesse estudo para a análise do rDNA 18S de diferentes espécies de Glomus. Mesmo limitando o uso para apenas um gênero, o screening revelou que a região amplificada pelo par de iniciadores NS31-AM1 continha variação insuficiente para discriminar as espécies. Em contraste, a análise da região amplificada pelo par de iniciadores NS31-Glo1, obtida pela técnica de PCR nested com o produto de NS31-AM1, mostrou que cada espécie é caracterizada por um perfil de bandas específico. Entretanto, isolados da mesma espécie não puderam ser distinguidos.

8. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

A análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos terminais de restrição, do inglês Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism ou t-RFLP, é uma variação da técnica de PCR-RFLP em que um nucleotídeo fluorescente terminal é incorporado ao DNA amplificado. Posteriormente os amplicons são cortados com uma enzima de restrição (ER) e separados, por tamanho, em gel longo de poliacrilamida ou sistema capilar, com detecção a laser dos fragmentos marcados em um sequenciador automático (LIU et al., 1997). O método fornece perfis distintos (fingerprints) dependentes da composição de espécies nas comunidades das amostras e permite a análise comparativa das comunidades (CLEMENT et al., 1998; MARSH, 1999).

A técnica de t-RFLP tem sido comum nas análises de comunidades microbianas, porém são ainda poucos os estudos de comunidades fúngicas (BRODIE et al., 2003; BURKE, 2008; BURKE et al., 2005, 2006; MORRIS et al., 2008; SINGH et al., 2006; VANDENKOORNHUYSE et al., 2003).

O método de análise de comunidades utilizando a técnica de t-RFLP segue alguns passos: (1) obtenção das amostras; (2) extração de DNA; (3) amplificação do DNA alvo com iniciador marcado com um fluoróforo (4 repetições por amostra), combinação e purificação dos produtos em um único tubo e eletroforese em gel de agarose para verificação; (4) digestão com enzima de restrição dos produtos de PCR obtidos na etapa anterior; (5) eletroforese dos produtos de restrição em sequenciador de DNA e (6) análise dos dados. A digestão com ER é realizada com 10 µL de produto de PCR concentrado e purificado, conforme descrição na Tabela 2, em temperatura adequada para a enzima escolhida. A eletroforese dos fragmentos de restrição não necessita ser realizada imediatamente, no entanto, esses fragmentos devem ser armazenados em -20 °C até sua aplicação no gel.

O conjunto de iniciadores utilizados para a análise de fragmentos terminais de restrição (T-RF) é geralmente composto por um iniciador forward com a extremidade 5’marcada com fluorescência que irá se anelar à extremidade 3’ da fita antisenso e um iniciador reverse não marcado que irá se anelar à extremidade 3’ da fita senso do gene alvo (muitas vezes o rDNA SSU). A reação de PCR resultará em amplicons de DNA de fita dupla com a extremidade 5’ da fita senso marcada.

Na reação de restrição enzimática que se segue, cada amplicon dará origem a um fragmento de DNA terminal marcado (T-RF) e um ou mais fragmentos não marcados. O uso das endonucleases de restrição HhaI, RsaI, HaeIII e MSPI já foi relatado (PARK et al., 2006; TIEDJE et al., 1999). Porém, outras enzimas de restrição podem ser selecionadas de acordo com o conhecimento que se tenha sobre o gene/organismo alvo da pesquisa. Os fragmentos são então separados (± 1 a 2 bases, dependendo do comprimento total do fragmento) por eletroforese em um sequenciador automático, no qual os fragmentos marcados são reconhecidos por um detector de fluorescência. Padrões internos (marcadores de tamanho de fragmento com fluorescência) são incluídos em cada amostra.

O cromatograma resultante revela os tamanhos de fragmentos presentes na amostra, assim como a distribuição quantitativa relativa entre eles, sendo então possível comparar amostras de acordo com a presença/ausência de picos e a distribuição relativa dos picos. Para a eletroforese e detecção dos fragmentos terminais marcados, as amostras necessitam ser preparadas (passo 5 mencionado acima). Nessa etapa, os T-RFs são misturados com o tampão de corrida e com um marcador de tamanho de fragmentos (e.g. GS-1000 ROX, PE Biosystems), na seguinte proporção:

Marcador padrão

0,5 μL

Tampão de amostra

2,5 μL

T-RFs

2 μL

Volume total

5 μL

Uma mistura master (menos T-RFs) é preparada em volume suficiente para todas as amostras e distribuída (3 μL) em cada pocinho de uma placa de PCR de 96 poços, e então os 2 μL dos T-RFs são adicionados. A placa é colocada em um termociclador a 94 °C por 2 a 4 minutos para a desnaturação do DNA e transferida imediatamente para o gelo, onde será mantida até que as amostras (aproximadamente 2 μL) sejam carregadas no gel.

O gel utilizado nesse caso é de poliacrilamida, preparado de modo semelhante ao descrito para a análise de TGGE. Um técnico responsável pela operação do sequenciador geralmente executa essa etapa do trabalho. Algumas recomendações podem ser feitas para os passos mais críticos do processo:

1) As duas placas de vidro do sequenciador devem ser lavadas com sabão e água quente seguida de enxágue com água desionizada e enxágue final com água ultrapura, tomando-se cuidado especial na limpeza das faces internas que irão ter contato direto com o gel.

2) Observar que os espaçadores devem ser umedecidos antes de montados nas placas, e as outras partes deverão estar limpas e secas; todo o trabalho com acrilamida deve ser realizado em capela de exaustão.

3) Pode-se bater levemente na placa conforme o espaço do gel for sendo preenchido para evitar a formação de bolhas. Colocar o pente com a parte lisa (sem dentes) voltada para o gel e posicionar os grampos na placa de vidro ao redor do pente. O gel deve ser deixado para solidificar por pelo menos uma hora e meia.

4) Os lados de fora do conjunto de placas contendo o gel polimerizado devem ser limpos para remover resíduos de acrilamida que se queimariam nas placas, o que poderia também obstruir a passagem do laser do leitor. O pente deve então ser removido, o poço enxaguado com água ultrapura e o pente, depois de limpo com água, novamente posicionado no poço com os dentes pressionados aproximadamente 0,5 mm no gel.

5) Deve-se correr uma checagem da placa (comando ‘plate-check’). Se forem observados picos nessa etapa, limpar as placas novamente e correr outra checagem.

6) Carregar as amostras no gel aquecido a, no mínimo, 48 °C.

7) Após a corrida, checar visualmente se todas as canaletas foram corretamente rastreadas; corrigir manualmente, se necessário.

8) Os dados são fornecidos de duas formas: um eletroferograma (série de picos coloridos representando a comunidade microbiana), e uma tabela numérica que inclui o tamanho em pares de base e altura do pico representando uma medida relativa da proporção de cada população na comunidade.

Como ocorre com todas as técnicas de análise de comunidades microbianas, a t-RFLP também apresenta limitações. Avis et al. (2006) sugeriram que os estudos em que se emprega t-RFLP necessitam incluir informações sobre fungos conhecidos, identificados nos locais onde os estudos serão realizados e não confiar apenas nos perfis de t-RFLP. Edwards e Turco (2005) chamam a atenção para a escolha da enzima de restrição que pode influenciar fortemente a distinção entre as sequências, especialmente quando menos de três enzimas são usadas para grupos de espécies proximamente relacionadas. Isso mostra a necessidade de ter cautela na interpretação dos resultados, ainda mais porque já foi mostrado que fragmentos terminais de restrição (TRF) idênticos podem ser gerados para grupos de espécies não relacionadas.

Em uma tentativa de facilitar a interpretação dos resultados das análises de t-RFLP de comunidades microbianas complexas, Smith et al. (2005) propuseram uma ferramenta com base na web. Essa ferramenta4 (T-Align) – permite a comparação de múltiplos perfis de t-RFLP para identificação de componentes microbianos únicos e compartilhados de maneira mais rápida e com menor probabilidade de erro. O funcionamento dessa rotina se dá pela geração de um perfil consenso, baseado na comparação de repetições, contendo apenas os fragmentos que ocorrem em todas as repetições. Os perfis consenso das diferentes comunidades são comparados para produzir uma lista que mostrará se um TRF está presente em uma amostra em particular e também a sua fluorescência relativa.

9. Considerações finais

Os métodos baseados no DNA não são afetados por mudanças durante a ontogênese ou diferenciação de órgãos. Dessa forma, é urgente o desenvolvimento de ferramentas para detecção e identificação de FMA durante todos os estádios de seu ciclo de vida. Sem essa perfeita caracterização, torna-se difícil o uso otimizado dessa simbiose em campo, pois estudos básicos ligados à competição, sobrevivência, dispersão e eficiência ficam comprometidos quando executados em comunidades complexas como as encontradas em solos tropicais (SALLES; SOUZA, 1998). É importante salientar, também, que, na maioria dos casos, classificações baseadas em marcadores moleculares corroboram classificações feitas com base em características morfológicas (LEAL-BERTIOLI, 1998). O desenvolvimento de técnicas para a identificação taxonômica, associadas a novas ferramentas da biologia molecular, são pontos de grande importância para sustentar as pesquisas com FMAs no País, que é um grande centro de biodiversidade desses fungos.

10. Referências

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Capítulo 3
Análise in silico para o desenvolvimento de marcadores SNP-CAPS associados a características agronômicas

Laureen Michelle Houllou-Kido
Éderson Akio Kido
Ana Maria Benko Iseppon
Sérgio Crovella

1. Introdução

O melhoramento tradicional de plantas produziu, ao longo de séculos, cultivares e variedades mais produtivas e resistentes às condições adversas, bem como aos diferentes níveis tecnológicos dos produtores, utilizando-se principalmente da seleção massal de indivíduos superiores, oriundos de cruzamentos envolvendo uma mesma espécie ou da hibridização entre membros de diferentes espécies ou até de diferentes gêneros. No entanto, apesar desse sucesso, o desenvolvimento de novas cultivares pelo melhoramento convencional normalmente é muito demorado, em média, mais de uma década (LEWONTIN, 2004).

As últimas três décadas permitiram à agricultura testemunhar o desenvolvimento e a consolidação, em alguns casos com sucesso, do melhoramento assistido por marcadores moleculares. O desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores e a disponibilidade ou facilidade de obtenção poderiam facilitar a identificação de materiais promissores em processos seletivos demorados, de difícil instalação e/ou avaliação ou caros. Ao longo dessas décadas várias metodologias de marcadores moleculares foram desenvolvidas e empregadas: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Rapid Amplified Polymorphic DNAs (Rapd), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Simple Sequence Repeats (SSR), Single Nucleotide Polymorphism (SNP), etc. Um ponto em comum no uso dessas diferentes técnicas é que todas são baseadas em polimorfismos encontrados em DNAs genômicos. Em termos genéticos, esses marcadores moleculares têm se mostrado úteis na detecção de variabilidade genética caracterizando indivíduos ou mesmo bancos de germoplasmas. Além da finalidade acima, em termos agronômicos práticos, para auxiliar o melhoramento convencional, um fenótipo específico deveria ser associado com um dos polimorfismos vistos no DNA. No entanto, a utilização dessas metodologias com esse intuito pode ser custo-proibitiva, principalmente quando se avalia populações segregantes muito grandes. Assim, estratégias devem ser desenvolvidas visando desenvolver marcadores confiáveis e de custos mais acessíveis (BUCKLER; THORNSBERRY, 2002; WEISING et al., 2005).

Os projetos em Genômica, sejam eles estruturais ou funcionais gerados a partir de transcritos, vêm fornecendo ao longo dos anos informações extremamente relevantes com relação às sequências ou os genes envolvidos. Atualmente, existe uma quantidade relevante de sequências nucleotídicas disponibilizadas em bancos de dados públicos, que podem ser utilizadas para auxiliar o desenvolvimento de marcadores específicos para uma característica em estudo. Normalmente, as estratégias iniciais se baseiam na busca da(s) sequência(s) de interesse ou daquelas similares e que se encontram disponíveis nos bancos de dados, via análises computacionais. A seguir, verifica-se a possibilidade de desenhos de primers específicos, que poderão amplificar regiões alvo em DNAs genômicos ou mesmo a partir de transcritos, procurando validar os marcadores em diferentes genótipos ou seus devidos controles (JACKSON et al., 2006).

O polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) é uma das formas mais comum de variabilidade encontrada nos genomas. Os SNPs são uma variação da sequência de DNA que ocorre quando um nucleotídeo (A, C, G ou T) do genoma difere entre membros de uma mesma espécie (KWOK, 2000). Os SNPs ocorrem tanto nas regiões codantes como nas regiões não codantes e intergênicas (REGISTER et al., 2002). Em Arabidopsis, foram identificados cerca de 37.000 SNPs entre 2 acessos (JANDER et al., 2002). Já em milho, foi descrita a ocorrência de SNP a cada 31 pb em regiões não codantes e a cada 124 pb em regiões codantes (CHING et al., 2002). Essa variabilidade tem recebido muita atenção dos pesquisadores, objetivando-se associar características importantes a um haplótipo específico (CONG et al., 2002; KNIGHT, 2004). De fato, os marcadores baseados em SNPs pertencem a mais recente geração de marcadores moleculares utilizados para a genotipagem, com vistas a uma seleção futura assistida por marcadores (MAS). O desenvolvimento de marcadores SNPs baseia-se, em sua maioria, no conhecimento e compreensão da base genética envolvida nas características agronômicas importantes. Dessa forma, seria possível correlacionar um polimorfismo com os genes envolvidos com o fenótipo alvo.

A principal diferença entre os marcadores tradicionais (RFLP, AFLP, SSR) e os marcadores baseados em SNPs é que os primeiros requerem a utilização de eletroforese, ao passo que algumas das diferentes metodologias para o desenvolvimento de marcadores SNPs dispensam a mesma. Outro aspecto importante dos marcadores SNPs é que eles são excelentes para mapear genes que controlam características complexas, auxiliando dessa forma o desenvolvimento de mapas gênicos de alta resolução (NAKITANDWE et al., 2007).

Existem várias metodologias descritas e utilizadas para o desenvolvimento de marcadores SNPs. Neste capítulo, será descrita uma abordagem in silico para desenvolvimento de marcadores SNP-CAPS.

2. Levantamento de sequências no banco de dados

O trabalho se inicia com o levantamento das sequências relacionadas à característica ou aos genes de interesse nos bancos de dados. Atualmente, um grande número de bancos de dados, principalmente de sequências expressas, aquelas derivadas de transcritos com cauda Poli A e que são denominadas Expressed Sequence Tags (EST) (Tabela 1), tem permitido explorar de uma forma eficiente o polimorfismo do tipo SNP em genes.

Tabela 1. Exemplo de bancos de dados disponibilizados na internet com sequências EST de plantas.

Banco de dados de EST de plantas

Endereço eletrônico

PlantGDB

http://www.zmdb.iastate.edu/PlantGDB

NCBI Unigenes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov./UniGene

TIGR Plant Genes Indices

http://www.tigr.org/tdb/tgi/plant.shtml

Solanaceae genomic network

http://sgn.cornell.edu/

B-EST barley database

http://:pgrc.ipk_gatersleben.de/est/est/login

Nesses bancos de dados, realizam-se buscas de sequências EST relacionadas com a característica alvo, por exemplo, genes induzidos por ABA, com tolerância à seca, relacionada com estresses, etc. As sequências em formato FASTA podem ser agrupadas em arquivos multifasta, conforme o interesse, por exemplo, por gênero vegetal, para análises posteriores. Esse formato é o mais comumente aceito pelas diferentes ferramentas de bioinformática.

A busca pode ser feita por palavra-chave ou empregando-se uma sequência conhecida em programas que realizam alinhamentos, comparando a similaridade entre sequências, por exemplo, ferramentas Basic Local Alignment Seach Tool (Blast) (ALTSCHUL et al., 1990). Sequências similares apresentam relevante grau de identidade, pareamento das mesmas bases em um alinhamento. Essa similaridade, no entanto, não necessariamente está associada ao desempenho de mesma função biológica pelas sequências alinhadas. Isso só pode ser definido a partir de experimentos desenhados para esse propósito. Se as sequências similares compartilham uma ancestralidade em comum e foram sabidamente relacionadas com as mesmas funções, elas são consideradas também homólogas. A similaridade entre sequências é determinada não somente pelo percentual de nucleotídeos idênticos em DNAs e cDNAs ou aminoácidos, proteínas, em comum entre as sequências comparadas, mas também por parâmetros como: Expectation value (E-value), tamanho do trecho alinhado, presença ou não de gaps, que representam inserções ou deleções presentes na sequência fornecida (query) ou na sequência do banco de dados (subject).

Um alinhamento de boa similaridade apresenta mais de 70% dos nucleotídeos idênticos, os mesmos, nos mesmos locais, em sequências query e subject com mais de 100 nucleotídeos. Um dos parâmetros mais importantes na identificação de similaridade é o E-value. De uma maneira simplificada, o E-value pode ser definido como o número de vezes de concordância (match) da sequência query alinhadas com sequências do banco de dados somente em razão do acaso. Sendo assim, quanto mais baixo for o valor do E-value, menores as chances desse alinhamento ter ocorrido em razão do acaso. Este valor leva em conta também o tamanho da sequência e do banco em questão (KORF et al., 2003). No presente caso, recomenda-se trabalhar com sequências cujo resultado do Blastn forneça um E-value igual ou menor que 0,06. Alguns bioinformatas consideram similaridade entre sequências cujo E-value é igual ou menor que 0,01. Outros são mais restritivos, recomendando a seleção de sequências cujo E-value é igual ou menor que 0,001. No entanto, a definição de um valor de E-value utilizado como ponto de corte (Threshold) varia de acordo com a finalidade do trabalho a ser desenvolvido (ex.: identificação de sequências provenientes de uma biblioteca de cDNA, filogenia, etc.) e o tipo de sequência que se busca similaridade ou homologia (proteína ou DNA).

Para tornar mais didáticas as diferentes etapas das análises bioinformáticas que precedem a validação em bancada, será utilizado um conjunto de sequências pertencentes à família gênica Heat Shock Proteins (HSPs) da espécie vegetal Glycine soja, depositadas no banco de dados NCBI.

As HSPs estão associadas a mecanismos de adaptação dos organismos à condição de estresse. Elas correspondem a membros de várias famílias de proteínas conservadas, cuja função parece estar correlacionada com a preservação e reparo de estruturas macromoleculares durante a desidratação ou reidratação (VERTUCCI; FARRANT, 1995). As principais classes descritas em plantas são: Hsp60; Hsp70; Hsp90 e Hsp100. Embora todos os organismos sintetizem HSPs em resposta ao calor, o balanço de proteínas sintetizadas e a relativa importância das famílias individuais de HSP na tolerância ao estresse variam enormemente entre organismos (QUEITSCH et al., 2000). Proteínas resistentes ao calor já foram identificadas em eixos embrionários de sementes de soja, sendo o seu acúmulo variável de acordo com as condições de dissecação ou embebição.

O trabalho in silico se inicia com a mineração das sequências alvo no banco de dados NCBI1. Na página principal, deve-se digitar na caixa de busca (Search) as palavras-chave Heat Shock proteins Glycine (Figura 1), bem como individualizar o banco a ser pesquisado ou não (em todos os bancos de dados seria All Databases).

Figura 1. Página inicial do NCBI. A seta indica a caixa de busca onde devem ser colocadas as palavras-chave.

Das 584 sequências ESTs (Figura 2), 39 foram descritas para G. soja (Figura 3). Um número maior de sequências poderá ser encontrado em virtude dos depósitos constantes de novas sequências nos bancos de dados NCBI. É comum, mesmo utilizando-se palavras-chave específicas, o aparecimento na página de resultados de sequências não correlacionadas, em princípio, com a busca inicial. No caso, sequências de HSP relacionadas aos gêneros Brassica, Prunus e Malus foram listadas (Figura 3). Isso ocorre como consequência das informações fornecidas para cadastramento das sequências no banco de dados, quando alguma referência à palavra Glycine (ex.: similar a HSP70 de Glycine) teria sido feita, mesmo em se tratando de sequência de outra espécie ou gênero. Para se obter somente as sequências de G. soja clica-se no link correspondente (Figura 3).

Figura 2. Exemplo da página de resultado do NCBI utilizando-se as palavras-chave Heat Shock Protein Glycine. A seta indica o link para acesso às sequências EST.

Figura 3. Página do NCBI com sequências obtidas a partir da busca com palavras-chave. A seta indica link para obtenção das sequências de Glycine soja.

Uma nova página de resultados será aberta (Figura 4). Para obtenção das sequências em seu formato FASTA deve-se selecionar a opção na caixa Display, que originalmente apresenta Summary como default, bem como alterar em Show o número de sequências exibidas, de 20 para 50. Por sua vez, para salvar as sequências FASTA em arquivo para análises posteriores em seu computador, seleciona-se a opção file na caixa Send to.

Figura 4. Tela parcial de resultados mostrando setas para tipo de informações (Display), número de sequências por tela (Show), modo de ordenamento (Sort by) e enviar para (Send to).

Para maximizar a possibilidade de identificação de polimorfismos SNP e o desenvolvimento de marcadores específicos relacionados, é necessário levantar o maior número possível de sequências FASTA relativas aos genes envolvidos com a característica alvo. Quanto maior o número de genes e de sequências, maior a chance de identificar polimorfismos úteis para desenhos de iniciadores específicos. Os arquivos multifasta gerados e salvos (Figura 5) serão utilizados nas demais análises.

Figura 5. Exemplo de sequências em formato FASTA.

3. Preparo das sequências

3.1. Clusterização – Identificação dos contigs e das sequências únicas

No caso da análise para identificação de polimorfismo tipo SNP, as sequências levantadas no banco de dados devem ser clusterizadas minimizando, assim, a ocorrência de redundância de análise de sequências pertencentes a uma mesma informação. Nesse caso, as sequências FASTA de Heat shock protein foram clusterizadas utilizando-se o programa CAP32 (Figura 6). A função do CAP3 é literalmente formar sequências maiores a partir de fragmentos menores de cDNA ou de DNA (HUANG; MADAN, 1999). Essas sequências, provenientes do sequenciamento genômico, são agrupadas considerando sobreposições de regiões comuns. Dessa forma, um conjunto de sequências pode ser agrupado formando os chamados contigs, resultando em uma sequência consenso. Sequências que não puderem ser agrupadas permanecem como sequências únicas (single sequence ou singlets). Essa ferramenta permite minimizar a análise repetitiva de sequências que na realidade fazem parte de mesmo consenso.

Figura 6. Página do programa CAP3. As sequências podem ser copiadas e coladas na janela da página, desde que não ultrapassem 50 Kb.

Após as análises, contigs e sequências únicas são disponibilizados na página de resultado, sendo os respectivos FASTAs obtidos ao se clicar nos respectivos links (Figura 7). Em Assembly details é possível ver quais sequências (de acordo com o número gi – identificador do NCBI) compõem cada um dos contigs. Essa informação é relevante, ao se determinar quais contigs permitiram identificar polimorfismos SNP.

Figura 7. Página de resultado do CAP3. A seta indica link para sequências no formato FASTA.

Todas as sequências (contigs e singlets) serão utilizadas na identificação dos quadros abertos de leitura (Open read frames – ORFs), sendo as ORFs utilizadas na busca de polimorfismo tipo SNP (Figura 8).

Figura 8. Página inicial do ORFinder. A seta indica janela para seleção da tabela de código genético.

3.2. Identificação das ORFs

Apesar de um cDNA ser gerado a partir de um RNA com cauda poli A, nem toda a sua extensão é informativa para a síntese de proteínas. As regiões denominadas 3’ e 5’ UTR (UnTranslated Region) não são informativas durante a síntese proteica, sendo traduzida somente a região codificadora. Sendo assim, uma ferramenta do tipo ORFinder3, disponível no site do NCBI, identifica possíveis quadros abertos de leitura para uma dada sequência. O ORFinder (ROMBEL et al., 2002) busca ao longo da sequência FASTA o códon de iniciação ATG (ou alternativo, se selecionado) e os códons de finalização (TAA,TAG e TGA). O resultado com cada sequência usada como query gera seis barras horizontais, cada uma correspondente a um dos possíveis frames de leitura. Os frames positivos (+1, +2 e +3) são determinados a partir da própria sequência fornecida, começando-se as trincas codificadoras a partir do primeiro, segundo ou terceiro nucleotídeo, respectivamente. Os frames negativos (-1, -2 e -3) correspondem aos três possíveis frames obtidos a partir da fita complementar àquela fornecida como query. Uma ORF completa apresenta códon de início e de fim. Normalmente, a sequência codante do gene corresponde à maior ORF encontrada (com exceções). Para verificar esse resultado pode se realizar um alinhamento via Blast da sequência FASTA da ORF contra o banco de dados de proteínas do NCBI (Blastp). Se a ORF escolhida for correta, o resultado do Blast indicará o grau de similaridade com alguma sequência relacionada depositada. Algumas vezes pode não haver sequências similares depositadas no banco de dados, ainda.

O ORF finder permite que alguns dos critérios da análise sejam alterados, como o tamanho do Threshold padrão de 100 nucleotídeos para, por exemplo, 50–300 nucleotídeos.

Para identificação da ORF pelo ORFinder foi utilizada, a título de exemplo, a sequência do Contig 7, resultado do agrupamento de cinco sequências HSP de G. soja em um único consenso pelo CAP3. A sequência consenso é dada a seguir:

Essa sequência deve ser colada na janela de análise da ferramenta ORFinder4, deixando-se os demais parâmetros sem alterações (default) (Figura 9). Dependendo do organismo, pode-se escolher o código genético mais adequado para identificação da ORF. No ORFinder, há atualmente 16 opções, incluindo os códigos para mitocôndria de vertebrados e de invertebrados.

Figura 9. Página do ORFinder com os seis diferentes frames possíveis para o Contig 7 com sequências de Heat Shock Protein para Glycine soja.

O resultado da análise pelo ORFinder (Figura 9) mostra os possíveis frames para a sequência fornecida (+1, +2, +3, respectivamente as três primeiras barras horizontais) e para a sua fita complementar (-1, -2, -3, respectivamente as três barras seguintes).

Nesse caso, o frame correto é o maior e corresponde ao +1 (trincas definidas a partir da primeira base da sequência fornecida). Para selecionar essa ORF, clica-se na barra que mudará de cor, devendo-se aceitá-la em accept. A sequência FASTA da ORF selecionada pode ser vista em View. A sequência FASTA da ORF correspondente ao frame +1 do Contig7 se inicia no 13o nucleotídeo da sequência original.

As ORFs de cada contig e de cada singlet de Heat Shock Protein devem ser salvas em arquivos separadamente.

4. Identificação e classificação do polimorfismo

A ideia de gerar marcadores moleculares a partir da digestão do DNA com enzimas de restrição não é recente. A técnica de RFLP já utilizava esse princípio para o desenvolvimento de marcadores. Atualmente, esse princípio foi utilizado para o desenvolvimento de marcadores mais facilmente reprodutíveis, via PCR, em diferentes laboratórios. Entre as metodologias atuais, está a SNP-CAPS, que surgiu da modificação da técnica de marcadores CAPS. Marcadores CAPS são desenvolvidos a partir de duas etapas. Na primeira, uma sequência específica do DNA é amplificada utilizando-se primers específicos. Na segunda etapa o produto da amplificação é digerido com enzima de restrição (normalmente uma de corte frequente, com sequência de reconhecimento de quatro bases). O produto da digestão pode ou não apresentar polimorfismo após a separação dos fragmentos em um gel de agarose (DEL BLANCO et al., 2007; MAEDA et al., 1990).

O desenvolvimento de marcadores SNP-CAPS difere da metodologia tradicional CAPS pela análise prévia, via bioinformática, para identificação de possíveis SNPs na região de reconhecimento da enzima de restrição. Dessa forma, a presença do SNP pode interferir no reconhecimento da sequência do DNA pela enzima de restrição gerando o polimorfismo entre amostras de diferentes indivíduos.

A seguir, serão descritos os passos para a identificação de polimorfismo SNPs, o desenho de primers específicos que flanqueiam a região com polimorfismo e, por último, a identificação de enzimas de restrição que sejam compatíveis com os possíveis pontos de polimorfismo.

Nessa etapa do trabalho, as sequências levantadas nos bancos de dados e processadas (CAP3 e ORFinder) são utilizadas em programas específicos que permitem a identificação de SNPs, como o programa HaploSNPer5. Esse programa apresenta uma interface flexível, que permite a identificação e classificação de SNPs tanto em organismos diploides como em organismos poliploides (TANG et al., 2008).

Na identificação in silico de SNPs com a ferramenta HaploSNPer (Figura 10), pode-se usar uma das estratégias descritas a seguir.

4.1. Utilizando banco de dados do HaploSNPer

A sequência de cada ORF (identificada em cada contig e em cada sequência única) pode ser analisada frente a banco de dados disponibilizados pelo site (uma das ferramentas mais utilizadas na identificação de polimorfismo tipo SNP ou Indel). Para a busca de SNPs, deve-se, após colar a sequência FASTA na janela do lado esquerdo, selecionar o banco de dados desejado com a opção Select a database (Figura 10). Atualmente há 22 bancos de sequências disponíveis, sendo 9 de animais e 13 de vegetais.

Figura 10. Página inicial do HaploSNPer. A janela do lado esquerdo é utilizada para busca de SNPs utilizando-se banco de dados disponibilizado pelo site. A janela da direita restringe a busca contra um conjunto de sequências.

4.2. Utilizando um conjunto de sequências FASTA

Nessa estratégia, para se fazer a identificação de SNPs, cada uma das ORFs identificadas é alinhada separadamente via programa CAP3 ou Phrap (opções para seleção) contra um conjunto de sequências que funcionaria como o banco de dados. Essas sequências são inseridas na janela do lado direito da tela do HaploSNPer (Figura 10). Recomenda-se que as sequências com E-value entre 0 e -60 sejam selecionadas e salvas em formato FASTA nas respectivas pastas de cada ORF de origem. Essas sequências serão utilizadas para identificação de SNPs e Indels em uma outra opção do HaploSNPer.

Alguns parâmetros do HaploSNPer podem ser ajustados conforme a necessidade da análise, tais como: E-value, percentual de similaridade a ser considerado pelo CAP3 ou Phrap, tamanho das regiões a serem consideradas de baixa qualidade na região 3´ e 5´, o número mínimo de sequências a formar o cluster, etc. (Figura 11).

Figura 11. Continuação da página do HaploSNPer mostrando diferentes parâmetros que podem ser otimizados para as análises.

Utilizando-se ORF do Frame +1 do contig 7 como sequência query em relação ao banco de dados de Soja do HaploSNPer (a primeira estratégia) e os demais parâmetros na condição default (E-value: 1e-60; Minimum number of sequences for a cluster: 4; Minimum number of sequences for each allele for every potential SNP: 2; Low quality region from 5’ side: 30 nucleotides; Low quality region from 3’ side: 20% of the whole length of sequence; Weight value of low quality region: 0.5), com alinhamento via CAP3 (similaridade de 95%) foi identificado um SNP, classificado como uma transição (A-T) verdadeira. Esse SNP foi localizado na posição 479 e está assinalado na sequência abaixo em vermelho. Nesse caso, o polimorfismo corresponde à presença da base T ou C na posição 479.

5. Desenho de primers para amplificar a região polimórfica

O desenho do par de primer a ser utilizado na PCR é uma das etapas mais importantes. Primers são pequenas sequências de DNA (20–30 bases) que se anelam com as extremidades da sequência alvo que se deseja amplificar. Entre os programas de bioinformática mais utilizados para desenho de primers está o Primer36.

Basicamente, o tamanho dos primers pode variar, mas eles devem ser suficientes para dar especificidade à reação e não aumentar o custo de síntese. Além disso, se a temperatura de dissociação dos primers é muito baixa, produtos não específicos podem aparecer na reação. Esse valor é usado para calcular a temperatura de anelamento, normalmente de 2 a 3 graus abaixo da Tm (T melting – corresponde à temperatura em que metade dos primers se encontram anelados com a fita molde). Atenção deve ser dada ao resultado do Primer3, para que o conjunto de primers tenha temperatura de Tm similar e que o conteúdo de GC esteja entre 40% e 60% ao longo da extensão do primer. O programa fornece mais algumas informações como o Max Self Complementarity (grau de homologia dentro cada primer para evitar anelamento entre os primers reduzindo a eficiência da amplificação) e o Max 3´ Complementarity (grau de homologia entre a região 3` de cada primer evitando a formação de dímeros causando baixa eficiência na formação do produto).

Para o desenho dos possíveis conjuntos de primers, a sequência FASTA que contém o polimorfismo SNP deve ser colada na janela específica (Figura 12). A região alvo pode ser indicada entre colchetes.

Figura 12. Página inicial do Primer3.

O programa Primer3 fornece o melhor par e mais quatro conjuntos de primers alternativos e que poderiam ser utilizados. Além das sequências dos mesmos, outras informações relevantes são fornecidas e ajudam a otimizar a reação de PCR, tais como: TM, conteúdo de GC (%), tamanho dos primers (forward e reverse), tamanho esperado do produto de amplificação, etc.

Dos pares de primers desenhados pelo programa Primer3 (nas condições default) para a sequência consenso do contig 7 de Heat Shock Protein Glycine soja (Figura 13), um dos pares amplifica a região polimórfica de interesse (SNP na posição 479). As características desse par podem ser vistas na Tabela 2.

Figura 13. Página de resultados do Primer3 mostrando os quatro pares de oligonucleotídeos adicionais.

O primer esquerdo, se anelando da base 419 até a 429, amplificaria um produto da amplificação de 223 pb, o que incluiria a base 479, local do SNP.

Tabela 2. Característica do par de primers que amplifica a região de polimorfismo da sequência consenso do contig 7 de Heat Shock Protein de Glycine soja.

Primer

Início (pb)

Tamanho (pb)

Tm (°C)

GC%

Sequência

Esquerdo

419

20

60,2

45

TGAGATTCAACATGCCAGGA

Direito

641

20

59,9

50

ATCCCATCTTTGACCTGTGC

Obs.: tamanho do produto = 223 pb.

6. Identificação das enzimas de restrição que identificam o polimorfismo

Uma das ferramentas disponíveis on line para a identificação de sítios de restrição a partir de uma dada sequência de DNA é o NEBcutter (VINCZE et al., 2003). Nesse caso, também tem que se fornecer a sequência para análise em formato FASTA.

O resultado fornecido pelo NEBcutter (Figura 14) indica não somente quais são as enzimas que apresentam sítios de restrição na sequência, mas a localização de cada um dos sítios (Figura 15).

Figura 14. Página inicial do NEBcutter. Essa ferramenta fornece opções para restrição das enzimas que serão utilizadas na análise logo abaixo da janela em que é depositada a sequência.

Figura 15. Página de resultado do NEBcutter, mostrando graficamente a sequência com as respectivas enzimas de restrição e seus sítios de ação.

Para visualizar melhor a região de polimorfismo, deve-se marcar com o mouse (clicando sobre a sequência) e solicitar na janela Zoom, que fica logo abaixo da representação gráfica da sequência, para ampliar o trecho marcado. Ao ampliar o trecho da sequência correspondente ao polimorfismo, torna-se mais fácil visualizar os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição. Ao passar com o mouse sobre o nome da enzima, o programa automaticamente indica no gráfico (em vermelho) a região de reconhecimento da enzima (Figura 16). Essa ferramenta também fornece algumas informações relevantes, como se a enzima ainda é comercializada e que tipo de corte ela produz na sequência (seta na Figura 16).

Figura 16. Página do NEBcutter apresentando ampliação de trecho específico da sequência do contig 6 de Heat Shock Protein de Glycine soja. A seta indica escala de cores referente às características de cada enzima.

Com a análise pelo NEBcutter foi possível identificar quatro enzimas (NspI, NlaIII, CviAII, FatI) cujos pontos de reconhecimento coincidem com a posição 479 da sequência do contig 6 da Heat Shock Protein de Glycine soja.

É importante lembrar que, como os primers foram desenhados a partir de sequências de EST, é possível que não amplifiquem a sequência genômica se houver um intron na região de anelamento do primer com o DNA genômico. Da mesma forma, caso exista um intron no meio da sequência de reconhecimento da enzima de restrição, a clivagem do DNA não ocorrerá.

Sendo assim, se for possível, deve-se comparar a sequência EST com a sequência genômica do gene. Outra possibilidade, para evitar esses problemas, é utilizar as enzimas de restrição para digerir os produtos da RT-PCR.

7. Referências

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Anexo

Lista dos gi das sequências EST de Glycine soja utilizadas nas análises do capítulo...

>gi|16281180|gb|BI944355.1|BI944355 saa56f01.y1 Gm-c1060 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-650 5’ similar to TR:O04056 O04056 HEAT SHOCK PROTEIN 70 PRECURSOR.

>gi|12689344|gb|BG155680.1|BG155680 saa64d11.y1 Gm-c1060 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1342 5’ similar to TR:Q40867 Q40867 HEAT SHOCK PROTEIN 17.9. ;, mRNA sequence

>gi|12689338|gb|BG155674.1|BG155674 saa64c06.y1 Gm-c1060 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1284 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|12493448|gb|BG045577.1|BG045577 saa03c04.y1 Gm-c1058 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-127 5’ similar to SW:HS82_ARATH P55737 HEAT SHOCK PROTEIN 81-2 ;, mRNA sequence

>gi|12492958|gb|BG045334.1|BG045334 saa40f03.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1422 5’ similar to SW:HS82_TOBAC P36182 HEAT SHOCK PROTEIN 82 ;, mRNA sequence

>gi|12492910|gb|BG045310.1|BG045310 saa40d01.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1322 5’ similar to SW:HS82_ORYSA P33126 HEAT SHOCK PROTEIN 82. ;, mRNA sequence

>gi|12492255|gb|BG044981.1|BG044981 saa36a01.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-794 5’ similar to TR:Q40694 Q40694 HEAT SHOCK PROTEIN HSP82 ;, mRNA sequence

>gi|12490491|gb|BG044011.1|BG044011 saa23b09.y1 Gm-c1058 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-2009 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|12489475|gb|BG042997.1|BG042997 saa46g12.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-2232 5’ similar to TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA sequence

>gi|12488280|gb|BG041844.1|BG041844 saa41g12.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1847 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|12488268|gb|BG041837.1|BG041837 saa41g03.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1829 5’ similar to TR:O80982 O80982 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|12015538|gb|BF716266.1|BF716266 saa17c09.y1 Gm-c1058 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-1649 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|12489242|gb|BG042764.1|BG042764 sv13f04.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-1807 5’ similar to SW:HS11_LYCES P30221 17.8 KD CLASS I HEAT SHOCK PROTEIN. [2] TR:Q9SYU9 ;, mRNA sequence

>gi|12487754|gb|BG041578.1|BG041578 sv36c04.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-1640 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|11691080|gb|BF598756.1|BF598756 sv21d05.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-177 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|11690967|gb|BF598643.1|BF598643 sv20a07.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-14 5’ similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|11690757|gb|BF598433.1|BF598433 sv17e06.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2147 5’ similar to TR:O80329 O80329 HEAT SHOCK PROTEIN 26 ;, mRNA sequence

>gi|11690742|gb|BF598418.1|BF598418 sv17c11.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2061 5’ similar to SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT SHOCK PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence

>gi|11690433|gb|BF598109.1|BF598109 sv03e02.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-963 5’ similar to TR:Q9XIF5 Q9XIF5 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18849152|gb|BM568262.1|BM568262 sal02b06.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3923 5’ similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18732190|gb|BM526900.1|BM526900 sal47a10.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-5036 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18731186|gb|BM526307.1|BM526307 sal39f05.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4498 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18731104|gb|BM526260.1|BM526260 sal38h11.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4605 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18727984|gb|BM524462.1|BM524462 sal16a05.y1 Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-2313 5’ similar to TR:Q9XCB2 Q9XCB2 HEAT SHOCK PROTEIN DNAJ. ;, mRNA sequence

>gi|18727288|gb|BM524049.1|BM524049 sal06g12.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4559 5’ similar to SW:HS21_SOYBN P05477 17.9 KD CLASS II HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18727056|gb|BM523910.1|BM523910 sal05b01.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4274 5’ similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18691843|gb|BM520691.1|BM520691 sak97d04.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3631 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18691767|gb|BM520615.1|BM520615 sak96d05.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3610 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18691638|gb|BM520486.1|BM520486 sak94g12.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3408 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18691076|gb|BM519924.1|BM519924 sak86c12.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2448 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|18690990|gb|BM519838.1|BM519838 sak85a03.y1 Gm-c1057 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2333 5’ similar to TR:Q9SIL3 Q9SIL3 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|26059251|gb|CA802165.1|CA802165 sat46b02.y2 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4299 5’ similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|26057001|gb|CA799915.1|CA799915 sat64c09.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6257 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|26056878|gb|CA799792.1|CA799792 sat62f11.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6045 5’ similar to TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA sequence

>gi|26056078|gb|CA798992.1|CA798992 sat73f06.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-7164 5’ similar to SW:HS14_SOYBN P04794 17.5 KD CLASS I HEAT SHOCK PROTEIN ;, mRNA sequence

>gi|26047084|gb|CA783981.1|CA783981 sat59g11.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-5710 5’ similar to SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT SHOCK PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence

>gi|26046400|gb|CA783579.1|CA783579 sat50c04.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4735 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|26045556|gb|CA783102.1|CA783102 sat67g01.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6458 5’ similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

>gi|26044294|gb|CA782452.1|CA782452 sat29a03.y1 Gm-c1056 Glycine soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-2694 5’ similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence

Capítulo 4
Bioinformática aplicada ao estudo de genomas expressos (EST) em plantas

Laureen Michelle Houllou-Kido
Antonio Felix da Costa
Lílian Vieira de Medeiros
Meiriana X. Vila Nova

1. Introdução

O sequenciamento de genomas foi iniciado na segunda metade do século 20 e se desenvolveu rapidamente na última década do século passado para abranger várias espécies de organismos (1995 – Genomas completos bacterianos, 1996 – Genoma completo de levedura, 1999 – Genoma completo da mosca-da-fruta). O resultado deste trabalho permitiu acumular conhecimento sobre as sequências de diferentes genes nas mais variadas espécies de organismos. Essas sequências vêm sendo depositadas, em sua maioria, em bancos de dados públicos, facilitando o acesso a essas informações por quaisquer grupos de pesquisa no mundo inteiro. Esses bancos de dados genômicos contêm tanto as sequências de DNA como as sequências de etiquetas de sequências expressas (EST). As sequências de EST correspondem a pequenos cDNAs (com 200 a 800 bases) obtidos a partir do mRNA. Os ESTs correspondem, atualmente, a uma parcela bastante representativa dos projetos de genoma desenvolvidos até o presente momento e são utilizados para identificação de genes, identificação de transcritos alternativos, caracterização de proteomas, etc. (NAGARAJ et al., 2006).

O conjunto completo de RNAs codificadores e não codificadores (mensageiros, ribossômicos, transportador) é chamado transcriptoma. Desse transcriptoma, só uma pequena parte é codificadora (mRNA). Ao contrário do genoma, o transcriptoma de uma planta varia de acordo com estádio fisiológico, com os estímulos físicos, químicos e biológicos, doenças, etc. (SOUZA et al., 2000).

As informações fornecidas com o estudo do transcriptoma são de grande importância não apenas para a identificação de novos genes, mas também por fornecer informações que esclareçam a que rotas metabólicas os genes podem estar associados, por estarem sendo expressos em condições específicas. As condições fisiológicas podem inclusive induzir um splicing alternativo, conferindo a um gene específico uma grande variação funcional, de acordo com a montagem dos exons (processamento diferencial).

Os ESTs permitiram estudar o padrão de genes expressos em diferentes situações e estádios de desenvolvimento nos mais diferentes organismos, gerando a criação de bancos de dados específicos. Sendo assim, os objetivos do sequenciamento de ESTs são: 1) associar os mRNAs expressos em uma dada condição às respectivas etiquetas de genes de função conhecida (anotação); 2) permitir a identificação de genes e proteínas desconhecidos; 3) viabilizar o estudo de rotas metabólicas associadas a características específicas, etc.

Dentre os bancos de dados gerados a partir da anotação de ESTs, destaca-se o dbEST (NCBI, 2009). O dbEST (Expressed Sequence Tags database, dados de 30 janeiro de 2009) é, atualmente, o maior banco público do mundo de sequências expressas e conta com mais de 59 milhões de ESTs, entre eles, mais de oito milhões de ESTs humanos, mais de 4,8 milhões de ESTs de camundongo e de rato, mais de 2 milhões de ESTs de milho, mais de 1,3 milhão de sequências de EST de soja, mais de 1,2 milhão de EST de arroz, etc. Vale a pena ressaltar que, em 1999, o dbEST possuía pouco mais de 2 milhões de ESTs depositados.

Surge, então, um importante problema: processar a grande quantidade de informações proveniente do sequenciamento de EST, como agrupar as sequências pertencentes a um mesmo contig e identificar a que gene corresponde cada sequência de EST. Nesse ponto, entram as ferramentas computacionais que fazem parte da bioinformática para ajudar a analisar de forma mais eficiente os dados produzidos pelos projetos de genomas expressos (EST).

A bioinformática surgiu da necessidade de gerenciamento da quantidade maciça de dados gerados pelos projetos de sequenciamento (PERSSON, 2000) e requer a atuação conjunta de profissionais de diversas áreas (EWING et al., 1998). Atualmente, diversas técnicas e programas computacionais estão sendo utilizados para o estudo da estrutura dos genomas (ver capítulo 5 da parte 3), permitindo, por exemplo, a identificação de regiões codantes (codificadoras), usualmente chamadas de quadros abertos de leitura, ou Open Reading Frames (ORFs), e de outras regiões não codantes (3’ e 5’ UTR), regiões repetitivas, elementos transponíveis, etc. Entre as diferentes ferramentas de bioinformática, uma das mais relevantes na anotação de EST recém-sequenciados pertence ao pacote de programas do Blast. O Blast permite determinar a possível função de um gene, pela busca de similaridade com sequências de genes conhecidos e descritos em bancos de dados públicos (ex.: NCBI). A utilização de ferramentas computacionais para correlacionar ou predizer a função gênica de sequências recém-sequenciadas recebe o nome de anotação. A atribuição de uma provável função a uma sequência EST só é possível graças à existência de genes ortólogos (genes homólogos, descritos em diferentes espécies, que se originaram de um gene ancestral comum por especiação). Dessa forma, pode-se atribuir uma possível função a uma sequência EST pelo grau de homologia entre sequências provenientes de organismos distintos. Acredita-se que uma característica comum de genes ortólogos é de que eles, normalmente, realizam a mesma função (KOONIN, 2005).

Graças à exploração de informações da expressão gênica em espécies modelos (ex.: Arabidopsis thaliana), aliada à conservação gênica entre espécies relacionadas (Sintenia), foi possível a identificação de genes candidatos associados a características agronômicas relevantes. Como exemplo, Graham et al. (2006) identificaram, usando a bioinformática, 52 genes candidatos em feijão, induzidos apenas em condição de baixos níveis de fósforo. Outro exemplo foi a identificação de genes candidatos a transportadores de Fe e Zn em milho, por meio da comparação com sequências gênicas conhecidas de arroz e outras espécies de gramíneas (CHAUHAN, 2006).

No entanto, a validação dessa informação pode requerer a realização de testes em bancada como as técnicas que provocam a perda de função gênica (knockout) ou pela inibição total ou parcial da tradução do RNA, conhecida como iRNA (KIM, 2001).

Este capítulo objetiva apresentar, de uma forma resumida, a estratégia que pode ser utilizada para a obtenção e análise de bibliotecas de ESTs. Sendo assim, será utilizada como exemplo a metodologia para análise de EST obtidos de cultivares contrastantes para resistência à salinidade.

2. Condições experimentais dos genótipos para a construção das bibliotecas

Para a construção das bibliotecas de expressão de genes de resistência à salinidade podem ser utilizadas duas variedades contrastantes, uma suscetível e outra resistente. As plantas, mantidas em casa de vegetação, devem ser cultivadas em areia lavada e regadas com solução nutritiva de Hoagland. Em seguida, parte das plantas é regada com solução nutritiva de Hoagland acrescida de NaCl (100 mM). Parte das plantas não será submetida ao estresse salino, para ser utilizada como controle. O número de plantas para o experimento depende do número de bibliotecas que serão feitas. Esse exemplo foi montado em um experimento para construção de seis bibliotecas, conforme a Tabela 1 abaixo. Nesse caso, serão utilizadas oito plantas por biblioteca, fazendo um total de 48 plantas (24 de cada cultivar).

Tabela 1. Esquema resumido do experimento de estresse salino em variedades contrastantes para construção de biblioteca de expressão.

Cultivar

Tratamento

Número de plantas

Suscetível

30 minutos após estresse

8

Suscetível

90 minutos após estresse

8

Suscetível

Controle

4 coletas com 30 minutos + 4 coletas com 90 minutos

Resistente

30 minutos após estresse

8

Resistente

90 minutos após estresse

8

Resistente

Controle

4 coletas com 30 minutos + 4 coletas com 90 minutos

Normalmente o material do controle é coletado no mesmo período do material submetido ao estresse, para eliminar quaisquer interferências de fatores ambientais, como variação da luminosidade e temperatura, no momento da coleta. Os tecidos pertencentes ao material controle podem ser reunidos em uma só amostra dentro de cada cultivar. Sendo assim, as raízes do material suscetível, coletadas aos 30 e aos 90 minutos, que não foram submetidas ao estresse salino, podem ser misturadas formando apenas uma biblioteca.

Cada biblioteca será designada empregando um sistema de codificação para sua identificação, sendo duas letras para o tipo de estresse (sob estresse ou controle); duas letras para o tecido (raiz ou folha); dois dígitos para o tempo; uma letra para a forma (resistente ou suscetível). Exemplo: RCTRZ30+90PL3P37 corresponde à biblioteca do material resistente, não exposto à salinidade (controle) com material de raiz coletada nos tempos 30 e 90 minutos, placa 3, poço 37 (R = resistente e S = suscetível; ES = estresse salino; CT = controle; RZ = raiz; FL = folha; 30 = 30 minutos; 90 = 90 minutos; PL = placa; P = poço).

Depois das plantas serem submetidas a cada tratamento, as raízes são lavadas para a remoção de impurezas e imediatamente congeladas em N2 líquido e mantidas a -80 °C.

3. Extração de RNA

A metodologia descrita a seguir pode necessitar de modificações conforme o tecido e a espécie vegetal em estudo. Para este capítulo será descrita metodologia que pode ser utilizada para purificação de RNA de raízes de cana-de-açúcar.

As raízes congeladas são maceradas em N2 líquido e o RNA total isolado preferencialmente com o reagente Trizol (Invitrogen), conforme preconizado pelo fabricante. Outras metodologias de extração podem ser empregadas caso a qualidade do RNA não esteja boa com a extração com Trizol (ex.: extração com cloreto de lítio). O RNA total das raízes, de cada cultivar e de cada tratamento, pode ser extraído e reunido após extração individual. A proporção recomendada é de 100 mg de tecido vegetal fresco, macerado em nitrogênio, para 1 mL de Trizol. Esse material deve ser vortexado e homegeneizado por 5 minutos, a 15 °C–30 °C. Em seguida, o material é centrifugado (11.400 rpm, 15 minutos a 4 °C). A fase aquosa, transferida para um tubo novo, deve ser lavada com clorofórmio (200 µL) sob agitação (± 20 segundos) e incubada à temperatura ambiente (5 minutos). Após esse período, submete-se a amostra a uma centrifugação novamente. A fase aquosa é transferida para um microtubo limpo, para precipitação do RNA total com isopropanol (0,5 mL de isopropoanol por mL de Trizol). A solução é centrifugada mais uma vez. O pellet é então lavado com 1 mL de etanol 75% e seco a 37 °C por 10 minutos. O RNA total deve ser, então, ressuspendido em 30 µL de água Depc (0,01%), precipitado em 1/10 do volume de NaOAc 300 mM, pH 5,5; 1/50 volumes de glicogênio (50 µg/mL) e 2,5 volumes de etanol absoluto e armazenado a -80 °C.

Ressaltamos que se o material tiver uma grande quantidade de polissacarídeos, como em raízes de algumas espécies, é recomendado algumas modificações dessa metodologia: (i) utiliza-se a proporção de 200 mg para cada mL de Trizol; (ii) o RNA deve ser centrifugado a 11.400 rpm, 15 minutos a 4 °C após a homogeneização com Trizol, e o sobrenadante deve ser precipitado com 0,8 M de citrato de sódio e 1,2 M NaCl, juntamente com o isopropanol; (iii) a qualidade e limpeza do RNA são analisadas por espectrometria e em gel de agarose, utilizando o tampão da amostra com 1% de formamida. Quando necessário, realiza-se limpeza de RNA com o RNase Plant Mini Kit (Qiagen). Para a extração de RNA poli A+ utiliza-se 1 mg de RNA total de cada ponto (dia) e o kit Oligotex Spin Column (Qiagen) de acordo com as orientações do fabricante, salvo algumas modificações: (i) Incuba-se o RNA total e resina de oligo-dT por 30 minutos sob agitação; (ii) nas três eluições, ressuspende-se a resina com o volume máximo recomendado (100 µL) da solução OEB e pipeta-se a solução a 70 °C.

4. Isolamento do RNA mensageiro (RNAm)

Amostras de RNAm são isoladas a partir do RNA total, utilizando um kit específico (ex.: Oligotex dT – Qiagen), conforme as instruções do fabricante. Utilizando-se o Kit Oligotex dT: (i) misturar uma alíquota da amostra, contendo 1 mg de RNA total em 500 µL de água-Depc, com 500 µL de solução tampão OBB (TRIS-HCl 20 mM, pH 7,5; NaCl 1 M; Edta 2 mM e SDS 0,2%) e 100 µL de resina Oligotex Suspension; (ii) incubar a 70 °C por 5 minutos e, em seguida, a 37 °C mais 20 minutos; (iii) o complexo RNA total + oligo (dT) deve ser peletizado por centrifugação (20.000 g por 2 minutos), e o precipitado remanescente deve ser ressuspendido em 600 µL de tampão OW2 (TRIS-HCl 10 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM e Edta 1 mM) e transferido para uma coluna RNase-free Spin Columns e centrifugado (12.000 g por 2 minutos). A coluna é transferida para um novo microtubo, e a lavagem com OW2 repetida. Para a eluição do RNAm, são adicionados 100 µL de tampão OEB (TRIS-HCl 5 mM, pH 7,5) pré-aquecido a 70 °C.

Para precipitação do RNA deve-se proceder da seguinte forma: (i) após a centrifugação (20.000 g por 1 minuto), o sobrenadante é separado e tratado com uma solução de 1/10 do volume de NaOAc (300 mM, pH 5,5), 1/50 volumes de glicogênio (50 µg/mL) e 2,5 volumes de etanol absoluto a -80 °C por 2 horas; (ii) após esse período, a solução deverá ser centrifugada, e o precipitado lavado com 2 mL de etanol 75%. Por último, (iii) deixa-se o pelet secar a 37 °C por 20 minutos. O RNA deverá ser ressuspende em água-DEPC.

5. Construção das bibliotecas de cDNA fita dupla

As bibliotecas de cDNA podem ser confeccionadas, por exemplo, com o protocolo descrito para o kit SuperScript Plasmid ou outro, de outra marca, contanto que as instruções do fabricante sejam seguidas. Utilizando-se o kit SuperScript Plasmid e o Cloning Kit (Invitrogen) deve se proceder da seguinte forma: (i) utilizar primers oligodT estendidos e com o sítio para a enzima de restrição e a enzima transcriptase reversa para sintetizar o cDNA; (ii) utilizar base metil-dC para a síntese da primeira fita, evitando da fita clivagem por enzimas de restrição; (iii) adicionar adaptadores às extremidades do cDNA. Após essa etapa, o produto é duplamente digerido, utilizando-se enzimas de restrição, para liberação do cDNA. A ligação do cDNA ao vetor deve seguir as instruções do fabricante.

Após a ligação, a biblioteca gerada deve ser amplificada e aliquotada, podendo ser estocada a 4 oC. A alíquota de uso da biblioteca, uma vez titulada, serve para a preparação das sub-bibliotecas de sequenciamento. Dessa forma, se ocorrer algum problema durante o sequenciamento, será possível repeti-lo.

6. Bibliotecas EST para sequenciamento

As bibliotecas são elaboradas a partir dos ESTs obtidos nas etapas anteriores. Essa fração é transformada in vivo com o plasmídeo fornecido no Cloning Kit (Invitrogen). Alíquotas da transformação devem ser plaqueadas, e os clones bacterianos, contendo o vetor pSORT1 recombinante, repicados em placas de 96 poços. As placas máster devem ser estocadas a -80 oC até o momento do uso.

7. Validação da biblioteca de EST

A validação das bibliotecas de EST se faz com o uso da PCR, avaliando-se a presença e tamanho dos insertos. São selecionadas as bibliotecas de EST contendo inserto médio com 1 kb a 2 kb e com ao menos 70% dos 96 poços da placa indicando a presença do inserto.

Para amplificação dos insertos, os recombinantes são coletados, individualmente, da biblioteca de EST e ressuspendidos em 200 µL de tampão SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO4 7 H2O, 50 mM Tris-HCl pH 7 e 0,04% de gelatina) contendo 0,5% de clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989). Em seguida, os materiais são incubados a 4 oC por 12 horas.

As reações de PCR são realizadas em um volume total de 50 µL (5 µL da suspensão obtida na etapa anterior e 45 µL de master mix, dos quais 38,05 µL de água estéril, 5 µL de tampão de PCR 10X, 0,75 µL 150 mM dNTPs e 0,5 µL de 0,1 µM primers). São utilizados os primers universais que hibridizam de cada lado do sítio de multiclonagem do pSORT1 inseridos no vetor.

Após desnaturação preliminar a 95 oC, por 10 minutos, são adicionados 0,2 µL de Taq polimerase (5 U/µL) em cada tubo de reação. Em seguida, são realizados 30 ciclos (desnaturação a 95 oC por 90 segundos, anelamento a 60 oC por 90 segundos, e extensão a 72 oC por 20 segundos, com uma extensão final a 72 oC por 15 minutos). Controles negativos sem DNA são adicionados a cada série de amplificações para verificar a ocorrência de possíveis contaminações. Os produtos de PCR são mantidos a -20 oC até sequenciamento. Os amplicons são analisados em eletroforeses, em gel de agarose 1%–1,5% e tampão de corrida TBE 1X (SAMBROOK et al., 1989). Utiliza-se um DNA padrão de tamanho e concentração conhecidos. Os produtos são visualizados, após coloração em solução de brometo de etídio (4 µg/mL), o resultado da corrida é observado em transiluminador UV, e a imagem capturada em sistema computadorizado. São mantidas as suspensões de fagos com produtos acima de 600 pb. A seguir, é feita uma miniprep (metodologia para extração de DNA plasmidial) para purificação dos plasmídeos que serão utilizados na etapa de sequenciamento.

8. Sequenciamento automático

Para o sequenciamento são utilizados os plasmídeos como moldes, usando kits da Applied Biosystems (BygDye Cycle Sequencing kit). Cada clone deve ser sequenciado separadamente, utilizando-se os primers T7 (início em 3´) e T3 (início em 5´). Os produtos são precipitados com etanol 95% usando de acetato de sódio 3 M e lavados com etanol 70%, antes de serem secos sob vácuo. As reações secas podem ser estocadas a -20 oC, protegidas da luz. Os produtos das reações de sequenciamento são analisados em sequenciador (ex.: ABI 3100 – Applied Biosystems) que disponha de programas específicos para coleta, análise dos dados, gerando arquivo em formato abi, que pode ser interpretado pelo programa Phred.

9. Preparo das sequências EST para análises em bancos de dados

Os eletroferogramas, obtidos do sequenciamento dos cDNAs, devem ser analisados pelo programa Phred. Esse programa vai atribuir um valor qualitativo para cada um dos picos de cada base, a partir de critérios como: a intensidade do sinal, o espaçamento entre bandas, a largura e a altura de cada pico, etc. Para essa análise, devem ser estabelecidos os parâmetros de aceitação das sequências (ex.: recomenda-se definir o tamanho mínimo da sequência no intervalo entre 150 pb–250 pb). Essa análise deve ser feita utilizando-se um valor de qualidade Phred superior a 20, o que corresponde a 99% de certeza de que a base indicada está correta (um erro a cada 1.000 bases). Todas as sequências devem ser depositadas em banco de dados específico preferencialmente em formato FASTA. A seguir, todas as sequências devem ser submetidas a uma análise para eliminar qualquer segmento de vetores, de cauda poli-A, de genes ribossomais ou de contaminação por DNA. Segundo Telles e Silva (2001), essas sequências devem ser eliminadas porque podem introduzir, nos EST, regiões de similaridade que não são relevantes para a clusterização. Dessa forma, a presença de segmentos de vetores pode ser identificada e eliminada com o programa VecScreen1.

Em seguida, essas sequências devem ser submetidas à clusterização pelo programa CAP3 (Figura 1) (HUANG; MADAN, 1999), que vai agrupar as sequências por meio da sobreposição de áreas comuns. A partir dos contigs (agrupamento de sequências em um consenso) e das sequências únicas (que não foram agrupadas com nenhuma outra no CAP3), são formados bancos de dados que irão ser utilizados na busca de homologia com genes já depositados em bancos de dados.

Figura 1. Página inicial do CAP3. Essa ferramenta é utilizada para agrupar os ESTs em contigs.

O CAP3 (2009) ordena as sequências dos clones formando um contig. O ordenamento é feito pela sobreposição das sequências dos clones. Assim, o contig é uma sequência contínua, resultado da sobreposição das sequências com o uso do CAP3, e a Single sequences refere-se às demais sequências que não se agruparam. O Assembly details refere-se aos detalhes do alinhamento e da sobreposição das sequências (Figura 2).

Figura 2. Página de acesso a resultado do CAP3. Os links da página permitem acessar os detalhes do agrupamento (contigs), as sequências que não agruparam (single sequences) e o gráfico contendo o alinhamento dos gi em cada contig (assembly details).

Para identificação da região codante das sequências dos agrupamentos é feita a identificação da ORF (Open Reading Frame), com o programa ORFFinder (2009), Rombel et al. (2002), desprezando-se as regiões 3’-UTR e 5’-UTR de cada uma das sequências (Figura 3).

Figura 3. Página inicial do NCBI. A seta indica o link para acessar o programa ORF Finder (Open Reading Frame Finder).

10. Análises em bancos de dados para busca de homologia

O objetivo do sequenciamento de ESTs é tentar descobrir as funções moleculares e celulares referentes a cada uma das sequências de cDNA, etapa denominada de anotação. No entanto, apesar de ter um grande aparato de bioinformática para dar suporte, a anotação gênica não deve ser considerada uma tarefa simples. A anotação pode ser dividida em duas etapas: a anotação em nível de nucleotídeo e a anotação em nível proteico.

Para cada uma dessas etapas, os principais programas utilizados de bioinformática pertencem ao Basic Local Aligment Search Tool (Blast), que corresponde a um pacote de programas que analisam a similaridade entre sequências de nucleotídeos e aminoácidos (ALTSCHUL et al., 1990). Na página do NCBI2, existem dois grupos de pacotes de programas para alinhamento e busca de homologia. O primeiro grupo corresponde ao Basic Blast (Blast básico) em que são encontradas cinco opções: nucleotide blast, protein blast, blastx (faz uma busca no banco de dados de proteínas utilizando-se uma sequência de nucleotídeos traduzida para aminoácidos), blastn (faz uma busca no banco de dados de nucleotídeos traduzidos para proteína utilizando uma sequência de aminoácidos), tblastx (busca no banco de dados de sequências de nucleotídeos traduzidas para proteína utilizando-se uma sequência de nucleotídeo também traduzida para proteína). O segundo pacote de programas do Blast corresponde ao Specializer Blast (Blast especializado), que permite entre outras coisas fazer primers específicos, buscar domínios conservados, buscar imunoglobulinas, SNPs, etc. Neste capítulo do livro serão utilizadas apenas as ferramentas do Blast básico, por isso não serão detalhadas as características do Blast especializado.

Torna-se necessário nesse ponto esclarecer dois conceitos que algumas vezes são confundidos: similaridade e homologia. Nem todas as sequências que apresentam similaridade podem ser consideradas homólogas. No entanto, a determinação de homologia é feita com base na similaridade. Sendo assim, como determinar se duas sequências apresentam similaridade suficiente que justifique ser denominada de homologia? Similaridade é uma medida da qualidade do alinhamento entre duas sequências. Para que a similaridade seja considerada homologia, é necessário levar em consideração alguns parâmetros fornecidos pela análise de similaridade como o E-value (Expectation value), o comprimento da sequência similar entre duas sequências, o padrão de conservação de aminoácidos e o número de inserções e deleções. Homologia significa dizer que duas (ou mais) sequências vêm de um ancestral comum na história evolutiva (CLAVERINE; NOTREDAME, 2007).

10.1. Anotação em nível de nucleotídeo

Com as sequências de nucleotídeos (contigs e sequências únicas – singlets) no formato FASTA, pode-se, então, compará-las em busca de homologia. Essa comparação permite inferir sobre as propriedades de uma determinada sequência, baseando-se em propriedades conhecidas da outra. A esse processo de comparação entre sequências dá-se o nome de alinhamento de sequências.

As sequências dos agrupamentos (clusters e singlets) são comparadas com as sequências contidas no Genbank (nr), utilizando-se o programa Blast nucleotídeo (ALTSCHUL et al., 1990) para identificar a presença e o grau de homologia com as sequências descritas para outras espécies (Figura 4).

Figura 4. Página do NCBI com o link para o pacote de programas do Basic Local Alignment Search Tool (Blast).

Para o exemplo deste capítulo vamos utilizar a sequência EST em formato FASTA a seguir:

Inicialmente, na página do Blast3, deve-se clicar no link para nucleotide blast. Em seguida, deve-se selecionar a opção expressed sequence tag no Database (Figura 5).

Figura 5. Detalhes da página de análise do Blast para sequência de nucleotídeo. A seta indica o banco de dados de EST selecionado para a busca de sequências similares.

O resultado dessa análise (Figura 6) permite determinar se essa nova sequência está correlacionada ao gene que tem a determinada função.

Figura 6. Resultado do alinhamento das sequências do EST contra o banco de dados de EST do NCBI.

O resultado (Figura 6) é apresentado em um gráfico colorido, no qual a cor das barras corresponde ao score do valor do alinhamento. Barras de coloração preta correspondem ao score mais baixo de alinhamento, enquanto que barras de coloração vermelha correspondem ao valor de score de alinhamento mais alto.

Ao passar a seta do mouse sobre cada uma das barras do gráfico, são fornecidas, na janela acima do gráfico, algumas informações a respeito da sequência indicada. Ao se clicar na própria barra do gráfico, a página irá ser direcionada ao gráfico do alinhamento. Vale a pena salientar que cada barra do gráfico corresponde ao alinhamento por similaridade da sequência (Query) que se deseja identificar com alguma sequência já descrita e depositada no banco de EST do NCBI. No alinhamento entre a sequência EST e as sequências do banco de dados são apresentadas, além do alinhamento base à base entre a sequência query e a sequência do banco de dados, as seguintes informações: o número de identificação da sequência que apresentou homologia (gb), seguida do cabeçalho que acompanha a sequência no banco de dados, o Score = 291, o E-value, o número de bases (em percentual) que apresentou identidade entre a sequência query e a sequência do banco de dados de EST (Identities), o número de bases (em percentual) que não apresentou identidade com a sequência do banco de dados (Gaps).

Ao se clicar na barra do primeiro alinhamento apresentado no gráfico será apresentado o resultado. Esse resultado indica que a sequência query apresentou homologia com uma sequência de cDNA de Glycine max cujo número de identificação é dbj|BW679146.1. Este alinhamento apresenta um E-value de 0, com uma identidade de 100% e nenhum Gap.

Na Figura 7, pode ser vista a lista de sequências referente ao FASTA da EST utilizada como exemplo neste capítulo. Na coluna referente ao E-value pode se observar que as 30 primeiras sequências apresentaram E-value igual a 0. Outras informações importantes são apresentadas na página de resultado (Figura 7) como: Max Score (probabilidade de número de alinhamentos esperados para um score específico entre a sequência query e o banco de dados); Total Score corresponde ao somatório dos scores de alinhamento de todos os segmentos de uma dada sequência query. O Total Score é utilizado para distinguir os hits feitos com os multiexons funcionais de genes daqueles hits feitos com retrotransposons ou pseudogenes; Query coverange corresponde ao percentual de nucleotídeos da sequência query que foi incluída no alinhamento com as sequências do banco de dados escolhido; Max Ident corresponde ao maior valor de percentual de identidade encontrado para um conjunto de alinhamentos feito a partir de uma mesma sequência query. Essas são as definições disponibilizadas pelo próprio NCBI4.

Figura 7. Página de resultado do Blast com a lista das sequências que apresentaram homologia com a sequência EST do exemplo.

Com esse resultado, já é possível fazer a primeira anotação referente ao EST utilizado como exemplo neste capítulo. A sequência EST, identificada como RESRZ30PL2P23, apresentou homologia com várias sequência de mRNA de leguminosas como Glycine, Phaseolus, etc.

10.2. Anotação em nível de proteína

Esta etapa tem por finalidade tentar correlacionar a sequência de aminoácidos obtida da tradução dos nucleotídeos da sequência query com outras sequências disponibilizadas em banco de dados específicos de proteínas (ex.: sequências primárias, estruturais, de famílias gênicas ou de domínios funcionais). Caso a análise de homologia dos nucleotídeos tenha fornecido alguma informação sobre a função da sequência de EST, a análise da sequência de aminoácidos servirá para validar ou não a possível função indicada pelo Blast de nucleotídeos. Caso a análise com nucleotídeos não tenha fornecido nenhuma indicação da função, o Blastx pode fornecer algum resultado que indique uma possível função para o possível produto da EST. Essa etapa tem como objetivo correlacionar o genoma expresso com os respectivos processos biológicos.

Em eucariotos, a busca de genes é complicada em virtude da presença de introns e de sítios de splicing alternativo. Sendo assim, a utilização de ESTs minimiza parte desses problemas, já que essas sequências de RNAm que deram origem aos ESTs foram processadas pela célula.

No exemplo descrito neste capítulo, a sequência de nucleotídeos, em formato FASTA, deverá ser analisada no Blastx. Essa ferramenta fará a tradução automática da sequência de nucleotídeos para a sequência de aminoácidos, para, em seguida, fazer o alinhamento com sequências de aminoácidos. Na página do Blastx é possível fazer a opção pelo código genético que será utilizado na tradução. Atualmente existem 13 opções disponibilizadas pelo NCBI (ex.: mitocôndria de vertebrados, mitocôndria de leveduras, bactéria, etc.). Para as análises descritas neste capítulo foi utilizado o código padrão (Standard).

A sequência utilizada para análise foi a seguinte:

O resultado da análise pelo Blastx utilizando-se o banco não redundante de sequência de proteínas indicou que a sequência em análise apresentou homologia com sequência de algumas proteínas de leguminosas correlacionadas com a tolerância à salinidade. O gráfico obtido com essa análise (Figura 8) é similar ao fornecido pela análise de nucleotídeos. Da mesma forma, ao passar a seta do mouse sobre as barras do gráfico, são fornecidas as informações a respeito da sequência indicada, e, ao se clicar na própria barra do gráfico, a página irá ser direcionada ao gráfico do alinhamento. Nesse caso, também é fornecida uma lista das sequências que apresentaram uma melhor homologia com a sequência query de aminoácidos (Figura 9). Nesse caso foi possível detectar homologia com sequências de diferentes gêneros vegetais (ex.: Glycine, Populus, Cucumis, Vitis, Solanun).

Figura 8. Resultado da análise pelo Blastx evidenciando diferentes níveis de scores para a sequência EST traduzida para aminoácido.

As sequências listadas pelo Blastx apresentam um número menor de informações que as disponibilizadas na página do resultado. A título de recordar, a página de resultado da análise de nucleotídeos do EST fornece informações do E-value, do Max Score, do Total Score, do Query coverange e do Max Ident. No entanto, a lista de sequências similares feitas pela sequência de aminoácidos fornece apenas o E-value e o score (Figura 9).

Figura 9. Lista de sequências obtidas pelo Blastx. Resultado indica provável similaridade com proteínas envolvidas na resposta de tolerância à salinidade.

Maiores informações podem ser observadas nos alinhamentos entre a sequência EST query e as sequências do banco de dados que apresentaram homologia. Abaixo, estão apresentadas duas sequências que apresentaram homologia com a EST query. Nesses exemplos pode-se ver que foram fornecidos, para cada alinhamento, o gb, o Score, o E-value, o percentual de identidade, o número de aminoácidos idênticos em ambas as sequências (positives) e o número de Gaps.

Com base nesses resultados, a anotação para a sequência de EST utilizada neste capítulo poderia ser a seguinte:

Estes são alguns passos que permitem fazer a anotação dos genes envolvidos com uma característica agronômica específica (ex.: tolerância à salinidade). No entanto, outros programas de bioinformática podem ser utilizados para aumentar o número de informações referente a cada uma das sequências de EST. Podem ser utilizados programas que fazem a predição da localização subcelular (ex.: WolfPSort – http://wolfpsort.org/), a identificação de resíduos proteicos funcionais e estruturais (ex.: ConSeq5).

Algumas vezes, mesmo fazendo todas essas análises, não é fácil encontrar alguma informação que permita associar a sequência EST em estudo com algum gene já descrito ou com alguma proteína. Dessa forma, essas sequências são tratadas, em alguns casos, como Unknown (desconhecida). Esse resultado é cada vez menos comum, já que os bancos de dados estão sendo ampliados com os estudos dos projetos de genoma, e os genes desconhecidos (Unknown) sendo identificados com pesquisa em bancada (ex.: Shut down – inativação do gene permite identificar a que rota metabólica este pertence). De fato, em bancos de dados, como o Swiss Prot, são encontrados os termos: Hypotetical protein, Putative protein, Predicted protein e Protein with unknown function. No entanto, apesar de não haver uma definição clara desses termos, Liberman (2004) assume que Hypotetical protein corresponde a uma sequência de aminoácidos que não se tem certeza que origina uma proteína; Putative e Predicted protein correspondem a proteínas cuja função necessitam de comprovação experimental, e Protein with unknown function corresponderia a uma sequência de aminoácidos que comprovadamente se constitui em uma proteína, no entanto sua função é desconhecida.

Para poder depositar as sequências em um banco de dados (ex.: NCBI), é necessário publicar ao menos um artigo referente às sequências encontradas na pesquisa; este é um pré-requisito para depósito em bancos de dados de acesso público. Sendo assim, o máximo de cuidado deve ser tomado ao se realizar a anotação de sequências. Alguns grupos chegam a fazer uma seleção rígida dos anotadores, dando prioridade àqueles que já têm experiência prévia ou realizando treinamento prévio dos anotadores. Em alguns grupos, é feita a determinação de que parâmetros devem ser observados. Todo esse cuidado visa minimizar ao máximo os erros nessa etapa do trabalho. A etapa de anotação pode ser automatizada. No entanto, existem relatos de problemas quanto à padronização da ontologia adotada e das regras de análise dos dados (LIBERMAN, 2004).

11. Referências

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Capítulo 5
Bioinformática como instrumento de apoio aos programas de melhoramento genético

Paula Regina Kuser-Falcão

Michel Eduardo Beleza Yamagishi

Natália Florêncio Martins

1. Introdução

Nos últimos anos, com os avanços na biologia molecular e o desenvolvimento das pesquisas genômicas em larga escala, houve um crescimento explosivo na informação biológica gerada pela comunidade científica. Essa avalanche de informação genética, por sua vez, gerou a necessidade de bancos de dados e ferramentas especializadas, conduzindo ao desenvolvimento da Bioinformática. A Bioinformática é uma ciência relativamente nova cujo escopo de atuação vem se modificando continuamente (KOCH; FUELLEN, 2008). No início, na década de 1990, o volume de dados genômicos produzidos pelos projetos de sequenciamento exigiu uma concentração no desenvolvimento de bancos de dados e algoritmos de alinhamento a fim de armazenar e buscar similaridades entre as sequências de nucleotídeos e aminoácidos. O resultado dessas atividades precursoras foi tão positivo que estabeleceu uma associação não intencional entre Bioinformática e organização, armazenamento e comparação entre sequências, deixando em segundo plano a análise dos dados, que é um aspecto igualmente importante. Uma vez consolidada a fase inicial e impulsionada pelos avanços tecnológicos, cada vez mais a ênfase da Bioinformática se voltou para a análise e interpretação de diversos tipos de dados biológicos. Ou seja, não apenas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos são objetos de estudo, mas também imagens digitais, grafos, tabelas, etc. Se no início a Bioinformática era quase sinônimo de desenvolvimento e organização de banco de dados, hoje, ela usa ferramentas de áreas tão distintas quanto a Mineração de Dados, o Processamento de Imagens, a Estatística e a Matemática entre outras ciências para extrair informações dos dados disponíveis. Essa multidisciplinaridade, mais do que uma escolha, foi uma exigência dos avanços da Tecnologia e das novas ferramentas biotecnológicas que põem à disposição do melhoramento genético metodologias inovadoras capazes, por exemplo, de, pelo cruzamento entre os dados de marcadores moleculares e de fenótipos, identificar regiões cromossômicas que contêm genes ligados a fenótipos de interesse, ou inferir a quantidade de genes expressos em um determinado tecido analisando imagens digitais.

Portanto, a delimitação do escopo da Bioinformática se modifica à medida que problemas que envolvam dados biológicos de diferentes naturezas demandem análises científicas. Assim, quando o problema é análise de sequências, a Bioinformática trabalha com banco de dados e algoritmos de alinhamento (Smith-Waterman, BLAST, BLAT); quando o problema é estudar o transcriptoma utilizando microarranjos, usa ferramentas do processamento de imagens, mineração de dados, estatística, etc; quando o problema é predição de genes a partir de sequências, usa algoritmos matemático-estatísticos, modelos ocultos de Markov (HMM); quando o problema é predição de estruturas tridimensionais de proteínas, usa dinâmica molecular, física, matemática, etc. A Bioinformática vem se afirmando como a mais multidisciplinar das ciências multidisciplinares.

Atualmente, o melhoramento genético tem demandado buscas inteligentes em bancos de dados de diferentes naturezas a fim de compreender questões biológicas complexas que dizem respeito à interação genes-fenótipos. Dessa forma, a integração de plataformas ômicas vem se insinuando como um desafio concreto para a Bioinformática. Ou seja, integrar dados gerados em diferentes problemas a fim de cruzar informações que por sua natureza diferem consideravelmente, desde sequências de DNA até a estrutura da proteína. Para enfrentar esse desafio, a Bioinformática vem utilizando sofisticadas ferramentas da Ciência da Informação, como ontologias. Uma das grandes contribuições que a Bioinformática pode dar é possibilitar ir além das relações entre as informações dos bancos de dados e auxiliar mais claramente na interpretação das complexas redes biológicas de genes e suas relações com os fenótipos. A exploração de informações a partir de espécies-modelo aliada à conservação gênica entre espécies está possibilitando a mineração da informação genética armazenada, tornando a mineração de dados uma das áreas de atuação da Bioinformática que mais pode contribuir nos programas de melhoramento genético.

A busca por sequências similares e ferramentas de junção são a base de muitas aplicações para a análise de informação genômica. A habilidade de identificação rápida de similaridades com sequências previamente caracterizadas melhora muito o processo de anotação de sequências e conduziu ao desenvolvimento de banco de dados altamente especializados. A disponibilidade de bancos de dados mais completos permite a mineração de características biológicas – por exemplo, polimorfismos de base única (SNP) (SOMERS et al., 2003) e marcadores moleculares com sequências simples repetidas (SSR) (ROBINSON et al., 2004), que são aplicados no melhoramento genético.

2. Bioinformática, Biotecnologia e melhoramento genético

A redescoberta da Lei de Mendel, a identificação dos caracteres genéticos em cromossomos e a descoberta da molécula de DNA trouxeram grandes mudanças para a ciência e abriram perspectivas inéditas como o desenvolvimento do DNA recombinante, a criação das tecnologias de marcadores, mapeamento genético e sequenciamento genômico entre muitas outras técnicas incluídas no campo da Biotecnologia. Com o uso de conhecimento da genética, citogenética e bioquímica que visem à melhoria de plantas, animais ou microrganismos, a Biotecnologia se desenvolveu e gerou ferramentas extremamente úteis ao melhoramento genético. A partir daí tornou-se possível incorporar as bases da hereditariedade no melhoramento de forma a orientar e acelerar fixação das características desejadas.

O melhoramento genético, quando usa ferramentas avançadas de Biotecnologia, normalmente também necessita do auxílio da Bioinformática, não só para organizar os dados, mas principalmente para analisá-los. A cada dia surgem inovações tecnológicas com aplicações diretas em melhoramento genético que exigem o desenvolvimento de novas ferramentas de Bioinformática, deixando obsoletas as anteriores. Por esse motivo, o foco desta discussão serão os problemas e não as ferramentas utilizadas, embora algumas sejam mencionadas no decorrer do texto. Apenas para efeito de ilustração, não faz muito tempo, ferramentas de Bioinformática eram usadas para identificar microssatélites ou SNPs em bases de dados de ESTs ou cDNAs. A partir de 2005, com o advento das novas tecnologias de sequenciamento (SHENDURE; JI, 2008) que produzem milhões de pares de bases (pb) em uma única corrida a um custo médio de US$ 2,00 (dois dólares) por megabase, a Bioinformática precisou desenvolver novos algoritmos que pudessem lidar com tal volume de dados e com as características próprias das sequências geradas por esses novos equipamentos que geralmente têm comprimento menor que aquelas produzidas pelos sequenciadores automáticos por capilares. O problema não mudou em sua essência, ou seja, identificar marcadores moleculares, mas o avanço tecnológico impôs novos desafios.

Uma das premissas do melhoramento genético é que características fenotípicas estão associadas a genes específicos, sem esquecer, é claro, a interação com o meio ambiente. As técnicas de melhoramento genético consolidadas usam a Genética Clássica em seus programas de melhoramento sem estabelecer a relação entre fenótipos e genes (o termo está no plural, pois mais de um gene pode estar envolvido). Entretanto, saber qual gene(s) está relacionado com um determinado fenótipo pode ser científica e economicamente importante, pois além de possibilitar testes diagnósticos, pode ainda abrir caminhos para o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGM). Que a associação de fenótipos e genes é possível, já está mais do que provado. Há, entretanto, duas formas de estabelecer essa associação. A primeira é a associação um-para-um, e a segunda, a de um-para-muitos. A musculatura dupla, por exemplo, é um fenótipo que está associado ao gene GDF8 (um único SNP). Esse é um exemplo clássico e bem documentado na literatura de um gene associado a um fenótipo. Entretanto, nem sempre, é possível estabelecer essa relação unívoca (um-para-um). Em muitos casos, o máximo de informação possível é estabelecer a associação entre um fenótipo e uma região cromossômica, denominada Quantitative Trait Loci (QTL). Um exemplo em bovino é o trabalho realizado por Gasparin et al. (2007) que identificou QTLs em três cromossomos de Bos indicus relacionados à resistência a carrapatos.

Assim, o melhoramento genético, que nos primórdios passou pela simples domesticação, agora, com o auxílio da Biotecnologia e consequentemente da Bioinformática, pode avançar ainda mais. Pois, não utiliza apenas informações, grosso modo, visíveis a olho nu, mas lança mão de recursos que possibilitam ir à informação contida no próprio genoma dos animais e plantas.

Embora a divisão animal e vegetal pareça um tanto artificial no contexto do melhoramento genético, optou-se por fazer a divisão para enfatizar algumas idiossincrasias de cada caso

2.1. Melhoramento genético animal

O melhoramento genético animal começou com a domesticação de animais há mais de 11.000 anos (ZEDER, 2008). Embora não haja uma definição irrestritamente aceita, podemos definir domesticação como o processo pelo qual animais cativos se adaptam ao homem e ao ambiente fornecido pelo homem (PRICE, 1984). A adaptação é obtida pelas mudanças genéticas em sucessivas gerações (MIGNON-GRASTEAU et al., 2005). Obviamente, de uma geração para outra, animais com uma determinada característica são seletivamente cruzados a fim de transmitir aos descendentes a característica desejada. Essa é a base do melhoramento genético: seleção e cruzamento (EUCLIDES FILHO, 2000).

Se o fenótipo é de fácil observação ou mensuração, as técnicas consolidadas do melhoramento genético fornecem excelentes resultados. Tais técnicas possibilitam estimar a capacidade genética de transmissão de cada animal. Essa capacidade de transmissão, chamada de Diferença Esperada na Progênie (DEP), e modelos matemático-estatísticos, como o BLUP (HENDERSON, 1975), auxiliam o processo de seleção. Para mais detalhes sobre seleção e cruzamento no melhoramento genético animal consultar Euclides Filho (2000).

Embora os resultados dessas técnicas sejam extremamente significativos, seja no aumento da produtividade, seja na melhoria da qualidade dos produtos de origem animal, como em todas as técnicas, há algumas limitações associadas à sua utilização. Talvez, a mais importante esteja relacionada aos fenótipos de difícil mensuração ou de baixa herdabilidade. Para contornar essas dificuldades, o melhoramento genético vem utilizando ferramentas avançadas da Biotecnologia, como marcadores moleculares (microssatélites, SNPs) e chips de expressão gênica e genotipagem (microarranjos) para identificar quais genes estão de fato associados à determinada característica fenotípica. Essa parceria entre melhoramento genético e Biotecnologia trouxe novas perspectivas para o melhoramento genético animal, pois a identificação dos genes fornece mais informações sobre os processos biológicos envolvidos no fenótipo, possibilitando, no futuro, até mesmo a manipulação genética dos indivíduos. No item sobre aplicações, será discutida a seleção assistida que, além de possibilitar testes precoces, ainda viabiliza a redução do tempo entre gerações que no caso animal é um desafio.

2.2. Melhoramento genético vegetal

Tendo iniciado pelo menos 1.000 anos antes do melhoramento genético animal, o melhoramento de plantas também começou com a domesticação de algumas espécies. Contudo, nos últimos 30 anos passou por transformações importantes, culminando com o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGM) comercialmente disponíveis, um avanço ainda não observado em animais. O melhoramento vegetal possui algumas características, como a plasticidades dos vegetais ou o tempo reduzido entre gerações que facilitam o processo de melhoramento. Por outro lado, provoca discussões éticas acirradas.

Os programas de melhoramento iniciaram-se nas universidades públicas em grandes programas, mas foi no setor privado que a produção de cultivares melhoradas se desenvolveu e se consolidou. Essas mudanças foram impulsionadas pela tecnologia e pelo aumento da informação disponível, tornando mais acessível a avaliação de germoplasmas e a identificação de genótipos que exibissem adaptações necessárias para a sociedade e/ou para o mercado. O desenvolvimento das ciências da informação e da Biotecnologia trouxe ao cotidiano do melhorista um conjunto novo de ferramentas e opções para vários aspectos do melhoramento. Os processos biológicos que formam os mecanismos de resistência a patógenos e melhoram a qualidade das plantas estão agora expostos para uma análise funcional sistemática. Essas análises são feitas com softwares específicos em cima da grande quantidade de dados gerada e armazenada em bancos de dados, e essa é uma das atividades da Bioinformática no melhoramento vegetal.

A Bioinformática aplicada ao melhoramento vegetal busca identificar variantes genéticas associadas aos fenótipos e melhorar as variedades por meio de melhoramento assistido ou modificação genética. Para tal, utiliza as informações de genomas de plantas-modelo sequenciados, sequências de genes de interesse, informação sobre expressão gênica, coleções de germoplasma e mapas genéticos. Do ponto de vista da economia, as mais importantes espécies de plantas que estão tendo seus genomas estudados são: milho, arroz, trigo, sorgo, soja e alfafa.

Como alguns desses genomas são muito grandes, estudos estão se baseando em métodos de genômica comparativa que será discutida com maiores detalhes no item sobre aplicações. Graças à similaridade em nível genômico entre arroz e outras espécies de culturas importantes, a obtenção do genoma do arroz (GOFF et al., 2002; MATSUMOTO et al., 2005; YU et al., 2001) teve um impacto significativo na biotecnologia de plantas e no melhoramento vegetal.

3. Aplicações

A seguir serão apresentadas duas aplicações da Bioinformática no melhoramento genético. Uma aplicação mais direta e outra indireta, mas igualmente importante. A aplicação direta é o MAS e a seleção genômica. A seleção é uma parte importante de qualquer programa de melhoramento genético, e por isso apresentaremos uma aplicação direta da Bioinformática nessa etapa. A aplicação indireta é a genômica comparativa. É indireta porque não está diretamente ligada à seleção ou ao cruzamento, mas pode indiretamente auxiliar nessas etapas, pois identifica genes de interesse por meio da comparação entre genomas de espécies filogeneticamente próximas.

3.1. MAS e seleção genômica

Como foi mencionado anteriormente, o melhoramento genético pode ser dividido para efeitos didáticos em duas etapas: seleção e cruzamento. Há alguns casos em que os métodos convencionais de seleção não podem ser aplicados, ou quando o são não produzem resultados satisfatórios. No caso de melhoramento animal, alguns fenótipos só podem ser aferidos numa fase tardia do desenvolvimento animal ou até mesmo após abatimento, ou seja, não estando disponíveis no momento da etapa de seleção. Há também fenótipos de baixa herdabilidade ou que requerem testes dispendiosos ou que envolvam riscos, como resistência a doenças ou pragas. Para lidar com esses casos, desde a década de 1980 existe a seleção assistida por marcadores moleculares (FERNANDO; GROSSMAN, 1989), ou, em inglês, Marked-Assisted Selection (MAS). O objetivo do MAS é realizar a seleção considerando aqueles animais cujos polimorfismos estejam positivamente correlacionados com o fenótipo desejado. Usando essa estratégia, a seleção pode ser feita num estágio bastante inicial de desenvolvimento, até mesmo na fase intrauterina, bastando para tal a coleta de amostra de tecido para posterior genotipagem. Uma outra vantagem da seleção assistida por marcadores moleculares na pecuária é a redução do intervalo entre gerações (GEORGES; MASSEY, 1991; HALEY; VISCHER, 1998). Essa redução é especialmente importante no melhoramento genético animal, em que normalmente o intervalo entre gerações é medido em meses.

Um ponto fraco do MAS é que apenas uma pequena porção da variação genética total é explicada pelos marcadores. Isso é consequência dos testes estatísticos serem bastante restritivos na identificação de QTLs com o intuito de reduzir o número de falso-positivos. Uma forma de contornar esse problema é simplesmente estimar os efeitos de todos os genes (ou segmentos de cromossomos) simultaneamente. A premissa é que genes com pequenos efeitos terão estimativas pequenas; enquanto genes com grandes efeitos terão estimativas grandes. Isso pode ser feito espalhando-se um número considerável de marcadores moleculares em todos os cromossomos, dividindo-se dessa forma o genoma em muitos segmentos de cromossomo. Cada segmento cromossômico é flanqueado por dois marcadores não muito distantes entre si. Essa técnica, chamada de seleção genômica, foi originalmente proposta por Meuwissen et al. (2001) e exige um grande número de marcadores moleculares assim como uma tecnologia de custo acessível para genotipagem.

Com o sequenciamento de vários organismos de interesse pecuário, um grande número de Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) foi descoberto com o auxílio da Bioinformática. E pela sua distribuição física nos genomas, esses marcadores são particularmente indicados para utilização na seleção genômica. Além disso, microarranjos de SNP podem ser usados para genotipagem já que o custo tem caído bastante. Com o suporte de algoritmos de Bioinformática especialmente desenvolvidos para analisar um volume de dados dessa ordem de grandeza, a identificação de QTLs pode ser realizada com sucesso. Assim, as condições básicas para a seleção genômica são satisfatórias para alguns organismos de interesse econômico.

Um animal modelo de interesse econômico que já possui uma versão do genoma é o Bos taurus. Além disso, há microarranjos com mais de 50.000 SNPs disponíveis no mercado, o que torna possível a seleção genômica para esse animal. No Brasil, onde a carne bovina é um dos principais produtos de exportação, o melhoramento genético tem contribuído bastante para o sucesso desse mercado. A Embrapa possui projetos estratégicos para a melhoria da carne bovina (bife de qualidade), resistência a carrapatos, mastite, reprodução (genômica animal) que utilizam técnicas avançadas de Biotecnologia e, consequentemente, de Bioinformática.

O desafio é particularmente grande porque a subespécie predominante em nosso território é o Bos indicus. Embora as duas subespécies sejam filogeneticamente bastante próximas, há diferenças genômicas que dificultam a utilização direta dos recursos disponíveis para o Bos taurus. Por exemplo, os chips de SNPs não são 100% compatíveis, sendo necessário descobrir SNPs exclusivos do Bos indicus. Como a principal fonte de descobertas de SNPs eram os projetos genomas; há 5 anos, a descoberta de SNPs em Bos indicus era considerada demasiadamente cara. Entretanto, a partir de 2005, surgiram as novas tecnologias de sequenciamento (SHENDURE; JI, 2008) que baratearam consideravelmente o custo de sequenciamento por base. Vale ressaltar que a montagem de novo de genomas não é a única aplicação dessas novas tecnologias. A descoberta de SNPs, estudos de expressão entre outros são igualmente aplicações importantes e viáveis.

Para mencionar um exemplo recente, a descoberta e validação de SNPs (TASSEL et al., 2008) em Bos taurus foram feitas utilizando as novas tecnologias de sequenciamento (plataforma Illumina). Usando ferramentas de Bioinformática especialmente desenvolvidas para lidar com milhões de sequências de comprimento reduzido (25 pb), pesquisadores identificaram e validaram 62.042 candidatos a SNPs. Esses candidatos foram mapeados de volta no genoma bovino para recuperar as regiões flanqueadoras com a finalidade de construir um microarranjo com os novos SNPs. Essa metodologia pode ser aplicada, por exemplo, para a descoberta e validação de SNPs em Bos indicus e construir um microarranjo específico para a subespécie comercialmente mais importante no País, o que viabilizaria a seleção genômica ou seleção assistida em nossos rebanhos.

3.2. Genômica comparativa

A genômica comparativa pode ser definida como o estudo de similaridades de genomas e genes entre duas ou mais espécies que podem ou não compartilhar linhagens taxonômicas. A genômica comparativa estuda as relações entre genes, segmentos de cromossomos e sequências proteicas por meio de estudos de sintenia. As sequências de DNA e proteínas são comparadas por algoritmos de alinhamento para identificar genes parálogos, ortólogos e duplicações gênicas. As comparações de sequências podem ser a base para o alinhamento de grandes segmentos gênicos que podem ser super-contigs ou mesmo cromossomos (macrossintenia e colinearidade) entre diferentes espécies.

Para realizar a comparação entre genomas, é necessário percorrer algumas etapas preparatórias. Sem a pretensão de um detalhamento exaustivo, serão mencionadas algumas etapas importantes. A primeira consiste no sequenciamento completo e montagem do genoma de uma espécie. Posteriormente, a etapa de análise é iniciada visando à determinação de sentido biológico às sequências de DNA. O resultado dessas análises é a atribuição de função a uma sequência gênica, ou anotação. Essa etapa inclui o estudo de íntrons, exons e regiões promotoras em genomas completos, e para transcriptomas consiste em atribuir a categoria ou a função da proteína codificada pela sequência obtida de bibliotecas de cDNA, exceto para as novas tecnologias de sequenciamento.

Em anotação, a prática comum é atribuir a função a um gene baseando-se na similaridade de sequência com um gene cuja função seja conhecida. Os sistemas de anotação mais conhecidos são Apollo (LEWIS et al., 2002), Artemis (CARVER et al., 2008), Pendant (FRISHMAN et al., 2001). Desde 2001, o Laboratório de Bioinformática da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia pesquisa algoritmos de análise de sequências genômicas e desenvolve um sistema de gerenciamento, armazenamento e análise de sequências chamado SisGen. O SisGen integra programas de análise e visualização de sequências nucleotídicas e cromatogramas originais produzidos em equipamentos de sequenciamento automático (Megabace, ABI 3700, ABI 3100). A anotação é realizada com a curadoria do usuário a partir de alinhamentos com bancos de dados de interesse do projeto. O SisGen foi montado sob a arquitetura Common Object Request Broker Architecture (Corba) que define uma plataforma de orientação de objetos com uma linguagem para descrição de interfaces com mapeamentos padronizados em diversas linguagens para um conjunto de serviços básicos (PAPPAS JÚNIOR et al., 2008).

O interesse em análise comparativa é uma consequência da descoberta de que muitos genomas de organismos-modelo são compostos de blocos genômicos similares e regiões de alta taxa de conservação. A disponibilidade de sequências completas de genomas, assim como o grande volume de dados de sequências, está redesenhando a maneira como esses dados podem ser organizados e investigados. Se uma sequência não está disponível para uma cultura específica, genomas de outras culturas que tenham relação taxonômica podem ser usados. Essa observação fez com que esforços fossem concentrados no estudo de genomas de espécies-modelo.

Em plantas, os principais genomas-modelo são o de arroz e o de Arabidopsis, que representam respectivamente uma espécie de monocotiledônea e uma dicotiledônea. A comparação direta entre os dois genomas provê as bases para a análise comparativa de diferentes espécies independente de suas distâncias filogenéticas. Diversas famílias gênicas foram identificadas nos dois genomas, indicando a conservação de processos biológicos básicos associados à manutenção da célula vegetal. Por outro lado, as diferenças observadas residem no número de cópias de famílias gênicas, como os receptores quinases que possuem 600 cópias em Arabidopsis e cerca de 1.100 cópias em arroz (SHIU et al., 2004).

Por meio da genômica comparativa em plantas, um grande número de estudos tem sido capaz de associar SNPs com características fenotípicas de interesse agronômico. Um exemplo bastante claro de como um único nucleotídeo altera um fenótipo é o SNP detectado no gene da betaína aldeído desidrogenase. Esse gene é responsável pela fragrância característica do arroz (BRADBURY et al., 2005). Ainda em arroz, o gene amido sintase é associado à temperatura de gelatinização do grão de arroz, uma característica importante na comercialização dessa cultivar (BRADBURY et al., 2005). Uma outra vantagem dos marcadores SNPs é que eles permitem uma fácil identificação inequívoca dos alelos ou haplótipos. Por outro lado, em plantas poliplóides, as análises tanto de genômica comparativa quanto de detecção de marcadores se tornam muito mais complexas. Brassica napus L. e Triticum aestivum L. são exemplos típicos de alotetraploide e alohexaploide respectivamente, cujas análises comparativas podem resultar em inferências incertas de duplicação gênica ou expansão genômica.

A genômica comparativa possibilita o estudo de regiões funcionais do genoma, tais como os sítios regulatórios de associação de motivos de DNA importantes para os fatores de transcrição. Duas ferramentas de Bioinformática comumente utilizadas para esses estudos são Vista1 (FRAZER et al., 2004) e Pipmaker2 (SCHWARTZ et al., 2000). Utilizando interfaces web de tais aplicações, grandes trechos de sequências de DNA podem ser usados para a busca de regiões conservadas em outras espécies. O programa Vista contém as comparações pré-calculadas entre diferentes genomas-modelo. Esses aplicativos podem ser usados em ambos os sentidos (sense e antisense) para a identificação de genes, e sequências reguladoras para a compreensão dos mecanismos e para a história da evolução de um genoma. Outros algoritmos de alinhamento foram desenvolvidos, além dos citados acima. Para aprofundamento sobre comparações de sequências de plantas, o tutorial de Lyons e Freeling (2008) pode ser consultado.

Existem ainda bases de dados de genomas com ferramentas integradas de genômica comparativa – como o Plant Genome DataBase3 (PGDB) que é um banco de dados público de espécies de plantas para comparação de sequências do tipo EST e GSS, além de permitir a navegação e visualização da anotação em diferentes genomas.

A seguir exemplificamos alguns casos bem sucedidos em que a genômica comparativa demonstrou um papel fundamental nas descobertas. Primeiramente o caso da busca de sintenia entre banana (Musa) e arroz, em que Lescot et al. (2008) demonstraram por meio de comparações de regiões genômicas de arroz, M. acuminata e M. balbisiana, a alta conservação entre a estrutura dos genomas e indicaram que esses genomas divergiram cerca de 4,6 milhões de anos. Esses resultados apontam para a utilidade de análises comparativas entre espécies de monocotiledôneas remotamente relacionadas como o arroz e Musa.

Outro exemplo de sucesso vem do estudo da tolerância a alumínio em sorgo e arroz (CANIATO et al., 2006; MAGALHÃES et al., 2007). Nesse trabalho os autores identificaram por estudos experimentais e por genômica comparativa os haplótipos de AltSB, que podem ser incorporados por melhoramento genético molecular e pela Biotecnologia em programas de melhoramento para a tolerância a alumínio em solos ácidos. A estratégia envolveu a comparação microssintênica entre sorgo e arroz seguida da conversão de dados de sequência em marcadores STS associada à montagem e anotação de sequências de BAC. A partir daí foi identificado e clonado o gene de tolerância ao alumínio tóxico em sorgo, sendo que o alelo de tolerância está sendo transferido para linhagens e híbridos comerciais de sorgo por meio de seleção assistida por marcadores. Além disso, a estratégia de transgenia está sendo utilizada por meio de um promotor constitutivo para a superexpressão do gene em milho. Novos alelos superiores de tolerância também estão sendo investigados, para a piramidação de genes visando ao aumento da tolerância ao alumínio em sorgo.

4. Novas perspectivas

Ao longo dos últimos três anos, surgiram novas abordagens tecnológicas para sequenciamento de DNA que diferem do método de Sanger pela química do processo e por se remeterem à paralelização do número de amostras processadas simultaneamente. Enquanto os sequenciadores automáticos por capilares, que utilizam o método de Sanger, geram até 96 sequências por corrida, este número sobe para centenas de milhares ou milhões com as novas tecnologias, batizadas de tecnologias de sequenciamento de próxima geração (SPG) ou sistemas de sequenciamento paralelo de ultradesempenho (MARDIS, 2008).

As expectativas são tão favoráveis em relação às novas tecnologias que permitem a idealização de experimentos que seriam inatingíveis sem essas.

Um alvo ativamente perseguido é a possibilidade de se obter a sequência de um genoma humano por US$ 1.000 (MARDIS, 2006), lembrando que o custo do genoma humano foi de US$ 2,3 bilhões ao longo de 13 anos (WADMAN, 2008). Com a brutal queda de custos de sequenciamento e disponibilidade de sequências de referência, foi recentemente lançado um projeto para o sequenciamento de 1.000 genomas humanos4. Assim, abre-se o caminho para o alcance da esperada genômica personalizada, quando não serão mais analisadas apenas pequenas regiões do genoma, mas o genoma completo de uma planta, animal ou qualquer objeto de estudo na busca de uma resposta para diagnóstico de doenças, determinação precoce de características fenotípicas de interesse, entre outras.

A perspectiva de aplicação da genômica individual, ou medicina personalizada, fascina a Biotecnologia no momento. Principalmente pela facilidade de se realizar esta façanha com as novas tecnologias de sequenciamento. O maior desafio é realizar um genoma de um indivíduo ao preço de mil dólares. As empresas, ainda poucas, que oferecem esse serviço prometem aos clientes a identificação de possíveis predisposições a doenças genéticas já conhecidas pelo genoma humano, traduzindo-se em porcentagens de surgimento de uma doença como Alzheimer, Diabetes ou doenças genéticas mais raras. As opções de mercado mais baratas são as identificações de polimorfismo de nucleotídeo único. Nos Estados Unidos já é possível identificar os SNPs personalizados por US$ 399 por indivíduo.

Essa tecnologia aplicada ao melhoramento genético certamente terá grande impacto, seja na descoberta de SNPs, seja no estudo de expressão gênica, seja na montagem de genomas de vários indivíduos. Ao lado dessas novas perspectivas está o horizonte de desafios para a Bioinformática.

5. Considerações finais

A era da informação está revolucionando as ciências naturais. O sequenciamento de genomas e as técnicas para obter dados em larga escala nos permitem adquirir conjuntos completos de dados de sistemas biológicos. A interpretação dos dados a fim de obter conhecimento biológico é um dos principais desafios da Bioinformática.

Obter esse conhecimento e conseguir realizar a integração de dados genômicos àqueles derivados de informação fenotípica será uma das contribuições da Bioinformática para o melhoramento genético. A Bioinformática pode ainda ajudar durante o processo de desenvolvimento ou seleção dos marcadores associados com fenótipos de interesse econômico e identificação e clonagem de genes candidatos para o controle de caracteres importantes. As técnicas pós-genômicas tais como o transcriptômica e metabolômica, que podem ajudar no mapeamento de populações e variedades, igualmente exigem ferramentas da Bioinformática para a análise dos dados que podem ser gerados.

Para compreender completamente as características de interesse e entender a genética e os genes que estão envolvidos no processo biológico, aparentemente não será possível um único procedimento para fazer a ponte entre genótipo e fenótipo, mas uma combinação de métodos será necessária para identificação dos genes fundamentais. A Bioinformática pode prover alguns métodos nessa combinação para trabalhar em prol do melhoramento. A habilidade para manusear e ligar todos os dados que podem ser minerados para responder questões específicas ou genéricas em melhoramento, e a partir daí identificar e acessar as características relevantes, será um desafio para as próximas décadas.

6. Referências

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Glossário (termos de Bioinformática)

Algoritmo

Conjunto de passos (instruções/comandos) necessários para o computador executar uma tarefa. Os programadores utilizam a lógica algorítmica nas diversas linguagens de programação. O computador, portanto, executa uma tarefa baseado nas instruções definidas no algoritmo.

Alinhamento

É o processo de alinhar duas ou mais sequências que tem o máximo nível de identidade (e conservação, no caso de sequências de aminoácidos) com o propósito de avaliar o grau de similaridade e a possibilidade de homologia.

Alinhamento global

Alinhamento de duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos em toda a sua extensão.

Alinhamento local

É o processo de busca de alinhamento de regiões altamente similares de duas sequências de DNA ou proteína.

Alinhamento múltiplo

É a comparação entre três ou mais sequências de nucleotídeos ou aminoácidos, com objetivo de posicionar a maior quantidade de elementos idênticos entre elas (similaridades).

Bioinformática

Ciência que analisa e administra dados biológicos utilizando-se de técnicas computacionais.

Blast

Do inglês Basic Local Alignment Search Tool. É um algoritmo de comparação sequêncial otimizado para buscas rápidas em bancos de dados de sequências genômicas, visando a alinhamentos locais otimizados.

Genômica

Área da ciência que estuda e sequencia o genoma de um organismo.

Metabolômica

Área da ciência que estuda o conjunto de metabólitos e os perfis metabólicos de um organismo.

Metagenômica

Área da ciência que sequencia e estuda os genomas de diversos organismos em conjunto.

Ômica

Terminação associada às plataformas tecnológicas que têm o objetivo de isolar e caracterizar o maior número possível de biomoléculas de um mesmo grupo como DNA, RNA, proteínas e metabólitos.

Proteômica

Área da ciência que estuda o conjunto de proteínas de uma célula.

Score

No resultado de um alinhamento entre sequências, o score é a pontuação que uma determinada sequência recebe dependendo do grau de correspondência encontrada no banco de dados. São pesos (valores) das operações realizadas no alinhamento múltiplo. As operações mais comuns são: inserção de espaço (gap´s), inserção de um novo elemento (nucleotídeos ou aminoácidos), substituição do elemento (de A para T, ou de G para C).

Similaridade

Sequências correlatas. A similaridade entre duas sequências pode ser baseada no percentual de identidade e/ou conservação.

Sintenia

Refere-se à propriedade de dois ou mais genes estarem localizados no mesmo cromossomo.

Capítulo 6
Transformação genética de cana-de-açúcar

Djair dos Santos de Lima e Souza

Eduardo Romano

Hugo Bruno Correa Molinari

Maria Fátima Grossi-de-Sa

1. Introdução

A cana-de-açúcar representa, desde o início da colonização do Brasil, uma importante fonte de alimentos, como o açúcar, a rapadura e a cachaça. Os subprodutos do seu processamento são usados para a produção de ração para a alimentação animal e papel (STUPIELLO, 1987). Além disso, vale salientar a importância da produção de energia elétrica, gerada a partir da queima do bagaço proveniente da extração do caldo.

A produção da cana-de-açúcar no Brasil está concentrada principalmente nas regiões Centro-Sul e Nordeste e ocupa uma área de aproximadamente 8 milhões de hectares. A estimativa de produção para a safra 2007–2008 é de cerca de 473 milhões de toneladas, das quais 46,92% (221,99 milhões de toneladas) são para a fabricação de açúcar e 53,08% (251,17 milhões de toneladas) para a produção de álcool. O Estado de São Paulo é o de maior participação na produção, representando cerca de 60% (280 milhões de toneladas) da produção total (CONAB, 2007).

Atualmente, o Brasil é o maior exportador de etanol e o segundo maior produtor, após os Estados Unidos. Todo etanol brasileiro é produzido a partir da cana-de-açúcar. O interesse crescente por esse combustível fez com que a sua produção mundial aumentasse de 17,25 bilhões de litros no ano 2000 para cerca de 46 bilhões de litros em 2007, representando cerca de 4% dos 1.300 bilhões de litros de gasolina consumidos mundialmente. Com todos os novos programas governamentais da América, Ásia e Europa, a demanda global pode ultrapassar 125 bilhões de litros por volta de 2020 (BALAT; BALAT, 2009). A perspectiva em 2025 é que o uso do etanol substitua o uso projetado para a gasolina no mundo em 5% (LEITE et al., 2009).

Dentre os estresses abióticos causadores das maiores perdas de colheitas no mundo, além da seca, a alta salinidade é um dos mais relevantes. O aumento da salinidade de solos aráveis deve levar a uma perda de 30% na área cultivável nos próximos 25 anos. Do ponto de vista fisiológico, há sobreposição entre a resposta à seca e à salinidade. Apesar disso, estudos com a planta modelo Arabidopsis thaliana revelaram que, em nível de transcriptoma, muitos genes respondem especificamente à salinidade, enquanto outros também respondem a outros estresses abióticos, como frio e seca.

Como toda monocultura, a produção de cana-de-açúcar é prejudicada também pelo ataque de insetos-praga e patógenos. Visando diminuir as perdas causadas por fitopatógenos, os agricultores passaram a investir no controle de insetos-praga e doenças a partir da utilização de produtos químicos, na rotação de culturas e no desenvolvimento de híbridos mais resistentes; mas, com o passar do tempo, essas pragas foram adquirindo resistência e vêm tornando cada vez mais elevado o custo do cultivo de cana-de-açúcar. O desenvolvimento de cultivares mais resistentes por meio de intercruzamentos vem ajudando a conseguir maiores índices de produção e reduzir os danos causados à natureza. Porém, nem sempre essa é a melhor estratégia para controlar as doenças causadas por fitopatógenos e insetos-praga, principalmente porque as espécies do gênero Saccharum possuem diferentes números de cromossomos (variando entre 80 e 250) podendo tornar o cruzamento praticamente inviável, gerando indivíduos triploides e/ou aneuploides, fato este que pode retardar a obtenção de uma cultivar de cana-de-açúcar com características agronômicas desejáveis em até 15 anos (LAKSHMANAN et al., 2005).

O crescimento do mercado de consumo de cana-de-açúcar e seus derivados associado ao aumento da preocupação com a preservação do meio ambiente têm gerado a necessidade de buscar novas alternativas e metodologias para o controle de fitopatógenos, insetos-praga e tolerância a estresses abióticos, como a seca. A utilização de ferramentas biotecnológicas e a transformação de plantas vêm surgindo como estratégias promissoras para a obtenção de cultivares mais produtivas e resistentes, além de serem menos prejudiciais ao meio ambiente e reduzirem os custos de produção (NÓBREGA; DORNELAS, 2006).

2. Situação e perspectivas sobre plantas transgênicas no mundo

Apesar das restrições ao seu uso em alguns países, as lavouras geneticamente modificadas (GMs) são uma realidade, e, após 13 anos de cultivo comercial, a tecnologia vem sendo adotada de forma crescente por muitos países. Essa adoção se deve, principalmente, ao retorno financeiro e ao ganho ambiental resultante desse plantio. O aumento na renda dos pequenos agricultores também reflete a importância das lavouras GMs para aliviar a situação dos que sofrem com fome no mundo (JAMES, 2008). Entre os anos de 1970 e 2006, a população mundial aumentou de 3 bilhões para 6,5 bilhões de habitantes, o que significa um considerável aumento no número de famintos (DE WAELE; ELSEN, 2007).

A biotecnologia agrícola é uma importante ferramenta para aumentar a disponibilidade de alimentos em regiões onde o aumento crescente da população humana torna o alimento um fator limitante. Além disso, o aumento na produção de vegetais produtores de fibras, como o algodão e dos usados para a extração de biocombustíveis (cana-de-açúcar, milho, mandioca e sorgo), é bastante importante para nações emergentes como o Brasil. O Brasil hoje é o terceiro país em área plantada de lavouras GMs (15,8 milhões de hectares), perdendo apenas para os Estados Unidos e Argentina, respectivamente. Podemos citar vários exemplos dos benefícios da utilização de lavouras GMs. O primeiro ponto consiste na possibilidade de se aumentar a produtividade e a produção de certos cultivares de plantas (JAMES, 2008). Em segundo lugar, a geração de plantas resistentes a estresses abióticos como a seca, o estresse salino e o estresse de congelamento (GAO et al., 2008; XUE et al., 2009) pode ser muito importante em regiões com condições climáticas, ou de solo, inadequadas para a agricultura.

Além disso, o ganho ambiental pela diminuição com o uso de pesticidas nas lavouras GMs pode ser representado pelo Quociente de Impacto Ambiental (EIQ), uma medida composta baseada nos diversos fatores que contribuem ao impacto ambiental líquido de um ingrediente ativo individual. Esse coeficiente indicou uma redução de 17,2% no impacto ambiental, que correspondeu a uma diminuição de 359 mil toneladas métricas de ingrediente ativo, de 1996 a 2007, em virtude do plantio de plantas transgênicas (JAMES, 2008).

Atualmente, a tolerância a herbicidas é a característica predominante nas lavouras GMs. Em 2008, a tolerância a herbicida empregada na soja, no milho, na canola, no algodão e na alfafa ocupou 63% ou 79 milhões de hectares da área global de 125 milhões de hectares de variedades transgênicas. Plantas com mais de uma característica (principalmente tolerância a herbicidas e resistência a insetos) ocupam uma área maior (26,9 milhões de hectares, ou 22% da área global com culturas biotecnológicas) do que as variedades com resistência a insetos (19,1 milhões de hectares, ou 15% da área global com culturas biotecnológicas) (JAMES, 2008). Isso demonstra a nítida tendência de combinar os benefícios resultantes dessas distintas tecnologias para a transformação de plantas para uma ou mais características novas. A maior parte das plantas resistentes a insetos utilizam a tecnologia Bt. Essas plantas carregam genes codificadores para toxinas Cry, isolados de Bacillus thuringiensis (Bt). Quando ingeridas pelo inseto alvo, as toxinas Cry se inserem na membrana das células epiteliais do intestino, criando poros e provocando um desbalanço eletrolítico que leva o inseto à morte (CARLINI; GROSSI DE SÁ, 2002; ROH et al., 2007). Dos US$ 10 bilhões gerados com o mercado global de produtos GMs, em 2007, US$ 6 bilhões foram oriundos de países em desenvolvimento, e US$ 4 bilhões vieram de países industrializados (JAMES, 2008). Os lucros gerados com as plantas Bt reforçam o potencial de mercado das plantas GMs para o presente e futuro. Nesse sentido, muitos trabalhos foram desenvolvidos até o momento, com o objetivo de gerar plantas transgênicas com potencial agrícola. E, além das plantas Bt resistentes a insetos e a outras comercializadas atualmente, como as resistentes a herbicidas, já foram geradas plantas que exibem tolerância a estresses abióticos (GAO et al., 2008) e outras resistentes a diferentes patógenos como bactérias (HUANG, 2007), fungos (SHAH et al., 2009) e nematoides (HUANG et al., 2006). Sendo assim, plantas transgênicas com potencial para uso comercial estão sendo produzidas a partir de pesquisas científicas; e, provavelmente, o Brasil possuirá em alguns anos eventos-elite de cana-de-açúcar mais produtivos, com características de resistência a estresses bióticos ou abióticos ou com características metabólicas adicionais.

3. Transformação genética de cana-de-açúcar

Por ser uma fonte de combustível renovável e uma alternativa ao uso de combustíveis fósseis emissores de gases poluentes, o foco nas pesquisas com cana consiste em maximizar a sua produtividade, levando a um maior rendimento na produção de etanol (LEITE et al., 2009). Para atingir essa meta, além de aumentar a disponibilidade de terras para o seu cultivo, introduzir características para estresse biótico (insetos-praga) e abiótico em germoplasma de cana-de-açúcar vem sendo cada dia mais uma forte demanda. Nesse sentido, o Brasil poderá se beneficiar muito com novas tecnologias que levem ao aumento da produção da cana no mundo, diminuição dos custos de plantio e, consequentemente, o aumento da acessibilidade ao consumidor. Para atingir esses objetivos, pesquisadores brasileiros e de outras partes do mundo estão concentrando esforços na busca de genes de interesse e de métodos mais eficazes para a transformação genética da cana-de-açúcar.

É de conhecimento geral que a introdução heteróloga de genes em plantas é uma estratégia única que transcende as opções que o melhoramento convencional oferece. Sendo assim, características de interesse agronômico podem ser retiradas de qualquer espécie de plantas, microrganismo ou animal e introduzidas em plantas produtoras de alimentos, fibras e combustível. A complexidade genética das variedades modernas de cana-de-açúcar, decorrente do elevado nível de ploidia e ocorrência de aneuploidia, constitui o principal obstáculo para a geração de variedades geneticamente melhoradas por métodos convencionais. Além disso, atualmente, são necessários de 12 a 15 anos para se obter novas variedades. Sendo assim, a transformação genética é uma importante ferramenta para a introdução de características de interesse no germoplasma da cana-de-açúcar (MENOSSI et al., 2008).

4. Cultura de tecidos preparativa para a transformação genética

Desde o trabalho pioneiro na indução de calos por Nickell (1964), a cultura de tecido de cana-de-açúcar surge como uma ferramenta valiosa para várias atividades de pesquisas, o que permitiu a sua utilização para várias aplicações tais como a micropropagação (HENDRE et al., 1983), conservação de germoplasma (TAYLOR; DUKIC, 1993), a eliminação de patógenos virais e bacterianos sistêmicos (PARMESSUR et al., 2002; WAGIH et al., 1995) e, finalmente, a engenharia genética de cana-de-açúcar (ARENCIBIA et al., 1995; BOWER; BIRCH, 1992).

A cana-de-açúcar é uma gramínea perene que normalmente se reproduz vegetativamente por meio dos botões nodais e dos rizomas, mas a propagação via semente também ocorre (BAKKER, 1999). Comercialmente, a propagação da cana-de-açúcar ocorre via vegetativa por cortes nodais, e, por esse motivo, a micropropagação oferece um método prático e rápido para a produção massal do material de origem clonal.

A micropropagação é um método in vitro para a multiplicação clonal das plantas utilizando como fonte células e/ou tecidos meristemáticos ou não meristemáticos, em meios de cultura contendo vitaminas e nutrientes específicos. As plantas podem ser regeneradas diretamente do explante (GEIJSKES et al., 2003) ou indiretamente (de novo) por meio de calos derivados de explante (HEINZ; MEE, 1971). Como em outras espécies vegetais, as plantas de cana-de-açúcar propagadas a partir de meristemas são consideradas, geneticamente e fenotipicamente, mais estáveis que aquelas produzidas a partir de calos de origem não meristemática (HENDRE et al., 1983.; LEE, 1987).

Embriogênese somática é provavelmente o método in vitro mais investigado de regeneração de cana-de-açúcar (GUIDERDONI et al., 1995). Um grande número de clones comerciais de cana-de-açúcar foi obtido a partir de embriogênese somática (GUIDERDONI et al., 1995; MANICKAVASAGAM; GANAPATHI, 1998.) e pode ser obtido diretamente (MANICKAVASAGAM; GANAPATHI, 1998.), ou indiretamente (GUIDERDONI; DEMARLY, 1988), do tecido da folha. Embora desenvolvida originalmente como um sistema alternativo de regeneração à cultura de tecidos meristemáticos, a embriogênese somática se tornou importante como uma parte integrante do sistema genético da transformação (BOWER; BIRCH, 1992).

5. Transformação genética de cana-de-açúcar mediada por Agrobacterium spp.

Os primeiros calos/células transgênicos de cana-de-açúcar foram obtidos pelo método de transferência de DNA mediada por Poli Etileno Glicol (PEG). Esse método, porém, recebeu pouca atenção, pois a eficiência de transformação dos protoplastos reportada para a cultivar F164 foi baixíssima (um por 106), além da baixa reprodutibilidade do método (CHEN et al., 1987). Por outro lado, a transformação estável de cana por eletroporação de protoplastos se mostrou um método mais eficiente e reproduzível do que o método de transformação via PEG. Esse fato foi observado em várias cultivares transgênicas, como as cultivares Q63 e Q96 que apresentaram uma frequência de transformação de 102 a 104, respectivamente (RATHUS; BIRCH, 1992). Nesses experimentos, porém, a falta de regeneração dos protoplastos culminou na não formação de plantas transgênicas. Outros experimentos de transformação via eletroporação obtiveram sucesso na produção de plantas transgênicas a partir de células embriogênicas intactas e de tecidos meristemáticos in vitro (ARENCIBIA et al., 1992, 1995). Uma série de trabalhos também reporta a transformação da cana-de-açúcar, mediada por Agrobacterium. Dentre esses podemos citar Arencibia et al. (1998) que transformaram calos de cana-de-açúcar em cocultura, com as linhagens LBA 4404 e EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens. Nesse trabalho, a frequência de transformação variou de 9,4 x 10-3 a 1,15 x 10-2, e três principais fatores foram indicados como cruciais para o aumento da competência das células para o processo de transferência do T-DNA: 1) uso de calos jovens e regeneráveis como explantes; 2) indução e/ou aumento do sistema de virulência de A. tumefaciens com culturas de células de cana; e 3) pré-indução da organogênese ou embriogênese-somática. Em outro trabalho, a transformação mediada por A. tumefaciens (C58C1 RifR (At 2260)) foi usada para introduzir na cana-de-açúcar resistência genética ao sal de fosfinotricina (PPT), o componente ativo do herbicida comercial Basta. Nesse caso, foram usados diferentes protocolos de transformação para a introdução do gene bar no genoma da cana. Para isso, secções meristemáticas, usadas como fonte de explantes, foram tratadas com compostos antinecróticos para minimizar o dano por estresse oxidativo. A frequência de transformação para a cultivar comercial Ja60-5 foi de 35% (ENRIQUEZ-OBREGON et al., 1998). Esse trabalho demonstrou que tanto a utilização de calos jovens e regeneráveis quanto à prevenção da morte celular provocada pela infecção com Agrobacterium são importantes para a obtenção de uma alta frequência de transformantes em cana-de-açúcar. Ademais, Manickavasagam et al. (2004) obtiveram plantas de cana resistentes ao herbicida Basta em uma frequência de transformação de 50%, utilizando para isso gemas axilares como fonte de explante. Essa alta taxa de transformação foi obtida com as cultivares Co92061 e Co671, usando a linhagem de A. tumefaciens, estirpe EHA105.

6. Transformação genética de cana-de-açúcar mediada por biobalística

A transformação de plantas via bombardeamento de micropartículas, também conhecido como biobalística, consiste na introdução em um tecido alvo de microprojéteis, envoltos por DNA de interesse, que são acelerados a velocidades superiores a 1.500 km/h. Os microprojéteis acelerados penetram na parede e membrana celular, e o DNA exógeno em contato com o líquido celular se dissocia das partículas e é incorporado no genoma do tecido alvo. O desenvolvimento da primeira cana-de-açúcar transgênica a partir da cultivar comercial Q117 foi realizado por meio do referido método de transformação (BOWER; BIRCH, 1992). Esse procedimento rendeu cerca de uma planta transgênica por bombardeamento de calos embriogênicos para a inserção do gene nptII. Calos embriogênicos são os alvos preferidos para esse método, em razão do alto percentual de transformação e da fácil regeneração. Outros tecidos, como os meristemas apicais de folhas jovens, verticilos florais e influorescências (ELLIOTT et al., 2002; GAMBLEY et al., 1993), também foram usados com sucesso como alvos para a transformação de cana-de-açúcar. Portanto, em virtude da facilidade em transformar diversos tecidos e a praticidade do método, a transformação de cana-de-açúcar por bombardeamen-to de micropartículas é a metodologia atualmente mais utilizada (LAKSHMANAN et al., 2005). Na Figura 1 são mostradas as diferentes etapas do processo de transformação aplicadas na geração de uma planta transgênica de cana-de-açúcar usando o método de biobalística.

Figura 1. Esquema de regeneração e transformação de cana-de-açúcar via biobalística: A – explantes oriundos de folhas imaturas com diâmetro de 2 mm a 3 mm; B – calos embriogênicos obtidos após 4 subcultivos em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) acrescido de 13 μM de 2,4-D; C – aparelho de bombardeamento de micropartículas utilizado nos experimentos de transformação genética de cana-de-açúcar; D – etapa de regeneração dos calos embriogênicos em meio de cultura contendo 25 μM de glufosinato de amônio; E – alongamento e enraizamento das plantas putativas transgênicas de cana-de-açúcar; F – fase de aclimatização das plantas em casa –de vegetação; G – fase de multiplicação e avaliação dos componentes de rendimento dos eventos transgênicos selecionados em áreas credenciadas pela CTNBio; H – fase final de comercialização e incorporação das cultivares GMs no sistema de produção sucroalcooleiro.

Fotos: Hugo Bruno Correa Molinari

7. A cana-de-açúcar como fonte de genes para melhoramento genético da cultura

Definido o método de transformação a ser utilizado para a cultura de interesse, deve-se então selecionar a característica genética a ser inserida na planta. Sendo assim, melhorias como o aumento da qualidade nutricional do vegetal, o melhoramento do seu sistema de defesa ou o incremento da sua produtividade em campo podem ser obtidos pela transferência de informação genética de outras fontes, ou da própria espécie em estudo ou de um isolado da espécie que contém a característica desejada. Um exemplo da grande profusão de moléculas a serem utilizadas para a transgenia de plantas consiste na utilização de genes codantes de proteínas anticongelantes presentes no sangue de peixes de mares gelados. Essas proteínas, quando expressas em vegetais, amenizaram os problemas resultantes dos danos causados pelos cristais de gelo formados em alimentos como frutas (HIGHTOWER et al., 1991). Vários trabalhos reportam genes descobertos em bibliotecas de genes transcritos (ESTs) de cana-de-açúcar. Muito desses genes são expressos em resposta à herbivoria, à seca e a outros estresses (CARSON; BOTHA, 2002; CASU et al., 2001; VETTORE et al., 2003). Assim, essas bibliotecas representam fonte importante de genes para viabilização da genômica funcional como estratégia prévia à transgenia da espécie. Não existe ainda relatado o genoma completo da cana-de-açúcar. Por outro lado, foram construídos bancos de acesso público que são uma fonte de genes a serem explorados para o melhoramento da cana no mundo inteiro. Essa é uma tendência atual da Biotecnologia, trazer facilidades para a realização de pesquisas com maior eficácia. Para consulta de genes da cana, podemos acessar o banco internacional Sugarcane Gene Index1 ou o banco brasileiro Sucest2.

8. Genes potenciais a serem usados na transformação genética da cana-de-açúcar

8.1. Genes relacionados ao estresse biótico

Assim como outras plantas cultiváveis de grande importância agrícola, a cana-de-açúcar sofre danos severos causados por agentes bióticos como insetos e patógenos. Os mecanismos de defesa vegetal são bastante complexos e envolvem uma série de genes relacionados a receptores, a proteínas de resistência (proteínas R) e a metabólitos secundários envolvidos com a sinalização para a resistência, como o ácido salicílico, o etileno e o ácido jasmônico. O entendimento da expressão gênica na cana-de-açúcar, durante a herbivoria, ou com a presença de patógenos, é de suma importância para a escolha da melhor estratégia a ser utilizada na transformação da planta. Alguns relatos apontam potenciais genes relacionados com alguns desses mecanismos. Como exemplo podemos citar a expressão de um provável receptor de etileno (SCER1) e dois prováveis fatores de transcrição (SCERF1 e SCERF2), membros da via de sinalização do etileno, os quais mostraram ser regulados durante a associação da cana-de-açúcar com bactérias fixadoras de nitrogênio (CAVALCANTE et al., 2007).

O projeto do transcriptoma da cana-de-açúcar (Sucest) revelou a expressão de uma série de genes ortólogos relacionados à resposta às injúrias causadas por insetos herbívoros. Dentre esses genes, podemos destacar os que codificam para inibidores de proteinases digestivas, com potencial de inibição do processo de digestão de proteínas vegetais pelo inseto-praga, os inibidores de alfa-amilases que podem impedir a atividade catalítica de enzimas responsáveis pela digestão do amido da planta atacada e quitinases que podem atuar no mecanismo de defesa vegetal por digerir o conteúdo quitinoso da matriz peritrófica do intestino do inseto forrageiro (FALCO et al., 2001). Em outro relato a cana-de-açúcar foi submetida a diversos estímulos como tratamento com metil jasmonato, ácido abiscísico, assim como em associação com bactérias fixadoras de nitrogênio e sob o ataque do inseto-praga, a Diatraea saccharalis. No referido trabalho, a presença da D. saccharalis na cana-de-açúcar, após 24 horas, induziu na planta uma forte expressão de uma proteína relacionada à patogênese similar à taumatina (ROCHA et al., 2007). O tratamento de plantas com hormônios vegetais também pode ser uma alternativa para a descoberta de novos genes de resistência associados ao estresse biótico. Por exemplo, quando plantas são atacadas por herbívoros, elas produzem jasmonato e metil jasmonato. Esses hormônios participam da sinalização para a expressão de genes de resistência em resposta à herbivoria ou a injúrias mecânicas no vegetal. Por essa razão, plantas de cana-de-açúcar foram tratadas com metil jasmonato, o que resultou na expressão de homólogos de genes de resistência como a lipoxigenase e uma proteína da família PR-10 (BOWER et al., 2005). Esses e outros exemplos demonstram que a cana-de-açúcar pode ser uma fonte de genes com potencial para o incremento da resistência a insetos-praga e patógenos em cultivares de interesse agronômico. Porém, muitas outras fontes podem ser utilizadas para a produção de plantas de cana transgênicas resistentes a estresses bióticos. Essas fontes podem incluir a bactéria de solo Bacillus thuringiensis como fonte de proteínas Cry (BRAGA et al., 2003), Galanthus nivalis como fonte de lectinas (SETAMOU et al., 2002).

8.2. Genes relacionados ao estresse abiótico

Além dos problemas com insetos-praga e patógenos, a agricultura mundial é afetada por diversos fatores ambientais como a seca, a salinidade dos solos, as altas temperaturas, o frio que impedem ou limitam o uso de terras que poderiam ser melhor aproveitadas na agricultura. Por exemplo, 22% das terras agrícolas do globo são salinizadas (BHATNAGAR-MATHUR et al., 2008). Além disso, as mudanças climáticas globais cada vez mais acentuadas, como a desertificação de florestas, constituem um problema que afetará seriamente as gerações futuras. Sendo assim, variedades agrícolas transgênicas ou naturalmente resistentes a estresses abióticos podem ser uma alternativa para o aproveitamento de terras não cultiváveis. Práticas como irrigação visando minimizar o déficit hídrico podem levar a um problema sério de salinização das terras aráveis no mundo de até 50% até o ano de 2050 (RODRIGUEZ et al., 2005). Além disso, o percentual de água doce usado na agricultura corresponde a 65% da água consumida no mundo. Esse fato demonstra a importância do desenvolvimento de plantas tolerantes à seca (MENOSSI et al., 2007).

As vias bioquímicas de resposta a estresses abióticos englobam respostas celulares complexas, as quais incluem moléculas sensoriais que percebem o sinal inicial do estresse, proteínas relacionadas com a cascata de sinalização celular, fatores de transcrição, promotores, bem como as proteínas expressas em resposta a estresses, como as chaperonas (GROVER et al., 2001; RODRIGUEZ et al., 2005). Os canais de Ca2+, por exemplo, são sensores para estresses como a seca, salinidade e frio. O influxo do cálcio para o meio intracelular leva a ativação das cascatas de sinalização para a expressão dos genes relacionados à tolerância a estresses abióticos (RODRIGUEZ et al., 2005). Uma estratégia importante para a identificação de genes de resistência a estresses abióticos em cana-de-açúcar consiste na construção de bibliotecas de cDNA usando variedades de cana submetidas a condições de déficit hídrico, altas temperaturas, frio ou alta salinidade. Nesse caso, experimentos realizados com cana-de-açúcar submetida ao estresse hídrico resultaram na expressão diferencial de vários genes em relação às plantas controles não submetidas à seca.

Dentre esses genes, podemos destacar ortólogos de fatores de transcrição Myb, WRKY, NAC e DREB que foram relacionados com mecanismos de tolerância ao estresse hídrico em outras espécies de plantas (ROCHA et al., 2007). Outras proteínas importantes que são expressas em resposta a altas temperaturas são as chaperonas moleculares Heat Shock Proteins – (HSPs). Pequenas proteínas (sHSP) ligam-se a proteínas parcialmente desnaturadas, impedindo que essas sejam inativadas durante o estresse de temperatura.

Essas proteínas são alvos de uso como ferramentas biotecnológicas. Em cana-de-açúcar foram identificadas formas dessas chaperonas (SsHsp17.2 e SsHsp17.9), que podem ser utilizadas posteriormente para a produção de variedades de cana transgênica resistente a estresse de temperatura (TIROLI; RAMOSA, 2007). Esses são alguns exemplos de genes oriundos da cana-de-açúcar com potencial uso na obtenção de tolerância de variedades de interesse econômico a estresses abióticos. Por outro lado, como já comentado anteriormente, outras espécies de plantas, animais ou microrganismos também podem ser usados como fontes doadoras de genes para o melhoramento genético da cana-de-açúcar.

9. Situação global da cana-de-açúcar transgênica

Atualmente, ainda não existe cana-de-açúcar transgênica comercial. Como relatado anteriormente, um enorme potencial para o aumento da produção do etanol brasileiro se abre com as alternativas para o melhoramento genético da cana-de-açúcar via transgenia. Existem, também, muitos insetos-praga e patógenos que contribuem para a diminuição da produtividade da cana-de-açúcar no Brasil como, por exemplo, a cigarrinha-das-folhas (Mahanarva posticata), cigarrinha-das-raízes (Mahanarva fimbriolata), a broca-da-cana (Diatrea saccharalis), broca-gigante (Telchin licuslicus), nematoides (Meloidogyne incognita), entre outras (PINTO, 2006) – Boletim Técnico. O maior entendimento da interação entre essas espécies e a cana-de-açúcar contribuirá para o desenvolvimento de plantas GMs resistentes em um futuro próximo.

A liberação comercial de cana GM ainda não se deu provavelmente em virtude de questões regulatórias e relacionadas à propriedade intelectual. No caso das características complexas, tais como o teor de sacarose, ainda não há comprovação da melhoria do desempenho agronômico das plantas transformadas (MENOSSI et al., 2008). Atualmente, existem plantas GMs de cana-de-açúcar com diferentes características, incluindo tolerância a herbicidas (CHOWDHURY; VASIL, 1992; ENRIQUEZ-OBREGON et al., 1998; GALLO-MEAGHER; IRVINE, 1996; LEIBBRANDT; SNYMAN, 2003), resistência a insetos (ARENCIBIA et al., 1997, 1999), ao vírus-do-mosaico (BUTTERFIELD et al., 2002; INGELBRECHT et al., 1999), à bactéria causadora da escaldadura das folhas (ZHANG et al., 1999) e, ainda, ao gene P5CS, que aumenta o acúmulo do aminoácido prolina, conferindo assim uma maior tolerância da planta à seca (MOLINARI et al., 2007), além do gene marcador de seleção nptII (ARENCIBIA et al., 1998; ELLIOTT et al., 1998; GAMBLEY et al., 1993). Esses relatos demonstram o potencial da transgenia na geração de variedades de cana-de-açúcar mais produtivas e resistentes a doenças e ao déficit hídrico. Um quadro geral da situação da cana-de-açúcar GM no mundo está resumido na Tabela 1.

Tabela 1. Plantas transgênicas de cana-de-açúcar obtidas pelos métodos de biobalística e transformação mediada por Agrobacterium spp. Os trabalhos citados na tabela descrevem diversos protocolos e adaptações para a transformação da cana-de-açúcar aplicados às características de resistência a herbicidas e a insetos-praga.

Característica

Gene

Método de transformação

Referência

Genes repórteres e sistemas de seleção

Neomicina fosfotransferase

nptII

Biobalística

Bower e Birch (1992)

β-Glucuronidase

uidA

Biobalística

Bower e Birch (1992)

β-Glucuronidase

uidA

Eletroporação

Arencibia et al. (1995)

β-Glucuronidase

uidA

Agrobacterium

Arencibia et al. (1998)

Higromicina fosfotransferase

Hpt

Agrobacterium

Arencibia et al. (1998)

Green Fluorecent Protein

Gfp

Agrobacterium

Elliott et al. (1998)

Fosfinotricina acetil transferase

Bar

Agrobacterium

Elliott et al. (1998)

Promotor Ubi4 e Ubi9

Gfp

Biobalística

Wei et al. (2003)

Promotor de superexpressão RUBQ2

Gus

Agrobacterium

Biobalística

Liu et al. (2003)

Resistência a herbicidas

Bialafos

Bar

Biobalística

Gallo-Meagher e Irvine (1996)

Fosfinotricina

Bar

Agrobacterium

Enriquez-Obregon et al. (1998)

Glifosato de amônio

Pat

Biobalística

Leibbrandt e Snyman (2003)

Fosfinotricina

nptII

Agrobacterium

Manickavasagam (2004)

Resistência a doenças

SCMV

SCMV-CP

Biobalística

Joyce et al. (1998a, b)

SrMV

SrMV-CP

Biobalística

Ingelbrecht et al. (1999)

SCYLV

SCYLV-CP

Biobalística

Rangel et al. (2003)

Vírus Fiji

FDVS9 ORF1

Biobalística

McQualter et al. (2004a)

Escaldadura das folhas

albD

Biobalística

Zhang et al. (1999)

Puccinia melanocephala

Glucanase, quitinase e ap24

Agrobacterium

Enriquez et al. (2000)

Resistência a insetos

Broca-da-cana

cry1A

Eletroporação

Arencibia et al. (1999)

Broca-do-arroz

gna

Biobalística

Legaspi e Mirkov (2000)

Broca-da-cana e broca-do-arroz

Gna

Biobalística

Setamou et al. (2002)

Scirpophaga excerptalis

Aprotinina

Biobalística

Christy et al. (2008)

Broca-da-cana

SKTI e SBBI

Biobalística

Falco e Silva Filho (2003)

Alteração de vias metabólicas

Acúmulo de sacarose

Invertase ácida antisense solúvel

Invertase ácida solúvel

Biobalística

Ma et al. (2000))

Botha et al. (2001)

Frutooligossacarídeo

lsdA

Agrobacterium

Enriquez et al. (2000)

Polifenol oxidase

Ppo

Biobalística

Vickers et al. (2005) Analysis and functional annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop sugarcane Genome Res. v. 13, p. 2725-2735, 2003.

Polihidroxidobutirato

phaA, phaB e phaC

Biobalística

Brumbley et al. (2003)

Ácido pHidroxibenzoico

hch1 e cpl

Biobalística

McQualter et al. (2004b)

Phytase

Appa

Agrobacterium

Santosa et al. (2004)

Déficit hídrico

P5CS

Biobalística

Molinari et al. (2007)

Déficit hídrico

Trehalose synthase (TSase)

Biobalística

Zhang et al. (2006)

Fonte: modificado de Lakshmanan et al. (2005).

10. Referências

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Capítulo 7
Análise do metagenoma do solo: acesso à diversidade genética de microrganismos e aplicações na Biotecnologia

Krystyna Gorlach-Lira

Teresa Cristina Soares de Lima Grisi

1. Introdução

Seleção de microrganismos por métodos tradicionais de isolamento e cultivo garantiu, até meados da década de 1990, a obtenção de novas substâncias que foram aplicadas nas mais diferentes áreas, como saúde, agricultura, indústria e meio ambiente (OLIVEIRA et al., 2006). Contudo, com o advento da biologia molecular, novas estratégias de bioprospecção de produtos bioativos estão sendo utilizadas, visto que mais de 99% dos microrganismos presentes em muitos ambientes naturais não são cultiváveis pelas técnicas de cultivo em laboratório (STREIT; SCHMITZ, 2004).

Nesse contexto, a metagenômica surge como uma nova metodologia de análise genômica de comunidades microbianas, que independe de cultivo e envolve extração direta de DNA de amostras ambientais, clonagem em vetor adequado, construção de bibliotecas genômicas do DNA ribossomal 16S, que poderão ser utilizadas para estudos filogenéticos e diversidade microbiana, além de bibliotecas genômicas funcionais para investigação de novos metabólicos, tais como antibióticos, enzimas, corantes, polissacarídeos, etc., que poderão ter as mais diversas aplicações biotecnológicas (HANDELSMAN, 2004; LEE, 2005; LORENZ; SCHLEPER, 2002; SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003).

2. Métodos de extração de DNA do solo

O solo é tido como um ecossistema complexo, sendo considerado o maior reservatório da diversidade genética microbiana. Essa complexidade é resultado da interação de múltiplos parâmetros, tais como pH, conteúdo de água, estrutura do solo, variações climáticas e atividade biótica (LAKAY et al., 2007), sendo os microrganismos distribuídos de forma heterogênea entre os agregados das partículas do solo (ROBE et al., 2003). Entretanto, mesmo com o crescente desenvolvimento das técnicas moleculares, tem sido um grande desafio o processo de extração e purificação de DNA de amostras ambientais, como o solo, para posterior investigação das comunidades microbianas ou aplicação em processos biotecnológicos (XAVIER et al., 2004).

A extração do DNA metagenômico ambiental pode ocorrer de maneira indireta, ou direta (HERRERA; COCKELL, 2007; ROH et al., 2006; XAVIER et al., 2004); porém, em amostras de solo, a eficiência desses métodos depende das suas características orgânicas e inorgânicas, que podem interferir na quantidade e no grau de pureza do DNA (AMORIM et al., 2008; ROBE et al., 2003; TSAI; OLSON, 1992; WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).

No solo existem inúmeras substâncias como compostos fenólicos, ácidos húmicos e metais pesados (WILSON, 1997), capazes de adsorver as moléculas de DNA, tornando-se um fator limitante, principalmente, quando se utilizam métodos de extração em que o DNA é liberado durante a etapa de lise celular ainda na presença do solo (SANTOS et al., 2002).

Solos ricos em matéria orgânica possuem uma grande quantidade de ácidos húmicos, resultado da ciclagem de nutrientes, e que aparecem como principais interferentes no processo de extração de DNA (SANTOS et al., 2002).

Os ácidos húmicos promovem a desnaturação do DNA, pela ligação de seus grupos fenólicos a amidas, ou por oxidação e formação de quinonas que podem se ligar covalentemente ao DNA (AMORIM et al., 2008; ROBE et al., 2003). Essas substâncias têm tamanho e cargas similares ao DNA, sendo coextraídas e visualizadas por apresentar uma coloração marrom, após o processo de extração (YEATES et al., 1998). Elas também possuem a capacidade de inibir processos moleculares como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA e digestão com enzimas de restrição (SANTOS et al., 2002).

A quantificação do DNA pode ser feita por espectrofotometria a 260 nm (DNA) e 280 nm (proteínas), em que a razão da absorbância nesses comprimentos de ondas entre 1,7 e 2,0 indica um alto grau de pureza do DNA (SAMBROOK et al., 1989). Porém a contaminação por ácidos húmicos, que interfere no processo de quantificação do DNA, pode ser estimada a um comprimento de onda de 230 nm, e a razão menor que 2,0, entre 260 nm e 230 nm, indica essa contaminação (YEATES et al., 1998).

No método indireto de extração do DNA, primeiramente as células microbianas são separadas das partículas do solo e depois lisadas para posterior purificação do DNA (TORSVIK, 1980). Esse procedimento requer mais tempo e esforço, além de ter, em geral, baixo rendimento de DNA (HERRERA; COCKELL, 2007).

O método da lise direta das células microbianas seguida da extração do DNA é uma abordagem relativamente mais fácil e que apresenta, na maioria das vezes, um melhor rendimento do DNA, sendo preferencialmente o mais utilizado (ROOSE-AMSALEG et al., 2001).

Vários tipos de extração têm sido pesquisados com o intuito de obter uma maior quantidade de DNA e um alto grau de pureza, mesmo de amostras de solo com conteúdos de substâncias interferentes (MILLER et al., 1999; ROBE et al., 2003; ROH et al., 2006; WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).

Lakay et al. (2007) citam alguns métodos de extração de DNA do solo, avaliados por vários autores: dissociação celular utilizando nitrogênio líquido (VOLOSSIOUK et al., 1995); ruptura por micro-ondas (ORSINI; ROMANO-SPICA, 2001); lise utilizando pérolas de vidro (BORNEMAN et al., 1996).

Para o processo de purificação após extração do DNA ambiental, Lakay et al. (2007) também citam o uso de brometo de cetil-trimetilamônio (Ctab), de gradientes de densidades com cloreto de césio, de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) e de várias resinas de gel de filtração.

Atualmente, kits de extração e purificação vêm sendo os mais requisitados, pois os mesmos apresentam um bom rendimento do extrato de DNA, bem como um elevado grau de pureza, além de ser um procedimento mais rápido (WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).

Entre os kits mais comumente utilizados temos: Fast DNA® SPIN® Kit for Soil (Q-BIOgene, EUA); Puregene DNA purification kit (Gentra, EUA); QIAamp DNA Stool Mini kit (Qiagen, EUA); SoilMasterTM DNA extraction kit (Epicentre, EUA); MoBio UltraCleanTM kit e MoBio PowerMaxTM soil DNA isolation kit (Bio 101, EUA), utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes (PEREIRA et al., 2007; PIRES; TEIXEIRA, 2004; WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).

Martin-Laurent et al. (2001) utilizaram dois tipos de kits comerciais de extração de DNA (UltraCleanSoilDNA – MoBio Lab., Icn., EUA e Fast DNA® Spin® – Bio 101, EUA), em comparação com método químico convencional associado à disruptura com pérolas de vidro, em três tipos de amostras de solo. Os dados obtidos mostraram um melhor rendimento do DNA quando eles utilizaram o kit Fast DNA Spin (0,76 – 1,01 µg de DNA/g de solo). Entretanto, quando o gene 16S rDNA foi amplificado, eles observaram um melhor rendimento do produto da PCR com o DNA extraído do kit Fast DNA Spin. Provavelmente isso ocorreu em razão de o kit ter extraído o DNA com melhor grau de pureza, o qual foi capaz de reter interferentes da Taq polimerase.

O método direto abaixo descrito foi proposto por Yeates et al. (1998), que utilizaram pérolas de vidro para auxiliar na desagregação dos microrganismos na amostra do solo e obtiveram melhor rendimento (de 1,5 mg a 2,35 mg de DNA por 100 g solo) do DNA entre os demais métodos avaliados, como: sonicação, lise química e isolamento das células bacterianas.

O método de Yeates et al. (1998) consiste das seguintes etapas: pesar 100 g de solo (peso seco) e adicionar 100 mL de tampão de extração (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; Edta 100 mM, pH 8,0; NaCl 1,5 M) contendo 100 g de pérolas de vidro (Bio-Spec Products, Bartesville,U.S.). Misturar a amostra em Bead-Beater (Bio-Spec Products) por 2 minutos. Acrescentar 10 mL de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 20% e misturar por mais 5 segundos. Incubar a amostra a 65 ºC por 1 hora, transferir o homogeneizado para tubos de centrífuga (250 mL) e centrifugar a 6.000 g por 10 minutos. Coletar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 100 mL de tampão de extração e novamente incubar e centrifugar, como descrito acima. Juntar os sobrenadantes e distribuir em tubos de centrífuga (50 mL) contendo a metade do volume com poliethileno glycol (30%)/cloreto de sódio (1,6 M), e incubar à temperatura ambiente por 2 horas. Centrifugar as amostras (10.000 g por 20 minutos) e parcialmente purificar o DNA ressuspendendo o pellet em 20 mL de TE (10 mM Tris- HCl, 1 mM sodium Edta, pH 8,0). Adicionar acetato de potássio (7,5 M) para uma concentração final de 0,5 M. Colocar as amostras em banho de gelo por 5 minutos e depois centrifugar (16.000 g, 30 minutos) a 4 ºC para precipitar as proteínas e polissacarídeos. Extrair a fase aquosa com fenol/clorofórmio (v/v) e clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e precipitar o DNA com 0,6 volume de isopropanol. Após 2 horas à temperatura ambiente, centrifugar 16.000 g por 30 minutos e ressuspender o DNA com 1 mL TE. O DNA extraído pode ser estocado a -20 °C.

3. Construção de biblioteca metagenômica

A construção de uma biblioteca metagenômica das amostras ambientais é conceitualmente simples, entretanto representa um grande desafio.

A diversidade genética do metagenoma do solo é de 5 mil a 5 milhões de vezes maior que o genoma de E.coli (DOOLITTLE, 1999; TORSVIK et al., 1998). Com base em vários estudos utilizando métodos não dependentes de cultivo, estima-se que um grama do solo pode conter mais que 10 bilhões de células microbianas, as quais representam milhares ou milhões de espécies genômicas distintas (TORSVIK; OVREAS, 2002).

Assumindo que um grama de um solo possui 4 mil espécies de bactérias, o metagenoma possuirá 10 mil Gb do DNA único (CURTIS et al., 2002), e para obter mais sequências do mesmo tipo, o tamanho da biblioteca metagenômica deve ser várias vezes maior que o metagenoma. As bibliotecas de tamanho mínimo provavelmente representam os genomas de espécies mais frequentes. Para que a biblioteca possa representar as espécies raras (0,1%) da comunidade, ela deve ser 100 a 1.000 vezes maior que o metagenoma (RIESENFELD et al., 2004b).

Outro aspecto importante é o tamanho e a organização dos genes envolvidos na síntese de metabólitos secundários. Nos procariontes, esses genes são usualmente organizados em agrupamentos clusters (MARTIN, 1992) possibilitando a clonagem de um grande inserto de DNA que abrange toda via biossintética em um vetor.

Dependendo do objetivo do estudo podem ser construídas bibliotecas de grandes fragmentos de DNA em fago lambda, cosmídeos, fosmídeos e Bacterial Artificial Chromosomes (BACs), ou de insertos pequenos (menos que 15 kb) em plasmídios (EYERS et al., 2004; SOSIO et al., 2000).

As bibliotecas de grandes insertos permitem identificação de complexas vias metabólicas codificadas por vários genes. Os fragmentos de DNA até 40 kb podem ser clonados em fosmídeos e cosmídeos, enquanto os fragmentos de DNA maiores são inseridos em BAC.

Fosmídeos são vetores que apresentam alta eficiência de clonagem, estabilidade em Escherichia coli e ótimo tamanho do fragmento de inserção (35 kb–45 kb). Várias bibliotecas foram construídas utilizando fosmídeos (LIM et al., 2005; QUAISER et al., 2003; TREUSCH et al., 2004) e cosmídeos (COURTOIS et al., 2003; ELEND et al., 2006; ENTCHEVA et al., 2001; VOGET et al., 2003).

O vetor BAC tem sido usado para clonagem de fragmentos de DNA maiores que 100 kb (HANDELSMAN et al., 1998; RONDON et al., 2000). BACs mantêm insertos até 360 kb em E. coli e apresentam pequeno número de cópias por célula. Esses vetores foram desenvolvidos para clonagem do DNA eucarionte e são amplamente utilizados para estudos genômicos das plantas, animais (HANDELSMAN et al., 1998; SHIZUYA; SIMON, 1992) e microrganismos (ELEND et al., 2006; FIERER et al., 2007; LAMMLE et al., 2007; LILES et al., 2003; LIM et al., 2005; RIESENFELD et al., 2004ab; RONDON et al., 2000).

As bibliotecas de pequenos fragmentos de DNA são construídas em plasmídios, tais como pGEM-T, o qual é usado para clonagem de segmentos de DNA de 1,5 kb de amostras ambientais em E. coli DH10B como hospedeiro (DUNBAR et al., 1999). Esse vetor têm sido utilizado na construção da biblioteca do gene de 16S rDNA dos microrganismos cultivados ou de DNA microbiano extraído do solo (RONDON et al., 2000). Lammle et al. (2007) construíram biblioteca metagenômica de amostra de compostagem utilizando o plasmídio pJOE930 e os fragmentos de DNA de 3 kb a 8 kb. Outros plasmídios têm sido utilizados para construção de bibliotecas metagenômicas do solo, tais como pJN105 e pCF430 (RIESENFELD et al., 2004b).

As bibliotecas de pequenos insertos de DNA são úteis para pesquisar novas funções metabólicas codificadas por um gene ou pequenos operons e para análise da biodiversidade, entretanto, não são adequadas para pesquisar as vias metabólicas que dependem de vários genes (TYSON et al., 2004).

Alta diversidade molecular de microrganismos do solo e de outros ambientes necessita de uma técnica de clonagem muito eficiente para que os clones da biblioteca representem todo metagenoma. A maioria das bibliotecas de grandes insertos possui até 10 mil clones, o número suficiente para caracterizar uma comunidade microbiana, em geral, entretanto insuficiente para representar todas as espécies da comunidade de um ambiente (RIESENFELD et al., 2004b).

Para melhorar a probabilidade de inclusão na biblioteca de genes mais raros, pode ser realizado o processo de enriquecimento específico do solo antes da construção de biblioteca (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003).

A bactéria hospedeira mais frequentemente utilizada para obtenção de biblioteca metagenômica é Escherichia coli (E. coli DH10B, E. coli EPI-100, E. coli DH5α). A diversidade dos genes de DNA de diversos procariontes que foram expressos em E. coli é surpreendente (BLACK et al., 1995; FERREYRA et al., 1993; RONDON et al., 1999, 2000), entretanto a expressão heteróloga persiste como um fator limitante para obtenção da informação máxima da análise funcional do metagenoma.

Futuramente, E. coli poderá ser modificada para expressar mais funções dos genes pela introdução de genes que codificam novos fatores sigma, raras moléculas de RNAt, ou funções que são necessárias para síntese de compostos precursores para biossíntese de antibióticos deficientes em E. coli (RIESENFELD et al., 2004a).

Outras bactérias hospedeiras, tais como Bacillus subtilis, Streptomyces spp., Pseudomonas spp. ou sistema de expressão eucarionte podem ser utilizados para melhorar a expressão dos genes de interesse (LORENZ; ECK, 2005). Como exemplos, Streptomyces lividans foi muito útil como bactéria hospedeira na descoberta de vários metabólitos novos (COURTOIS et al., 2003; WANG et al., 2000), como também Rhizobium leguminosarum nos estudos de expressão de vários genes (LI et al., 2005).

Para facilitar identificação dos genes dos diferentes grupos de microrganismos, podem ser construídas bibliotecas submetagenômicas como as de bactérias com alto teor de G+C (RAJENDHRAN; GUNASEKARAN, 2008).

Actinomicetos possuem muitos genes envolvidos na síntese de metabólitos secundários, como enzimas e antibióticos, os quais são de grande interesse biotecnológico. Em virtude da diferença no conteúdo G+C entre E. coli (baixo teor G+C) e actinomicetos (alto teor G+C), E. Coli não reconhece aproximadamente 80% dos promotores de actinomicetos (STROHL, 1992), como também não ocorre a expressão de maioria dos genes de actinomicetos nesse hospedeiro. Para construção de biblioteca metagenômica voltada para análise de actinomicetos, Sosio et al. (2000) desenvolveram um cromossoma artificial E. coli – Streptomyces (Esac).

Um dos parâmetros críticos na construção de banco dos genes em E. coli ou em outra bactéria hospedeira é o conteúdo de DNA eucariótico. Burgmann et al. (2001) quantificaram ácidos nucleicos de bactérias, arqueas e eucariontes em DNA metagenômico, por hibridização com três sondas de oligonucleotídeos específicos. Nas diversas amostras do DNA extraído diretamente do solo, 61% a 93% de DNA foram eucarióticos, originados provavelmente da lise parcial de organismos como fungos, algas e protozoários, ou em razão da lise do material vegetal. Nas amostras de DNA obtidas pelo método indireto, a maioria do DNA (> 92%) foi bacteriana em virtude da separação das células bacterianas dos organismos eucariontes por centrifugação diferencial (BURGMANN et al., 2001).

Para construir uma biblioteca metagenômica, o DNA de alto peso molecular é extraído do solo e purificado (Figura 1). O DNA pode ser submetido à digestão com enzimas de restrição, tais como EcoRI (LAMMLE et al., 2007), gelase (RONDON et al., 2000), HindIII (LILES et al., 2003; RONDON et al., 2000). Os fragmentos de restrição podem ser separados na base do seu tamanho por eletroforese em campo pulsante (RONDON et al., 2000), e os fragmentos de DNA do tamanho desejado são cortados do gel e clonados em um vetor (fosmídeo, cosmídeo, plasmídio, cromossomo artificial). Após a transformação realizada em E. coli, os transformantes são selecionados no ágar LB (Luria-Bertani), com antibiótico(s) específico(s). A presença dos plasmídios recombinantes e do polimorfismo dos insertos de DNA pode ser examinada por eletroforese de campo pulsante dos plasmídios purificados obtidos dos transformantes de E. coli e digeridos com enzima de restrição. Os clones podem ser estocados em microplacas (15% de glicerol, -70 °C) (DUNBAR et al., 1999). Biblioteca de clones pode ser analisada na base de sequências ou expressão funcional dos genes.

Figura 1. Construção e análise de uma biblioteca metagenômica do solo.

4. Análise da biblioteca

Bibliotecas metagenômicas constituem uma ferramenta muito promissória para identificar novos metabólitos (DANIEL, 2005). Triagem da biblioteca pode ser realizada com base na análise de sequências ou na de expressão funcional do DNA clonado (QUAISER et al., 2003; RONDON et al., 2000; WANG et al., 2000) (Figura 1).

Análise baseada em sequência pode revelar os genes que não são expressos em espécie hospedeira utilizada para construção de biblioteca (RIESENFELD et al., 2004b). Sequências fornecem valiosas informações, entretanto apenas os genes similares com os já conhecidos podem ser identificados pela limitação dos bancos de dados de sequências disponíveis. Por outro lado, triagem funcional tem potencial para identificação de genes novos, os quais não seriam reconhecidos por detecção de sequências.

A análise dos clones da biblioteca metagenômica por sequência pode ser realizada por meio dos iniciadores ou de sondas desenhadas com base nas sequências conservadas dos genes conhecidos. Esse método é eficiente no caso de genes que codificam enzimas com domínios altamente conservados (PIEL, 2002). Um dos genes mais estudados por esse método é o gene 16S rRNA utilizado para avaliar a diversidade filogenética de microrganismos.

Análise da biblioteca baseada na função dos genes objetiva identificar clones com novas classes de genes, que produzem um metabólito de interesse. Estima-se que para analisar todo o genoma microbiano do solo é preciso testar 1 milhão de clones (HANDELSMAN et al., 1998). A identificação de clones ativos que produzem uma enzima ou metabólito dentro de milhões de clones requer muito tempo e esforço e é realizada por testes que devem ser simples e rápidos.

O número de clones testados em trabalhos sobre detecção de enzimas e biocatalizadores varia muito. Por exemplo, dois clones com atividade de lipase e esterase e oito clones com atividade de amilase foram identificados entre 3.648 clones da biblioteca metagenômica do solo construída em BAC, com inserto de cerca 27 kb (RONDON et al., 2000).

Henne et al. (2000), analisando 286 mil clones (biblioteca metagenômica do solo construída em plasmídio com insertos de cerca de 6 kb), identificaram 3 clones com atividade de esterase e lipase. Henne et al. (1999) identificaram 11 clones que produziram chitinase entre 825 mil clones da biblioteca metagenômica de água marinha construída em fago lambda.

5. Amplificação dos genes 16S rDNA

Bibliotecas do gene de 16S rDNA constituem uma ferramenta útil para o estudo do conteúdo genômico da microbiota do solo. O gene 16S rRNA é mais utilizado para esclarecer afiliação taxonômica de vários táxons (BAKER et al., 1999) e para analisar diversidade molecular dos ambientes naturais (DUNBAR et al., 1999; HUANG et al., 2005).

Amplificação de 16S rDNA dos organismos não cultiváveis fornece inestimável contribuição para conhecer comunidades microbianas, especialmente dos ambientes extremos, cujas condições para o cultivo de microrganismos são difíceis de reproduzir em laboratório. Foram elaborados diversos iniciadores para amplificação e sequenciamento de 16S rDNA, alguns são descritos como específicos para certos táxons, outros foram desenhados para amplificar todos genes procarióticos de 16S rDNA, ditos iniciadores universais.

Os fragmentos de 16S rDNA amplificados são submetidos à eletroforese em gel de agarose, e as bandas que correspondem ao tamanho esperado são cortadas, purificadas e concentradas. Os fragmentos de DNA são clonados em plasmídios, como pGEM-T, e transformados em E. coli obtendo a biblioteca de 16S rDNA.

Entre os iniciadores frequentemente utilizados encontramos: 8F (forward) (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (MARTINEZ-MURCIA et al., 1995; REYSENBACH; PACE, 1995), 9F (forward) (5’-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’) (FARELLY et al., 1995; HANSEN et al., 1998), 1115R (reverse) (5’-AGGGTTGCGCTCGTTG-3’) (REYSENBACH; PACE, 1995), 1541R (reverse) (AAGGAGGTGATCCANCCRCA) (SUZUKI; GIOVANNI, 1996).

Fierer et al. (2007) construíram biblioteca de 16S rDNA de bactérias de diversos solos utilizando os primers Bac8f (5’- AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’) e Univ529r (5’-ACCGCGGCKGCTGGC-3’) para as bactérias (BAKER et al., 2003; REYSENBACH; PACE, 1995) e com os primers Arc21f (5’-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’) e Univ529r para as arqueas. Lim et al. (2005) amplificaram o gene 16S rDNA do DNA metagenômico do solo de floresta utilizando os primers 530F (5’–TGACTGACTGAGTGCCAGCMGCCGCGG-3’) e 1492R-1 (5’-TGACT GACTGAGGYTACCTTGTTACGMYTT-3’).

Baker et al. (2003) analisaram a especificidade dos primers utilizados para amplificar 16S rRNA nos estudos da diversidade de microrganismos nos ambientes e concluíram que nenhum dos primers usados atualmente é universal e que nenhum único par de primers pode ser recomendado para amplificar 16SrRNA de todos os procariotos. As descobertas recentes de novos táxons com sequências de 16S rDNA não complementares com os iniciadores universais sugerem que a maioria das bibliotecas atuais não representam verdadeira biodiversidade de procariontes.

A maioria dos primers específicos para arquea não é eficiente para amplificação de novos táxons desse domínio, como: Korarchaeotes e Nanoarchaeum (BAKER et al., 2003). O par de primers A2Fa (5’- TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3’)/ U1510R (5’- GGTTACCTTGTTACGA CTT-3’) é frequentemente utilizado para amplificar 16S rDNA de arqueas das amostras ambientais (HUGENHOLTZ et al., 1998; REYSENBACH; PACE, 1995). Baker et al. (2003) desenharam novos iniciadores A571F (5’-GCYTAAAGSRICCGTAGC-3’)/UA1204R (5’-TTM GGGGCATRCIKACCT-3’) e A751F (5’-CCGACGGTGAGRGRYGAA-3’)/UA1406R (5’- ACGGGCGGTGWGTRCAA- 3’), os quais mostraram-se eficientes para amplificar 16S rDNA dos diversas táxons de arqueas e de amostras de DNA de vários ambientes.

6. Ferramentas de Bioinformática utilizadas nos estudos de metagenoma

Novas abordagens envolvendo a biologia molecular e Bioinformática vêm permitindo a bioprospecção in silico a partir de informações genômicas geradas por sequenciamento e depositadas em bancos de dados (NCBI – National Center for Biotechnology Information1; EMBL – Nucleotide Sequence Database2; DDBJ – DNA Database of Japan3) (BENSON et al., 2000; TATENO et al., 2002), para análise de microrganismos sem a necessidade de isolamento e cultivo, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais, denominada metagenômica (OLIVEIRA et al., 2006).

A metagenômica surge, nesse contexto, como uma estratégia fundamental para acessar uma microbiota, até então não cultivável pelas técnicas tradicionais de cultivo, abrindo uma grande perspectiva de conhecimento de novos grupos microbianos e de novos produtos bioativos para utilização biotecnológica (HANDELSMAN, 2004; LORENZ; SCHLEPER, 2002; SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003).

O volume de informações geradas a partir dos dados metagenômicos é analisado pelas ferramentas da Bioinformática (GIBAS; JAMBECK, 2001), que incrementou o desenvolvimento e o emprego de bases de dados e programas de análise de sequências de DNA (genômica) e proteínas (proteômica), contribuindo para acelerar a análise funcional e comparativa dos genes ou operons clonados (OLIVEIRA et al., 2006).

A sequência genômica de interesse contida em cada clone pode ser definida como uma unidade taxonômica operacional (UTO) e pode ser analisada por programas específicos (GORDON et al., 1998).

As sequências obtidas dos clones da biblioteca 16S rDNA podem ser primeiramente analisadas utilizando o algoritmo Pherd (EWING et al., 1998), que verifica a probabilidade de erros base a base. Em geral, valor maior que 20 em mais de 200 bases é o mais aceito, que significa dizer que uma base tem a chance em 100 de estar errada. Outros programas como Check Chimera (LIM et al., 2005) ou Ballerophon program (HUBER et al., 2004) são utilizados para verificar a qualidade das sequências e na procura de artefatos quiméricos (PEREIRA et al., 2007).

O uso do programa VecScreen4 dentro do maior banco de dados dos Estados Unidos, GenBank (NCBI), serve para identificar a sequência do vetor que pode estar junto da sequência alvo, informando ao usuário se há ou não contaminação, onde e qual vetor foi identificado, devendo essa sequência ser retirada (BENSON et al., 2000).

No NCBI também podemos utilizar o programa ORF Finder (Open Reading Frame5), que busca os possíveis quadros abertos de leitura, pois um dos problemas enfrentados com as sequências geradas é a identificação de genes, isto é, saber onde os mesmos começam e/ou terminam, ou qual a matriz de leitura correta que irá gerar a proteína (CARRARO; KITAJIMA, 2002). Nesse caso, o ORF Finder procura pelo códon de iniciação ATG e os de terminações (TGA, TAA ou TAG) na sequência analisada, devendo-se colocar a sequência no formato Fasta no campo apropriado ou digitar o número de acesso no GenBank.

Outra ferramenta dentro do NCBI é a família de programas Blast (Basic Local Alignment Search Tool6), BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn, tBLASTx e BLAST 2 sequence (ALTSCHUL et al., 1990), que serve para alinhar e comparar sequências depositadas em bancos de dados.

Para ocorrer a comparação das sequências geradas, é necessário alinhá-las, isto é, duas sequências são combinadas aleatoriamente, e a qualidade da combinação é avaliada e pontuada e deve ocorrer até se obter o máximo de combinação e pontuação (GIBAS; JAMBECK, 2001). O tipo de alinhamento utilizado dependerá do objetivo da pesquisa; entre eles podemos citar: alinhamentos globais, localizados e múltiplos.

O software Clustal é indicado para alinhar sequências múltiplas, não apenas de nucleotídeos, mas também de aminoácidos. As principais versões são Clustal W e Clustal X (THOMPSON et al., 1997). Para utilizar os programas, basta colocar todas as sequências no formato Fasta, salvando-as em um arquivo com extensão txt.

Uma árvore filogenética é um gráfico bidimensional que representa as relações evolutivas entre os organismos, ou no caso de sequências, entre os genes específicos de diferentes organismos. Árvores filogenéticas podem ser construídas utilizando programas como Phylogeny Interference Package (Phylip), DNADist e Neighbor (GIBAS; JAMBECK, 2001).

Dados moleculares e suas respectivas análises são bastante úteis para inferir relações entre os organismos; porém, é necessário primeiramente saber o que se pretende obter com dados gerados e só então definir o tipo de programa a ser utilizado.

A Bioinformática deverá gerar novas possibilidades de análises de dados e diferentes modos de acesso a um número cada vez mais crescente de informações, que deverão contar com a união de profissionais das mais diversas áreas.

7. Aplicação metagenômica na Biotecnologia e agricultura

A metagenômica torna-se cada vez mais promissória frente à demanda crescente por novas enzimas, biocatalizatores, detergentes, fármacos e outras substâncias que podem ser usadas na indústria química, farmacêutica e de alimentos, como também na agricultura. Vários metabólitos com aplicação biotecnológica têm sido identificados utilizando análise de bibliotecas metagenômicas (LORENZ; ECK, 2005).

A triagem funcional de bibliotecas permitiu identificar muitas enzimas, tais como quitinases (COTTRELL et al., 1999); lipases e esterases (HENNE et al., 2000; LAMMLE et al., 2007; LEE., 2005; RHEE et al., 2005; RONDON et al., 2000; VOGET et al., 2003); amilases (GABOR et al., 2003; LAMMLE et al., 2007; RICHARDSON et al., 2002; RONDON et al., 2000; VOGET et al., 2003); protease (GUPTA et al., 2002); β-glucosidades e β-lactamases (GABOR et al., 2004; SONG et al., 2005); celulases (VOGET et al., 2003); nitrilases (ROBERTSON et al., 2004); e liases pécticas (SOLBAK et al., 2005; VOGET et al., 2003).

Em bibliotecas metagenômicas foram detectados os genes das vias biossintéticas de vitaminas, como os genes de 2,5-diketo-D-ácido glucônico redutase (biossíntese de vitamina C a partir de glicose) e operon da síntese de biotina (ENTCHEVA et al., 2001; Eschenfeld et al., 2001), como também os genes responsáveis pela produção de pigmentos indirubina e índigo azul (LIM et al., 2005).

Vários novos antibióticos e fármacos foram descobertos por bioprospecção em bibliotecas metagenômicas (BRADY; CLARDY, 2003, 2004; GILLESPIE et al., 2002; LIM et al., 2005).

As bibliotecas do solo são as mais promissoras na detecção de novos antibióticos produzidos por microrganismos não cultiváveis (GILLESPIE et al., 2002; RIESENFELD et al., 2004a; STEELE; STREIT, 2005), como também fornecem muitas informações sobre a diversidade de mecanismos naturais de resistência aos antibióticos (RIESENFELD et al., 2004a).

Análise funcional de bibliotecas construídas em E. coli e S. lividans baseada na detecção da via biossintética da policetídeo sintetase tipo I, envolvida na produção de antibióticos como eritromicina, rapamicina e epotilona, resultou na detecção de oito clones positivos (COURTOIS et al., 2003), com as novas sequências da policetídio sintetase.

As bibliotecas de microssimbiontes de besouros e esponjas possuíram 3 e 60 clones com novos tipos de policetídeo sintetase tipo I, respectivamente (PIEL et al., 2004).

O desenvolvimento de novos agroquímicos via metagenômica (CORRAN et al., 1998), bem como a possibilidade de identificação de microrganismos não cultiváveis importantes em fitopatologia, tais como agentes patogênicos e os organismos que atuam na supressividade de solos (WELLER et al., 2002), despertam muito interesse na área de agronomia.

A supressividade de solos pode estar relacionada com a produção de substâncias (antibióticos) por microrganismos do solo envolvidos no processo de antibiose (MAZZOLA, 2004). Análise funcional da biblioteca metagenômica do solo supressivo para Rhizoctonia solani (15 mil clones) não detectou nenhum clone com atividade antagonística contra R. solani; entretanto a análise de sequências revelou que alguns clones possuíram insertos (cerca de 40 kb) com um potencial para a produção de pollicetídeos (ELSAS et al., 2008). Uma das três sequências analisadas por Elsas et al. (2008) foi originada da espécie de Acidobacterium, enquanto outras não foram identificadas.

Os estudos metagenômicos podem também fornecer uma contribuição importante para o melhoramento genético de plantas. A maioria dos genes introduzidos em plantas origina-se de microrganismos; sendo assim, novos genes descobertos em estudos metagenômicos podem ser utilizados para desenvolvimento de plantas com novas características, como resistência a pragas (DUNWELL, 2005).

8. Referências

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BENSON, D. A.; KARSCH-MIZRACHI, I.; LIPMAN, D. J.; OSTELL, J.; RAPP, B. A.; WHEELER, D. L. GeneBank. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 28, p. 15-18, 2000.

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Parte 4
Microrganismos promotores do crescimento de plantas

Capítulo 1
Bactérias promotoras do crescimento de plantas: estratégia para uma agricultura sustentável

Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Júlia Kuklinsky Sobral
Tânia Lucia Montenegro Stamford
Janete Magali de Araújo

1. Introdução

1.1. Bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCPs)

A utilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCPs), para o aumento da produção agrícola, será provavelmente uma das táticas mais importantes para a atualidade no mundo. Isso se deve à demanda emergente para a diminuição da dependência de fertilizantes químicos e a necessidade de desenvolvimento da agricultura sustentável (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Bactérias em habitats naturais colonizam o interior e exterior de órgãos de plantas e podem ser benéficas, neutras ou prejudiciais ao seu crescimento (MARIANO et al., 2004). As BPCPs estimulam diretamente a fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), podem ser capazes de solubilizar nutrientes (RODRÍGUEZ; FRAGA, 1999), produzir hormônios de crescimento por meio da presença de 1-amino-ciclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase (DONATE-CORREA et al., 2004); ácido indol acético (AIA) (CATTELAN, 1999) e indiretamente por antagonismo a fungos patogênicos, produção de sideróforos, quitinase, β-1,3-glucanase, antibióticos, pigmentos fluorescentes, e cianetos (RENWICK et al., 1991).

Pesquisas vêm sendo desenvolvidas no intuito de se conhecer cada vez mais as potencialidades das BPCPs. Rodríguez-Díaz et al. (2004), em estudo realizado na Antártica, encontraram três novas espécies de Paenibacillus (P. cineris, P. cookii e P. wynnii), fixadores de nitrogênio atmosférico. Seldin (2008) relata que, dentre as 89 espécies e 2 subespécies de Paenibacillus descritas na literatura, 14 possuem estirpes com a capacidade de fixar o nitrogênio atmosférico; são elas: P. polymyxa, P. macerans, P. peoriae, P. graminis, P. odorifer, P. brasilensis, P. durus, P. borealis, P. wynnii, P. massiliensis, P. sabinae, P. zanthoxyli, P. donghaensis e P. forsythiae.

Pesquisas sobre aplicações práticas de BPCPs têm tido sucesso na medida em que já existem produtos comerciais à base dessas bactérias nos Estados Unidos, China, Austrália, País de Gales e Nova Zelândia (LUZ, 1996). Na China, BPCPs são chamadas Yield incresing bactéria (YIB), sendo aplicadas extensivamente no campo, chegando a induzir aumentos médios de cerca de 21% em produtividade.

O papel dos microrganismos endofíticos nas plantas tem sido muito discutido; e embora pouco entendido, uma associação simbiótica têm sido sugerida (CREWS et al., 2004). Algumas bactérias endofíticas antagonistas têm sido testadas para o controle biológico de fungos fitopatogênicos (CHEN et al., 1995).

A grande vantagem dessas bactérias com relação às epifíticas é o fato de colonizarem internamente as plantas, um habitat protegido onde exercem mecanismos diversos (PEIXOTO NETO et al., 2002). Mendes e Azevedo (2007) sugerem, dentro da definição de microrganismos endofíticos, a divisão de endofíticos em dois tipos: a) tipo I, os que não produzem estruturas externas à planta, e b) tipo II, os que produzem estruturas externas à planta.

Tem sido demonstrado que estirpes isoladas de uma espécie vegetal são mais aptas a se restabelecer nas raízes, quando inoculadas na mesma espécie vegetal, sendo denominadas estirpes homólogas (BALDANI; BALDANI, 2005). Além disso, admite-se ser o genótipo da planta fator-chave para obtenção dos benefícios causados por bactérias diazotróficas endofíticas (REIS et al., 2000). Lacava et al. (2008) relatam que os microrganismos endofíticos são uma nova fonte para busca de moléculas bioativas de interesse em diversas áreas, como as indústrias farmacêuticas e agrícolas.

1.2. Coinoculação: bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCPs) e rizóbios

Li e Alexander (1988) conseguiram incrementar a colonização e a nodulação de soja, por meio da coinoculação de Bradyrhizobium japonicum com bactérias do gênero Bacillus, produtoras de antibióticos. Outros relatos demonstram efeitos positivos na nodulação pela coinoculação de rizóbio com outras espécies de bactérias (FIGUEIREDO et al., 2007; SILVA et al., 2006, 2007). Essa contribuição foi relacionada com a produção de fito-hormônios, pectinase ou sinais moleculares em Bacillus cereus (HALVERSON; HANDELSMAN, 1991) e outras espécies de microrganismos (DAKORA, 2003).

Estudos de coinoculação com BPCP e rizóbios têm apresentado aumento na nodulação e fixação do N2 (ARAÚJO; HUNGRIA, 1999; FIGUEIREDO et al., 2008; LI; ALEXANDER, 1988; SILVA et al., 2006; VESSEY; BUSS, 2002). A coinoculação de Bradyrhizobium com estirpe de Bacillus resultou no aumento da nodulação da Vigna unguiculata (Figura 1). Trabalhos conduzidos por Sindhu et al. (2002) também encontraram aumento na nodulação e crescimento da Vigna radiata.

Figura 1. Raízes de caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp.) cv IPA 205 nodulada, inoculada com Bradyrhizobium sp. (BR 3267) (B) e coinoculada com Bradyrhizobium sp. + Bacillus subtilis 434(C1) (B+434). Experimento desenvolvido em casa de vegetação do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) em vasos de Leonard com areia + vermiculita na proporção 2:1.
Foto: Márcia do Vale Barreto Figueiredo

A variedade de microrganismos, incluindo espécies de Bacillus e Pseudomonas, é comumente encontrada na rizosfera de plantas leguminosas e não leguminosas (LI; ALEXANDER, 1988). Em virtude da rápida colonização desses microrganismos na rizosfera e estimulação no crescimento da planta, existe considerável interesse em pesquisar esses e/ou outros microrganismos existentes na rizosfera visando otimizar a produção da cultura de interesse. Aumento na nodulação e benefícios nas plantas são encontrados em diferentes culturas, tais como feijão (CAMACHO et al., 2001; FIGUEIREDO et al., 2007, 2008; SRINIVASAN et al., 1996); soja (LAMBRECHT et al., 2000; VESSEY; BUSS, 2002); caupi (SILVA et al., 2006, 2007); e ervilha (COOPER; LONG, 1994).

Araújo e Hungria (1999) demonstraram a viabilidade da coinoculação em semente de soja, de metabólitos brutos ou formulados ou, ainda, de células de Bacillus subtilis, para incrementar a contribuição do processo de FBN.

Silva et al. (2007) verificaram que houve estímulo na nodulação específica do caupi coinoculado com Bradyrhizobium sp. (BR2001), Paenibacillus polymyxa (Loutit L) e Bacillus sp. (LBF-410), evidenciado pela correlação positiva entre nitrogênio acumulado/ matéria seca da raiz (MSR) e nodulação específica. Efeitos indireto e direto na nodulação específica foram mostrados pela diminuição significativa do crescimento da raiz (40%) e pelo aumento não significativo do número de nódulos (46%) nas estirpes Loutit (L.) de P. polymyxa e na LBF-410 de P. macerans.

Em relação ao aumento nas concentrações de macro e microelementos, Silva et al. (2006), em estudos utilizando diferentes métodos de inoculação, verificaram que a coinoculação no caupi com estirpes de Bradyrhizobium sp. (BR 2001) e Paenibacillus polymyxa (Loutit L) introduzidas no solo proporciona aumentos nas concentrações de cálcio, ferro e fósforo na parte aérea das plantas.

1.3. Contribuição dos rizóbios como promotores de crescimento e mediadores de nutrientes

Segundo Dakora (2003), as maiores contribuições feitas separadamente por leguminosas e seus microssimbiontes que não estão relacionadas com a fixação de N2 nos nódulos da raiz têm sido ignoradas. O rizóbio produz moléculas químicas que podem influenciar o desenvolvimento das plantas, incluindo fito-hormônios, fator Nod, lumicroma, riboflavina e evolução do H2 por nitrogenase (Tabela 1). Quando presente no solo, o fator Nod pode estimular as leguminosas e não leguminosas por diferentes formas.

Os sinais moleculares excretados pelas raízes da planta hospedeira ativam a expressão dos genes de nodulação, pelo rizóbio, resultando na produção de fatores Nod (SUGAWARA et al., 2006). Além disso, têm sido verificados sinais hormonais da planta (sinais endógenos) que também são importantes para o estabelecimento da simbiose (HIRSCH et al., 1997). Os fatores Nod são responsáveis, em baixa concentração, pela síntese de proteínas denominadas nodulinas, que desempenham papel importante na formação e manutenção do nódulo radicular (ALMARAZ et al., 2007). O rizóbio é conhecido por formar nódulos em leguminosas pela simbiose (micro e macrossimbionte), além de suprimir a população de patógenos no solo.

Tabela 1. Moléculas de rizóbios com potencial para promoção de crescimento em sistema de cultivo.

Composto rizobiano

Papel funcional

Referência

Fator Nod (Nod factor)

Estimula a germinação das sementes

Promove o desenvolvimento das plântulas

Aumenta a taxa de fotossíntese foliar

Induz a expressão dos genes

flavonoides

Estimula a colonização da raiz por fungo micorrízico arbuscular

Causa divisão das células e embriogênese

Zhang e Smith (2001)

Smith et al. (2002)

Smith et al. (2002)

Spaink e Lugtenberg (1991)

Xie et al. (1995)

Spaink (1996)

Lumicroma

(Lumichrome)

Estimula o desenvolvimento das plântulas

Estimula a produção de CO2 nas raízes

Phillips et al. (1999)

Riboflavina (Riboflavin)

Serve de vitaminas para plantas e bactéria

West e Wilson (1938)

Evolução do H2 por nitrogenase

Promove populações microbianas no solo

Estimula a diversidade de fauna no solo

Aumenta o C no solo

Dong e Layzell (2001)

Fonte: adaptado por Dakora (2003).

2. Identificação e caracterização de bactérias endofíticas promotoras do crescimento de plantas

2.1. Identificação de BPCPs

Os microrganismos apresentam imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos (MYERS, 1996). Apesar de sua grande importância, o número de grupos microbianos conhecidos e descritos (diversidade de espécies) representa apenas pequena fração da diversidade microbiana encontrada na natureza (AZEVEDO, 1998; PACE, 1997). Dados derivados de estudos comparativos apontam para o fato de que apenas uma pequena fração dos microrganismos na natureza (entre < 0,1% e 1%, dependendo do habitat) é cultivada por meio do emprego de métodos microbiológicos convencionais (AMANN et al., 1995). Um grande número de fatores pode ser apontado para a dificuldade no cultivo de microrganismos em condições de laboratório, incluindo o pouco conhecimento sobre seus requisitos nutricionais e a biologia de organismos presentes em diferentes amostras ambientais.

Nesse contexto, o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico no qual muitos fatores, tais como mudanças sazonais, tecidos vegetais (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; MOCALI et al., 2003), cultivares e espécies de plantas, tipos de solo (DALMASTRI et al., 1999; FROMIN et al., 2001; KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2005; TORRES et al., 2008) e interação com outros microrganismos benéficos ou patogênicos (ARAÚJO et al., 2001, 2002a), podem afetar a estrutura e composição de espécies das comunidades bacterianas que colonizam os tecidos das plantas, como as BPCPs.

A preservação da diversidade microbiana concentra-se, atualmente, em instituições que mantêm coleções de culturas disponíveis à comunidade científica, como American Type Culture Collection (ATTC) nos Estados Unidos da América, Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) na Bélgica, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) na Alemanha, Embrapa Agrobiology Diazothrophic Microbial Culture Collection (Embrapa) no Brasil e Japan Collection of Microorganisms (JCM) no Japão1. Esses institutos também são os principais responsáveis pela identificação e classificação bacteriana, incluindo os isolados obtidos do ambiente em grupos já definidos ou em novos taxa.

A identificação/classificação clássica de bactérias é baseada principalmente nas características morfológicas e bioquímicas de cada espécie. Dessa forma, a identificação bacteriana, geralmente, tem início com a separação dos grupos em Gram positivo ou Gram negativo. Para tanto, realiza-se a coloração de Gram. Após isso, as bactérias Gram negativas devem ser submetidas ao teste de O/F (oxidação fermentação de glicose). Nesse ponto, bactérias fermentadoras devem ser submetidas a testes específicos de fermentação de açucares enquanto que as não fermentadoras devem ser submetidas a outros testes bioquímicos (ARAÚJO et al., 2002b; HOLT et al., 1994). A morfologia e o arranjo celular também devem ser considerados.

A evolução das metodologias de biologia molecular aplicadas ao estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana. Resultados de estudos independentes de isolamento e cultivo, baseados em amplificação e sequenciamento de fragmentos dos genes de rRNA 16S (rDNA 16S), demonstraram que a diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta (HEAD et al., 1998; HUNTER-CEVERA, 1998). A aplicação dessas metodologias na identificação de bactérias tem permitido a descoberta de um número extenso de novas linhas evolutivas nesse grupo. Métodos independentes de cultivo tendem a complementar os métodos baseados em isolamento e cultivo para a realização de levantamentos e comparações da composição, diversidade e estrutura de comunidades microbianas (ANDREOTE et al., 2009; HUGENHOLTZ; PACE, 1996; HUGENHOLTZ et al., 1998; RANJARD et al., 2000).

Nesse contexto, a aplicação de técnicas baseadas em ácidos nucleicos tem auxiliado muitos estudos de diversidade microbiana (COSKUNER, 2002; ELSAS et al., 1998; MUYZER; SMALLA, 1998; RANJARD et al., 2000). Existe um grande número de técnicas que revelam polimorfismo de DNA, sendo importante considerar o tipo de organismo em estudo.

2.2. Caracterização morfológica e bioquímica de BPCPs

A caracterização morfológica de BPCPs tem início com a observação do comportamento das colônias em meio de cultura sólido. Para tanto, diferentes aspectos são observados, como, cor da colônia, tempo de crescimento (rápido, médio ou lento), aspecto (liso, rugoso, cremoso, seco, brilhante), borda (regular ou irregular), produção de pigmento, dentre outros. Entretanto, é importante ressaltar que o comportamento morfológico de uma determinada espécie bacteriana é variável de acordo com as condições ambientais (temperatura, tensão de oxigênio, etc.) e nutricionais (concentração de sais, fonte de carbono, etc.) às quais é submetida.

Ainda considerando a caracterização morfológica das BPCPs, a microscopia é uma ferramenta muito importante. Além da microscopia ótica, largamente utilizada para classificação das bactérias em Gram positiva ou Gram negativa, como citado anteriormente, e para outros testes, a microscopia eletrônica de varredura e de transmissão tem permitido grandes avanços no estudo da interação bactéria-planta.

O equipamento utilizado permite localizar e caracterizar o microrganismo dentro do organismo superior ou aderido externamente. O modo de penetração ou adesão, a colonização do hospedeiro e as alterações mutuamente induzidas são outros aspectos caracterizados (JAMES; OLIVARES, 1997; NOGUEIRA; BARROSO, 1998).

Nos estudos de bactérias endofíticas, a microscopia eletrônica é um poderoso instrumento para reconhecer e localizar as bactérias em tecidos vegetais. A microscopia eletrônica de varredura convencional (MEV) tem sido satisfatoriamente usada para detectar bactérias endofíticas em várias plantas, como milho, trigo, arroz e cana-de-açúcar (JAMES; OLIVARES, 1997; QUADT-HALLMANN et al., 1997; REINHOLD-HUREK; HUREK, 1998).

2.2.1. Inoculação de BPCPs em plantas hospedeiras

As sementes da planta hospedeira devem ser lavadas em álcool (70%) por 1 minuto, desinfectadas em solução de hipoclorito de sódio (2% de Cl- disponível) suplementado com Tween 20 (1 mL/L) por 10 minutos (otimizar tempo para diferentes vegetais), enxaguadas novamente em álcool (70%) e, posteriormente, lavadas três vezes em água destilada e esterilizada para a retirada do excesso de bactérias e para que permaneçam apenas as que estiverem agregadas às sementes. A água da última lavagem deve ser distribuída em meio de cultura rico em nutrientes, como controle do processo de esterilização.

Após a desinfecção superficial, as sementes devem ser incubadas em câmara úmida por 24 horas e posteriormente colocadas numa suspensão bacteriana (106 UFC/mL–107 UFC/mL) em tampão fosfato e agitadas a 150 rpm por 18 horas. Depois as sementes devem ser enxaguadas com tampão fosfato salino (Phosphate Buffered Saline – PBS: 1,44 g/L Na2HPO4; 0,24 g/L KH2 PO4; 0,20 g/L KCl; 8,00 g/L NaCl; pH 7,4) e reincubadas em câmara úmida por 24 horas para germinarem. Transcorrido o período, as sementes devem ser transferidas para tubos contendo meio MS (MURASHIGUE; SKOOG, 1962), e, após 15 dias, as amostras devem ser preparadas para a microscopia eletrônica.

O mesmo procedimento deve ser realizado para o material a ser analisado como controle, excetuando-se a etapa de inoculação de bactérias.

Composição do MS (MURASHIGUE; SKOOG, 1962) por litro: NH4NO3 1.650 mg; KNO3 1.900 mg; CaCl2.2H2O 440 mg; KH2PO4 170 mg; MgSO4.7H2O 370 mg; MnSO4.7H2O 22,3 mg; H3BO3 6,2 mg; CuSO4.5H2O 0,025 mg; CoCl2P.6H2O 0,025 mg; NaMoO4.2H2O 0,25 mg; Kl 0,83 mg; ZnSO4.7H2O 8,6 mg; Tiamina-HCl 0,1 mg; Ácido Nicotínico 0,5 mg; Piridoxina-HCl 0,5 mg; Glicina 2,0 mg; Inositol 100,0 mg; Ágar 1,8 g. pH 7,0–7,2.

2.2.2. Preparo das amostras para microscopia eletrônica por varredura (MEV)

Pequenos fragmentos (em torno de 2 cm x 2 cm) de diferentes tecidos vegetais devem ser seccionados, com o auxílio de estilete estéril. Esses devem ser fixados em solução de Karnovksy (glutaraldeído 2,5%; formaldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,05 M; pH 7,2; CaCl2 0,001 M) por 1 hora. Em seguida, realiza-se a lavagem em tampão cacodilato 0,05 M por 3 vezes durante 10 minutos cada. A pós-fixação deve ser feita com OsO4 1% (em tampão cacodilato 0,05 M; pH 7,2) por 1 hora. Depois as amostras devem ser lavadas em água destilada por 5 vezes, e, então, realiza-se a desidratação numa série crescente (30%, 50%, 70%, 90% e 100%) de acetona, 10 minutos em cada etapa, sendo que a de 100% deve ser realizada três vezes. Depois as amostras devem ser secas ao ponto crítico e metalizadas com ouro. Depois de metalizadas, as amostras devem ser montadas em suportes especiais (stubs) e observadas em microscópio eletrônico de varredura (KITAJIMA; LEITE, 1999).

2.2.3. Testes para caracterização bioquímica

Em relação à caracterização bioquímica, existem vários testes a serem utilizados, como o EPM (ácido e gás de glicose, urease, H2S, L-triptofano desaminase), Mili (motilidade, indol – lisina), utilização de citrato, utilização de diferentes fontes de carbono, hidrólise do amido, oxidase, produção de indol, redução de nitrato a nitrito (ARAÚJO et al., 2002b). Atualmente, existem diversos kits comerciais para identificação bacteriana com bases em características bioquímicas, tornando-se uma análise rápida e barata. Contudo, esses kits geralmente são específicos para alguns grupos bacterianos. Dentre os mais utilizados estão: sistemas API (Appareils et Procédés d’Identification, bio Mérieux); Biolog Nutritional System (testa a habilidade de uma bactéria em oxidar 95 diferentes fontes de carbono pré-selecionadas); Enterotubos e Micro ID System (identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae).

2.3. Caracterização fisiológica de BPCPs

A caracterização fisiológica de BPCPs testa a capacidade do isolado bacteriano em relação a características envolvidas com a promoção de crescimento de plantas, como fixação de nitrogênio, produção de fito-hormônios e disponibilização de nutrientes.

2.3.1. Seleção de bactérias com capacidade de fixar N2

A metodologia inicial, e mais comumente empregada, para a seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio atmosférico é pelo cultivo em meio livre de fonte de nitrogênio. Existem meios apropriados para diferentes grupos bacterianos, mas o mais comum é o meio de cultura NFb [5 g/L de ácido málico; 0,5 g/L de K2HPO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O; 0,1 g/L de NaCl; 0,01 g/L de CaCl2.2H2O; 4 mL/L de Fe.Edta (solução 1,64%); 2 mL/L de azul de bromotimol (0,5%); 2 mL/L de solução de micronutrientes (0,2 g/L de Na2MoO4.2H2O; 0,235 g/L de MnSO4.H2O; 0,28 g/L de H3BO3; 0,008 g/L de CuSO4.5H2O); 1,75 g/L de ágar; pH 6,8]. Nesse caso, após o período de incubação, o resultado positivo é caracterizado pela presença de um halo de crescimento no interior do meio de cultura (DÖBEREINER et al., 1995).

2.3.2. Seleção de bactérias produtoras de fito-hormônios do tipo auxina

A detecção de auxinas pode ser realizada por um método mais preciso e quantitativo, como a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) ou por uma reação colorimétrica específica e sensível na qual utiliza-se o reagente de Salkowski, porém menos precisa quantitativamente (CROZIER et al., 1988; EHMANN, 1977). Existem diferentes metodologias que utilizam o reagente de Salkowski, algumas utilizam microplacas, outras, membranas de nitrocelulose (BRIC et al., 1991; SARWAR; KREMER, 1995).

Resumidamente, inocula-se o isolado bacteriano em meio de cultura acrescido de 5 mM de L-triptofano, incuba-se sob agitação e na ausência de luz por tempo e temperatura adequados a cada espécie avaliada, e, após o cultivo, acrescenta-se o reagente de Salkowski (2% de FeCl3 0,5 M em 35% de ácido perclórico). A reação será positiva quando o resultado expressar a coloração rosa, indicando a produção de auxina. Mais informações sobre auxinas estão descritas no capítulo 2 da parte 4.

2.3.3. Seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico

As bactérias solubilizadoras de fosfato dissolvem o fosfato insolúvel pela produção de ácidos orgânicos e inorgânicos e/ou pela diminuição do pH; consequentemente, ocorre a produção de fosfato disponível que pode ser capturado pelas plantas (NAUTIYAL, 1999; VASSILEV; VASSILEVA, 2003; VAZQUEZ et al., 2000).

Para a bioprospecção dessas bactérias, utiliza-se meio de cultura sólido contendo fosfato insolúvel (10 g/L de glicose; 5 g/L de NH4Cl; 1 g/L de NaCl; 1 g/L de MgSO4.7H2O; 0,8 g/L de Ca3HPO4; 15 g/L de ágar; pH 7,2), tendo como resultado positivo a formação de um halo claro em torno da colônia, indicando, assim, a solubilização do fosfato.

3. Streptomyces promotores de crescimento em plantas

As plantas compreendem um microecossistema complexo, composto por diferentes habitats que podem ser colonizados simultaneamente por uma grande diversidade de microrganismos endofiticos e epifíticos (CHELIUS; TRIPLETT, 2001; LODEWYCKX et al., 2002). Essa população microbiana é essencial para o desenvolvimento das plantas uma vez que facilita a absorção de nutrientes ao mesmo tempo em que protege a planta contra fitopatógenos.

Dentro dessa diversidade microbiana, merecem destaque as actinobactérias, particularmente espécies de Streptomyces como os endófitos e os da rizosfera que influenciam o crescimento da planta, além de funcionar como agentes biocontroladores protegendo a planta por diversos mecanismos (BLOEMBERG; LUGTENBERG, 2001; LODEWYCKX et al., 2002).

Na rizosfera, os mecanismos desses agentes biocontroladores são antibiose, que envolve a produção de metabólitos secundários impedindo que o patógeno colonize a rizosfera e estabeleça doenças, e micoparasitismo, que ocorre pela destruição física da parede celular do fungo por meio da ação de enzimas hidrolíticas, produzidas pelo agente biocontrolador (ADAMS, 1990; DOUMBOU et al., 2001).

A colonização da rizosfera é determinada por uma série de fatores que varia de acordo com a planta, microrganismos e meio ambiente (RAMAMOORTHY et al., 2001). As actinobactérias endofíticas colonizam o tecido da planta obtendo nutrição e proteção da planta hospedeira sem causar sintomas de doença, ao mesmo tempo em que produzem uma grande variedade de metabólitos que estimulam o crescimento da planta. Essa associação é complexa e provavelmente ocorre variação de hospedeiro para hospedeiro e de microrganismo para microrganismo (HASEGAWA et al., 2006; OWEN; HUNDLEY, 2005). Todas as plantas examinadas mostram a ocorrência de actinobactérias endofíticas principalmente na raiz, indicando que essa associação é comum na natureza (HASEGAWA et al., 2006).

3.1. Atividade antagônica

O estímulo do crescimento da planta por actinobactéria endofítica pode ser influenciado pela produção de fito-hormônio ou pelo biocontrole de fitopatógenos por meio da produção de antibióticos, sideróforos, pela competição por nutrientes e indução de resistência a doenças (IGARASHI et al., 2002a, 2002b).

Tem sido documentado que algumas actinobactérias endofiticas apresentam atividade antagonista para alguns patógenos como Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia solani, entre outros. Cao et al. (2004) isolaram Streptomyces endofíticos de raízes de tomate (Licopersicum esculentum) e observaram que 65% dos isolados inibiram o crescimento de Rhizoctonia solani, e entre esses isolados a linhagem de Streptomyces sp. S30 que apresentou atividade in vitro e in vivo para esse fitopatógeno, indicando o seu potencial como agente de biocontrole. Taechowisan et al. (2003) também isolaram 330 actinobactérias endofíticas de 36 espécies de plantas herbáceas e lenhosas da Tailândia, das quais 10% apresentaram atividade para Colletotrichum musae e Fusarium oxysporum.

Pesquisas sobre a produção de fito-hormônio por Streptomyces endofíticos também têm sido realizadas mostrando o benefício dessa comunidade microbiana para o crescimento da planta. Ácido piterídico, substância similar à auxina, foi extraído de S. higroscópicos TP-A045, endófito da planta Pteridium aquilinens, e mostrou que, na concentração de 1 µM, esse composto acelerou a formação e o crescimento das raízes em cultura de tecido de feijão tão efetivamente quanto o ácido indol acético (IGARASHI et al., 2002b). Igualmente Meguro et al. (2006) também relataram que o endófito Streptomyces sp. MBR-52 acelerou a emergência e o alongamento de raízes em cultura de tecido da planta ornamental Rhododendron indicando que essa linhagem produz algum tipo de fito-hormônio.

3.2. Isolamento de actinobactérias endofíticas

Microrganismos endofíticos podem ser observados por microscopia ótica ou eletrônica, mas sua identificação in vivo é difícil. Entretanto muitas pesquisas são realizadas, e diferentes tecidos vegetais passam por processos de desinfecção para eliminação dos epifíticos, e os endofíticos são isolados em diferentes meios de cultura e condições controladas, possibilitando a avaliação do seu potencial biológico in vitro (ARAÚJO et al., 2002b; OWEN; HUNDLEY, 2005).

A técnica de isolamento de actinobactérias endofíticas descrita abaixo está de acordo com Araújo et al. (2002b).

a) Coletar as amostras de folhas, ramos ou raízes, tendo o cuidado de verificar que folhas e ramos não entrem em contato com o solo. Acondicionar cada amostra em sacos plásticos individuais, identificados, e transportar para o laboratório em baixa temperatura (isopor com gelo). O material pode ser armazenado em câmara fria (4 °C) durante 72 horas.

b) No laboratório o material será separado e lavado com água corrente para eliminar resíduos de poeira. Em seguida raízes e caule são cortados em fragmentos de 10 cm para proceder a desinfecção.

c) Em câmara de fluxo laminar, desinfetar cada amostra com álcool a 70% por 1 minuto, e em seguida transferir para solução de hipoclorito de sódio (2,6%) durante 5 minutos, e novamente tratar com álcool a 70% por 30 segundos. A seguir, lavar a amostra com água destilada esterilizada por duas vezes e avaliar a eficiência da desinfecção, plaqueando alíquotas da última água de lavagem nos meios sólidos utilizados para o isolamento dos endofíticos. Esse plaqueamento tem como finalidade comprovar se todos os epifíticos foram eliminados após a desinfecção.

d) Utilizando um estilete esterilizado cortar de 1,0 mm a 2,0 mm das bordas das folhas e as extremidades das raízes, e em seguida colocar de 8 a 10 fragmentos com 0,5 cm2 das folhas e de 8 a 10 fragmentos de 5,0 mm das raízes na superfície de cada placa de Petri (ARAÚJO et al., 2001; PEREIRA et al., 1993) contendo os meios Arginina Glicerol Ágar (EL-NAKEEB; LECHEVALIER, 1963) e Caseína Amido Ágar (KUSTER; WILLIAMS, 1964) com ciclohexamida e nistatina na concentração de 100 µg/mL.

e) Cultivar as placas, durante 30 dias, a 28 °C–30 °C, para observar crescimento de colônias de Streptomyces que emergem dos fragmentos e apresentam crescimento muito lento.

f) Após o isolamento, calcular a frequência de isolamento-FI, dividindo o número de fragmentos que apresentou crescimento de colônias de Streptomyces pelo número total de fragmentos analisados e em seguida multiplicar por 100.

3.3. Isolamento de actinobactérias do solo

As actinobactérias, e em especial o gênero Streptomyces, ocorrem em diversos habitats, entretanto o solo é o maior reservatório dessas bactérias filamentosas, saprofíticas, que no solo, decompõem a matéria orgânica, especialmente polímeros como amido, lignocelulose e quitina que favorecem o desenvolvimento da população microbiana (SRINIVASAN et al., 1991; ZIMMERMAN, 1990).

Em áreas cultivadas, o número de Streptomyces pode conter aproximadamente 107 unidade formadora de colônia (UFC) por grama de solo, enquanto Micromonospora varia de 104 UFC/g a 105 UFC/g; entretanto, em menor freqüência, outros gêneros de actinobactérias podem ocorrer (HUNTER et al., 1981; KIESER et al., 2000). A quantidade e o tipo das bactérias filamentosas Gram positivas são influenciados por vários fatores, como: temperatura, pH e outros atributos do solo, bem como o conteúdo da matéria orgânica, umidade e aeração (DAVIES; WILLIAMS, 1970; LABEDA; SHEARER, 1990). Várias pesquisas mostram que as actinobactérias são qualitativa e quantitativamente importantes na rizosfera, podendo influenciar o crescimento das plantas, além de proteger contra a invasão por fungos patogênicos radiculares (AGHIGHI et al., 2004; GETHA; VIKINESWARY, 2002).

3.3.1. Pré-tratamento

Em geral as bactérias filamentosas apresentam um crescimento muito lento durante o seu isolamento em meio de cultura sólido. Por isso se faz necessário eliminar microrganismos indesejáveis como as bactérias que são numericamente 10 vezes maiores que Streptomyces, e o pré-tratamento da amostra por aquecimento a 45 °C, por 2 horas, ou 50 °C, por 10 minutos, elimina principalmente bactérias Gram negativas que crescem rapidamente (LABEDA; SHEARER, 1990). Outro pré-tratamento é a ativação dos esporos de actinobactérias que é importante no isolamento de bactérias filamentosas Gram positivas. Nessa técnica a suspensão do solo é tratada com uma solução de extrato de levedura (6,0%) mais dodecilsulfato de sódio – (SDS) (0,05%), a 40 °C por 20 minutos, seguida da diluição seriada em água destilada esterilizada e plaqueamento em meio sólido seletivo (NONOMURA; HAYAKAWA, 1992). Existem vários pré-tratamentos que podem ser realizados visando a um gênero específico como relatado por Araújo (1998).

Para a determinação da diversidade de microrganismo cultivável no solo, a técnica do isolamento e quantificação em placa ainda é a mais indicada. Alguns métodos podem medir a função microbiana por meio da determinação da velocidade do processo metabólico, mas não é possível identificar a espécie microbiana (NANNIPIERI et al., 2003).

3.3.2. Isolamento pela técnica de diluição

Pesar assepticamente amostra do solo (10 g) e adicionar 90 mL de tampão fosfato (PBS) ou soro fisiológico esterilizado, colocar em agitação (150 rpm/10 minutos) e realizar diluição seriada. Das diluições 103 a 106 retirar 0,1 mL e colocar na superfície de cada placa contendo 20 mL do meio Caseína Amido Ágar-CAA (KUSTER; WILLIAMS, 1964) e/ou Ácido Húmico Ágar (NONOMURA; HAYAKAWA, 1992), e em seguida espalhar com alça de Drigalski. As placas devem ser cultivadas em estufa BOD à temperatura de 28 °C a 30 °C, durante 15 a 20 dias.

Composição do meio Caseína Amido Ágar-CAA (KUSTER; WILLIAMS, 1964): Amido solúvel 10,0 g; KNO3 2,0 g; Caseína 0,3 g; K2HPO4 2,0 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; NaCl 2,0 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; CaCO3 0,02 g; Ágar 20,0 g. pH 7,0–7,2.

Composição do meio Ácido Húmico Ágar (NONOMURA; HAYAKAWA, 1992): Ácido Húmico 1 g dissolvido em NaOH 0,2 M; Na2HPO4 0,5 g; KCl 1,7 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; CaCO3 0,01 g; vitamina B 10 mg; Ágar 18 g. pH 7,2.

Composição do meio Arginina-Glicerol Ágar (EL-NAKEEB; LECHEVALIER, 1963): Arginina-HCl 1,0 g; Glicerol 12,5 g; K2HPO4 1,0 g; NaCl 1,0 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; Fe2(SO4)3.6H2O 0,01 g; CuSO4.5H2O 0,1 mg; MnSO4.H2O 1,0 mg; ZnSO4.7H2O 1,0 mg; Ágar 15,0 g. pH 6,9–7,1.

4. Atividade antimicrobiana

Para avaliação da atividade antifúngica e antibacteriana de Streptomyces, a metodologia mais simples é a seleção primária por meio do ensaio com blocos de gelose e segundo metodologia de Ichikawa et al. (1971).

a) A partir de culturas de Streptomyces isoladas e cultivadas em tubos inclinados preparar suspensão de esporos em 2,0 mL de soro fisiológico esterilizado, contendo 0,1% de Tween 80, agitar o tubo em vortex e adicionar 0,1 mL dessa suspensão a cada placa de Petri contendo 15 mL dos meios Caseína Amido Ágar (CAA) e ISP2 (SHIRLING; GOTTLIEB, 1966). Em seguida, espalhar a suspensão com alça Drigalski sobre toda a superfície das placas, que devem ser cultivadas em BOD a 28 °C–30 °C durante 7 dias para observar o crescimento em forma de tapete.

b) Para o ensaio antifúngico usar culturas de Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani ou outros fungos que se deseja testar. Preparar a suspensão de esporos e inocular como no item anterior usando placas com 15 mL de meio Sabouraud Ágar ou Batata Dextrose Ágar.

c) No ensaio antibacteriano utilizar linhagens de bactérias Gram positivas como Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus e Gram negativa como Escherichia coli com 24 horas de cultivo a 37 °C. Preparar as suspensões das bactérias com densidade 0,5 da escala de McFarland, segundo Kirby et al. (1966) e inocular como no item anterior em placas contendo 10 mL do meio TSA (Triptona Soja Ágar) ou o meio Muller Hintton Ágar.

d) Após o crescimento dos Streptomyces (item a) serão feitos blocos de gelose e circulares, utilizando um furador de rolha (diâmetro de 6 mm) esterilizado em álcool e flambado. Cada bloco será transferido para as placas já inoculadas (item b e item c) levadas para estufa BOD a 37 °C para as bactérias, durante 24 horas, enquanto os fungos serão cultivados a 28 °C–30 °C, durante 72 horas–96 horas. Após esses períodos serão observados os halos de inibição os quais serão medidos em mm com auxílio de uma régua.

5. Considerações finais

Os benefícios dos processos ecológicos desempenhados por microrganismos por meio das bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCPs) têm contribuído para alcançar a sustentabilidade no setor do agronegócio. A tecnologia de inoculação de bactérias de interesse biotecnológico na agricultura é um recurso de grande importância econômica, além do que pode contribuir para reduzir o uso e consequente impacto dos agroquímicos.

A agricultura sustentável requer a utilização de estratégias que permitam o aumento da produtividade sem o prejuízo do meio ambiente, abrindo novas perspectivas para contribuir no desenvolvimento de novas tecnologias, métodos e estratégias na agroindústria. Os processos mediados pelos microrganismos tornam-se essenciais na preservação e na conservação dos recursos naturais.

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Capítulo 2
Diazotróficos associativos e de vida livre: avanços e aplicações biotecnológicas

Veronica Massena Reis
Stefan Schwab
Luc Felicianus Marie Rouws
Kátia Regina dos Santos Teixeira

1. Introdução

A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é um processo em que a molécula de N2 na forma gasosa é incorporada, na forma de amônio, ao metabolismo primário de fixação de nitrogênio, participando da produção de proteínas nas plantas. Apenas bactérias que possuem o complexo enzimático da nitrogenase são capazes de realizar a quebra da tripla ligação e fazer a redução de N2 a NH3+. De uma forma geral bactérias são encontradas na natureza, em diversos habitats, e nesse caso específico são conhecidas espécies que vivem em vida livre, outras que foram isoladas de diversos tecidos de plantas e um grupo mais conhecido e de aplicação agronômica, que são aquelas que formam nódulos nas raízes de plantas, principalmente da família das leguminosas. As associações de bactérias diazotróficas com plantas têm sido alvo de trabalhos de isolamento, identificação, quantificação do nitrogênio (N) fixado, desenvolvimento de produtos contendo bactérias selecionadas e mais recentemente de técnicas moleculares para estudos taxonômicos e caracterização de genes tanto de plantas como de bactérias no sentido de elucidar os mecanismos complexos que esse processo de interação envolve.

Neste capítulo será abordado o estudo sobre bactérias diazotróficas associativas e de vida livre fornecendo informações metodológicas de como fazemos para isolar novas estirpes, como proceder a caracterização morfológica, taxonômica e filogenética, bem como os testes bioquímicos e moleculares que podemos aplicar para avaliar seu efeito no crescimento de plantas e quais são os fatores relacionados à interação com o hospedeiro.

2. Isolamento e identificação taxonômica

Amostras de solo e planta podem ser utilizadas no isolamento de bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) do ambiente. Para se escolher a melhor época de ir ao campo coletar amostras, devemos conhecer o ciclo da cultura. E para conhecer a população de bactérias diazotróficas de uma comunidade bacteriana no solo, podemos utilizar 10 g de solo úmido (coletar logo após uma chuva e de preferência antes do plantio da cultura) que devem ser mantidos à temperatura (de 25 oC a 30 oC) ambiente em sacos plásticos com pequenos furos. Jamais manter na geladeira. Essa amostra deve ser analisada no mesmo dia ou mantida em isopor para transporte e avaliação no mais curto espaço de tempo.

No caso de pedaços de planta, utilizamos também 10 g de preferência. Se fizermos a coleta nos primeiros dias de plantio até a floração, temos as bactérias associadas à fase de raízes ativas e maior demanda de N na cultura. Amostras tiradas ao final do ciclo podem apresentar populações de bactérias de comportamento saprofítico, as quais proliferam usando raízes e outros materiais orgânicos em decomposição. Colmos e folhas podem ser utilizados também. Nesse caso o material fresco é mantido em sacos plásticos nas mesmas condições citadas acima para o solo.

A amostra de 10 g é triturada em 90 mL de solução salina composta de (teor para 1 L de solução): 3,4 g de K2HPO4, 0,2 g de MgSO4, 0,2 g de NaCl, 0,02 g de CaCl2.2H2O 2 mL de solução de micronutrientes para meio de cultura contendo 0,04 g de CuSO4.5H2O 1,20 g de ZnSO4.7H2O, 1,40 g de H3BO3, 1,0 g de Na2MoO4.2H2O e 1,175 g de MnSO4.H2O. Completar o volume para 200 mL com água destilada. Adicionar 4 mL de FeEdta (solução 1,64%). Ajustar o pH para 7,0 com KOH. A seguir é feita a diluição seriada de 10-2 a 10-5 transferindo 1 mL da suspensão para tubos de ensaio contendo 9 mL de solução salina. Também pode ser utilizado tampão PBS ou mesmo solução de sacarose a 5% para plantas como a cana-de-açúcar. É importante manter as melhores condições fisiológicas (concentração salina, pH, temperatura, osmolaridade, etc.) na fase de diluição das amostras manterá fim de preservar a integridade celular.

Inoculação nos meios de cultivo: uma alíquota de 0,1 mL de cada uma das diluições é transferida para frascos contendo 5 mL dos meios semissólidos a seguir. A gota deve ser introduzida no centro do meio de cultivo para proporcionar a formação da película de crescimento que, ao atingir a superfície do meio, terá a forma de uma folha de papel após três a cinco dias dependendo da bactéria estudada. Crescimentos diversos e subsuperficiais são comuns de ocorrer e podem significar diferenças no uso do oxigênio (bactérias anaeróbicas ou anaeróbicas facultativas). Uma observação importante nessa etapa de formação da película é o espessamento e opacidade, pois diversas bactérias apresentam comportamento semelhante no meio semissólido, porém apenas aquelas capazes de fixar o N-atmosférico é que podem acumular biomassa durante o período de incubação.

Existem várias receitas de meios semissólidos sem adição de nitrogênio e que podem ser obtidos na literatura. Por exemplo: Döbereiner et al. (1995) descrevem os meios NFb, JNFb, LGI, LGI-P; Baldani et al. (1996) e Reinhold et al. (1986), o meio SM; e Reis et al. (2004) descrevem o meio JMV. Podemos destacar um dos mais importantes, o meio NFb (DÖBEREINER et al., 1995). Para preparo desse meio são necessários os seguintes reagentes em quantidades para um litro: 5 g de ácido málico; 0,5 g de K2HPO4; 0,2 g de MgSO4.7H2O; 0,1 g de NaCl; 0,02 g de CaCl2.2H2O; 2 mL de solução de micronutrientes; 2 mL de azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2 N de KOH); 4 mL de FeEdta (solução 1,64%); 1 mL de solução de vitaminas para meio de cultura (10 mg de Biotina e 20 mg de Piridoxol – HCl, dissolver em banho-maria e completar o volume para 100 mL com água destilada e manter a solução em geladeira. Neutralizar o ácido com 4,5 g de KOH). Completar o volume para 1.000 mL com água destilada. Ajustar o pH para 6,5. Adicionar o ágar na concentração de 0,17% para semissólido e 1,5% para sólido. No caso de preparo do meio sólido para placas, deve-se adicionar 50 mg de extrato de levedura por litro. De uma forma geral, os meios de cultivo são compostos de pelo menos uma fonte de carbono, tampão, macro e micronutrientes, fatores de crescimento como vitaminas. O pH pode ser modificado de acordo com o objetivo do trabalho, mas a maioria das bactérias isoladas de regiões tropicais cresce bem em pH mais ácido, variando de 5,5 a 6,5 – em geral essa é a faixa de pH da maioria dos solos nessa região. Os meios também possuem um indicador que auxilia a visualização da mudança de pH durante o crescimento bacteriano. O azul de bromotimol, vermelho congo e verde de bromocresol são os mais comuns. Eles podem ser usados nas formulações líquidas, semissólidas ou sólidas. Nos casos em que se deseja avaliar a densidade ótica ou medir proteína, os indicadores de pH devem ser omitidos, pois a variação na cor interfere no uso de técnicas baseadas em absorvância e colorimetria.

Os frascos contendo meio semissólido inoculados são incubados a 30 °C por um período de 5 a 7 dias para o desenvolvimento de uma película em forma de véu ou espessa na região superficial do meio. A contagem da população bacteriana é realizada pela técnica do Número Mais Provável (NMP), utilizando a tabela de Mc Crady para três e cinco repetições das diluições (DÖBEREINER et al., 1995). Para facilitar o entendimento, apresentamos a seguir uma tabela orientadora de nomes e referências dos diversos meios de cultivo descritos na literatura e qual organismo é beneficiado pela formulação proposta (Tabela 1).

Processo de isolamento: após a contagem devem-se escolher dois frascos das duas diluições mais altas e repicar para novo meio semissólido. Após dois a três dias de incubação, nos frascos com película positiva inicia-se o processo de riscagem em placa usando a mesma formulação do meio semissólido utilizado na etapa anterior, mas desta vez deve-se utilizar a quantidade de ágar necessária para torná-lo sólido (15%), além de uma pequena dose de extrato de levedura (50 mg por litro). As colônias isoladas devem ser repicadas novamente para meios semissólidos. Após a formação da película característica, devemos fazer a fase de purificação que consiste da utilização de meios ricos (exemplos: LB, DYGS, TY, etc.) para verificar se temos apenas uma colônia por placa, e proceder o estoque inicial da bactéria. Novamente temos diversos meios ricos que podem ser utilizados. Os mais comuns são o batata (DÖBEREINER et al., 1995), o caldo nutritivo (fórmula disponível no mercado), SYP (CABALLERO-MELLADO; MARTINEZ-ROMERO, 1994), Dygs (RODRIGUES NETO et al., 1986).

Tabela 1. Meios de cultivo semissólidos desenvolvidos para o isolamento de bactérias fixadoras de nitrogênio, sem adição de nitrogênio.

Espécie privilegiada

Nome do meio de cultivo e fonte de carbono

Referências

Azospirillum brasilense, A. lipoferum

NFb – ácido málico

Döbereiner et al. (1995)

Azospirillum amazonense

LGI – açúcar cristal

Baldani (1984) e Döbereiner et al. (1995)

Gluconacetobacter

LGI-P – açúcar cristal

Döbereiner et al. (1995) e Reis et al. (1994)

Burkholderia (B. tropica, B. silvatlantica e outros)

LGI e JMV – açúcar cristal e malato; BAz – ácido azelaico

Baldani et al. (1996), Döbereiner et al. (1995), Estrada-de Los Santos et al. (2001) e Reis et al. (1994)

Herbaspirillum seropedicae,

H. rubrisubalbicans

JNFb

Baldani et al. (1992)

Azoarcus

SM

Reinhold et al. (1986)

Pantoea

LGI-P

Döbereiner et al. (1995), Loiret et al. (2004) e Reis et al. (1994)

Sphingomonas

JNFb

Baldani et al. (1992) e Videira et al. (2004)

2.1. Caracterização morfológica dos isolados

Para verificação da morfologia celular, devemos montar lâminas para visualização ao microscópio ótico de contraste de fase. O melhor será fazer uma nova inoculação no meio semissólido de culturas jovens, com 24 a 48 horas de crescimento. Nesse caso também anotamos informações sobre a motilidade das células. O crescimento nos diversos meios de cultivo também deve ser anotado.

2.2. Caracterização morfológica de colônias

É importante considerar que nesta etapa deve-se usar mais do que um meio de cultura para a avaliação, pois diversas bactérias apresentam morfologia de colônia diferente em relação ao pH e outros componentes do meio. A seguir é apresentado um protocolo para a caracterização morfológica de colônias. As células de uma bactéria isoladas e crescidas em meio semissólido LGI-P foram riscadas em placas de Petri contendo o mesmo meio. Por se tratar de um meio semiespecífico, apesar de permitir observar morfologia de colônias típica de uma espécie, não permite visualização de possíveis variações entre os isolados. Portanto, os isolados foram riscados em placas contendo meio sólido Batata-P e SYP. Nos isolados crescidos em meio Batata-P, foram avaliadas apenas a presença e a intensidade de pigmento, já nos isolados crescidos em SYP foram avaliados: tamanho (anotar dimensão, menor que 1 mm, maior que 1 mm) e forma (puntiforme, circular ou irregular). Outros critérios utilizados para a caracterização morfológica de colônias são elevação, borda e superfície da colônia. Abaixo (Figura 1) estão apresentados esquemas de tipos de elevação, bordas e superfícies geralmente observados.

Figura 1. Esquemas de tipos de elevação, bordas e superfícies para a caracterização morfológica de colônias.
Fonte: Yano (1993).

2.3. Uso de fontes de carbono

Para avaliar a capacidade dos isolados de utilizar diferentes fontes de carbono, pode-se usar a mesma receita do meio semissólido utilizado no isolamento e variar a fonte de carbono que pode ser substituída por açúcares como glicose, frutose, sacarose, arabinose, ribose, galactose, açúcares-álcoois – mio-inositol, sorbitol e adonitol. Fazer a solução estoque de forma a aplicar 100 µL da fonte de carbono na concentração de 10 mM. Todas as fontes devem ser esterilizadas por filtração (Millipore®, 0,2 µm). O inóculo deve ser crescido em meio líquido e de preferência sem limitações (meio rico), e com o auxílio de uma micropipeta inocular 20 µL deste nos frascos. Fazer duas repetições para cada fonte de carbono. Após a inoculação (30 °C por 3 a 5 dias), observar a formação de película característica, correspondendo à capacidade de uso da determinada fonte de carbono.

Outra forma de avaliar fontes de carbono é adquirir kits desenvolvidos para esse fim. No mercado existe o Biolog® e o API®. A capacidade de utilização das diversas fontes de carbono é feita pela visualização da cor roxa produzida pela redução do indicador tetrazolium. A cor é medida por espectroscopia ou pelas simples marcações de positivo (roxo) e negativo (sem alteração da cor). Esses dados são fornecidos ao programa Bio, do Kit Biolog, que identifica o gênero e espécie, ou a similaridade do isolado com algum gênero já descrito.

2.4. Atividade da nitrogenase

A atividade da nitrogenase pode ser medida pela redução do acetileno, inibidor competitivo da enzima. A técnica da redução de acetileno (ARA) foi descrita por Boddey e Knowles (1987), e a atividade específica é quantificada dividindo-se a atividade total de ARA pela proteína total acumulada pelas bactérias durante o cultivo, determinada pelo método descrito por Lowry et al. (1951) ou outro de sua preferência. Antes de escolher o método recomenda-se que seja feito uma curva de calibração contendo proteína comercial (tipo BSA) preparada no meio utilizado durante o cultivo, para avaliar possíveis interferências de componentes do meio sobre a linearidade e sensibilidade do método de dosagem de proteínas. Os isolados são cultivados como descrito no item anterior para uso de fonte de carbono, e uma alíquota de 20 µL da cultura crescida é inoculada no centro do meio de cultura, em frascos com capacidade de 10 mL, contendo 5 mL de meio de cultura semissólido com a fonte preferencial utilizada pela bactéria. Os frascos são incubados no escuro a 30 °C por 48 horas. Após a formação da película na superfície do meio de cultura, os frascos são fechados com rolhas de borracha perfurável, e 0,5 mL de acetileno será injetado usando uma seringa. Esse volume de injeção corresponde a 10% da fase gasosa do frasco. Após a injeção das amostras testes e do controle contendo apenas o meio de cultura sem bactérias, os frascos serão incubados por 1 hora a 30 °C. A seguir procede-se a avaliação do etileno produzido por meio da injeção de 0,5 mL da fase gasosa das amostras em cromatógrafo a gás com detector por ionização de chama. O resultado é obtido por meio de um integrador digital de marca PE Nelson modelo 1022 que está acoplado ao cromatógrafo. O integrador recebe o sinal do cromatógrafo e o converte em gráfico, calculando a área e altura do pico e comparando-as com a curva padrão usada na calibração do aparelho; dessa maneira, obtém-se a concentração do gás etileno contido na fase gasosa das amostras. Após a leitura de ARA, as amostras são homogeneizadas para misturar a película ao meio de cultura e realizada a determinação de proteínas totais (GUEDES et al., 2007). O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico (reagente de Fenol-Ciocalteau), que sofre redução quando reage com proteínas na presença de cobre e produz um composto com absorção máxima em 750 nm. Em tubos de ensaio, foram adicionados 0,1 mL de amostra, 0,4 mL de água destilada estéril, para diluir a amostra e não saturar o método, e 0,5 mL de NaOH 1 M, agitados e postos em banho-maria a 100 oC por 5 minutos para lisar as células e desnaturar o ágar. Após atingir temperatura ambiente, adiciona-se 0,25 mL de regente de Lowry, agitam-se os tubos e incubam-se no escuro por 10 minutos. Em seguida coloca-se 0,5 mL da solução do Reativo Fenol Ciocalteau, diluído na proporção de 1 porção de reagente para 2 porções de água destilada estéril, agitados e incuba-se no escuro por 30 minutos. Após incubação, é efetuada leitura de absorbância em espectrofotômetro com filtro de 750 nm. Os valores de absorbância das amostras são multiplicados por 10 (correção pelo uso de 100 µL de amostras, para obter o resultado em mL), e a concentração de proteínas determinada usando como padrão curva obtida pelos valores de absorbância de amostras com quantidades conhecidas da proteína albumina bovina. O valor da concentração de proteína será multiplicado pela quantidade de meio de cultura em que a bactéria estava crescendo.

A atividade de redução de acetileno é dada por nmol de etileno produzido por hora de incubação (neste caso 1 hora) e dividido pelo valor de absorbância obtido pela análise de proteínas totais, resultando em nmol de etileno por mg de proteínas totais, quantificando dessa maneira a atividade específica da nitrogenase dos isolados.

2.5. Secreção de auxina

Embora a produção de auxina não seja um processo vinculado à FBN, normalmente se faz a análise de excreção de auxinas nas estirpes isoladas. Esse método colorimétrico é bem simples e permite agregar valor ao isolado. Estirpes produtoras de auxinas atuam no sistema radicular e podem aumentar a superfície das raízes, melhorando a absorção das plantas e indiretamente a área de benefício à colonização, por aumentar os pontos de entrada e de excreção de fontes de carbono, beneficiando o estabelecimento de bactérias.

A determinação colorimétrica da concentração de auxina no sobrenadante de culturas de bactérias endofíticas tem sido descrita em diversos trabalhos (CARREÑO-LOPEZ et al., 2000; GLICKMAN; DESSAUX, 1995) e foi modificada para o formato de microplacas de 96 poços (SCHWAB et al., 2007). De fato, a técnica colorimétrica detecta outros compostos indólicos além de auxina, por isso seremos aqui mais genéricos quanto à terminologia. Após cultivo em meio líquido apropriado (Tabela 1), 200 µL de cultura são transferidos para poço de uma placa-filtro Multiscreen-GV (Millipore) e filtrados por centrifugação a 2.500 g por 5 minutos para poço de uma outra placa de 96 poços. 100 μL dessa solução filtrada são transferidos para poço de uma placa de ELISA de 96 poços. São adicionados 100 µL de uma variação de reagente de Salkowski (FeCl3 55 mmol/L, H2SO4 7,9 mol/L), fechando em seguida com tampa adesiva. O sistema é incubado por 30 minutos, sob ausência de luz, à temperatura ambiente. Os valores de absorbância são determinados a 550 nm utilizando um leitor automático de microplacas. Para relacionar a concentração de compostos indólicos com o número de células na cultura, a D.O.600 da amostra também é determinada. Para isso, são transferidos 200 μL de cultura para poço de uma placa de ELISA, e a absorbância é determinada a 600 nm de modo semelhante à determinação a 550 nm. Recomenda-se a realização dos experimentos em quadruplicata.

Além do método colorimétrico, a secreção de auxina pode ser acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) em gel de sílica, essencialmente como descrito (EHMANN, 1977), ou por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). No caso da bactéria Herbaspirillum seropedicae, CCD foi utilizada com sucesso para acompanhar os níveis de auxina secretada (SCHWAB et al., 2007), sendo potencialmente aplicável a outras espécies de endófitos. 20 mL de cultura são centrifugados a 15.000 g, e o sobrenadante coletado. O pH do sistema é ajustado para ≈1,0 por meio da adição de solução HCl concentrada. A solução resultante é extraída com 1 volume de clorofórmio. A fase orgânica inferior é coletada e concentrada cerca de 15 vezes por evaporação. Aproximadamente 30 µL são aplicados gradualmente na placa de gel de sílica, de forma a concentrar a amostra por evaporação do solvente em uma área circular em torno de 3 mm de diâmetro. O sistema de solventes de CCD consiste de uma mistura: clorofórmio:metanol:água na proporção 84:14:1. Após a CCD, a placa é seca a 45 °C–60 °C por 5 a 10 minutos e fotografada sob luz UV (254 nm). Para a revelação dos compostos indólicos, a placa é borrifada na posição vertical, até a sílica adquirir um aspecto úmido, com o reagente de van Urk–Salkowski (EHMANN, 1977). O reagente de van Urk consiste de 1 g de p-dimetilaminobenzaldeído dissolvido em 50 mL de solução HCl concentrada (massa específica 1,19 g/cm3), adicionado de 50 mL de etanol 96%. O reagente de van Urk–Salkowski consiste de uma mistura reagente dos dois na proporção 1:3. A placa é incubada em estufa a 100 °C por 5 minutos e depois resfriada à temperatura ambiente. A placa é lavada 3 vezes por imersão em ddH2O, agitando cuidadosamente por 1 minuto cada ciclo, pois nessa etapa o gel de sílica pode descolar-se da placa. O excesso de umidade da placa pode ser eliminado por mata-borrão com papel toalha, e as cores das bandas são comparadas com as da literatura (cores com a placa úmida) (EHMANN, 1977). A placa pode ser seca a 45 °C–60 °C por 20 a 30 minutos, e novamente as cores das bandas são comparadas com as da literatura (cores com a placa seca) (EHMANN, 1977).

2.6. Caracterização molecular

Atualmente, uma etapa importante no processo de caracterização e descrição de isolados é o uso de técnicas moleculares. Informações genéticas associadas às fenotípicas geram informações mais detalhadas sobre o isolado e permitem uma abordagem polifásica. Dentre as várias técnicas moleculares descritas a partir da década de 1980, as que mais apresentam poder de gerar informações claras e descritivas de uma espécie assim como de sua variabilidade genética intrínseca são baseadas no uso de sequências de DNA da região codificadora de genes ribossomais e espaços intergênicos. O uso da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar sequências dessas regiões do genoma resulta em amplificação exponencial do número de cópias do gene-alvo ou de uma região intergênica. O produto dessas reações é então utilizado em reações de restrição na presença de endonucleases, as quais promovem cortes em sítios específicos caracterizados por sequências de bases nucleotídicas.

Durante a reação de PCR é necessário usar os seguintes reagentes em determinadas concentrações: DNA extraído a partir do organismo alvo, 1 par de sequências iniciadoras também conhecidas como primers, mistura de desoxinucleosídeos trifosfatados para as 4 bases do DNA (dNTPs), MgCl2, tampão de reação comercial e a Taq DNA polimerase. Uma reação de amplificação padrão deve conter esses reagentes em concentrações descritas na Tabela 2.

Tabela 2. Reagentes e concentrações utilizadas em uma reação padrão de PCR.

Reagente

Concentração final

Quantidade para uma reação de 50 µL

Água milli-Q estéril (livre de nucleases)

–

Variável

Tampão de reação 10X

1X

5 µL

Mistura de dNTP 10 mM

200 µM de cada dNTP

1 µL

MgCl2 50 mM

1 mM–4 mM(1)

Variável

Primer I

0,1 µM–1 µM

Variável

Primer II

0,1 µM–1 µM

Variável

DNA molde

10 µg–1 µg

Variável

Taq DNA polimerase 5 U/µL

1,25 U 50 µL-1

0,25 µL

(1) A concentração desse reagente pode variar de acordo com o conjunto de primers utilizado e
deve ser testado utilizando um DNA amplificado anteriormente como controle positivo.

Os primers utilizados foram descritos por Young et al. (1991): Y1 (5’-TGGCTCAGAA CGAACGCTGGCGGC – 3’) e Y3 (5’–CTAGACCC CACTTCAGCATTGTTCCAT–3’). No entanto, existe uma diversidade de primers que pode ser utilizada para obter as sequências do gene 16S inclusive pelo sequenciamento (CRUZ et al., 2001). No caso da amplificação de região reconhecida como espaço intergênico localizado entre os genes 16 e 23S DNAr, são utilizados os primers PHR e P23 (ARTURO et al., 1995). As condições de amplificação no termociclador variam de acordo com o conjunto de primers utilizado. Para os primers Y1 e Y3, é utilizado o seguinte conjunto de etapas da PCR: 1) desnaturação inicial a 95 ºC por 2 minutos; 2) 35 ciclos em sequência de desnaturação a 92 ºC durante 45 segundos, anelamento a 60 ºC durante 45 segundos e extensão a 72 ºC durante 2 minutos; 3) etapa final de extensão a 72 ºC durante 5 minutos. Para os primers PHR e P23 o programa da PCR é: 1) desnaturação inicial a 95 ºC por 3 minutos; 2) 35 ciclos em sequência de desnaturação a 94 ºC durante 30 segundos, anelamento a 48 ºC durante 1 minuto e extensão a 72 ºC durante 1 minuto e 30 segundos; 3) etapa final de extensão a 72 ºC durante 10 minutos. Em alguns casos, pode ser necessário alterar algumas dessas condições de amplificação em razão da origem da amostra ou qualidade do DNA e de primers utilizados. Os fragmentos amplificados devem ser observados após eletroforese em gel de agarose 1,2%, em tampão TAE, a 65V, por 2,5 horas. As bandas resolvidas no gel são visualizadas após coloração com brometo de etídeo (5 µg/mL), sob iluminação ultravioleta, e registradas por sistemas de fotodocumentação ou fotografia utilizando equipamento com filtro adequado para UV. Os produtos de amplificação obtidos a partir das amostra de DNA avaliadas podem ser utilizados diretamente para aplicação de outras técnicas moleculares ou mantidos em freezer -20 ºC.

Após obtenção do produto de PCR dos isolados, é possível utilizar as técnicas de restrição do DNA ribossomal amplificado (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis – Ardra) e análise do espaço intergênico ribossomal (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis – Risa) para avaliar, respectivamente, a variabilidade genética entre espécies e intraespecífica (AZEVEDO et al., 2005; GUEDES et al., 2008; REIS JÚNIOR et al., 2004). Essas técnicas se baseiam na análise do perfil de fragmentos gerados após digestão do produto da amplificação (DNA amplificado) com endonucleases que reconhecem uma sequência específica do DNA, também conhecidas como enzimas de restrição. Dentre as várias enzimas de restrição disponíveis comercialmente, recomendamos iniciar os estudos de perfil de restrição dos isolados com HaeIII, AluI, RsaI ou CfoI. Para um volume final de 20 µL de reação, cada sistema de restrição deve conter: produto de PCR equivalente a 0,1 µg–0,5 µg de DNA (volume variável), 5U da enzima de restrição (volume variável), 2 µL de tampão de reação 10X (fornecido comercialmente junto com a enzima) e água milli-Q estéril para ajustar o volume final da reação. As reações de restrição dos produtos de PCR devem ser incubadas a 37 ºC, por no mínimo 3 horas ou até 16 horas. Após incubação, os produtos da reação de restrição devem ser submetidos à eletroforese em gel de agarose (3% em tampão TAE 1X), a 50 V por 4 horas. Posteriormente, após coloração com brometo de etídeo, os géis devem ser visualizados sob luz ultravioleta, e a imagem deve ser registrada por equipamento de fotodocumentação ou fotografada.

Os resultados obtidos na forma de perfil de bandas específicas para cada tipo de enzima utilizada correspondem a um padrão comum aos isolados que apresentam sequências similares e consequentemente formam um grupo. Para realizar o agrupamento, deve ser construída uma matriz binária, com os dados obtidos da análise do universo total das bandas, de todos os perfis gerados pelas quatro enzimas. Para cada posição de migração são atribuídos os valores 1 ou 0, indicando a presença ou ausência de uma banda. Os padrões de migração gerados podem então ser comparados, e suas semelhanças estimadas pelo coeficiente de Jaccard, em que J = a/(n - d), sendo a o número de combinações com a presença dos fragmentos menos as combinações de ausência dos fragmentos, d é o número de combinações de ausência de fragmentos, e n é o número de combinações possíveis. Os isolados são então agrupados pelo método das médias das distâncias, e a representação dos grupos presentes é feita por um dendrograma utilizando software adequado.

2.7. Expressão gênica

Uma tecnologia para o estudo da expressão e regulação gênica de um organismo, com ênfase na identificação e caracterização de promotores ou genes responsivos a uma dada condição de cultivo, é a técnica de promoter trap (captura de promotores) ou gene trap (captura de genes). Essa metodologia tem sido aplicada com sucesso em trabalhos envolvendo bactérias que se associam a plantas (HAAPALAINEN et al., 1996; RAMÍREZ-ROMERO et al., 2006; ZHANG; CHENG, 2006), e faz uso de um vetor cuja característica principal é a de apresentar um sítio múltiplo de clonagem adjacente a um gene repórter sem promotor (DUNN; HANDELSMAN, 1999). Bibliotecas contendo fragmentos de DNA clonados em frente ao gene repórter podem ser utilizadas para estudar a atividade dos promotores em diversas condições de cultivo. Um gene repórter bastante utilizado é lacZ, que codifica a enzima β-galactosidase. As triagens que utilizam os ensaios dessa enzima têm sua metodologia bem estabelecida (MILLER et al., 1970).

Utilizando estirpes transformadas com plasmídeos repórteres, ensaios de atividade específica de β-galactosidase envolvendo A. brasilense, A. lipoferum e H. seropedicae têm sido descritos (KATUPITIYA et al., 1995; LIANG et al., 1991; PEDROSA et al., 1997); em relação a G. diazotrophicus, temos realizado ensaios dessa enzima com sucesso. São transferidos 40 µL de cultura em triplicata ou quadruplicata ou de meio de cultura (branco da reação) para poço de uma placa de 96 poços de 2,2 mL contendo 360 µL de tampão Z (SDS 0,27%, β-mercaptoetanol 0,39%, Na2HPO4.7H2O 60 mmol/L, NaH2PO4.H2O 40 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgSO4.7H2O 1 mmol/L, pH 7,0). São adicionados 25 µL de clorofórmio. A placa é fechada com uma tampa adesiva. Mistura-se por agitador de tubo tipo vórtex (cerca de 2 minutos), centrifugando brevemente e deixando estabilizar em banho-maria a 28 °C ou à temperatura ambiente, por 10 minutos. Para iniciar a reação, são adicionados 80 µL de solução de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) 4 mg/mL em tampão Z, e, depois de determinado período de tempo conforme o desenvolvimento da coloração amarela, são adicionados 200 µL de uma solução de Na2CO3 1 mol/L para interromper a reação. A mistura é centrifugada a 2.600 g utilizando rotor para placas durante 10 minutos. 200 µL da fase aquosa superior são transferidos para uma placa de ELISA de 96 poços para a leitura da A415 em leitor de microplacas.

A atividade específica de β-galactosidase pode ser apresentada em nanomoles de o-nitrofenol (ONP) formados por minuto por miligrama de proteína total (nmol ONP/min/mg prot), pela seguinte equação:

em que V é o volume de amostra ensaiado (0,040 mL); t é o tempo de reação (em minuto); [prot] é a concentração de proteína determinada (em mg/mL); e 255 nmol ONP representa um fator de conversão entre A415 e nmol de ONP formado (MILLER, 1972). Os valores de atividade específica de β-galactosidase, referente às condições de cultivo diversas, podem ser comparados por meio do teste t bilateral, 95% de intervalo de confiança.

3. Testes em plantas – avaliação efeito agronômico

Fase 1: seleção de estirpes em substrato estéril

A melhor maneira de se avaliar o efeito de estirpes selecionadas do ambiente no crescimento de uma determinada planta é instalar um ensaio em casa de vegetação utilizando substrato estéril e que não é solo. O solo esterilizado favorece o desenvolvimento de fungos que podem inviabilizar seu ensaio. O substrato mais barato é a areia lavada (de rio ou mar). A lavagem é feita em tanques com água de boa procedência. A areia é misturada com vermiculita expandida comercial na proporção de 2:1 – v/v. A esterilização a 120 oC por 60 minutos é repetida novamente após resfriamento de 24 horas. O procedimento a seguir é fazer a análise de solo e adequar os nutrientes para a cultura alvo, lembrando que esses ensaios são de curta duração, 45 dias aproximadamente, dependendo do substrato. A procedência da semente deve ser levada a sério e não possuir agentes de conservação como fungicidas e inseticidas. Caso não seja possível receber um lote de sementes antes do tratamento, passar as sementes por álcool 70% diversas vezes até o produto não ser mais notado visualmente e lavar com água ao final. O inóculo será testado quanto à pureza (placa com meio rico) e deverá crescer por 48 horas. A estirpe crescida em meio líquido será aplicada sobre a semente (1 mL) contendo o mesmo número de células que deve ser ajustado pela densidade ótica calibrada pela contagem em câmara de Neubawer. Cada semente receberá 1 mL da suspensão.

Os controles recomendados são testemunha sem o inoculante e sem N e duas testemunhas não inoculadas mas adubadas com a metade e a dose total de N recomendada para cada cultura. O delineamento utilizado será de blocos ao acaso com quatro repetições. As avaliações consistem da medida da matéria fresca e seca das raízes e parte aérea das plantas. O volume e área radicular devem ser medidos pelo programa de análise de raízes desenvolvido pela Embrapa Instrumentação Agropecuária (Siarcs) ou por outra metodologia disponível.

Fase 2: seleção em solo não estéril

As melhores estirpes são testadas em vasos preenchidos com solo pobre em nitrogênio. A inoculação procederá da mesma forma citada acima. O delineamento experimental é de blocos ao acaso com quatro repetições e com os mesmos controles. Os mesmos parâmetros devem ser avaliados. Essa fase permite avaliar se a estirpe selecionada na fase 1 é competitiva e mantém a resposta quando o substrato contém a biota nativa do solo. Essa fase se justifica se o número de bactérias selecionadas na fase 1 for elevado. Caso o ensaio selecionou um número pequeno de estirpes, a melhor maneira é instalar um ensaio no campo.

Fase 3: ensaio no campo de cultivo

Devemos limitar o número de estirpes testadas nas fases anteriores e montar um ensaio com área útil representativa, usando as recomendações da cultura quanto ao espaçamento, à adubação, forma de manejo, etc. Recomendam-se nesse caso seis repetições por tratamento em razão da variabilidade dos sistemas biológicos (estirpe). Quanto ao local, devemos implantar o ensaio onde seja mais fácil acompanhar o desenvolvimento da cultura. Caso o sucesso da inoculação ocorra, devemos implantar ensaios em outros locais e repeti-los por pelo menos dois anos em virtude da variabilidade de clima. Como a maioria das plantas, não há recomendação de genótipos mais responsivos para a FBN; devemos utilizar materiais selecionados para baixa resposta a nitrogênio nos ensaios iniciais e depois expandir o uso para materiais contrastantes. Como tratamos de uma resposta da planta à inoculação, a escolha sobre o material genético é muito importante. No caso de plantas em que o melhoramento genético ainda não evoluiu, devemos escolher sementes de mesmo tamanho e origem (lote). A inoculação nesse caso deve ser preparada conforme o descrito para o rizóbio que mistura a estirpe com um veículo que permite a bactéria aderir à semente. No caso de plantas propagadas por colmos, devemos fazer a imersão no inóculo com densidade ótica conhecida, em torno de 108 a 109 células por mL. A produção (no caso de grãos – 14% de umidade) e N total no grão são parâmetros a serem analisados. Avaliações do stand (número de plantas), número de espigas por planta (ex.: milho, panículas no arroz, etc.), peso médio de espigas entre outras análises de produtividade podem e devem ser incluídas. O conteúdo total de N será determinado pela digestão de Kjeldahl, seguida de destilação e titulação, conforme descrito em Bremner e Mulvaney (1982).

4. Quantificação da contribuição da FBN

Existem vários métodos disponíveis na literatura que permitem avaliar a contribuição da FBN. Talvez o fator limitante seja o equipamento necessário para a escolha de uma metodologia em detrimento de outra. Embora esse fator possa ser contornado por meio de parcerias com outras instituições, devemos dar ênfase à seleção de alguns parâmetros iniciais que permitem avaliar o sistema no qual estamos trabalhando. Podemos começar com o balanço de N no sistema solo-planta. Isso significa que todas as entradas e saídas, tais como o N do solo (inicial e final), da semente e da planta ao final do ciclo ou qualquer outra entrada, são quantificadas. Se no final houver mais nitrogênio do que no início, isso representa que houve ganho via FBN. O balanço de nitrogênio é uma metodologia fácil de aplicar, e embora algumas perdas de N por volatilização sejam difíceis de controlar, podemos usar formas de N pouco voláteis. Um outro método mais preciso de medir o ganho atribuído à FBN é pela marcação do N do solo com um isótopo mais pesado do nitrogênio, o 15N. Essa marcação pode ser feita por meio da utilização direta do adubo ou da incorporação de material marcado que tenha sido cultivado previamente. Desde que a marcação do solo esteja estável, essa técnica pode estimar a entrada do N do ar, que irá diluir a quantidade da marcação do N no material analisado. Também pode ser feita a incorporação direta na forma de gás, mas essa medida é possível por um curto intervalo de tempo. Outra técnica usa o 15N naturalmente presente no solo. Essa técnica pode ser empregada uma vez que o N do solo é enriquecido em 15N em comparação ao N2 do ar (SHEARER et al., 1978). A planta não fixadora apresenta uma abundância natural de 15N muito semelhante a do N disponível do solo, enquanto que a planta fixadora de N2 apresenta valores de abundância de 15N que mais se aproximam de zero quanto maior for a atividade fixadora das bactérias a elas associadas.

Para a estimativa da FBN por meio da abundância natural de d15N utiliza-se a seguinte expressão:

em que P é a % de fixação biológica de N, δ15N solo é o valor de δ15N encontrado na planta testemunha coletada em cada parcela experimental, e B é o fator de correção do fracionamento isotópico que no caso das gramíneas é considerado zero. Em virtude de diferenças do desenvolvimento radicular entre as plantas em avaliação e as plantas controle, amostras de várias profundidades do solo serão retiradas para avaliar a uniformidade de marcação natural de 15N no perfil do solo. Dependendo da uniformidade de marcação do solo, as espécies espontâneas deverão ser selecionadas em função do aprofundamento de raízes e exploração do solo.

5. Considerações finais

A exemplo do uso do inoculante de rizóbio na agricultura, muitos outros produtos podem vir a ser desenvolvidos para utilização em plantas diferentes das leguminosas. O entendimento das relações entre plantas e bactérias aumentou muito com o advento de métodos moleculares e instrumentos de visualização como novos microscópios e técnicas de marcação. Sabe-se hoje que apenas uma pequena parcela da diversidade microbiana do solo foi descoberta, e que os microrganismos colonizam os diversos tecidos vegetais. Por um lado podemos esperar que a ciência desenvolva novos produtos biotecnológicos que podem substituir parcialmente ou totalmente a aplicação de nitrogênio fertilizante em plantas e que eles estejam disponíveis para uso nos próximos anos, mas, por outro lado, estamos cientes da diversidade de nichos a serem colonizados e pouco conhecemos sob a interação de uma nova estirpe no solo ou em uma planta.

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Capítulo 3
Bactérias fixadoras de N2 e fungos micorrízicos arbusculares em espécies florestais: avanços e aplicações biotecnológicas

Fatima Maria de Souza Moreira
Sergio Miana de Faria
Fabiano de Carvalho Balieiro
Ligiane Aparecida Florentino

1. Introdução

Milhares de espécies de microrganismos promotores de crescimento vegetal, cuja biodiversidade ainda está sendo desvendada, habitam o solo não rizosférico. Dentre esses, já são conhecidas várias espécies que podem estabelecer dois tipos básicos de interação com espécies vegetais: as associações e as simbioses. Do ponto de vista biotecnológico, ainda não é possível o manejo bem sucedido das associações em espécies florestais. Já para as simbioses, diversos inoculantes estão disponíveis e vários outros ainda podem ser obtidos. Os processos mediados pelos microssimbiontes que contribuem para o crescimento vegetal são: a fixação biológica de N2 (FBN) por bactérias, e outros processos principalmente relacionados ao aumento da área explorada pelas raízes, quando infectadas por fungos micorrízicos, que aumentam a absorção de água e nutrientes pouco móveis, como o P.

As simbioses de bactérias fixadoras de N2 (BFN) com espécies florestais têm como característica a formação de estruturas denominadas nódulos. Espécies nodulíferas estão restritas a famílias pertencentes a quatro ordens componentes de um dos dois subclados das Eurosídeas nas Angiospermas, considerando a classificação baseada nos genes: ribossomal 18S rDNA, cloroplástico rbcL e atpD. Maior diversidade filogenética de espécies hospedeiras (de oito famílias distribuídas nas ordens Fagales, Cucurbitales e Rosales) estabelece simbiose com bactérias do gênero Frankia, simbioses estas denominadas de actinorrízicas. As simbioses de BFN vulgarmente denominadas rizóbios se restringem a espécies das famílias Ulmaceae e Leguminosae, respectivamente pertencentes às ordens Rosales e Fabales. Ressalta-se que nessas ordens ocorrem outras famílias que não estabelecem simbiose com BFN. Do mesmo modo, nas famílias e gêneros contendo espécies nodulíferas podem ocorrer outros gêneros e espécies não nodulíferos. Só dois dos gêneros relatados até o momento como actinorrízicos ocorrem no Brasil: Colletia e Discaria. No entanto, esses não têm importância econômica. Além disso, o manejo das simbioses actinorrízicas, em geral, é bastante limitado em razão da dificuldade de isolamento e multiplicação do microssimbionte. Por isso, essas simbioses não serão abordadas neste capítulo, mas tem um grande potencial para novas descobertas no Brasil, uma vez que seu estudo em nossos solos é praticamente inexistente. Já as simbioses de rizóbios com leguminosas se destacam não só pela importância econômica e ampla distribuição geográfica dos hospedeiros, que incluem várias espécies florestais, mas também pela facilidade de seu manejo.

Os fungos micorrízicos são ubíquos na natureza e se dividem em sete tipos, dos quais os arbusculares e ectomicorrízicos são os mais importantes do ponto de vista de simbiose com espécies florestais (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Os fungos ectomicorrízicos não serão abordados neste capítulo, pois é assunto do capítulo 7 da parte 4.

A eficiência dos processos biológicos, mediados pelos microssimbiontes, no crescimento vegetal depende da compatibilidade entre macro e microssimbiontes e dos diversos fatores ambientais e edáficos. Apesar de diversos resultados promissores e práticos já estarem disponíveis, nosso conhecimento ainda é limitado em relação à grande diversidade de espécies microbianas e vegetais, solos e climas que ocorrem nos diversos biomas brasileiros, cujo estudo, portanto, precisa ser incentivado e incrementado.

Este capítulo aborda os métodos utilizados para estudo das simbioses de espécies florestais com bactérias fixadoras de N2 (BFN) e com fungos micorrrízicos arbusculares (FMA) visando maximizar e manejar os processos, por meio dos quais promovem o crescimento vegetal.

2. Simbioses de bactérias fixadoras de nitrogênio (BFN) com espécies da família Leguminosae

A família Leguminosae é subdividida em três subfamílias: Mimosoideae, Papilionoideae e Caesalpinioideae (POLHILL, 1994; POLHILL et al., 1981). As espécies arbóreas são predominantes nas cerca de 3.000 espécies, tanto em Caesalpinioideae como em Mimosoideae. Embora não sejam predominantes nas Papilionoideae, as arbóreas ocorrem em número expressivo de cerca de 4.000 espécies nessa subfamília. A nodulação apresenta-se de forma diferenciada nas três subfamílias, sendo mais frequente nas Papilionoideae, depois na Mimosoideae e pouco expressiva na Caesalpinioideae (ALLEN; ALLEN, 1981; FARIA et al., 1999; MAGALHÃES et al., 1982; SPRENT, 2001). Diferentes tipos de nódulos são encontrados nas diversas espécies de leguminosas, e esses são determinados pela espécie hospedeira. O tipo mais comumente conhecido é o esférico de crescimento determinado que ocorre nas leguminosas de grãos como soja e caupi, mas também é encontrado em várias espécies florestais arbóreas ou com outros hábitos de crescimento (Figura 1A). Outro tipo comum nas espécies florestais é o ramificado de crescimento indeterminado que pode alcançar tamanhos bem maiores que os esféricos como os mostrados nas Figuras 1B, 2A e 2B.

Figura 1. Nódulos de crescimento determinado e indeterminado em A) Desmodium leiocarpum e B) Crotalaria juncea.
Fotos: S. M. Faria

Figura 2. Nódulos de crescimento indeterminado em A) Swartzia schomburkii e B) Enterolobium contortisiliquum.
Fotos: F. M. S. Moreira

3. Simbioses de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) com espécies vegetais

Os FMA, restritos ao Filo Glomeromycota, formam uma das mais expressivas simbioses com raízes de plantas em termos de ocorrência no reino vegetal, distribuição geográfica, benefícios para a planta hospedeira e para o meio ambiente. Levantamentos sobre a ocorrência da simbiose micorrízica no reino vegetal indicam que 80% das famílias de plantas formam algum tipo de simbiose micorrízica (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006), e que as micorrizas arbusculares são as mais ancestrais e de maior ocorrência em regiões tropicais (BRUNDRETT, 2002). Os FMA agem como uma extensão do sistema radicular das plantas potencializando a absorção de nutrientes, principalmente aqueles que apresentam uma menor taxa de mobilidade no solo, como o fósforo, ou incrementando a absorção de água sob condições de estresse hídrico. Os FMA podem também apresentar efeito sinérgico com BFN em simbioses tripartites (fungo-planta-bactéria) (CARVALHO; MOREIRA, 2010; JESUS et al., 2005).

Trabalhos recentes têm demonstrado a existência de especificidade hospedeira ou seletividade na simbiose micorrízica (SANDERS, 2003; SCHEUBLIN et al., 2004; VANDENKOORNHUYSE et al., 2002, 2003); além disso, a eficiência da simbiose em termos de contribuição para o crescimento vegetal pode variar em função tanto da espécie fúngica como da espécie vegetal envolvidas na simbiose (SANTOS et al., 2008). Comunidades de plantas podem apresentar espécies com respostas diferenciadas tanto em relação aos fungos micorrízicos quanto às BFN, de forma que o efeito desses microrganismos sobre o crescimento vegetal e na estrutura da comunidade vegetal vai depender da especificidade e das características funcionais das espécies vegetais.

4. Utilização de espécies florestais em monocultivos, sistemas agroflorestais e na recuperação de áreas degradadas

A simbiose tripartite com BFN e FMA em espécies florestais tem ampla variabilidade para exploração econômica por seu próprio uso em monocultivos ou por sua inclusão em sistemas de manejo diversos com outras espécies nas agroflorestas, sistemas silvipastoris e na recuperação de áreas degradadas.

Embora espécies florestais compreendam predominantemente espécies arbóreas, encontram-se entre elas espécies com os mais diversos hábitos de crescimento, que possuem como principal característica a tolerância a condições de menor luminosidade, uma vez que o dossel formado pelas espécies arbóreas limita a entrada de luz nos extratos inferiores do ecossistema. Além do uso como madeira, as espécies florestais podem ser usadas como forrageiras, lenha, flora apícola, gomas, celulose e papel, alimentação humana, cercas vivas, produtos medicinais, aromáticos e fotoquímicos e adubação verde. Neste último caso, a maior concentração de N e de outros nutrientes nos tecidos, em virtude das simbioses com bactérias fixadoras de N2 e fungos micorrízicos, pode fornecer aporte ao solo de matéria orgânica de alta qualidade com baixa relação C:N e C:P, entre outros, aumentando a disponibilidade de nutrientes no solo que pode ser usada por outras espécies vegetais (consorciadas, em sucessão, rotação ou após incorporação dos resíduos vegetais) e também por organismos macro e microscópicos do solo, contribuindo para o aumento da biodiversidade. Alguns trabalhos têm confirmado que a presença de leguminosas arbóreas fixadoras de N2 em sistemas mistos de produção de eucalipto em área degradada ou pastos pode aumentar os estoques de carbono do solo (BALIEIRO et al., 2008; MACEDO et al., 2008; RESH et al., 2002) e, consequentemente, manter as reservas orgânicas de N e de outros nutrientes.

As simbioses de leguminosas com FMA e BFN estão entre as mais bem estudadas, em função dos benefícios gerados. Tem sido demonstrado experimentalmente que plantas que vivem em simbiose mutualística com BFN e FMA apresentam vantagens na colonização de áreas degradadas. A simbiose resulta no surgimento de propriedades emergentes na planta hospedeira, que no caso de leguminosas, BFN e FMA, confere às plantas autossuficiência em nitrogênio e maior capacidade de absorver nutrientes e água, o que a torna uma espécie melhor colonizadora. Essa combinação enriquece o solo com a deposição de matéria orgânica permitindo que espécies não leguminosas possam se estabelecer, facilitando assim o recrutamento mais rápido de espécies da flora local. Vários trabalhos têm demonstrado os benefícios que essas espécies trazem sobre a capacidade de regeneração de áreas severamente impactadas pela ação antrópica (CHADA et al., 2004; DOMMERGUES et al., 1999; FRANCO; FARIA, 1997; HERRERA et al., 1993; PARROTA; KNOWLES, 1999; REIS, 2006) e a estabilidade dos ecossistemas (HEIJDEN et al., 1998; MAHERALI; KLIRONOMOS, 2007).

Com relação à recuperação de áreas degradadas, a demanda por técnicas de revegetação1 e recomposição ambiental2 de terras impactadas pela ação antrópica tem crescido nos últimos anos. Essa demanda reflete a maior conscientização da sociedade, em geral, da necessidade de conservação dos recursos naturais com vista à sustentabilidade dos ecossistemas. Além disso, indica a expansão e intensificação de atividades agrícolas, pecuária e da exploração mineral. Por razões diversas, sejam éticas, profissionais e também por força da lei (Lei nº 6.938/81 da Política Nacional de Meio Ambiente, regulamentada pelo Decreto nº 99.274/90), a revegetação, por meio de reflorestamento, e a recomposição ambiental têm sido algumas das demandas prioritárias para a continuidade da exploração mineral a qual sempre resulta em impactos marcantes no meio ambiente, podendo levar a perdas significativas da biodiversidade local.

É importante e necessário desenvolver tecnologias para a recuperação e conservação da biodiversidade. Para alcançar esses objetivos, é imprescindível o conhecimento do papel dos processos biológicos, dentre eles os que permitam a coexistência das espécies vegetais e dos microrganismos. A funcionalidade e a estabilidade dos ecossistemas terrestres são determinadas pela biodiversidade de plantas e de outros organismos micro e macroscópicos, pela ciclagem de nutrientes e pelo fluxo de energia. Entretanto, os mecanismos que regem a dinâmica dessas comunidades nos ecossistemas ainda não são completamente compreendidos (HEIJDEN et al., 1998). Um entendimento maior dos mecanismos determinantes da diversidade vegetal possibilitará também a adoção de práticas mais eficazes de revegetação de áreas degradadas e recomposição ambiental, seja por ações antrópicas ou por causas naturais.

5. Levantamento da capacidade de estabelecer simbiose com BFN em espécies de leguminosas

Allen e Allen (1981) e Graham (1976) já alertavam para o fato de que a capacidade de nodular só era conhecida em 12% a 15% das cerca de 20.000 espécies da família Leguminosae, e que a maioria das espécies sem informação era leguminosa arbórea tropical. Hoje, apesar de diversos trabalhos e de levantamento intensivos terem sido realizados, principalmente no Brasil (BARBERI et al., 1998; BONETTI et al., 1984; FARIA; LIMA, 1998; FARIA et al., 1984, 1987, 1989; MAGALHÃES et al., 1982; MAGALHÃES; FERNANDES, 1984; MAGALHÃES; SILVA, 1986; MOREIRA et al., 1992; SOUZA et al., 1994; SYLVESTER-BRADLEY et al., 1980), essa característica ainda é desconhecida para cerca de 75% das espécies da família (SPRENT, 2001). Portanto, ainda existe um campo vasto para novas descobertas. Além de informações sobre a capacidade de nodular e consequentemente seu potencial para a FBN, os levantamentos permitem a coleta de nódulos, o isolamento, a coleção e a avaliação da diversidade de bactérias nodulíferas fixadoras de N2 para fins posteriores de seleção para obtenção de inoculantes.

O levantamento da capacidade de fixação biológica de nitrogênio das espécies leguminosas pode ser realizado no campo e em condições de viveiro.

No campo, cada coleta de nódulos e/ou sementes deve ser acompanhada por uma ficha com o maior número possível de informações sobre características diversas (nome vulgar ou científico da espécie vegetal, tipo de solo, local, etc.), pois essas serão muito importantes, não só para análise posterior dos dados de nodulação como também para experimentos de seleção de estirpes, principalmente para espécies altamente específicas ou até mesmo para verificar o grau de promiscuidade das mesmas. Todas as plantas investigadas devem ser coletadas secas e armazenadas em um herbário para a correta identificação botânica e para a constatação de futuras dúvidas (FARIA et al., 1984; MAGALHÃES; SILVA, 1986; MOREIRA, 2008a).

5.1. Análise de mudas, ervas e árvores no campo

No campo é mais fácil a análise de mudas ou ervas, pois seu sistema radicular inteiro pode ser removido escavando em torno delas cuidadosamente e afofando o solo para evitar que os nódulos sejam removidos das raízes acidentalmente.

O sistema radicular de indivíduos adultos deve ser analisado retirando cuidadosamente o solo ao redor de uma raiz que esteja inserida no tronco principal. Esse procedimento deve ser realizado até as ramificações mais finas dessa raiz, onde normalmente ocorrem os nódulos. Como na floresta raízes de várias espécies entrelaçam-se, mesmo rente ao tronco de cada árvore, essa análise deve ser cuidadosa para que a procedência dos nódulos seja confirmada. Esse procedimento é bastante demorado e laborioso, mas compensa, pois permite, a partir do isolamento das bactérias dos nódulos encontrados, a obtenção de estirpes que nodulam aquela espécie hospedeira nas condições climáticas e edáficas locais e que, portanto, estão potencialmente mais adaptadas a elas.

Cada nódulo deve ser coletado contendo um pedaço de 0,5 cm a 1 cm da raiz onde está inserido para facilitar sua manipulação com os instrumentos durante as etapas de isolamento das bactérias de seu interior, pois o contato direto dos instrumentos com o nódulo pode danificá-lo e comprometer o isolamento.

No campo, a eficiência dos nódulos pode ser analisada pela presença da leghemoglobina que confere uma cor avermelhada a rósea ao interior dos mesmos, com a desvantagem que uma vez cortados os nódulos não poderão ser utilizados para isolamento de BFN. Alternativa e/ou concomitantemente em outros nódulos, pode se analisar a eficiência da atividade da nitrogenase em reduzir o acetileno, embora seja mais laboriosa e demorada. O acetileno pode ser produzido num recipiente de vidro com tampa de borracha flexível como uma mamadeira ou um kitasato acoplado a uma câmara de borracha de bola, colocam-se pedras de carbureto no interior, fecha-se o recipiente, e, com a ajuda de uma seringa, introduzem-se lentamente gotas de água. O acetileno se formará, e o excesso deve ser evitado com a permanência somente da agulha na tampa, ou, no caso da câmara, interrompendo a entrada de água quando ela estiver suficientemente inflada (MOREIRA, 2008a; MOREIRA; PEREIRA, 2001). Os nódulos são colocados em vidros hermeticamente fechados e 10% (V:V) de acetileno injetado nos mesmos. Após um período de incubação determinado, geralmente 1 hora, uma amostra gasosa é retirada e guardada num vacutainer para posterior análise por cromatografia gasosa da presença de etileno resultante da redução do acetileno pela nitrogenase (DILWORTH, 1966).

Após análise da presença e atividade, e antes de serem colocados em frascos contendo sílica gel ou cloreto de cálcio anidro como dessecante, os nódulos devem ser lavados para remoção das partículas de solo e de outros detritos, e o excesso de água removido com papel toalha. A sílica gel e o cloreto de cálcio anidro promovem o dessecamento dos nódulos evitando que apodreçam durante o período de armazenamento desde a coleta até o isolamento no laboratório. A sílica gel geralmente traz um indicador de umidade que a torna azul sem umidade e rosa com umidade. Sem indicador sua cor é esbranquiçada. O cloreto de cálcio anidro, quando sob excesso de umidade, torna-se leitoso. Assim, deve-se verificar o estado do dessecante antes de colocar o nódulo no vidro de armazenamento, pois se o dessecante já estiver com excesso de umidade não será efetivo. Os vidros devem ser hermeticamente fechados para evitar a entrada de umidade. É importante salientar que os nódulos não devem entrar em contato direto com esses produtos, porém eles podem ser embrulhados em papel poroso e acondicionados nos recipientes ou pode-se colocar algodão sobre o dessecante separando-o do(s) nódulo(s). Esses procedimentos aumentarão e manterão a viabilidade das bactérias até o momento do isolamento em laboratório. Deve-se proceder ao isolamento logo após o retorno ao laboratório, pois a viabilidade pode diminuir durante longos períodos de armazenamento. O isolamento é realizado em meio 79 sólido (FRED; WAKSMAN, 1928), também conhecido como YMA (VINCENT, 1970), após desinfestação superficial com hipoclorito de Ca ou de Na ou peróxido de hidrogênio (H2O2) e lavagem com água estéril. O tempo de exposição ao desinfetante é variável dependendo do tamanho do nódulo e da camada externa de células suberificadas que constituem a periderme, ou seja, quanto maior e mais suberificado, maior o tempo. Após o isolamento, as bactérias são estocadas para posterior uso em experimentos diversos. A estocagem pode ser em meio 79 sólido em tubos. Após crescimento das bactérias até a fase log, as culturas podem ser cobertas com óleo mineral esterilizado, ou, caso os tubos tenham tampas rosqueáveis que os mantenham hermeticamente fechados, o óleo mineral é dispensável. Outros métodos mais eficazes para preservar as culturas são a liofilização e o armazenamento em ultrafreezer a -80 ºC.

5.2. Análise de mudas no viveiro

Geralmente é muito difícil encontrar nódulos em sistemas em clímax como florestas (MOREIRA et al., 1992). Nesse caso, quando há disponibilidade de sementes, essas podem ser coletadas e plantadas em substrato livre de nitrogênio na forma combinada mineral ou orgânica. Todos os demais nutrientes devem estar em teores adequados no substrato para evitar que fatores limitantes inibam o crescimento das plantas e consequentemente a nodulação. O uso de esterco, comum na produção de mudas florestais, deve ser evitado, pois seu teor de nitrogênio inibe a nodulação. Métodos de desinfestação do substrato como o uso de brometo de metila também devem ser evitados, pois resíduos desse produto são tóxicos às BFN. Esse substrato pode ser inoculado com uma mistura de várias estirpes de rizóbio obtidas de espécies taxonomicamente próximas. O solo originário da área de coleta ou de outras áreas com tipos de solo e clima diversos pode também ser utilizado sem inoculação, quando se pretende obter, pelo isolamento dos nódulos, uma ampla diversidade de estirpes bacterianas compatíveis com aquela espécie (FARIA et al., 1984; MOREIRA, 1995, 1997; MOREIRA et al., 1992; MAGALHÃES; SILVA, 1986).

As sementes de várias espécies perdem a viabilidade rapidamente enquanto outras podem ser estocadas por longos períodos sem perda de viabilidade. Além disso, existem espécies cujas sementes necessitam de quebra de dormência para que possam germinar. Portanto, para cada espécie, tanto a viabilidade das sementes como a necessidade de quebra de dormência com tratamentos adequados devem ser verificadas. A quebra de dormência pode ser efetuada com imersão em ácido sulfúrico concentrado, água quente, ou por rompimento do tegumento por processos diversos, como pelo uso de uma lixa. Nesse caso, deve-se realizar o rompimento do tegumento longe do embrião para evitar que esse seja danificado. O uso do ácido sulfúrico dispensa a desinfestação com outras substâncias. Cada espécie tem tratamentos específicos que podem variar dependendo da condição de estocagem apenas com relação ao tempo de exposição. Por exemplo, estocagem em condições secas geralmente requer tempos maiores de exposição à água quente ou ao ácido sulfúrico. O sistema radicular das plantas deve ser analisado em torno de quatro meses ou mais após o plantio, dependendo da taxa de crescimento inerente de cada espécie. Após esse período, o sistema radicular é analisado, e, se houver nódulos, eles são retirados e levados ao laboratório para isolamento e estocagem das bactérias de acordo com os procedimentos descritos anteriormente.

6. Aplicações biotecnológicas

O estabelecimento, o desenvolvimento, a sobrevivência e a taxa de aquisição de nutrientes pelas plantas dependem, muitas vezes, da sua simbiose com os microrganismos eficientes. A existência de diferentes níveis de especificidade/promiscuidade na simbiose de espécies vegetais e BFN, além de variabilidade quanto à eficiência, requer que se faça a seleção das bactérias nodulíferas mais eficientes na fixação de nitrogênio para cada espécie. Para os FMA, não ocorre uma seletividade preferencial entre planta, ambiente e o fungo, podendo a planta ser colonizada simultaneamente por diversas espécies de FMA. No entanto, mesmo para leguminosas promíscuas, determinadas estirpes de BFN podem se sobressair quanto à eficiência nas condições de campo (LACERDA et al., 2004; SOARES et al., 2006), e espécies de FMA podem exibir maior eficiência com determinadas espécies (SANTOS et al., 2008). Portanto, o entendimento das interações desses microrganismos com espécies em condições ambientais determinadas assume destaque no manejo dessas simbioses.

6.1. Especificidade e promiscuidade hospedeira de leguminosas com rizóbio

Em condições naturais, as espécies e gêneros de leguminosas são noduladas por estirpes, espécies e até gêneros diferentes (MOREIRA, 2008a, 2008b), podendo essa diversidade ocorrer até num mesmo nódulo. Essa variabilidade pode se refletir na eficiência do processo da FBN, de ineficiente até altamente eficiente (LIMA et al., 2009), que será resultante da interação e contribuição das diversas estirpes. A seleção de estirpes de bactérias compatíveis com a espécie vegetal, altamente eficientes, competitivas e adaptadas a condições edáficas e climáticas, para inoculação no ato do plantio, assegura que os nódulos formados pela planta serão das bactérias desejáveis, e que a FBN será maximizada.

Em experimentos de inoculação e de avaliação da especificidade hospedeira de espécies florestais realizados na Embrapa Agrobiologia desde a década de 1960 observa-se que determinadas tribos da família são muito específicas quanto à estirpe de rizóbio, enquanto outras são muito promíscuas em relação a essas bactérias (CAMPELO; DÖBEREINER, 1969; FARIA et al., 1999). No primeiro caso, tem-se detectado que as espécies da tribo Mimoseae só nodulam com bactérias isoladas do mesmo gênero, enquanto que, no segundo caso, as espécies da tribo Phaseoleae nodulam eficientemente com a maioria dos isolados de toda a família. Ainda, observa-se que algumas bactérias são capazes de nodular, eficientemente, várias espécies da família de onde foram isoladas, de outros gêneros, tribos e até de outras subfamílias. Ou seja, a promiscuidade ou a especificidade podem ocorrer tanto na espécie vegetal como na BFN. Um exemplo extremo de especificidade é de Sesbania virgata com Azorhizobium doebereinerae, tanto do ponto de vista do hospedeiro como da BFN. Nesse caso, todas as estirpes homólogas, i. e., que são oriundas de nódulos da mesma espécie onde estão sendo testadas, têm alta eficiência com seu hospedeiro (GONÇALVES; MOREIRA, 2004).

No caso das espécies arbóreas, a maioria das respostas obtidas à inoculação de estirpes foi observada em casa de vegetação ou em viveiro de produção de mudas, e poucos estudos demonstram um efeito significativamente no campo durante vários anos. Isso acontece em virtude do longo tempo requerido para obtenção de respostas no caso dessas espécies. Todavia, em áreas como as de mineração, onde o substrato é geralmente desprovido de matéria orgânica, os efeitos da inoculação são muito significativos porque não existem bactérias que possam competir com as inoculadas. Resultados positivos e significativos da inoculação também são disponíveis para a sobrevivência de mudas no campo. Estudos sobre a competição entre estirpes naturais e inoculadas, e sobre sua sobrevivência com o passar do tempo em campo, devem ser incentivados no Brasil para uma melhor avaliação do potencial da inoculação das bactérias em diferentes condições edafoclimáticas. A seleção de estirpes de BFN selecionadas para espécies florestais tem sido realizada predominantemente pela Embrapa Agrobiologia. Muitas delas já são aprovadas como inoculantes pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) (Tabela 1). Porém, considerando que parcela significativa das cerca de 2.000 espécies de leguminosas nativas é espécie florestal, ainda existe um vasto campo para pesquisas futuras nessa área.

Tabela 1. Identificação referencial das estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio autorizadas pelo Mapa
(IN no 5 de 6/8/2004) para produção de inoculantes para leguminosas florestais no Brasil.

Espécie de leguminosa

Designação
Semia

Designação original

Base de recomendação(1) – Instituição

Identificação (no acesso Genbank ou EMBL)

Referências

Acacia angustissima

6429

6430

BR3629

BR3630

III - Embrapa Agrobiologia

n.d. Mesorhizobium amorphae (FJ025124)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Menna et al. (2006)

A. auriculiformis

6387

6391

BR3609

BR3624

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii et al. (AY904778)

Bradyrhizobium elkanii et al. (AY904780)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

A. farnesiana

6430

6436

BR3630

BR9002

III - Embrapa Agrobiologia

Mesorhizobium amorphae (FJ025124)

Burkholderia sp.

Faria (2002), Faria e Guedes (1999) e Menna et al. (2006)

A. mangium

6387

6420

BR3609

BR 3617

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii et al. (AY904778)

B. elkanii (M55490) (AY904786)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

A. mearnsii (syn. A. decurrens)

6164

6390

BR3608

BR3614(2)

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium japonicum (AY904765)

Burkholderia sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

A. podalyriifolia

6388

6389

BR3611

BR3612

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii

B. elkanii (FJ025113)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

A. salicina

6392

6400

BR3804

BR5005

III - Embrapa Agrobiologia

Mesorhizobium plurifarium (Y14159)

Bradyrhizobium elkanii (FJ025114)

De-Lajudie et al. (1998), Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

A. saligna

6096

6428

BR8601

BR3628

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (FJ025115)

Bradyrhizobium elkanii (FJ025116)

Faria (1997), Faria e Guedes (1998), Faria e Mello (1998) e Menna et al. (2006)

Acosmium nitens

6443

6444

BR4901

BR4902

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium sp. (FJ390932)

n.d

Faria (2002), Faria e Guedes (1999) e Menna et al. (2006)

Albizia lebbeck

6160

6432

BR5610

Br5611

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (AY904762)

Bradyrhizobium elkanii (M55490)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

Balizia pedicellaris

6396

6408

BR6816

BR6815

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium japonicum (FJ025099)

Rhizobium sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

Bowdichia virgilioides

6096

6414

BR8603(2)

BR8604(2)

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), e Faria e Mello (1998)

C. surinamensis

6395

6423

BR4301

BR4302

BR4303(2)

II - Embrapa Agrobiologia

Rhizobium sp.

Rhizobium sp. ((FJ025132)

Rhizobium sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

Chamaecrista ensiformis

6392

BR3804

II - Embrapa Agrobiologia

Mesorhizobium plurifarium (Y14159)

De-Lajudie et al. (1998), Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

Clitoria fairchildiana

6411

6412

BR8007(2)

BR8008(2)

III - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia sp. (baseado em estirpes homólogas)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira (2001)

Dalbergia nigra

6413

6101

BR8402

BR8404

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii

Bradyrhizobium elkanii (M55490)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

Dimorphandra jorgei

6099

6400

BR5004

BR5005

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (FJ3903941)

Bradyrhizobium elkanii (FJ025114)

Faria (1997), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

Enterolobium contortisiliquum

6159

6397?

BR4406

BR4407(2)

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (AJ003235)

Bradyrhizobium elkanii

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

E. cyclocarpum

6159

6403

BR4406

BR6205

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (AJ003235)

Bradyrhizobium elkanii (FJ0251120)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

E. timbouva

6159

6397

BR4406

BR4407

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (AJ003235)

Bradyrhizobium elkanii et al. (FJ025139)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

Erythrina poeppigiana

6388

6426

BR3611

BR3696

Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium japonicum

Moreira et al. (1993)

E. speciosa

6393

6395

BR4101

BR4301

II - Embrapa Agrobiologia

Ochrobactrum sp.

Rhizobium sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Moreira (2001) e Moreira et al. (1993, 1998)

E. verna

6388

6100

BR3611

BR5609

III - Embrapa Agrobiologia

Rhizobium sp.

Bradyrhizobium elkanii (M55490)

Faria (2002), Faria e Guedes (1999), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

Falcataria moluccana (syn. Paraserianthes facataria, Albizia falcata)

6100

6432

6169

BR5609

BR5611

BR5612

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (M55490)

Bradyrhizobium elkanii (M55490)

Bradyrhizobium elkanii (FJ025110)

Faria (1997, 2000), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

Gliricidia sepium

6168

6435

BR8801

BR8802

III - Embrapa Agrobiologia

Rhizobium leguminosarum (AJ003239)

Rhizobium leguminosarum

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

Inga marginata

6433

6434

BR6609

BR 6610

III - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium sp. (FJ025105)

Bradyrhizobium elkanii (FJ390934)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Leucaena diversifolia

6153

6164

BR827(2)

BR3608(2)

III - Embrapa Agrobiologia

Ensifer (Sinorhizobium) fredii (X67231)

Bradyrhizobium japonicum

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

L. leucocephala var. k72, k8, Peru

6153

6069

BR827

BR814(2)

III - Embrapa Agrobiologia

Ensifer (Sinorhizobium) fredii (X67231)

Rhizobium sp. (D12788)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

L. leucocephala

var. cunningham

6069

6070

DF-10/BR814

BR801

III - Embrapa Cerrados e Agrobiologia

Rhizobium sp. (D12788)

Ensifer (Sinorhizobium) fredii (X67231)

Moreira et al. (1993, 1998)

Lonchocarpus costatus

6399

6404

BR6009

BR6010

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium elkanii (AJ003235)

Bradyrhizobium elkanii

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

Melanoxylon brauna

6381

BR3901

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium japonicum

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993)

Mimosa acutistipula

6383

6384

BR3407

BR3446

III - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia sabiae (AY773186)

Burkholderia sp.

Chen et al. (2005, 2008), Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

M. bimucromanata

6386

6421

BR3460

BR3461

II - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia gladioli

Burkholderia nodosa (AY533861)

Chen et al. (2007) e Faria (1997)

M. caesalpiniifolia

6382

6410

BR3405

BR3451

III - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia sabiae (AY773185)

Burkholderia sp.

Chen et al. (2008), Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

M. flocculosa

6417

6422

BR3462

BR3463

II - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia sp.

Burkholderia sp.

Chen et al. (2005) e Faria (1997)

M. scabrella

6165

BR3454

III - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia mimosarum (AY533860)

Chen et al. (2006), Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Ormosia nítida

6393

6394

BR4101

BR4103

II - Embrapa Agrobiologia

Ochrobactrum sp.

Burkholderia sp.

Moreira (2001)

P. pterosperma

6415

6416?

BR9001

BR9004(2)

II - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia sp.

Burkholderia sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Parapiptadenia rígida

6153?

6416

BR827

BR9002(2)

II - Embrapa Agrobiologia

Ensifer (Sinorhizobium) fredii (X67231)

Burkholderia sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993, 1998)

Piptadenia gonoacantha

6385 (= 6167)

6398

BR3452

UFC-832.55/ BR4812

III - Embrapa Agrobiologia

Burkholderia

Burkholderia sp.

Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Pithecellobium tortum

6406

6407

BR6812

BR6813

II - Embrapa Agrobiologia

Rhizobium etli (FJ025116)

Methylobacterium

Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Poecilanthe parviflora

6403

BR8205

II - Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium japonicum (FJ025112)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

Prosopis juliflora

6161

6162

BR4002

UFC-933.52/BR4007

III - Embrapa Agrobiologia

Ensifer (Sinorhizobium) sp. (AY904763)

Ensifer (Sinorhizobium) sp. (X90810)

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993, 1998)

Pseudosamanea (syn. Albizia) guachapele

6403

6409

BR6205

BR6821

III - Embrapa Agrobiologia

B. elkanii

n.d

Faria (1997), Faria e Guedes (1999) e Faria e Mello (1998)

Samanea saman

6403

6405

BR6205

BR6212

III - Embrapa Agrobiologia

B. elkanii

B. elkanii (FJ025109)

Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998), Menna et al. (2006) e Moreira et al. (1993)

Sclerolobium paniculatum

6420

6413

BR3617

BR8402(2)

III - Embrapa Agrobiologia

B. elkanii (M55490)

B. elkanii

Faria (1997), Faria e Guedes (1999), Faria e Mello (1998) e Moreira et al. (1993)

Sesbania virgata

6401

6402

Sm 1/BR5401

Sm 5/BR5404

II - Embrapa Agrobiologia

Azorhizobium doebereinerae

(AJ003237) (AY626222)

Faria (1997), Gonçalves e Moreira (2004) e Moreira et al. (1993, 1998, 2006)

Tipuana tipu

6192

Semia 6192

II - Fepagro/UFRGS

Bradyrhizobium sp. (AY904772)

Menna et al. (2006)

(1) I - Em tubos; II - Vasos de Leonard; III - Vasos com solo; IV - Experimentos de campo; (2)estirpes que não constam da IN e/ou código Semia
não confere, mas cuja recomendação é corroborada pelo(s) trabalho(s) indicado(s).

6.2. Seleção de estirpes de rizóbio de alta eficiência na FBN

A seleção de estirpes eficientes para maximizar a FBN em espécies vegetais de importância econômica tem sido um dos principais alvos da pesquisa. A obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na FBN é um processo lento que requer tempo para sua conclusão; às vezes, dependendo da espécie, são necessários anos de experimentação até se chegar a uma indicação que ainda poderá ser melhorada com a obtenção de novas estirpes de bactérias que substituirão as previamente selecionadas, ou que estarão mais adaptadas a outras condições climáticas e edáficas. Além da alta eficiência, essas estirpes devem apresentar outras características, como serem boas competidoras por sítios de infecção em relação às populações de estirpes nativas e ter boa sobrevivência e adaptação às condições edáficas e climáticas onde serão introduzidas. O processo de seleção de estirpes para determinada espécie vegetal envolve em geral quatro estádios, sendo os dois primeiros em condições axênicas e os dois últimos em solo, cada um desses se constitui na base de recomendação de estirpe (Tabela 1).

6.2.1. Condições gerais dos quatro estádios

Em todos os estádios de seleção de estirpes são adicionados três tratamentos controle, sendo dois sem inoculação: (1) sem nitrogênio mineral e outro (2) com nitrogênio mineral. O terceiro controle (3) é inoculado com estirpe eficiente previamente selecionada (autorizada pelo Mapa) para a espécie (Tabela 1) e/ou com estirpe capaz de nodular a espécie. A inclusão do tratamento controle (3) é opcional, pois dependendo da espécie, estirpe(s) já selecionada(s) e/ou que a nodulem podem não ser disponíveis em nenhuma coleção. No entanto, deve-se ressaltar que é obrigatória a inclusão de estirpe autorizada pelo Mapa se ela for disponível.

O primeiro controle visa verificar se as condições de assepsia foram adequadas e, consequentemente, a ausência de contaminação no experimento, principalmente com outras BFN que não as testadas. Caso ocorram nódulos nesse controle, o experimento está perdido, e seus resultados não devem ser considerados. O segundo e o terceiro controle servem como referência para verificar o grau de eficiência da estirpe (o grau de eficiência também pode ser comparado ao controle 1) e também indicam se as condições experimentais foram adequadas para expressão da nodulação e fixação biológica de N2 e do crescimento vegetal. Todos os tratamentos devem ter no mínimo três repetições e satisfazer as condições para análise estatística adequada (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

O controle com nitrogênio mineral pode recebê-lo sob diferentes formas (NH4NO3, KNO3 e NH4SO4), porque as espécies respondem diferentemente ao nitrato ou ao amônio.

As bactérias são colocadas para crescer em meio de cultura 79 semissólido ou líquido (FRED; WAKSMAN, 1928) e inoculadas junto às sementes no ato do plantio.

As sementes, quando ortodoxas, são escarificadas como mencionado anteriormente. Depois são esterilizadas superficialmente com peróxido de hidrogênio por cerca de quatro minutos ou com hipoclorito de sódio, lavadas abundantemente com água estéril e colocadas para germinar em papel filtro e algodão dentro de placas de Petri, previamente esterilizadas. Posteriormente são acondicionadas em câmara de germinação.

As soluções nutritivas podem ser de Jensen, Norris (VINCENT, 1970), Hoagland e Arnon (1938) ou outras.

6.2.2. Ensaios em condições axênicas

No primeiro estádio é verificada em câmara de crescimento (condições ótimas e controladas de temperatura, umidade, luminosidade e nutrientes) a capacidade de nodular e fixar nitrogênio de um número elevado de estirpes, testadas separadamente em recipientes menores (sacos plásticos, tubos, ou outros tipos de frascos de vidro autoclaváveis) com solução nutritiva livre de nitrogênio na forma mineral, com ou sem ágar em condições estéreis. Esse estádio visa principalmente à autenticação de isolados, ou seja, a confirmação de que são capazes de nodular a espécie de onde foram isolados. Essa etapa é fundamental, uma vez que dentro do nódulo podem ocorrer organismos endofíticos não nodulíferos ou pode também ocorrer contaminação durante o processo de isolamento. Esse procedimento também pode ser aplicado como estádio inicial na seleção para outra espécie que não a de origem. A recomendação de estirpes com base neste estádio é raramente usada. A autenticação dos isolados na espécie de origem é preferível. No entanto, muitas vezes não há disponibilidade de sementes dessa espécie, ou as suas sementes perdem a viabilidade rapidamente ou são difíceis de serem manipuladas (muito grandes e/ou de difícil desinfestação superficial) e, portanto, não poderão ser avaliadas neste estádio e no estádio posterior. Nesse caso, utiliza-se espécie de leguminosa promíscua em relação à BFN, como o siratro (Macroptilium atropurpureum), que é fácil de manipular em condições controladas e tem muita disponibilidade de sementes. Nem sempre os resultados com espécie promíscua no lugar da de origem são conclusivos, uma vez que apesar de promíscuas, espécies como o siratro não são universais, isto é, não nodulam com todas as estirpes de BFN. No entanto, se os isolados nodularem, é obtida a confirmação se são BFN. Informação qualitativa sobre a eficiência do isolado na espécie alvo, caso seja a mesma de origem, poderá ser obtida por meio do teste de atividade da nitrogenase realizado no campo e mencionado anteriormente.

No segundo estádio, para a base de recomendação II, os tratamentos são constituídos das estirpes de bactérias que foram autenticadas ou confirmadas como nodulíferas no hospedeiro alvo na fase anterior e são testadas em recipientes maiores com solução nutritiva sem N-mineral ou com pequena dose de “arranque”, contendo ou não mistura de areia mais vermiculita, ou outro suporte esterilizado (e.g. vasos de Leonard) em casa de vegetação. Esse tipo de recipiente permite maior crescimento e evidencia melhor as diferenças entre os tratamentos, o que nem sempre pode ocorrer no estádio anterior. O delineamento experimental é, em geral, de blocos casualizados, com três ou mais repetições, dependendo da disponibilidade de sementes.

Os vasos de Leonard são preparados com uma mistura de areia e vermiculita na proporção de 2:1 (v:v) e depois esterilizados em autoclave (VINCENT, 1970).

A colheita das plantas é realizada, entre 3 e 4 meses (em geral) ou mais após o plantio, quando elas apresentarem diferenças entre os tratamentos. Os seguintes parâmetros são avaliados: peso da parte aérea seca e número e peso dos nódulos secos. Os teores de nitrogênio e de clorofila nas folhas também podem ser analisados. Por meio desses parâmetros é possível confirmar se o isolado é realmente rizóbio e a eficiência de cada estirpe para a espécie alvo.

Estirpes que não tenham boa performance nos estádios 1 e 2 são eliminadas do processo de seleção para a espécie alvo, pois, se não estabelecem simbiose eficiente em condições nutricionais e ambientais adequadas, também não o farão nas condições estressantes do solo. No entanto, poderão ser utilizadas em testes com outras espécies vegetais.

6.2.3. Ensaios em condições não esterilizadas no solo

Para o estabelecimento e funcionamento da simbiose entre BFN e leguminosas, além da compatibilidade entre elas, é necessário que elas estejam adaptadas a uma série de fatores físicos, químicos, biológicos e ambientais que são característicos da complexidade e dinâmica e heterogeneidade de cada um dos diversos tipos de solo e regiões. De modo geral, todos os fatores que interferem no desenvolvimento da planta e/ou da bactéria podem afetar direta ou indiretamente a simbiose e a eficiência de fixação do N2. Fatores relacionados com características genéticas de ambos os simbiontes, fatores edáficos (e.g. pH associado ou não à toxicidade por Al e Mn; teores de nutriente, teores de N mineral ou orgânico, teores de elementos tóxicos como metais pesados, defensivos agrícolas, umidade e salinidade, temperatura, práticas de manejo) podem alterar significativamente tanto o estabelecimento como o funcionamento da simbiose. Além dos fatores citados, as diversas comunidades biológicas, incluindo as comunidades de rizóbios nativos, podem exercer relações antagônicas ou benéficas diversas que influenciam marcantemente a simbiose (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Como já mencionado, estirpes que não apresentarem boa performance nas condições ótimas dos estádios 1 e 2 não apresentarão boa performance nas diversas condições limitantes do solo. Porém, nem todas as estirpes selecionadas nos estádios anteriores poderão apresentar a mesma eficiência sob condições edáficas.

Portanto, de posse dos resultados da seleção de estirpes na etapa anterior (em condições esterilizadas), são escolhidas cinco ou mais estirpes, dependendo da disponibilidade de recursos do laboratório, de melhor desempenho na promoção do crescimento da espécie alvo para esta etapa que envolve os testes com solo. O objetivo desses experimentos, em solo, é então conhecer se os isolados são competitivos com as estirpes de rizóbios presentes no solo e se estão adaptados às condições físicas, químicas e biológicas características desse solo.

No estádio 3, vasos de polietileno de capacidade de 4 kg aproximadamente, dependendo da espécie, são preenchidos com camada de solo superficial de 0 cm a 20 cm de preferência do local onde será realizado o teste de campo (estádio 4). Nesse solo é feita a calagem e adubação conforme as recomendações das análises de fertilidade (baseadas nas exigências nutricionais da espécie, se for conhecida, ou, se não, nas exigências da cultura do feijoeiro). No caso de espécies florestais cuja adubação não seja economicamente viável, deve-se adubar nas mesmas condições do manejo comumente adotado. Os procedimentos adotados para as condições esterilizadas são os mesmos para esta fase, como o crescimento das culturas de bactérias, inoculação, preparação das sementes, colheita e os parâmetros avaliados. Assim como em vasos de Leonard, semanalmente é feita a aplicação de nitrogênio nos controles nitrogenados.

A eficiência da estirpe inoculada é avaliada pelo crescimento inicial da planta comparando-a com os dois controles (sem e com N-mineral). De posse dos resultados de massa seca da parte aérea ou massa de nódulos seca dos tratamentos, determinam-se a eficiência e a eficácia de cada estirpe testada. A eficiência se refere à contribuição da estirpe para o parâmetro avaliado (massa da parte aérea seca ou N total acumulado na biomassa) em relação ao tratamento não inoculado (controle absoluto). E a eficácia mostra o desempenho da estirpe para o parâmetro avaliado (massa da parte aérea seca ou N total acumulado na biomassa) comparado com o controle nitrogenado.

A avaliação de espécies arbóreas no estádio 4 é muito demorada, em virtude do longo tempo de desenvolvimento das mesmas; no entanto, um parâmetro comumente utilizado com sucesso para avaliar o benefício da inoculação neste estádio é a sobrevivência e o desenvolvimento das mudas inoculadas comparada às não inoculadas.

6.2.4. Fatores limitantes específicos de áreas de mineração

Especificamente em áreas de mineração, as restrições podem ser várias ao crescimento de bactérias e plantas. Pela própria natureza da exploração mineral, é nítido que a perda da estrutura original do solo leva a problemas relacionados à dinâmica de água e do ar do substrato exposto. Na maioria das vezes, esses impedimentos físicos podem ser contornados pela subsolagem, aplicação de camadas de top soil ou de resíduos orgânicos de diversas origens (CAMPELLO, 1998, FRANCO et al., 2001). Restrições de ordem química são muito comuns em áreas de mineração (BALIEIRO et al., 2005; DIAS, 1998; FRANCO et al., 2001; FORTES, 2000). Em algumas situações, como áreas de empréstimo e taludes, a baixa fertilidade e acidez excessiva são facilmente contornadas por meio da adição de corretivos, adubos e/ou resíduos orgânicos (FRANCO; FARIA, 1997; REIS, 2006); porém em outras, com problemas relacionados à oxidação de sulfetos como pirita, calcopirita e galena, muito comuns em áreas de mineração de ouro e carvão, a elevação da força iônica da solução e a solubilização de metais nocivos apresentam-se como fatores restritivos ao desenvolvimento e estabelecimento de plantas e microrganismos à área (DIAS, 1998). Embora alguns metais como Zn, Cu, Ni e Cr sejam essenciais ou benéficos às plantas e microrganismos, outros como Cd, Hg e Pb não possuem funções biológicas/fisiológicas conhecidas. Todos esses metais, no entanto, em menor ou maior escala, podem apresentar toxicidade aos microrganismos (DIAS-JÚNIOR et al., 1998; GADD, 1992; GILLER et al., 1989; LAKZIAN et al., 2007; MATSUDA et al., 2002a; PEREIRA et al., 2006; ZABALOY; GÓMEZ, 2005). No Brasil, importantes estudos visando à seleção de rizóbios eficientes na FBN e tolerantes a metais pesados para inoculação de leguminosas arbóreas com potencial para revegetação de áreas degradadas por mineração têm sido realizados (MATSUDA et al., 2002b).

Apesar dessas limitações sob certos tipos de mineração como a de bauxita, diversidade significativa de BFN e de fungos micorrízicos foram encontrados em áreas reabilitadas com vários tipos de revegetação (MELLONI et al., 2003, 2006), e alguns apresentaram alta eficiência em simbiose com espécies florestais (SANTOS et al., 2008), indicando que mesmo solos que passaram por períodos de estresse podem ser fonte de recursos genéticos com potencial para uso em inoculantes.

De forma quase que generalizada para as leguminosas herbáceas utilizadas nos agroecossistemas, há uma relação inversa entre a FBN e a disponibilidade de N do solo; esse efeito parece ser menos acentuado nas espécies arbóreas, que possuem aptidão diferenciada quanto ao uso do N do solo e do ar (BUSTAMANTE et al., 2004; SPRENT, 1993). De um modo geral, em áreas degradadas, o teor de matéria orgânica do solo é baixo e por consequência os de N também. Dessa forma, uma vez sanados os fatores restritivos ao desenvolvimento dos microssimbiontes e da planta, pode-se afirmar que a nodulação e a fixação biológica de N2 representarão ganhos ambientais indubitáveis à área.

6.2.5. Identificação de BFN

Até 1988, quando a espécie Azorhizobium caulinodans foi descrita, as espécies de BFN eram baseadas em estirpes que nodulavam leguminosas de grãos, principalmente de área temperadas. A partir da década de 1990 intensificou-se o estudo de estirpes oriundas de áreas tropicais e de espécies florestais. Nessa mesma década ocorreram avanços significativos da biologia molecular que revolucionaram a taxonomia bacteriana. O estudo das estirpes de espécies florestais no Brasil acompanhou esses avanços como pode se notar pelos trabalhos publicados relacionados na Tabela 1. Seis novas espécies foram descritas e aceitas pelo comitê de sistemática bacteriana: Mesorhizobium plurifarium, Mesorhizobium amorphae, Azorhizobium doebereinerae, Burkholderia mimosarum, Burkholderia sabiae e Burkholderia nodosa. Estas foram baseadas em estirpes nativas de solos brasileiros, incluindo inoculantes. Apesar desses resultados significativos, a maior parte da diversidade de BFN nativas ainda precisa ser desvendada.

6.2.6. Seleção de estirpes de rizóbio para espécies dependentes de fungos micorrízicos

É bem documentado o efeito da micorrização sobre a nodulação e o crescimento de plantas que não se desenvolvem bem em condições esterilizadas. Em geral são espécies dos gêneros Piptadenia, Parapiptadenia, Anadenanthera e algumas mimosas e acácias (FARIA, 1995; JESUS et al., 2005). Essas espécies mostram uma grande dependência a micorrizas para seu desenvolvimento e até para sua nodulação (JESUS et al., 2005; JESUS; FARIA, 2000, 2001) e podem também não responder a adubação nitrogenada (JESUS et al., 2005) como mostrado na Figura 3.

Figura 3. Mimosa scabrella cultivada em solo esterilizado e inoculada com Burkholderia nodosa BR 3437 (R) e fungos micorrízicos Glomus clarum e Gigaspora margarita (M): da esquerda para a direira: R+M; R; CN: controle com nitrogênio e CA: controle absoluto.
Foto: S. M. Faria

Para essas espécies que apresentam problemas de crescimento nas condições normais de seleção de estirpes em vasos de Leonard, são implantados experimentos com a presença de fungos micorrízicos arbusculares (FMA). O inoculante de FMA mais usado é constituído, normalmente, de esporos produzidos em condições assépticas das espécies Gigaspora margarita Becker & Hall e Glomus clarum Nicolson & Schenck.

Os experimentos são montados em geral no esquema fatorial com tratamentos adicionais, sendo o arranjo: 2 x 2+3. O delineamento experimental mais usado é de blocos casualizados, com três a cinco repetições, variando em função da disponibilidade de sementes. Os fatores são as estirpes de BFN e inoculação com FMAs. O fator estirpe de rizóbio é subdivido em dois níveis ou mais, de acordo com o número de estirpes de BFN testadas. O fator FMA se subdivide nos níveis presença e ausência de fungos micorrízicos, sendo que em alguns casos é testada mais do que uma estirpe de fungo. Os tratamentos adicionais são os controles com nitrogênio mineral, com nitrogênio mineral e FMA e controle absoluto. Um controle com adubo fosfatado também pode ser incluído.

Os experimentos são realizados em casa de vegetação em vasos de polietileno com 4 kg de solo e areia na proporção 1:1(v:v). O substrato é autoclavado em cubas de metal por 2 períodos de 2 horas cada. As sementes são desinfestadas em hipoclorito de sódio 0,5%, por 10 minutos, lavadas com água esterilizada até a remoção do desinfestante e pré-germinadas em bandejas com areia e vermiculita autoclavada. Após germinação, as sementes são transplantadas para os vasos. No centro de cada vaso são abertas pequenas covas que recebem, ao fundo, o inoculante contendo os fungos micorrízicos e onde são introduzidas as plântulas. Após a semeadura, é feita a inoculação com as bactérias, cerca de 1 mL de cultura na fase log/planta.

O controle com adição de nitrogênio mineral recebe, semanalmente, a aplicação de 10 mg de N inicialmente, e, dependendo do crescimento, a quantidade é aumentada sempre na forma de nitrato de amônio (NH4NO3) quando não se conhece a forma de N preferencial da espécie.

Os parâmetros avaliados nos experimentos são: massa da parte aérea seca, das raízes e dos nódulos, número de nódulos e colonização micorrízica. A colonização micorrízica é avaliada em amostras de raízes finas clarificadas e coradas, de acordo com o método utilizado por Koske e Gemma (1989), e a taxa de colonização micorrízica é estimada pelo método de interseção em placa quadriculada de Giovannetti e Mosse (1980).

6.3. Isolamento e seleção de fungos micorrízicos arbusculares (FMA)

Os FMA são biotróficos obrigatórios requerendo o estabelecimento de colonização com raízes de plantas compatíveis para que possam completar seu ciclo de vida. Em virtude dessa característica, todo o processo de isolamento em cultura pura e produção de inóculo são conduzidos com a utilização de plantas micotróficas/hospedeiras.

Culturas de FMA podem ser estabelecidas a partir de três tipos de propágulos: esporos, micélio e/ou fragmentos de raízes colonizadas. No entanto, a eficiência de cada tipo de propágulo varia com as espécies de fungo (SOUZA et al., 2005), sendo recomendada a utilização de solo, esporos e raízes como fonte de inóculo para isolamento de FMA de amostras ambientais. Os resultados obtidos com cada uma dessas fontes de inóculo, em geral, são diferentes. Assim, para recuperar com maior eficiência a diversidade de FMA de um ambiente, além de promover sua multiplicação, é recomendado o estabelecimento de culturas a partir dessas três fontes de propágulos separadamente. Culturas estabelecidas, utilizando solo, raízes e esporos coletados do ambiente, são denominadas culturas armadilha, e as espécies de plantas hospedeiras utilizadas são denominadas de plantas isca.

O cultivo armadilha deve ser estabelecido, de preferência, com duas ou mais espécies de plantas micotróficas de famílias distintas, como gramíneas (e.g. Brachiaria spp., Sorghum spp., Paspalum spp.) e leguminosas (e.g. Trevo-Lupinus spp., Siratro-Macroptilium atropurpureum; Estilosantes-Stylosanthes spp., caupi-Vigna unguiculata).

A duração do período de crescimento das culturas armadilha é variável e deve ser determinada experimentalmente. Em geral, períodos mínimos de quatro meses são necessários; no entanto, algumas espécies de FMA requerem períodos mais longos de 8 a 12 meses (BRUNDRETT et al., 1999a, 1999b). Após o período de crescimento, a rega dos vasos deve ser suspensa para que o substrato seque naturalmente, e as plantas morram. O substrato seco pode ser armazenado à temperatura ambiente à sombra por vários meses ou em câmara fria. Esporos de algumas espécies de FMA perdem (ex.: Gigaspora) a viabilidade após um ano de armazenamento, enquanto que outras apresentam dormência de 6 ou mais meses.

Culturas puras, contendo propágulos viáveis e ativos, devem ser utilizadas como fonte de inóculo para experimentos de seleção de estirpes eficientes. A resposta de uma determinada espécie de planta à inoculação com FMA varia em função do ambiente (tipo de solo, pH, nível e disponibilidade de nutrientes) e compatibilidade genética entre macro e microssimbionte. Os simbiontes devem ser selecionados em função do ambiente final onde serão utilizados. Exemplo, se as mudas inoculadas visam à revegetação de um substrato com características de elevada acidez, reduzida disponibilidade de nutrientes e textura pesada, os fungos devem ser selecionados em função dessas características visando a uma maior adaptação e, consequentemente, ao sucesso na colonização do ambiente. Combinações planta-fungo, com melhor desempenho em termos de produção de biomassa, são selecionadas. Para recomposição ambiental, é recomendada a inoculação de estirpes de FMA pertencentes a diferentes gêneros e famílias, visto que o recrutamento, a produtividade e a diversidade de sistemas vegetais mais complexos, em geral, são mais eficientes com o aumento da diversidade de FMA (HEIJDEN et al., 1998; MAHERALI; KLIRONOMOS, 2007).

A diversidade de BFN e FMA no Brasil e métodos para sua avaliação foram apresentados com detalhes recentemente (BAGYARAJ; STÜRMER, 2008; 2010; MOREIRA, 2008a, 2008b; 2010; SOUZA et al., 2008; STÜRMER; SIQUEIRA, 2008).

7. Considerações finais

Vários trabalhos sobre as simbioses de espécies florestais com BFN e FMA já foram realizados no Brasil. Esses trabalhos forneceram tanto informações básicas (e.g. ocorrência, identificação e diversidade), como aplicadas, resultando na disponibilização de estirpes inoculantes para cerca de 100 espécies de leguminosas. No entanto, considerando as cerca de 2.000 espécies nativas de leguminosas, uma diversidade ainda incalculável de espécies de BFN e FMA e suas possíveis combinações, nos diversos tipos de solo e biomas brasileiros, muitos estudos ainda têm que ser conduzidos para que se possa conhecer toda a diversidade de simbioses nativas, assim como seu potencial de utilização. Espera-se que os métodos aqui apresentados sejam úteis neste sentido.

Por outro lado, cerca de 99% de 25 milhões de doses de inoculante comercializadas no Brasil são para a cultura da soja, sendo insignificante seu uso em espécies florestais. O novo cenário emergente, que visa maximizar a contribuição dos processos biológicos nos sistemas de produção agrícola e florestal, economizando recursos e garantindo a segurança alimentar e preservação ambiental, certamente irá aumentar a utilização dessas espécies e suas simbioses com BFN e FMA em diversos sistemas de manejo e uso do solo.

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Capítulo 4
Análise de imagens para acompanhamento da nodulação em leguminosas

Mario de Andrade Lira Junior
Rinaldo Luiz Caraciolo Ferreira
Karina Patrícia Vieira da Cunha
Márcia do Vale Barreto Figueiredo

1. Introdução

1.1. Nodulação

A interação entre leguminosas e rizóbios é um exemplo de associação biológica intensamente estudada, cujos benefícios para a sustentabilidade agrícola são reconhecidos em virtude do processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) (XAVIER et al., 2006). Esse processo ocorre em nódulos radiculares induzidos pela infecção bacteriana (URIBE, 1994). Os nódulos e a planta hospedeira são perfeitamente interligados por meio de vasos xilemáticos e floemáticos e totalmente integrados em termos hormonais e nutricionais. O processo da FBN requer um suprimento contínuo de carboidratos que fornecem tanto a energia para a redução do nitrogênio quanto os esqueletos de carbono necessários à assimilação da amônia produzida, sendo relativamente intensivo em energia produzida na parte aérea da planta hospedeira (SILVEIRA et al., 2003).

O estabelecimento bacteriano na rizosfera é uma condição fundamental para que o microrganismo possa interagir com a planta. Além disso, é necessário que a bactéria se espalhe ao longo da raiz e não perca a capacidade de sobreviver e multiplicar-se de maneira competitiva em relação à comunidade nativa. A colonização radicular é um processo bastante complexo, pois diferentes microrganismos estão sujeitos a diversos fatores bióticos e abióticos (BENIZRI et al., 2001; FIGUEIREDO et al., 2008). A sobrevivência do rizóbio e nodulação é frequentemente ligada com a competição por substratos de carbono, produção de antibióticos, sideróforos ou substâncias estimuladoras do crescimento vegetal (RUMJANEK et al., 1995). Os sideróforos desempenham um papel fundamental na formação do nódulo (REIGH; O´CONNELL, 1993). A capacidade de produzir sideróforos parece ser mais difundida entre o gênero Rhizobium do que entre o gênero Bradyrhizobium, que evoluiu em solos ácidos, nos quais Fe está, normalmente, mais disponível (GUERINOT, 1994). Além disso, os rizóbios podem utilizar sideróforos de outros rizóbios, o que é chamado de sinergismo interestirpe, desde que possuam proteínas receptoras da membrana externa específica para o sideróforo em questão.

1.2. Nódulos indeterminados e determinados

Dependendo do sistema simbiótico, podemos encontrar dois tipos de nódulos: indeterminados e determinados, em função de sua origem no córtex interno ou externo. Ambos apresentam estrutura anatômica distinta e diferem na forma em que se comportam a bactéria no interior do nódulo em formação, embora a indução do ciclo celular em ambos os sistemas siga a mesma regulação. Nos nódulos indeterminados, que ocorrem em plantas dos gêneros Medicago, Pisum, Trifolium, Vicia, entre outras, são as células do córtex interior que reintroduzem a bactéria no ciclo celular, além de possuírem um meristema permanente, que lhe outorga uma forma cilíndrica com simetria radial na organização dos tecidos. Tem-se então uma zona central, na qual o rizóbio se instala e realiza a FBN (FOUCHER; KONDOROSI, 2000). Nos nódulos determinados, que ocorrem em plantas dos gêneros Phaseolus, Glycine, Vigna, Lotus, entre outras, não há um meristema permanente. Assim, seu crescimento se baseia na expansão em vez da divisão celular, razão pela qual apresentam uma morfologia esférica em vez de cilíndrica (HIRSCH, 1992).

1.3. Agentes sinalizadores

Resultados de experimentos têm mostrado a possibilidade de se obter incremento na nodulação, por exemplo, por meio do fornecimento de sinais (flavonoides) que podem ser adicionados aos inoculantes. Diversos benefícios agronômicos, como aumento significativo da nodulação de leguminosas e da capacidade competitiva dos rizóbios, podem ser alcançados pelo aumento quantitativo e/ou qualitativo dos indutores pelo hospedeiro (ALMARAZ et al., 2007; LIRA JUNIOR et al., 2003; MABOOD et al., 2006a, 2006b; POUSTINI et al., 2005). Para tanto, torna-se crucial um melhor entendimento de trocas de sinais moleculares na interação planta-microrganismos (ANTÓN, 2004).

O processo de infecção pelo rizóbio envolve diferentes sinalizadores entre a planta e a bactéria (TAÍZ; ZIEGER, 2004). Timmers et al. (1999) relatam que a bactéria noduladora migra em direção às raízes em função de uma resposta quimiostática. Essa resposta é decorrente da atração pelos isoflavonoides e betaínas secretadas pelas raízes. Esses compostos ativam enzimas que induzem a transcrição de genes nod, que codificam moléculas sinalizadoras de oligossacarídeos de lipoquitina, identificados após a secreção por receptores, como lecitinas especiais produzidas nos pêlos radiculares.

Quando as células dos pêlos radiculares reconhecem os fatores de nodulação (Nod), inicia-se o enrolamento dos mesmos. Com a evolução da infecção é formado um canal dentro do pelo radicular, e enquanto no periciclo é iniciado o rearranjo do citoesqueleto microtubular, na parte interna do córtex ocorre a ativação das células que se dividem formando um primórdio. Posteriormente, ocorre a infecção, localizada distanciadamente da área radicular ativada. A ativação celular se estende progressivamente para o meio e para a parte mais externa do córtex, seguindo gradientes de diferenciação celular, o que resulta na formação de um primórdio nodular (FAGAN et al., 2007). Os fatores nod são responsáveis, em baixa concentração, pela síntese de proteínas, denominadas nodulinas, que desempenham papel importante na formação e manutenção do nódulo radicular (ALMARAZ et al., 2007).

Outro mecanismo de troca de sinal é a secreção de proteínas pelo rizóbio. Desses mecanismos, os mais comuns são os de secreção tipo III, isto é, mecanismos de exportação de proteínas altamente conservados, em bactérias Gram negativas, que atravessam as membranas bacterianas, liberando as proteínas no citosol de células hospedeiras (SÜB et al., 2006). No caso rizobiano, recentemente, diversas proteínas têm sido identificadas como ligadas a esse sistema (SAAD et al., 2008). De modo geral, as funções dessas proteínas ainda não estão esclarecidas, visto que nem todas as estirpes apresentam esse sistema e que algumas mutações não afetam a nodulação enquanto outras têm efeitos deletérios (WASSEM et al., 2008).

Embora se conheça relativamente muito sobre genes dos rizóbios envolvidos na nodulação, pouco se sabe sobre os genes das leguminosas hospedeiras relacionados à simbiose. Nesse sentido, tem-se buscado identificar genes da planta envolvidos na nodulação (BUZAS; GRESSHOFF, 2007). Silverstein et al. (2006) encontraram novas famílias de genes em leguminosas, denominadas de proteínas ricas em glicina (GRP), prolina (PRP) e cisteina (CRP) que estão envolvidas, principalmente, na nodulação e proteção dos nódulos. Kuster et al. (2007) identificaram cerca de 100 genes das leguminosas que ativam diferentes estádios durante a simbiose com o rizóbio. Esses genes apresentam funções relacionadas à eficiência simbiótica, e entre elas a facilitação dos processos de transporte pelas membranas perissimbióticas, que cercam os bacteroides nos nódulos.

1.4. Avaliação da nodulação

Em razão das diferenças na habilidade nodulífera de leguminosas com estirpes nativas, a bioprospecção de rizóbios em solos locais pode fornecer subsídios sobre a eficiência da nodulação natural e da fixação de nitrogênio das espécies (SOUZA et al., 2007). Essas eficiências poderão ser avaliadas por meio de atividade da nitrogenase (HARDY et al., 1968); teor de ureídeos (HERRIDGE; PEOPLES, 1990); abundância natural 15N (BODDEY et al., 2001); teor de leghemoglobina (WILSON; REISENAUER, 1963); número e tamanho de nódulos; nodulação específica (GAN et al., 2004), assim como por meio das nodulinas (proteínas sintetizadas pelos nódulos) (FARNDEN; ROBERTSON, 1980). Esses diversos métodos têm sido utilizados para avaliar eficiência e eficácia das estirpes (FARIA; FRANCO, 2002), visando, eventualmente, à recomendação de estirpes para o uso na produção comercial de inoculantes. Uma característica comum da maioria desses métodos é ser baseado em métodos destrutivos, que não permitem, por exemplo, o acompanhamento de nódulos em uma mesma planta ao longo do tempo, como é possível por técnicas de análise de imagens (COSTA et al., 2006, 2007; LIRA JUNIOR et al., 2005), o que torna o desenvolvimento e aprimoramento dessas técnicas de grande valia.

2. Análise de imagens

Por muito tempo, as imagens foram utilizadas para simples documentação, descrição qualitativa e ilustração dos fenômenos observados pelos cientistas. Com o avanço tecnológico e a redução dos custos dos computadores, foram desenvolvidos sistemas de análise de imagem que representam, atualmente, um ponto de apoio a diversas áreas de estudo, como conservação de recursos naturais, manejo do solo e meteorologia; análises biomédicas, metalográficas e de anatomia vegetal (BOUMA et al., 2000; BRITO et al., 2004; COSTA et al., 2001; LIRA JUNIOR; SMITH, 2000; TEIXEIRA et al., 2006; VIEIRA JUNIOR et al., 2006). Algumas das maiores vantagens dessa análise estão na capacidade de diminuir a subjetividade da análise humana, de superar inconvenientes de análises manuais que são muitas vezes demoradas (BOUMA et al., 2000) e de permitir o armazenamento rápido das imagens antes da análise, seguido pelo processamento posterior em que o tempo pode ser menos limitante.

A análise de imagens tem como objetivo principal extrair informações úteis e relevantes para uma dada aplicação, expressando quantitativamente características específicas de objetos ou cenas de interesse dentro de uma imagem (VIEIRA JUNIOR et al., 2006). Essa possibilidade deve-se ao fato de as imagens digitais serem expressas como uma função matemática, após a digitalização de imagens contínuas (DOUGHERTY, 1994). As imagens digitais consistem em uma estrutura quadriculada formada por matrizes de números inteiros, e cada elemento dessas matrizes é composto por um pixel (picture element).

A partir da matriz de pixels da imagem, diversos tipos de processamento podem ser implementados por algoritmos computacionais, que são a base para a análise de imagens digitais, caracterizada pelo arquivamento de dados e/ou comparação de padrões (TEIXEIRA et al., 2006).

Um sistema de análise de imagem é constituído de diversas etapas que variam de acordo com seu objetivo imediato (Figura 1). A etapa de aquisição engloba a formação da imagem e sua digitalização, fornecendo como saída uma imagem digital. O processamento digital de imagem (PDI) consiste na etapa de pré-processamento, enquanto a análise digital de imagem (ADI) compreende etapas de segmentação, pós-processamento, extração de atributos, reconhecimento e classificação. No pré-processamento e na segmentação, opera-se sobre os pixels da imagem. No pós-processamento e na extração de atributos, os objetos são modificados e, em seguida, medidos. Na etapa de reconhecimento e classificação, são analisados os resultados das medidas, ou seja, os dados quantitativos. Geralmente, o termo Análise de Imagens usado na literatura engloba as etapas de aquisição, processamento e análise digital de imagem propriamente dita (DOUGHERTY, 1994).

Figura 1. Etapas típicas de um sistema de processamento digital de imagens.
Fonte: adaptado de Albuquerque et al. (2005).

Vale salientar que essas etapas não representam uma sequência obrigatória nesse processo, visto que há casos em que as imagens são capturadas, e nenhum tratamento é necessário. No entanto, em outros casos, a aplicação de técnicas refinadas de segmentação e filtragem é necessária para melhorar o desempenho do sistema de análise de imagem.

A aquisição e o pré-processamento de imagens são considerados etapas fundamentais para o sucesso dessa análise. Nessas etapas, as imagens podem ser capturadas e digitalizadas, compactadas, armazenadas e preparadas para as etapas posteriores. No processo de aquisição das imagens, são utilizadas as técnicas de projeção, digitalização ou tomografia, devendo ser adotados protocolos padrões e considerado o número de amostras necessárias à validação estatística dos dados ao final do processo (BOUMA et al., 2000). O pré-processamento é a etapa que intenciona melhorar a imagem, corrigindo defeitos oriundos da aquisição e realçando detalhes de interesse, de modo a facilitar sua visualização e prosseguir com as demais etapas de processamentos necessárias. Assim, antes de se trabalhar com uma imagem, faz-se necessário um processo de filtragem, que varre a imagem, procurando as transições entre fases e virtualmente decidindo a qual fase (por exemplo, objeto ou fundo) os pixels pertencem (ALBUQUERQUE et al., 2005).

Em sistemas de análise de imagens, é muito importante a subdivisão da imagem em suas partes constituintes ou objetos, técnica conhecida como segmentação (SENA JÚNIOR et al., 2004). Essas regiões ou objetos dentro da imagem são separadas ou segmentadas a partir de características como forma, geometria, topologia, textura, cor ou brilho, sendo escolhidas aquelas que possibilitem melhor distinção entre o objeto e o restante da imagem, ou seja, o fundo (VIEIRA JUNIOR et al., 2006). Após a segmentação, tamanho, cor, forma, posição, número e textura dos objetos são algumas das propriedades que podem ser quantificadas, representando a etapa de extração de atributos (DOUGHERTY, 1994). A partir dessa etapa, os objetos são reconhecidos e classificados para posterior análise e interpretação dos dados. A etapa final de um sistema de processamento de imagens é aquela em que se extraem as informações úteis da imagem processada. Quando o objetivo do processamento é obter informações numéricas, realiza-se a extração de atributos da imagem.

Como exemplo do processo de análise de imagens, temos o estudo de raízes. De maneira geral, a avaliação de raízes tem sido efetuada de duas formas: diretamente no perfil de solo ou por meio de raízes lavadas. Embora, para raízes lavadas, a segmentação seja bastante simples, a aquisição dessas imagens tem se mostrado como um ponto importante e, dependendo do caso, limitante para a utilização dessa técnica. Em geral, pode-se melhorar a imagem adquirida, devendo-se apenas efetuar a eliminação de sombras provenientes da aquisição, mas não acrescentar informação à mesma. Além disso, os resultados encontrados na análise de imagens digitais dependem diretamente da informação contida na imagem. Levar em conta os cuidados na aquisição de uma imagem facilita os processos de identificação de objetos e texturas e a segmentação da mesma (JORGE; CRESTANA, 1996).

Em geral, as imagens de raízes lavadas são digitalizadas em tons de cinza, e a fim de facilitar a etapa de segmentação, são usuais correções de iluminação e usos de corantes que evidenciam áreas de interesse a serem analisadas, durante a aquisição das imagens. O uso de corantes é muito comum em técnicas de microscopia para diferenciar estruturas celulares; corante pode ser utilizado também para melhorar a visualização de raízes finas durante o escaneamento para cálculo de comprimento, diâmetro médio, número de nódulo nas raízes (BOUMA et al., 2000; COSTA et al., 2001; SMIT et al., 1994). Bouma et al. (2000) sugerem que as raízes finas sejam coradas para melhorar o contraste com o fundo e evitar a subestimação dos valores de comprimento e diâmetro médio das raízes. Esse tratamento, no entanto, pode dificultar a comparação entre dados encontrados na literatura, uma vez que períodos de colorações diferentes são usados. A dificuldade de padronização desse protocolo é muitas vezes justificada pela diferença entre sistemas radiculares apresentados pelas espécies. Porém, colorações em períodos bem definidos e concentrações fixas de corantes são essenciais para produção de resultados confiáveis e reprodutíveis (BOUMA et al., 2000). É importante salientar que as técnicas de coloração não são indicadas caso as raízes necessitem ser submetidas a análises futuras, como determinações bioquímicas e digestão do tecido vegetal, para obtenção de teores de nutrientes e metais pesados acumulados. Nesse caso, os autores recomendam o aumento da resolução de digitalização e redução da densidade de distribuição de raízes sob o scanner, que além de melhorar a visualização de estruturas finas, reduz problemas de sobreposição e de sombreamento que pode subestimar e superestimar, respectivamente, os resultados obtidos. Outra técnica, sugerida por Teixeira et al. (2006), é o não fechamento da tampa do scanner e a não iluminação diretamente sobre o aparelho durante o procedimento de digitalização, o que produz o efeito de fundo desejado para a formação das imagens com o preto como cor predominante e as raízes em níveis de cinza, melhorando o contraste na imagem e a detecção do comprimento e diâmetro das raízes.

Para análise de imagens de raízes em perfis de solo, a presença de solo, palha e outros detritos podem dificultar o processo de segmentação, principalmente, porque essas imagens geralmente são coloridas. A aquisição da imagem a partir do perfil requer cuidados que vão desde a abertura da trincheira, preparo do perfil, filmagem, até digitalização (JORGE; CRESTANA, 1996), e em alguns casos pode depender também do operador do sistema.

Um dos maiores desafios para utilização de análise de imagem em campo é o controle da luminosidade. De fato, no campo, a iluminação não é controlada, e as variações na cor da luz durante o dia e as épocas do ano provocam alterações nas cores dos objetos nas imagens capturadas (SENA JÚNIOR et al., 2004). Na análise de imagem, a intensidade luminosa é um fator muito importante. Ela influencia diretamente nos valores numéricos dos pixels em uma imagem digital, uma vez que esses valores representam a energia refletida pelos objetos e que será captada pelo sensor da câmera.

Para a captura de imagens no campo, é frequente o uso de suportes verticais que centralizam a câmera sobre as parcelas e evitam a interferência subjetiva de fotógrafos (BEHRENS; DIEPENBROCK, 2006). Esses estudos usam, na maioria das vezes, o atributo cor como fator discriminatório para identificação e segmentação dos objetos dentro das imagens capturadas no campo. De maneira geral, os sistemas de representação de cor mais adequados para se obter resultados significativos no processo de segmentação dessas imagens são aqueles cujos componentes mostram-se menos correlacionados (LALIBERTE et al., 2007; LANA et al., 2006). O sistema de cores RGB (vermelho, verde e azul), que apresenta facilidades para a computação da informação cor, tem o inconveniente de possuir componentes altamente correlacionadas, responsáveis, na maioria das vezes, pela segmentação impura da imagem (LANA et al., 2006). Nesses casos, durante a segmentação, tem sido considerado mais adequado o sistema de cores HSI em virtude da baixa correlação de suas componentes matiz (H), saturação (S) e intensidade (I). Nesse modelo HSI, é fácil a eliminação de um dos componentes, como a intensidade (I), deixando assim a segmentação menos sensível às mudanças de iluminação (LALIBERTE et al., 2007).

É possível notar que diferentes técnicas de análise de imagem encontradas na literatura consistem em variações ou adaptações das etapas gerais de processamento digital de imagem, testadas a fim de se obter técnicas mais precisas e com maior aplicabilidade para a determinada área de estudo. Com o avanço da tecnologia computacional, métodos tradicionais têm sido substituídos por técnicas sofisticadas para obtenção e análise de dados. Nesse aspecto, os sistemas de análise de imagens se destacam no melhoramento de imagens ou na medição e análise de grandezas relevantes e como uma das áreas de maior desenvolvimento e significância na resolução de diversos problemas nos respectivos campos de estudo.

Uma motivação para o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas de análise de imagens aplicadas a estudos da interação planta-ambiente é a possibilidade de se obter informações complementares às técnicas experimentais convencionais, de tempo e custos muito elevados, permitindo o desenvolvimento de ferramentas mais precisas, rápidas e de custo reduzido. Um dos mecanismos para redução de custo experimental permitido pela análise de imagens é o acompanhamento do sistema radicular de uma mesma planta, pela substituição de métodos mais convencionais de análise destrutiva. Essas medições, ao serem repetidas em uma mesma planta, necessitam de técnicas adequadas para análise de dados.

3. Medições repetidas

Em várias áreas das ciências agrárias, tais como Agronomia, Engenharia Florestal, Zootecnia, entre outras, é bastante frequente a utilização de experimentos denominados de medidas repetidas no tempo. Nesse tipo de experimento, o objetivo principal é comparar as tendências dos tratamentos ao longo do tempo, ou seja, se os perfis dos tratamentos são horizontais e se são paralelos entre si (MALHEIROS, 2004).

O uso da análise de medidas repetidas exige a definição de pelo menos um fator intraindivíduos, o qual vai indicar as variáveis que contêm as medidas repetidas (NEMEC, 1996). Esse tipo de análise geralmente tem sido abordada como um experimento fatorial, em que o tratamento e o tempo são os dois fatores (VILLALOBOS et al., 2007).

Na análise de variância desses experimentos, devemos considerar que as observações são feitas em uma mesma unidade experimental e são naturalmente correlacionadas, visto que a situação no tempo t+1 de uma dada unidade experimental terá sido naturalmente afetada pela situação no tempo t. Conforme a estrutura da matriz de covariância das observações, essa análise pode ser realizada considerando um modelo univariado, multivariado ou misto.

Uma consequência imediata de se ignorarem diferentes correlações entre dados mensurados no tempo é que a significância aparente da diferença entre as médias dos tratamentos é grosseiramente exagerada, e a sensibilidade dos testes para interação é seriamente reduzida (CECON et al., 2008).

Assim, a análise univariada só deve ser adotada quando são atendidas suposições sobre a estrutura de covariância das observações. Nesse caso, a análise é baseada no número total de observações, ou seja, as medidas são tratadas separadamente, sendo o tempo incluído como um fator no modelo Anova (NEMEC, 1996).

No caso de se adotar uma técnica multivariada, as suposições sobre a estrutura de correlação das observações de um mesmo indivíduo não são rígidas. A análise é baseada no número total de unidades experimentais.

No entanto, tanto na análise univariada e na multivariada requer-se que as variâncias e as correlações sejam homogêneas, o que as diferenciam da análise mista, na qual a estrutura da matriz de covariâncias pode ser modelada da forma que melhor represente os dados, ou seja, pode levar em consideração se os dados são independentes, dependentes, correlacionados ou ainda apresentar outra relação que a matriz de covariâncias usual não consegue explicar (XAVIER; DIAS, 2001).

Segundo Villalobos et al. (2007), o procedimento mais simples para esse tipo de experimento é o de parcelas subdivididas, na qual a parcela principal é a unidade experimental, e as subparcelas são formadas pelo tempo. No entanto, Malheiros (2004) afirmou que isso nem sempre é correto, pois esse esquema pressupõe que a matriz de covariâncias (∑) tenha uma estrutura homogênea, que nem sempre se verifica. Para que esse procedimento seja válido, requer-se a condição de Huynh-Feldt (HUYNH; FELDT, 1970), ou seja, que as medições tenham a mesma variância em todos os períodos, e a correlação entre duas medições sucessivas ou separadas no tempo sobre um mesmo indivíduo ou objeto seja igual.

A condição de Huynh-Feldt (H-F) é necessária e suficiente para que o teste F da análise de variância usual, no esquema de parcelas subdivididas no tempo, seja válido. Quando a condição H-F é atendida, pode-se afirmar que a variável aleatória é igualmente correlacionada e tem variâncias iguais, considerando as diferentes ocasiões. A matriz de covariância com essas características tem uma forma chamada de simetria composta e atende a condição para que o teste F seja válido, em nível de subparcelas, para o fator tempo e interação tempo x tratamento.

Fernández (1991) também ressaltou que, ao se considerar um esquema de parcelas subdivididas, os níveis do tempo não podem ser aleatorizados para seus intervalos, pois a análise de variância usual pode não ser válida. Isso porque, com a falta de aleatorização, os erros correspondentes às respectivas unidades experimentais podem ter uma matriz de covariâncias que não possua variâncias homogêneas, acarretando, assim, um inflacionamento na probabilidade de rejeitar a hipótese nula quando ela corresponde à verdade (probabilidade do erro de tipo I).

Cole e Grizzle (1966), considerando que as observações obtidas nos experimentos de medidas repetidas estão correlacionadas e, portanto, são essencialmente de natureza multivariada, sugeriram que o método adequado para analisar esses experimentos é o procedimento multivariado, pois permite uma matriz de covariância com qualquer estrutura.

Vale salientar que antes dos procedimentos multivariados serem bem compreendidos, diversas aproximações foram introduzidas para compensar as violações (BOX, 1954a, 1954b; GEISSER; GREENHOUSE, 1958; HUYNH; FELDT, 1976), e essas técnicas são ainda amplamente utilizadas. No entanto, quando os dados são balanceados, a utilização de métodos multivariados é mais adequada considerando que ignora a presunção da existência de simetria e de esfericidade.

Para se verificar se a matriz de covariâncias atende a condição de H-F, Mauchly (1940) propôs um teste chamado teste de esfericidade, que verifica se uma população multivariada apresenta variâncias iguais e correlações nulas.

Fernández (1991) sugeriu as seguintes observações: a) se a condição de H-F para a matriz de covariâncias for satisfeita (teste de esfericidade não significativo), o teste univariado pode ser utilizado; b) se o teste de esfericidade apresentar entre 0,05 e 0,01 de significância, poderão ser utilizados a correção para os números de graus de liberdade ou os testes multivariados; e c) se a condição de H-F para a matriz de covariâncias for rejeitada, com um nível de significância menor que 0,01, somente testes multivariados deverão ser utilizados.

Segundo Vallejo e Lozano (2006), quando a suposição de esfericidade é satisfeita, a análise de variância univariada pode ser empregada. Caso contrário, se as matrizes de covariância são homogêneas, pode-se optar por um enfoque univariado com os graus de liberdade corrigidos mediante algum dos métodos existentes ou utilizar uma análise de variância multivariada. No entanto, ambos os enfoques são inválidos quando as matrizes são heterogêneas, especialmente quando os dados não têm distribuição normal e estão desbalanceados.

Xavier e Dias (2001) afirmaram que uma técnica alternativa aos modelos uni e multivariado seria a análise com modelos mistos que são uma extensão do modelo linear geral. Esses modelos englobam análise de curvas de crescimento, ou curvas polinomiais, que levam em conta a estrutura da matriz de covariâncias que melhor explica o comportamento das observações, tendo a vantagem de ajustar modelos que reduzem o número de parâmetros.

Um ponto importante nesse procedimento de análise é a escolha do modelo de covariância mais adequado para os dados, tendo em vista a existência de literalmente dezenas deles. O procedimento mais comumente recomendado é essencialmente um processo de tentativa e erro, em que o modelo é ajustado, determinando, por exemplo, medidas de informação como AIC, e, após o ajuste de todos os modelos avaliados, o que apresentou os melhores valores para AIC é adotado (LITTELL et al., 1998, 2000; MILLIKEN, 2003; SAS INSTITUTE, 2006; WOLFINGER; CHANG, 2006). Esse procedimento é repetido para cada variável sob análise.

4. Emprego de análise de imagens no estudo da nodulação

A literatura indica, até o momento, três aplicações principais da análise de imagens em estudos de nodulação. Uma das aplicações é a avaliação de características micromorfólogicas dos nódulos ou pelos radiculares, em que plantas são submetidas a determinados tratamentos, e, após processamento adequado do tecido, o que é dependente do estudo, as imagens obtidas são avaliadas, qualitativa ou quantitativamente (CHOVANEC et al., 2008; DAZZO et al., 1990; EHRHARDT et al., 1996; VIKMAN; VESSEY, 1993). Na segunda aplicação, a análise de imagem é utilizada para permitir a obtenção de medidas de tamanho de nódulos, que normalmente não seriam utilizadas em razão do esforço necessário, em particular considerando a rápida degradação do tecido nodular (LIRA JUNIOR et al., 2003). Essa variável pouco habitual é baseada em trabalhos bastante antigos que indicam relação entre eficiência de fixação e tamanho do nódulo (DÖBEREINER, 1966; DÖBEREINER et al., 1966), tendo sido confirmado em publicação recente que encontrou alta correlação entre tamanho do nódulo e matéria seca de nódulos, tanto para determinação por paquímetro (r = 0,97), quanto para determinação em uma imagem obtida sem a eliminação da planta (r = 0,89) (COSTA et al., 2007). O terceiro grupo de aplicações incluiria estudos em que medições destrutivas são, ao menos parcialmente, substituídas por medições não destrutivas da nodulação (ARAÚJO et al., 2005; CAMPANHARO, 2006; COSTA et al., 2005; LIRA JUNIOR et al., 2005; SOUSA et al., 2005; TAVARES, 2008).

Uma dificuldade comum é que geralmente nas medições não destrutivas a determinação do que é o nódulo é efetuada pelo operador do sistema, sendo frequentemente bastante difícil, em razão da semelhança entre as características visuais do nódulo e seu fundo visual, bem como, ocasionalmente, entre nódulos de um mesmo agrupamento. Por outro lado, o desenvolvimento dos nódulos, ao longo do tempo, é bastante claro, como pode ser observado na Figura 2.

Figura 2. Desenvolvimento do sistema radicular e da nodulação de caupi (Vigna unguiculata) dos 7 aos 70 dias após a emergência. Dias após a emergência (A) 7, (B) 14, (C) 21, (D) 28, (E) 35, F (42), G (49), H (56), I (63), J (70). Pontos em destaque indicam a presença e o tamanho dos nódulos visíveis.
Fonte: Costa et al. (2007).

Fotos: Mário de Andrade Lira Junior

Uma grande possibilidade desse tipo de estudo não destrutivo é avaliar o efeito de estresses ambientais sobre a nodulação, como indicado por alguns trabalhos realizados pelo grupo de pesquisa sob a coordenação de um dos autores do capítulo (CAMPANHARO, 2006; LIRA JUNIOR et al., 2005; TAVARES, 2008). Enquanto um dos trabalhos foi realizado em hidroponia (LIRA JUNIOR et al., 2005), utilizando sacos plásticos para crescimento de plantas, os demais foram efetuados utilizando vasos de acrílico, dimensionados para representar aproximadamente o espaço ocupado por uma planta de feijão em uma linha de plantio, admitindo o espaçamento recomendado para a cultura (COSTA, 2005), com a maior dimensão representando o perfil do solo, limitado pelo tamanho dos digitalizadores mais comuns no mercado.

A grande vantagem desse sistema é que, ao permitir o acompanhamento de uma mesma planta ao longo do tempo, reduz o número de parcelas necessário para avaliar cada tratamento. Como exemplo, admitiremos que queiramos avaliar o efeito de 5 doses de fósforo na nodulação de 2 variedades de feijão, e que serão utilizadas 4 repetições. Assim, temos que em um experimento mais convencional normalmente seriam adotadas 2 idades de amostragem, no florescimento e na colheita final, totalizando 80 vasos (5x2x4x2), mas sem condição de avaliar o efeito desses tratamentos ao longo do tempo, que frequentemente ajuda a entender o resultado final. Se utilizarmos essa técnica de análise de imagem, com um vaso transparente, com os mesmos 80 vasos, nós poderíamos observar o desenvolvimento do sistema radicular e dos nódulos a qualquer intervalo desejado.

Evidentemente, não é possível ter ganhos sem custos. Nesse caso, embora os vasos sejam comparativamente caros, eles têm demonstrado durabilidade suficiente para que o aumento de custo financeiro seja relativamente baixo. No caso particular do nosso grupo de pesquisa, os vasos têm demonstrado, além de alta durabilidade, baixo índice de perdas e a possibilidade de serem reaproveitados, como exemplo das três dissertações do nosso grupo. Assim, o principal aumento de custo é no nível de trabalho durante e depois do experimento. Tipicamente, utilizando a resolução que tem apresentado melhores resultados, 200 pontos por polegada, para a obtenção das imagens a partir da digitalização de todos os vasos de um experimento semelhante ao descrito acima, seriam necessárias 3 pessoas dia-1, com um dia provavelmente bastante longo.

Após essa digitalização, haveria necessidade ainda de realizar a análise de imagens propriamente dita. Até o momento, a equipe que tem realizado esses trabalhos não conseguiu desenvolver procedimentos automatizados para distinguir os nódulos do solo, em virtude da semelhança de cores e irregularidade no formato dos nódulos. Assim, a identificação dos nódulos necessita ser feita por pesquisadores treinados no aspecto, embora em nossa experiência o treinamento seja relativamente simples, com pouca variação entre os resultados de diferentes pesquisadores. Novamente, com base na experiência acumulada nos trabalhos anteriormente mencionados, uma equipe composta por 3 pessoas, por exemplo, 1 mestrando e 2 alunos de iniciação científica, deve levar algo em torno de 10 dias de trabalho para analisarem as imagens obtidas, admitindo que a nodulação seja razoavelmente abundante.

Finalmente, embora em teoria seja possível acompanhar um nódulo individual ao longo de seu desenvolvimento, a prática tem indicado que esse acompanhamento não é viável por dificuldades de organização dos dados. Assim, a análise de dados deve seguir as premissas descritas acima de análise de medições repetidas, considerando cada vaso como sendo a unidade básica que foi repetida nas diversas medições.

5. Considerações finais

O conjunto de técnicas descrito neste capítulo não deve ser considerado, na opinião dos autores, como possível substituto das técnicas mais convencionais descritas na primeira seção do trabalho, mas sim como uma técnica adicional, que permite observar características que dificilmente poderiam ser observadas com as medidas, como massa seca de nódulos, em razão de seu caráter necessariamente destrutivo.

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Capítulo 5
Abundância natural do 15N para quantificação da fixação biológica do nitrogênio em plantas

Ana Dolores Santiago de Freitas
Everardo Valadares de Sá Barretto Sampaio
Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos

1. Introdução

A fixação biológica do nitrogênio (FBN) por meio da associação leguminosas-rizóbios é um dos principais processos de entrada do elemento em ecossistemas naturais. Em sistemas agrícolas, a importância desse processo está relacionada a diferentes aspectos, de acordo com as características dos modelos de exploração adotados. Em modelos intensivos e extensivos, a FBN pode despontar como uma possibilidade de prevenir a degradação do meio ambiente e a insegurança alimentar. Para a agricultura de subsistência, em que o fertilizante nitrogenado é frequentemente indisponível, muitas vezes o aporte de nitrogênio atmosférico via cultivo de leguminosas é a única possibilidade de viabilização e sustentabilidade (DAKORA; KEYA, 1997; VANCE, 2001).

As quantidades de nitrogênio fixadas em ecossistemas naturais ou agrícolas são influenciadas por diversos fatores ambientais e práticas de manejo. Para estabelecer manejos adequados e a máxima realização dos benefícios da associação planta-microrganismo, é necessário estimar quanto de nitrogênio é fixado em diferentes condições. Existem diversos métodos para se quantificar a FBN, tanto em leguminosas cultivadas quanto em ambientes naturais, todos eles apresentando vantagens e desvantagens, de acordo com o sistema estudado. Neste capítulo, será abordada a metodologia da abundância natural do 15N (ou do δ15N), método isotópico baseado na variação de concentrações do isótopo entre plantas fixadoras e plantas não fixadoras. O objetivo é descrever a metodologia de maneira a servir de guia a pesquisadores interessados em quantificações do N fixado. Aos interessados em revisões aprofundadas, com discussões sobre aspectos teóricos e dificuldades de interpretação associadas ao método, recomendam-se os trabalhos de Boddey et al. (2000), Handley e Scrimgeour (1997), Högberg (1997) e Shearer e Kohl (1986).

2. Bases isotópicas da metodologia

O núcleo de um átomo contém duas partículas subatômicas principais, os prótons (p) e os nêutrons (n). O átomo de um dado elemento tem um número fixo de prótons, e este é chamado de número atômico. O número de prótons + nêutrons é chamado de número de massa. Um elemento particular pode ter diferentes números de nêutrons e, consequentemente, diferentes números de massa, porém sempre o mesmo número de prótons. Essas formas do mesmo elemento com diferentes massas são denominadas de isótopos e têm características químicas praticamente idênticas. No núcleo, os prótons, que são positivamente carregados, podem se repelir. A presença de nêutrons, entretanto, mantém os prótons juntos e estabiliza o núcleo. A estabilidade depende da relação nêutrons:prótons (n:p). Quando a razão de nêutrons e prótons é alta, o núcleo se torna instável e emite partículas (α e β) e/ou radiação eletromagnética (γ), e tal elemento é dito radioativo. Se a relação não fica fora de uma certa faixa de estabilidade, o elemento, espontaneamente, não emite partículas e/ou radiação γ e é chamado de estável. Os diferentes isótopos de um elemento (radiativo ou estável) podem ser usados para seguir seus caminhos, ao longo de diferentes reações, processos metabólicos e ciclos biológicos e geoquímicos. As passagens por essas rotas podem ser seguidas não só qualitativa mas também quantitativamente. Por essa razão, os isótopos são considerados traçadores das reações, processos e ciclos biogeoquímicos.

O nitrogênio tem dois isótopos estáveis, o 15N e o 14N, e suas proporções variam na biosfera em razão do fracionamento isotópico nos processos físicos, químicos e biológicos. O fracionamento isotópico é resultado de efeitos cinéticos e de equilíbrio. Moléculas ou íons mais pesados estão mais fortemente ligados (logo, uma energia de ativação maior é requerida para dissociá-los) e reagem mais lentamente que análogos isotopicamente mais leves. Dessa forma, para uma dada reação incompleta A↔B, o produto B será menos enriquecido em 15N que A.

As razões entre os dois isótopos estáveis do nitrogênio, o 15N e o 14N, variam na biosfera em razão do fracionamento isotópico nos processos físicos, químicos e biológicos. O N2 atmosférico, que tem uma abundância constante de 0,3663 atom% de 15N, é aceito como o padrão (HÖGBERG, 1997). A composição isotópica de amostras de solos e tecidos de plantas é o resultado líquido de processos (mineralização, volatilização de amônia, nitrificação, denitrificação, troca de íons, difusão, absorção pelas plantas e micorrizas, fixação biológica do N2, herbivoria, etc.) que envolvem diferentes magnitudes e direções de fracionamento isotópico (SHEARER; KOHL, 1989), com efeitos potenciais sobre a concentração de 15N no sistema solo-planta (HÖGBERG, 1997).

3. O valor δ

Por conveniência, a abundância natural de 15N é expressa em unidades de δ (‰), que é o desvio, em relação ao N2 atmosférico, da razão entre as massas de 15N e 14N do nitrogênio contido na amostra (SHEARER; KOHL, 1989):

em que Ramostra e Rpadrão são as razões 15N:14N da amostra e do padrão (N2 atmosférico), respectivamente.

Como o N2 atmosférico é o padrão, por definição seu δ15N é 0‰. Dessa forma, se uma amostra tiver uma concentração de 15N maior que a do ar, ou seja, maior que 0,3663 atom% de 15N, seu valor de δ15N será positivo (+). Ao contrário, amostras com concentração de 15N menor que a do ar apresentam δ15N negativo (-). Um δ15N é 1/1.000 da abundância de 15N do N2 atmosférico, ou seja, 0,0003663 atom%15N.

O δ15N do N total do solo é determinado pelo sinal isotópico do compartimento de N orgânico, que é altamente estável e não varia durante décadas. Em contraste, os compartimentos biologicamente ativos, que são os disponíveis para as plantas, são uma fração diminuta do N total do solo e possuem uma dinâmica bastante rápida, variando em pequenos períodos de tempo (dias ou semanas). Dessa forma, o δ15N do N total do solo não é, em geral, uma boa aproximação do δ15N do N disponível para as plantas. As plantas são integradoras do δ15N de todas as fontes de N disponível, incluindo o N inorgânico e formas simples de N orgânico (HÖGBERG, 1997). Materiais biológicos, em geral, apresentam valores de δ15N variando entre -5 a +10‰. Apesar dessas diferenças de abundância de 15N serem pequenas, elas podem ser facilmente determinadas, com instrumentação apropriada e cuidados na preparação das amostras (SHEARER; KOHL, 1989).

4. Determinação da abundância natural do 15N

A determinação da concentração natural de 15N numa amostra é feita por meio da técnica de espectrometria de massa. Essa técnica baseia-se na diferença de massa entre isótopos estáveis e tem a precisão requerida para leituras das pequenas diferenças de concentrações entre amostras. Para a determinação, as formas orgânicas ou inorgânicas de N das amostras têm de ser convertidas em N2. Essa conversão geralmente é feita por etapas, sendo a primeira uma digestão, que resulta em N amoniacal, podendo haver uma redução prévia no caso de formas oxidadas de N (nitratos e nitritos do solo, por exemplo). O sal amoniacal é então oxidado com hipobromito formando N2. O N2 precisa ser separado do vapor de água e óxidos de C e de N que possam estar presentes. A conversão em N2 também pode ser feita por combustão direta, em equipamento acoplado diretamente ao espectrômetro, em aparelhos mais modernos. Quando ela é feita antes, o N2 resultante do processo é armazenado em ampolas de vidro, que podem ser guardadas para leituras posteriores. Eventualmente, as ampolas são quebradas, e o gás arrastado para a parte de detecção do espectrômetro. No processo integrado, o N2 produzido é, em seguida, arrastado para o aparelho. No espectrômetro, o gás é ionizado e passa por um campo magnético que faz com que as três formas de N2 (14N-14N, 14N-15N e 15N-15N) sejam defletidas diferencialmente, em função de suas massas. Os feixes de íons de cada uma das formas são, então, detectados em coletores especiais, nos quais as intensidades das correntes geradas são proporcionais às concentrações das formas. As etapas seguintes são arranjos eletrônicos de processamento dos sinais, da amplificação ao registro dos resultados. Nos aparelhos mais modernos, toda essa parte é feita por computação, baseada em programas que calculam proporções, fazem correções, etc. (IAEA, 2001).

5. Descrição da metodologia do δ15N

A metodologia da abundância natural do 15N, para estimar a proporção do N da planta derivado da fixação biológica, baseia-se na comparação entre a abundância de 15N de uma espécie fixadora de N, que obtém N do N2 atmosférico em adição às fontes de N do solo, e a abundância de uma espécie referência não fixadora que conta apenas com o N derivado do solo (SHEARER; KOHL, 1986). Ou seja, espera-se que plantas não fixadoras que retiram todo seu N do solo sejam mais abundantes em 15N que plantas fixadoras que retiram parte de seu N do ar.

A metodologia da abundância natural é, basicamente, uma técnica de diluição isotópica, exceto que a marcação do solo ocorre naturalmente. Para calcular a proporção do N da planta que é derivado da atmosfera (ou seja, fixado via FBN) é feita uma interpolação entre as abundâncias de 15N do N fixado e do N de outras fontes disponíveis para a planta.

Idealmente, a técnica da abundância natural é mais eficiente quando: (i) existem apenas duas fontes de N para absorção pela leguminosa fixadora (o N do solo disponível para a planta e o N2 do ar); (ii) as duas fontes são suficientemente diferentes em abundância de 15N para determinação por um espectrômetro de massa; e (iii) a variabilidade biológica dessas abundâncias é pequena comparada com as diferenças entre elas (BODDEY et al., 2000).

A expressão para o cálculo do percentual de N da planta derivado do ar é (SHEARER; KOHL, 1989):

em que %Ndda é o percentual de N da planta fixadora que é derivado do ar, δ15N(referência) é a abundância de 15N da planta controle não fixadora, δ15N(fixadora) é a abundância de 15N da planta fixadora e B (também chamado valor B) é o valor de δ15N para plantas fixadoras cultivadas na ausência de N (ou seja, é abundância de 15N do N fixado na planta fixadora).

6. A planta controle e o valor B

Como dito anteriormente, o δ15N do N do solo absorvido pelas plantas crescidas num determinado solo é a integralização dos δ15N de todas as formas de N disponível para as plantas (N inorgânico e formas simples de N orgânico) naquele solo (HÖGBERG, 1997). Na expressão para o cálculo do %Ndda, é assumido que a concentração de 15N da planta controle (ou referência) reflete o sinal de 15N do N do solo disponível para as plantas (controle e fixadora). Na verdade, como as estratégias para absorção de N podem variar entre plantas de diferentes espécies, hábitos de crescimento, distribuição do sistema radical, associações com micorrizas, etc., essa premissa pode se afastar da realidade. Além disso, diferenças espaciais do solo também podem determinar variações de sinais de δ15N do N disponível para as plantas. Dessa forma, é importante selecionar uma planta controle que explore um volume de solo e absorva nutrientes num padrão de tempo semelhante ao da planta alvo (espécie fixadora). Ou seja, é importante que as plantas controle e alvo tenham fenologias e hábitos de crescimento semelhantes. Além disso, pode ser vantajoso coletar plantas fixadoras e plantas referência de maneira pareada, próximas umas das outras, bem como coletar várias espécies de plantas não fixadoras (HÖGBERG, 1997; PATE et al., 1994; SHEARER; KOHL, 1986).

O valor B é incluído na fórmula de %Ndda para corrigir o fracionamento isotópico durante o processo de fixação do N e corresponde ao valor de δ15N da planta fixadora cultivada dependendo exclusivamente do N2 do ar. Esse valor pode ser determinado cultivando leguminosas inoculadas com estirpes efetivas de rizóbios em substratos livres de N. Para leguminosas de ambientes naturais e/ou espécies arbóreas, em que existem maiores complicações metodológicas para determinação do valor B, recomenda-se que seja testada a importância potencial de valores extremos reportados na literatura – a maioria dos valores de B determinados para leguminosas oscilam entre -2,0 e +1,0‰ (BODDEY et al., 2000; HÖGBERG, 1997).

7. Vantagens e desvantagens da metodologia

A grande vantagem da técnica da abundância natural do 15N para estimar a FBN é que é um método que não perturba o ambiente (nada precisa ser adicionado ou destruído) e que integra o efeito do processo de FBN ao longo do tempo. Por conta disso, é o método mais utilizado para estimativas da FBN em árvores, em sistemas naturais ou agroflorestais (ARNDT et al., 2004; FREITAS et al., 2010; GALIANA et al., 2002; GATHUMBI et al., 2002; GEHRING; VLEK, 2004; KHADKA; TATSUMI, 2006; KOPONEN et al., 2003; KREIBICH et al., 2006; RADDAD et al., 2005; SALAS et al., 2001; SPRIGGS et al., 2003). Embora o método seja particularmente útil para ecossistemas naturais, principalmente no caso de árvores e arbustos, para os quais é muito difícil marcar o substrato, também pode ser utilizado para leguminosas anuais cultivadas (SANFORD et al., 1995).

O sucesso da quantificação da fixação de N2 utilizando a técnica do 15N e abundâncias naturais depende do padrão isotópico do N no sistema. Estimativas precisas requerem uma grande diferença (+5 ou -5‰) nos δ15N das espécies referência e das espécies fixadoras. Diferenças menores que 2‰ entre espécies devem ser discutidas com cautela, mesmo que sejam estatisticamente significativas (HÖGBERG, 1997). Em determinados ambientes, principalmente florestas tropicais, essas diferenças não são detectadas (GEHRING; VLEK, 2004; HANDLEY et al., 1994; ROGGY et al., 1999), tornando o método inadequado para fazer estimativas da FBN.

8. Estratégia de coleta e preparo das amostras

Aspectos da estratégia de amostragem que precisam ser considerados em estudos envolvendo a metodologia da abundância natural do 15N para estimativas da FBN são: a época de amostragem, a parte da planta a ser amostrada e a maneira que as amostras são coletadas em uma base espacial.

Para plantas anuais, a amostragem deve ser feita antes da senescência da planta, pois podem ocorrer mudanças no delta da planta durante a maturação que não seja em virtude de fixação de N2 ou absorção de N do solo. Reciclagem de N dentro da planta durante o enchimento de grãos pode levar a perdas gasosas de compostos nitrogenados (NH3), com efeitos potenciais sobre o δ15N da planta. Para a maioria das leguminosas anuais, a fixação de N2 e a absorção de N cessam aproximadamente no meio do florescimento, e cálculos do %Ndda depois dessa época, utilizando a metodologia do δ15N, não serão válidos. Também pode haver diferenças no δ15N entre as diferentes partes da planta, reflexo do fracionamento isotópico que ocorre durante o transporte e ciclagem internos do N. Em consequência disso, em plantas herbáceas, deve-se coletar toda a parte aérea para integrar essas variações (UNKOVICH, 1996).

Para plantas arbóreas, a coleta da planta inteira é extremamente difícil, se não impossível. Alguns poucos estudos disponíveis demonstram que as diferenças de concentração de 15N nos diferentes tecidos (folhas, troncos, ramos, etc.) são de magnitudes variáveis, de acordo com a espécie e o local. Considerando que as folhas representem o maior compartimento de N da planta e que diferenças entre suas abundâncias de 15N e a de outras partes não sejam grandes, o tecido foliar é a amostra mais conveniente e válida para estimativas da FBN (BODDEY et al., 2000). As folhas coletadas devem estar verdes, completamente expandidas e sadias, de preferência retiradas de vários locais da copa de modo a formar uma amostra composta.

Finalmente, para minimizar o impacto de variações espaciais no δ15N do solo, é recomendado coletar plantas referência tão perto quanto possível da leguminosa estudada, preferencialmente dentro de 2 m (UNKOVICH, 1996).

Para evitar fracionamento isotópico em razão de perdas de NH3, as amostras vegetais devem ser postas para secar em estufa o mais rapidamente possível, a uma temperatura máxima de 80 °C. Após a secagem, as amostras devem ser moídas a pó fino e estocadas em recipiente hermético e livre de umidade até a digestão.

9. Quantificação do N adicionado aos sistemas

A produtividade de um sistema agrícola ou florestal só é mantida se houver entradas de nutrientes que compensem as quantidades perdidas e removidas com a exportação de biomassa vegetal. Uma avaliação realística da sustentabilidade de tais sistemas deve incluir a quantificação da contribuição da FBN, entretanto essas informações são praticamente inexistentes para sistemas tropicais. Um dos problemas da falta de dados sobre as quantidades de N fixadas, em kg/ha/ano, é a dificuldade de medir simultaneamente a produção de biomassa, que em ambientes naturais pode ser feita por meio de equações alométricas ou determinação da massa de folhedo, e as proporções de N derivadas da fixação (%Ndda), nessa biomassa (BODDEY et al., 2000).

Num esforço para quantificar a quantidade de N fixado anualmente no globo, Cleveland et al. (1999) fizeram diversas estimativas das quantidades de N fixadas em diferentes ecossistemas. Para a maioria das florestas tropicais, em virtude da escassez de informações específicas, as estimativas foram baseadas em informações disponíveis para ambientes supostamente semelhantes. Para o caso das florestas xeromórficas brasileiras (Caatinga), resultados preliminares têm apontado para quantidades bem menores de N adicionado anualmente pela fixação (FREITAS et al., 2010). Para fazer essas estimativas, os autores utilizaram a metodologia da abundância natural do 15N para determinar o %Ndda em espécies arbóreas da Caatinga. Juntando esses resultados com os de teores de N total nas espécies fixadoras e informações disponíveis em outros trabalhos (proporção de fixadoras e produção anual de folhas) para estimar a massa de folhas de fixadoras produzida anualmente, foi possível estimar as quantidades de N adicionadas anualmente aos sistemas pela FBN. A Tabela 1 a seguir exemplifica os cálculos feitos para estimar a quantidade de N fixado anualmente em folhas de leguminosas arbóreas em dois fragmentos de Caatinga.

Tabela 1. Biomassa total, nitrogênio total e nitrogênio fixado em folhas de leguminosas em dois locais de Caatinga do Semiárido brasileiro (Serra Talhada, PE, e Remígio, PB).

Variável

Local

Serra Talhada

Remígio

Biomassa total de folhas (t/ha)

6,6

5,3

Proporção de leguminosas fixadoras na vegetação (%)

2,4

11,8

Biomassa de folhas de leguminosas fixadoras (kg/ha)

170

625

Teor de N nas folhas de leguminosas fixadoras (%)

2,88

3,90

Quantidade de N total nas folhas de leguminosas fixadoras (kg/ha)

4,9

24,4

%Ndda, com B = 0 (kg/ha)

68

49

%Ndda, com B = -2 (kg/ha)

52

41

Quantidade de N fixado, com B = 0 (kg/ha)

3,3

11,2

Quantidade de N fixado, com B = -2 (kg/ha)

2,5

9,3

Fonte: Freitas et al. (2010).

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Capítulo 6
Proteína do solo relacionada à glomalina: uma alternativa para avaliação da qualidade do solo

Cristiane Figueira da Silva
Jean Luiz Simões de Araújo
Eliane Maria Ribeiro da Silva

1. Introdução

A glomalina é uma glicoproteína componente da parede celular das hifas de fungos micorrízicos arbusculares (FMA), insolúvel em água e imunorreativa (WRIGHT, 2000; WRIGHT; UPADHYAYA, 1998; WRIGHT et al., 1996), e acumula-se no solo após o processo de decomposição das hifas por microrganismos edáficos (DRIVER et al., 2005). Desde sua descoberta em 1996 (WRIGHT et al., 1996) vem despertando interesse por parte da comunidade científica em função das suas características e da sua correlação com algumas propriedades do solo. A glomalina pode ser extraída do solo a partir de ciclos consecutivos em altas temperaturas, o que sugere que seja uma molécula extremamente estável, uma vez que as proteínas normalmente se desnaturam quando submetidas a elevadas temperaturas. Estimativas sobre sua permanência no solo mostram que, para sua completa mineralização ocorrer, pode ser necessário um período de 6 a 42 anos, tempo bem superior ao de hifas, que não ultrapassa de 5 a 7 dias (RILLIG et al., 2001; ZHU; MILLER, 2003), ou de raízes, que varia de 10 dias até a morte da planta arbórea (FITTER; MOYERSOEN, 1996).

A glomalina tem sido relacionada com diversos processos do solo, por exemplo, biorremediação em solos e sedimentos contaminados com metais pesados (CHRISTIE et al., 2004; CHERN et al., 2007; GONZÁLEZ-CHÁVEZ et al., 2004). Contudo, grande parte dos trabalhos realizados com essa glicoproteína concentra-se na sua relação com a estabilidade de agregados e o estoque de carbono do solo (BEDINI et al., 2007; PURIN, 2005; RILLIG, 2004; RILLIG; STEINBERG, 2002; RILLIG et al., 1999, 2001, 2002, 2003a; WRIGHT, 2000; WRIGHT; ANDERSON, 2000; WRIGHT; UPADHYAYA, 1998; WRIGHT et al., 1999, 2007). Isso se deve principalmente às seguintes características: produção abundante, aderência às partículas do solo, recalcitrância, características hidrofóbicas (WRIGHT, 2000; WRIGHT; UPADHYAYA, 1998) e elevada concentração de Fe (0,8% a 8,8%) na constituição da glomalina (WRIGHT; UPHADYAYA, 1998). Além disso, a glomalina está fortemente correlacionada com o C e o N do solo (NICHOLS; WRIGHT, 2005; RILLIG et al., 2003b), o que sugere que essa molécula desempenha um papel importante no estoque desses elementos no solo (RILLIG et al., 2001, 2003b), constituindo-se num importante reservatório global de C (TRESEDER; TURNER, 2007). Em áreas degradadas e revegetadas com eucalipto e leguminosas, foi observada uma alta correlação (r = 0,82; p < 0,05) entre a proteína do solo reativa a Bradford (PSRB) e o carbono orgânico (SILVA, 2009). O mesmo tipo de correlação foi observado em solos temperados submetidos a três tipos de manejo (monocultivo de milho, floresta não manejada e campo nativo), sugerindo que o conteúdo de C e PSRB estão sujeitos a dinâmicas similares de deposição e decomposição (BEDINI et al., 2007). A quantidade de glomalina produzida pelos FMAs pode variar de acordo com a espécie e com o hospedeiro (WRIGHT, 2000). Além disso, grande parte dos trabalhos realizados até o momento demonstra que a quantidade de glomalina é sensível às práticas de manejo do solo (PURIN, 2005; RILLIG et al., 2003b; WRIGHT; ANDERSON, 2000; WRIGHT et al., 1999).

A correlação positiva da glomalina com a estabilidade de agregados em água, bem como com o carbono, e a resposta destes componentes às mudanças no tipo de uso do solo, sugerem que a glomalina possa ser utilizada como um indicador de recuperação de ecossistemas (RILLIG et al., 2003a).

2. Métodos de extração e quantificação

A glomalina, termo geral utilizado para denominar essa glicoproteína, pode ser classificada de acordo com os processos de extração e quantificação. No momento há uma grande discussão em relação a sua denominação. Diversos autores têm sugerido termos em função basicamente da metodologia utilizada para a extração e quantificação da glomalina (JANOS et al., 2008). De acordo com Rillig (2004) e Rosier et al. (2006), a glomalina, quando quantificada pelo método de Bradford, pode receber as seguintes denominações: proteína do solo reativa a Bradford (PSRB), a qual é obtida com extrator de alta molaridade (citrato de sódio 50 mM, pH 8,0) e ciclos sucessivos de autoclavagem (121 oC, 60 minutos); e PSRB facilmente extraível (PSRB-FE) que é a fração da PSRB removida com apenas um ciclo de extração, quando os solos são autoclavados a 121 oC por 30 minutos, em 20 mM de citrato de sódio, pH 7,0. Quando o método de quantificação utilizado é o ELISA, os termos utilizados são: proteína do solo imunorreativa (PSIR) que é a parte da fração PSRB que exibe imunorreatividade com o anticorpo MAb32B11, produzido por meio de esporos de Glomus intraradices; e PSIR – facilmente extraível (PSIR-FE), parte da fração PSRB-FE que exibe imunorreatividade com o anticorpo MAb32B11(RILLIG, 2004; ROSIER et al., 2006; WRIGHT; UPADHYAYA, 1996).

2.1. Método de extração da glomalina

O procedimento para extração da glomalina inicialmente foi estabelecido por Wright e Upadhyaya (1996, 1998) e Wright et al. (1996) e tem sido amplamente utilizado para diferentes solos e condições ambientais. O protocolo descrito abaixo se baseia no procedimento desses autores com pequenas modificações.

2.1.1. Extração da proteína total

Durante a etapa de extração das amostras de interesse, é extremamente importante extrair concomitantemente a glomalina presente em potes utilizados para cultivos e multiplicação de fungos micorrízicos arbusculares. Esse material será utilizado para a obtenção da curva padrão para a quantificação por ELISA.

1) Pesar 1 g de solo e adicionar em tubos de centrífuga autoclavavéis (tubos cônicos tipo Falcon) de 15 mL.

2) Adicionar 8 mL de citrato de sódio 50 mM pH 8,0 e suspender o solo.

3) Autoclavar por 60 minutos a 121 ºC.

4) Centrifugar a 5.000 rpm (3.200 g) por 15 minutos imediatamente após a extração (autoclavagem).

5) Remover o sobrenadante contendo a proteína e estocar a 4 ºC.

6) Repetir as etapas de 2 a 5 até que o sobrenadante tenha uma aparência amarelo-clara (Figura 1).

Figura 1. Aparência das amostras após 10 ciclos de extração, sendo a coloração mais escura os ciclos inicias e a mais clara os ciclos finais.
Foto: Cristiane Figueira da Silva

7) Medir o volume total do sobrenadante obtido nos vários ciclos e estocar a 4 ºC por no máximo 2 a 4 semanas.

8) Quantificar a glomalina total por meio dos métodos de Bradford e/ou ELISA.

2.1.2. Extração da proteína (glomalina) facilmente extraível

1) Pesar 1 g de solo e adicionar em tubos de centrífuga autoclavavéis (tubos cônicos tipo Falcon) de 15 mL.

2) Adicionar 8 mL de citrato de sódio 20 mM pH 7,4 e suspender o solo.

3) Autoclavar por 30 minutos a 121 ºC. Utilizar apenas um ciclo de autoclavagem.

4) Centrifugar a 5.000 rpm (3.200 g) por 15 minutos imediatamente após a extração (autoclavagem).

5) Remover o sobrenadante contendo a proteína e estocar a 4 ºC.

6) Medir o volume total do extrato e estocar a 4 ºC por no máximo 2 a 4 semanas.

7) Quantificar a glomalina facilmente extraível por Bradford e/ou ELISA.

2.2. Métodos de quantificação

2.2.1. Bradford para quantificação da glomalina (BRADFORD, 1976; WRIGHT et al., 1996)

1) Preparar a curva padrão, usando albumina de soro bovino (BSA):

A. Preparar a solução estoque de BSA na concentração de 50 ng/µL em tampão PBS, pH 7,2 e congelar a -20 ºC.

B. A partir da solução estoque, preparar as diluições para a curva padrão de acordo com a faixa de proteína esperada para as amostras, conforme o exemplo abaixo (Tabela 1).

Tabela 1. Curva padrão com BSA para quantificação de proteína pelo método Bradford.

Identificação do poço

µg/poço

Solução estoque de BSA (µL)

TFS (µL)

Branco

0

0

200

Padrão 1

1,25

25

175

Padrão 2

2,5

50

150

Padrão 3

3,75

75

125

Padrão 4

5

100

100

Fonte: adaptado de Bradford (1976) e Wright et al. (1996).

2) Distribuir o extrato na placa de 96 poços. O volume de extrato a ser adicionado dependerá da coloração da amostra conforme exemplo na Tabela 2. O volume de extrato deverá ser adicionado de forma que a quantidade de proteína em cada amostra não ultrapasse a faixa de concentração utilizada na curva padrão.

Tabela 2. Volume de extrato a ser adicionado no poço em função da coloração da amostra.

Cor da amostra

µL amostra/poço

Amarelo claro

> 50

Amarelo amarronzado

25–50

Marrom

10–25

Marrom avermelhado

5–10

Preto

1–5

Fonte: adaptado de Bradford (1976) e Wright et al. (1996).

3) Adicionar o tampão PBS em quantidade suficiente para completar um volume de 200 µL em cada poço; por exemplo, caso seja adicionado 5 µL da amostra em cada poço, deverá ser adicionado 195 µL de PBS.

4) Adicionar 50 µL de corante de Bradford (Bio-Rad, cat nº 500-0006) em cada poço, misturando levemente com a pipeta para evitar a formação de bolhas. Caso não ocorra uma boa homogeneização, selar a placa com filme plástico apropriado e misturar em agitador tipo Vortex, centrifugar rapidamente e realizar a leitura em espectrofotômetro com filtro para 590 nm ou 595 nm. Esta etapa deverá ser realizada em um tempo máximo de 5 minutos.

5) A partir dos dados de espectrometria determinar a equação para a curva padrão e utilizar esta equação para determinar a quantidade de proteínas nos poços contendo o extrato.

6) A partir destes dados, calcular a quantidade de proteína em mg/g de solo utilizando a seguinte equação:

2.2.2. ELISA para quantificação da glomalina

A metodologia de ELISA permite a quantificação da glomalina de maneira específica pelo uso de dois anticorpos: o anticorpo primário específico para glomalina e o secundário conjugando a biotina, bem como a metodologia descrita por Wright et al. (1996), que produziram um anticorpo monoclonal (MAb32B11) contra esporos Glomus intraradicies capaz de reconhecer a glomalina de todos os fungos do filo Glomeromycota testados.

A) Preparação da curva padrão

1) A partir da amostra de referência (proteína extraída de hifas frescas de FMA ou de solo de potes de cultivos), preparar uma solução estoque com 0,8 ng/µL em PBS. A proteína deve estar com aproximadamente 100% de imunorreatividade.

2) Adicionar 50 µL de tampão PBS em 4 poços para obtenção do branco.

3) Adicionar 100 µL da solução estoque (0,8 ng/µL) em dois poços.

4) Preparar 6 poços para a diluição seriada adicionando 50 µL de tampão PBS.

5) Preparar uma diluição seriada transferindo 50 µL do poço contendo a solução estoque para um poço vizinho contendo 50 µL de tampão PBS. Misturar lentamente com auxílio da micropipeta.

6) Repetir a etapa de diluição pelo menos 4 vezes para obtenção de uma curva com faixa de concentração de 0 a 0,8 ng/µL em cada poço.

7) Após a última diluição, retirar 50 µL dos últimos poços para manter o volume de todos os poços semelhante.

B) Preparação das amostras

1) Adicionar 20 ng de proteína por poço a partir da quantificação realizada pelo Bradford.

2) Completar o volume do poço para 50 µL com PBS. Para facilitar a distribuição das amostras e do tampão PBS, a concentração das amostras pode ser ajustada de forma a permitir a adição de um mesmo volume de amostra e tampão nos poços.

3) Centrifugar por 1 minuto a placa com todas as amostras, o branco e a curva.

4) Deixar a placa aberta por pelo menos 16 horas para evaporação completa de toda a solução.

5) Adicionar 250 µL de leite em pó desnatado (2% em PBS) por poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.

6) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa.

7) Adicionar 50 µL por poço do anticorpo primário MAb32B11 diluído (1 mL em 5 mL de PBS) e incubar por 1 hora sob leve agitação.

8) Descartar o sobrenadante, secar a placa com papel toalha e lavar 3 vezes os poços com PBST.

9) Adicionar 50 µL do anticorpo secundário IgM biotinilado (Sigma, Cat. B-6398) diluído (1:2.500 em BSA 1%) e incubar sob leve agitação por 1 hora.

10) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa e lavar 3 vezes os poços com PBST.

11) Adicionar 50 µL de ExtrAvidin peroxidase (Sigma, Cat. E-8386) diluído (1:2.000 em BSA 1%) e incubar por 1 hora sob leve agitação.

12) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa e lavar 4 vezes os poços com PBST.

C) Desenvolvedor de cor

O desenvolvedor de cor deve ser preparado imediatamente antes do uso; caso esteja analisando mais de uma placa ao mesmo tempo, o desenvolvedor deve ser preparado para cada placa individualmente.

1) Preparo das soluções:

Tampão citrato: para 100 mL, utilizar 1,05 g de ácido cítrico e ajustar o pH para 4 com NaOH 2 ou 6 N.

Solução de ABTS: utilizar 0,015 g de 2,2´azino-di-(ácido 3-etilbezetiaolina sulfônico) em 1 mL de água.

Peróxido de hidrogênio: diluir 1:1.000 de H2O2 30% em PBS.

2) Preparar o desenvolvedor de cor de acordo com a Tabela 3.

Tabela 3. Preparação da solução para desenvolvimento da cor de acordo com o volume desejado.

Tampão citrato (mL)

Solução ABTS (µL)

H2O2 30% (µL)

10

200

10

7,5

150

7,5

5

100

5

2,5

50

2,5

Fonte: Wright et al. (1987, 1996).

3) Adicionar 50 µL do desenvolvedor de cor por poço e incubar por 15 minutos sob leve agitação.

4) Fazer a leitura em espectrofotômetro utilizando o filtro de 405 nm e determinar a concentração em mg/g a partir da utilização da equação obtida com a curva padrão.

5) A partir desses dados, calcular a quantidade de proteína em mg/g de solo utilizando a seguinte equação:

6) A partir da quantificação da proteína total obtida por Bradford e os valores obtidos por ELISA, é possível calcular a porcentagem de proteína imunorreativa (% IR) utilizando a seguinte equação:

3. Considerações finais

Diversos indicadores químicos, físicos e biológicos têm sido utilizados para avaliação da qualidade do solo, bem como sua alteração em função do tipo de manejo. Para ser um bom indicador, é necessário que o mesmo não se modifique frente a variações ambientais, mas que ao mesmo tempo seja sensível às modificações impostas pelo manejo. Além disso, deve ser capaz de definir os processos do ecossistema (DORAN, 1997). A glomalina, por atender a essas premissas e por estar fortemente correlacionada com algumas propriedades do solo, pode ser considerada como uma alternativa para avaliação da qualidade do solo.

A quantificação da glomalina vem sendo realizada por dois métodos: Bradford e ELISA. O método Bradford vem sofrendo diversas críticas, principalmente por não ser um método de extração específico para a glomalina. Proteínas presentes em folhas de plantas podem estar presentes após a extração da glomalina como observado por Rosier et al. (2006). Como o Bradford quantifica a proteína total presente na amostra e não apenas a glomalina, pode haver uma superestimativa da quantidade de glomalina. Além disso, compostos polifenólicos como tanino (HALVORSON; GONZALEZ, 2006, 2008; WHIFFEN et al., 2007) e ácidos húmicos (WHIFFEN et al., 2007) também podem ser encontrados em extratos de proteína do solo relacionados à glomalina (SCHINDLER et al., 2006) e podem influenciar na quantificação da proteína do solo reativa a Bradford (PSRB).

Embora o método Bradford superestime a quantidade de glomalina e seu uso seja bastante questionado na literatura (HALVORSON; GONZALEZ, 2006, 2008; WHIFFEN et al., 2007), a correlação direta entre os resultados obtidos por este método e pelo método de ELISA indica a sua eficiência para fornecer uma estimativa relativa do conteúdo dessa glicoproteína no solo (ROSIER et al., 2006).

O método de ELISA, embora seja o mais indicado para quantificação da glomalina, visto que o anticorpo utilizado é específico para detectar essa proteína, também é influenciado pela matéria orgânica do solo (ROSIER et al., 2006). Esta pode reduzir a sensibilidade do método por meio da retenção ou interferência parcial. A retenção parcial ocorre quando os compostos orgânicos se ligam ao antígeno impedindo que o mesmo esteja disponível para a reação após o processo de extração. A interferência parcial se dá quando componentes solúveis do solo se ligam à parede das microplacas impedindo que o antígeno de interesse possa se aderir (OTTEN et al., 1997).

Embora existam algumas limitações em relação aos métodos de extração e quantificação, a PSRB por si só, ou junto com os resultados obtidos pelo método de ELISA, têm sido usados tanto para quantificar os estoques e avaliar o ciclo da glomalina no solo, como para inferir as relações funcionais entre a glomalina e as propriedades físicas e químicas do solo (HALVORSON; GONZALEZ, 2006).

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Capítulo 7
Inoculantes de fungos ectomicorrízicos

Cláudia Elizabete Pereira de Lima
Bartolomeu Acioli-Santos
Zaida Inês Antoniolli
Márcio José Rossi

1. Introdução

Os fungos ectomicorrízicos (FEM) têm grande importância no crescimento e sobrevivência de plantas de interesse florestal; e, ao colonizarem os hospedeiros, estabelecem uma série de relações inter e intraespecíficas, com benefícios mútuos para os simbiontes. Nessa associação, a planta fornece ao fungo fotossintatos, e este, a partir do micélio circundante à raiz, capta água e nutrientes do substrato e os transfere à planta (READ, 1999). Os benefícios proporcionados à planta incluem aumento na absorção de nutrientes (ALVES et al., 2001), resistência a patógenos de raízes (MORIN et al., 1999; SEN, 2001), tolerância às condições adversas do solo, como excesso de metais pesados (KHAN et al., 2000; TICHELEN et al., 1999) e estresse hídrico (BOGEAT-TRIBOULOT et al., 2004).

A habilidade dos FEM para colonizar e beneficiar as plantas varia de acordo com o isolado fúngico, a espécie vegetal e as condições ambientais (OLIVEIRA et al., 1994; SMITH; READ, 2008). Assim, estudos sobre as melhores combinações fungo-hospedeiro são necessários, para que se possa alcançar o controle da micorrização (GARBAYE, 1984). Esse processo inicia-se com a identificação, o isolamento e a seleção de FEM e culmina com a produção de inoculantes eficientes na promoção do crescimento e da sobrevivência de plantas dependentes da associação ectomicorrízica (ALVES et al., 2001; GIACHINI et al., 2000; SOUZA et al., 2004, 2008).

A dificuldade para produção de inoculantes em escala industrial tem sido uma das principais limitações ao uso rotineiro dos fungos ectomicorrízicos nos programas de reflorestamento.

Assim, neste capítulo, serão abordados os principais métodos utilizados para a produção de inoculantes de fungos ectomicorrízicos, apresentando-se as principais vantagens e desvantagens de cada método e o estado atual de conhecimento e aplicação.

2. Isolamento de fungos ectomicorrízicos

As técnicas mais simples de isolamento de FEM para obtenção de culturas puras utilizam os corpos de frutificação (ascomas e basidiomas) desses fungos (BRUNDRETT et al., 1996; MOLINA; PALMER, 1982). O isolamento pode ser feito diretamente no campo, ou no laboratório, o mais cedo possível após a coleta. As frutificações devem ser jovens e cuidadosamente abertas para obter tecidos internos que não tenham sido expostos ao ar ou contaminados com solo ou por insetos. Para os fungos que possuem o himênio excluso, por exemplo, os cogumelos, os tecidos do ápice do estipe são os mais indicados. Para os que possuem o himênio incluso, os tecidos imaturos internos são os ideais.

Geralmente, quanto mais jovem o corpo de frutificação, maiores as chances de isolamento, pois os espécimes velhos têm maior possibilidade de contaminação com bactérias e/ou outros fungos. Alguns FEM são mais fáceis de ser isolados a partir dos corpos de frutificação, por exemplo, as espécies de Amanita, Pisolithus, Scleroderma e Rhizopogon, enquanto espécies de Russula, Laccaria e Tuber são mais difíceis de isolamento, quer por seus diminutos corpos de frutificação (ex.: Laccaria), quer pela dificuldade de crescer nos meios de cultura convencionais (Russula, Tuber).

Os FEM também podem ser isolados a partir das micorrizas (CHU-CHOU, 1979). Essa é uma tarefa delicada que exige maior número de tentativas. Uma grande desvantagem desse procedimento reside no fato de que a identificação do fungo simbionte torna-se muito mais difícil, a menos que se conheça antecipadamente o fungo colonizador (inoculação controlada). Além disso, é necessária a desinfestação superficial da raiz com produtos químicos, como hipoclorito de sódio, bicloreto de mercúrio, entre outros, que, além de sua toxidez para o manipulador, podem inviabilizar o fungo, tornando o isolamento um processo ainda mais complicado.

Vários meios de cultura podem ser usados para o isolamento (BRUNDRETT et al., 1996), sendo preferível usar meios mais pobres e de baixo pH para a primeira etapa, diminuindo assim os riscos de contaminação por bactérias (CHU-CHOU, 1979). Na Tabela 1 é apresentada a formulação do meio de Hagem (1910), modificado e suplementado com antibióticos. Depois de detectado o crescimento do fungo a partir dos pedaços de tecido ou das micorrizas, é necessária sua repicagem para meio mais rico para garantir a sobrevivência da cultura. Igualmente uma grande variedade de meios pode ser usada, destacando-se o meio Melin-Norkrans modificado (MARX, 1969) (Tabela 2), que também pode ser complementado com micronutrientes (Tabela 3).

Tabela 1. Meio de cultura Hagem para isolamento de fungos ectomicorrízicos.

Componente

Quantidade

NH4Cl

0,5 g

KH2PO4

0,5 g

MgSO4.7H20

0,5 g

Glicose

5,0 g

Tiamina – HCl

50,0 µg

FeCl3 (solução a 1%)

0,5 mL

Ágar

10,0 g

Água destilada

1.000,0 mL

Fonte: Hagem (1910).

Tabela 2. Meios de cultura recomendados para cultivo de fungos ectomicorrízicos.

Componente

MNM

(g/L)(1)

PGK

(g/L)

MC

(g/L)

Glicose

10,0

10,0

10,0

Peptona de soja

-

3,33

2,5

Extrato de levedura

-

0,67

-

Extrato de malte

3,0

-

1,5

CaCl2

0,050

-

-

NaCl

0,025

-

-

NH4NO3

-

1,0

0,7

(NH4)2HPO4

0,75

-

-

NH2CONH2

-

-

0,10

KH2PO4

0,50

0,264

0,185

K2HPO4

-

0,628

0,440

MgSO4.7H2O

0,15

0,330

0,230

CuSO4.5H2O

-

0,0021

0,0015

MnCl2.4H2O

-

0,0004

0,0004

ZnSO4.7H2O

-

0,0006

0,0004

FeSO4.7H2O

-

0,0005

0,0003

FeCl3 (solução 1%)

1,2

-

-

Tiamina – HCl

100,0 µg

-

-

Relação C/N

14/1

10/1

13/1

(1) Exceto para FeCl3 e Tiamina-HCl, que têm unidades diferentes.

Tabela 3. Micronutrientes para complementação dos meios de cultura.

Componente

Quantidade (g/L)

Na2Mo4.2H2O

0,00200

H3BO3

0,00300

CoCl2.6H2O

0,00003

KI

0,00075

Fonte: Rossi (2006).

Antes da repicagem para meio mais rico, o isolamento deve ser cuidadosamente inspecionado para detectar o crescimento do fungo e eventuais contaminações. Esse exame pode ser feito a olho nu e ao microscópio estereoscópico. A maioria dos FEM tem crescimento lento, e as culturas devem ser monitoradas diariamente para observação da emergência de hifas a partir do material inoculado. Isso pode ser visualizado em microscópio estereoscópico, em pequeno aumento (20 a 30 vezes). Também é necessário considerar que a velocidade de crescimento dos FEM é variável, dependendo da espécie ou mesmo do isolado, e alguns podem parar de crescer logo após o isolamento.

Características como a cor e a textura do micélio podem ser valiosas para distinção de espécies. Muitos basidiomicetos são reconhecidos em cultura pela presença de fíbulas em suas hifas. Para os ascomicetos ectomicorrízicos, o reconhecimento não é tão fácil, pois esses não apresentam essas estruturas. Em adição, alguns fungos contaminantes podem não esporular rapidamente, o que dificulta distingui-los dos FEM em cultura. A natureza micorrízica de alguns isolados só poderá ser confirmada pela formação de micorrizas em testes de inoculação usando hospedeiro suscetível.

2.1. Material e meio de cultura

– Corpos de frutificação frescos coletados no campo.

– Placas de Petri com meio de cultura sólido Hagem modificado.

– Pinças.

– Bico de Bunsen.

– Álcool etílico 70%.

– Bisturis ou outro tipo de lâmina.

– Canetas para identificação.

– Estufa incubadora a 25 ºC.

– Capela de fluxo laminar.

– Placas de Petri com meio MNM sólido com 0,2% de carvão ativo para posterior repicagem dos fungos isolados.

O meio deve ser esterilizado a 120 ºC durante 20 minutos. O pH após autoclavagem deverá estar entre 4,5 e 4,8. Acrescentar ao meio fundido (50 ºC), no momento da distribuição, os seguintes antibióticos:

– Cloranfenicol – 100 mg, dissolvido em 1 mL de etanol (p.a.).

– Rifampicina – 100 mg, dissolvido em 1 mL de metanol (p.a.).

A acidez do meio, seu baixo teor de açúcar e os antibióticos retardam ou suprimem o crescimento de bactérias, mas mutantes resistentes espontâneos podem aparecer rapidamente. É necessário repicar o fungo para um meio de cultura de uso rotineiro (ex.: MNM) ou contendo 50 mg/L de rifampicina logo que o fungo começar a crescer. Os antibióticos devem ser manipulados no momento do preparo do meio de cultura para evitar sua precipitação. A rifampicina é tóxica, devendo-se utilizar luvas e máscara contra pó quando da pesagem e preparo da solução.

2.1.1. Procedimento

1. Limpar os corpos de frutificação com ajuda de um pincel para eliminar o solo agregado.

2. Esterilizar pinças e lâminas com álcool e fogo.

3. Abrir os corpos de frutificação com a mão (não usar lâmina) para expor os tecidos internos.

4. Selecionar pequenas peças de tecido com o auxílio de pinças ou do bisturi estéreis e depositar na superfície do meio Hagem em placa.

5. Identificar as culturas.

6. Repetir essa operação com diferentes porções do corpo de frutificação.

7. Incubar em temperatura constante (25 °C).

8. Observar diariamente para detectar o crescimento miceliano; se necessário, retirar assepticamente uma porção do micélio e examinar ao microscópio.

9. Repicar para meio MNM e incubar sob as mesmas condições.

10. Uma vez confirmado o isolamento, manter os isolados por subcultura com repicagens periódicas para meio MNM (de 20 a 30 dias para utilização em cultivos e de 60 a 180 dias para armazenamento).

11. Os corpos de frutificação devem ser herborizados em seguida, para fins de identificação, colocando-se inicialmente em sacos de papel e secando-se em estufa ventilada (de 35 ºC a 40 ºC). Em seguida, armazenar o material em armário seco com naftalina ou cravo-da índia e, quando possível, depositar uma amostra em herbário credenciado.

3. Seleção de fungos ectomicorrízicos

A seleção de isolados de FEM é realizada geralmente com base na capacidade do fungo de colonizar as raízes e promover o crescimento da planta hospedeira (GARBAYE, 1990; OLIVEIRA et al., 1994; SOUZA et al., 2004, 2008). A eficiência de um isolado pode ser comprovada a partir da avaliação de parâmetros representativos do crescimento do hospedeiro, tal como matéria seca (GARBAYE, 1990; MARX et al., 1991), altura da planta, diâmetro do caule, porcentagem de sobrevivência das mudas (GARBAYE, 1990), área foliar e conteúdo nutricional da planta, sendo este último parâmetro bastante relacionado ao teor de fósforo (ALVES et al., 2001; NARLOCH, 2002; SOUZA et al., 2004).

Além da infectividade e eficiência do isolado em relação à planta de interesse, outros critérios de seleção de FEM podem ser utilizados. De acordo com Brundrett et al. (1996), devem ser consideradas as seguintes características:

• Facilidade de isolamento e cultivo em meios convencionais e em substratos disponíveis, a baixo custo. A maioria dos fungos ectomicorrízicos é de crescimento lento, razão pela qual é preferível selecionar os fungos que apresentem maior velocidade de crescimento.

• Competitividade na interação desse fungo com a microbiota nativa do solo.

• Baixa especificidade para o conjunto de hospedeiros importantes na região.

• Adaptabilidade às condições climáticas e edáficas na região.

Outro critério de grande importância, mas pouco considerado na prática, está relacionado com a capacidade de multiplicação do fungo em grande escala, em que a cinética de crescimento, avaliada em cultivo durante um estudo nutricional, é também fundamental para a etapa de seleção. Um isolado fúngico de FEM, com ótima capacidade de promover o crescimento da planta, pode ser inviável para a etapa de produção do inoculante em escala comercial caso apresente velocidade de crescimento muito baixa. Considerando que comparados aos microrganismos de vida livre, os fungos ectomicorrízicos apresentam baixa velocidade de crescimento (GARBAYE, 1990; ROSSI, 2001, 2006; ROSSI et al., 2002, 2003, 2005), esse fator torna-se muito importante na seleção de isolados. Além dos problemas técnicos na operação dos biorreatores, períodos longos de cultivo, acima de 20 dias, podem comprometer a viabilidade do inoculante, em razão da diminuição do potencial do inóculo (LAPEYRIE; BRUCHET, 1985), além do acúmulo de metabólitos tóxicos (DUARTE et al., 2008).

Assim, estudos da cinética de crescimento do fungo e também aqueles que envolvam o conhecimento das melhores combinações na relação fungo-planta-ambiente são necessários para o adequado controle da micorrização, especialmente em programas de inoculação de mudas de essências florestais.

4. Inoculantes ectomicorrízicos

Além da seleção dos fungos mais eficientes, o controle da micorrização exige o estabelecimento de métodos de produção de inoculantes de FEM, seja em pequena ou larga escala e com diferentes finalidades (experimental ou aplicada). O inóculo fúngico deve conter essencialmente micélio ativo e estar livre de contaminação por outros organismos. Embora a eficiência de um inoculante seja, em última análise, determinada por sua capacidade de propagar a associação, os seguintes critérios devem ser considerados:

a) Eficiência na promoção do crescimento da planta.

b) Baixa relação custo-benefício.

c) Facilidade e constância de produção com a tecnologia disponível.

d) Facilidade de transporte e armazenamento.

e) Viabilidade prolongada.

Nas últimas décadas, diversos tipos de inoculantes ectomicorrízicos, naturais ou artificiais, foram produzidos e utilizados de acordo com a necessidade e praticidade exigida.

Os inoculantes naturais podem ser produzidos à base de solo ou de esporos. Quando a inoculação é realizada a partir de solo, utilizam-se os propágulos que estão naturalmente ligados à rizosfera ou serrapilheira das plantas anteriormente existentes no local. Estruturas fúngicas como raízes colonizadas, micélio circundante à raiz, rizomorfas, esclerócios e esporos são retiradas juntamente com o solo e incorporadas às novas plantações. Entretanto, ao introduzir o solo como inóculo, o produtor adiciona, também, possíveis patógenos de raízes, plantas invasoras e outros organismos indesejáveis, interferindo negativamente no cultivo. Apesar dessas desvantagens e da elevada quantidade exigida, esse método é bastante utilizado em virtude da facilidade na obtenção de inoculante e do baixo custo que apresenta. Em alguns casos, porém, se o local de coleta for distante da nova plantação, será adicionado o custo do transporte, pois os inoculantes à base de solo são, em geral, muito volumosos.

Os inoculantes à base de solo deram importante contribuição à silvicultura em diversos países. Citam-se os casos de introdução de Pinus exóticos na América Central (BRISCOE, 1959; LAMB, 1956 citados por MIKOLA, 1973) e na África (MIKOLA, 1973), tornada possível em razão da introdução de solo das plantações originais.

A inoculação à base de esporos utiliza ascomas ou basidiomas coletados em plantações ou florestas (MARX; CORDELL, 1990). Esse tipo de inoculante pode ser aplicado de diferentes formas: na superfície das sementes (MARX et al., 1984) de modo semelhante ao empregado para inoculação de sementes de soja com rizóbios; aplicado seco e misturado ao substrato de plantio (CASTELLANO; TRAPPE, 1985); aplicado na forma de suspensão em água (ex.: Ecto® Spore Spray da empresa norte americana Plant Health Care Inc.); aplicado na forma de pellets; ou, ainda, encapsulado em hidrogel.

Assim como ocorre com os inoculantes à base de solo, a inoculação com esporos não assegura a eficiência dos FEM em promover o crescimento do hospedeiro. Grandes quantidades de inóculo são exigidas quando da aplicação, o que a torna uma técnica limitada, já que a produção de frutificações é um fenômeno sazonal. Exemplo expressivo de sua utilização é representado pela produção de trufas na França, onde plantas inoculadas com esporos de espécies de Tuber, e colonizadas por esses fungos, são produzidas e vendidas a produtores (CHEVALIER; GRENTE, 1979). Na região Noroeste dos Estados Unidos, o Departamento de Agricultura (Usda) desenvolveu um programa bem sucedido de inoculação de coníferas em viveiro utilizando esporos de fungos ectomicorrízicos em suspensão (CASTELLANO; MOLINA, 1989; MARX et al., 1992). Além das trufas, os FEM que produzem grandes quantidades de frutificações e de esporos são gasteromicetos como os gêneros Pisolithus, Rhizopogon e Scleroderma.

5. Inoculantes ectomicorrízicos micelianos

Várias pesquisas têm procurado desenvolver inoculantes alternativos que possam contribuir para eliminar ou reduzir as limitações impostas pelos inoculantes naturais. Os inoculantes micelianos, constituídos pelo sistema vegetativo do fungo (micélio) produzido em culturas puras, parecem preencher esses requisitos. A grande vantagem é que se pode testar previamente a infectividade e a eficiência dos fungos em relação à planta de interesse, antes de sua introdução nos sistemas de produção de mudas (MARX, 1980).

As culturas puras são obtidas pelo isolamento do fungo a partir de frutificações, esporos ou outros propágulos. Essas culturas são mantidas e multiplicadas assepticamente em meio de cultura apropriado, contendo nutrientes para o crescimento vegetativo dos FEM. O micélio retirado dessas culturas pode ser utilizado diretamente para inocular plântulas in vitro ou para inocular frascos com meio de cultura líquido que, após crescimento do micélio e trituração em liquidificador, irá formar uma suspensão miceliana. Tanto o micélio original quanto as suspensões micelianas podem ser utilizadas para inocular frascos com uma mistura turfa-vermiculita em meio de cultura líquido, para se obter inoculantes em substrato sólido. Alternativamente, após obtenção das suspensões micelianas em meio líquido, esse material pode ser encapsulado em alginato de cálcio (MAUPERIN et al., 1987), produzindo esferas de tamanho variável, sendo esta uma técnica mais sofisticada e de uso mais recente (ROSSI, 2001, 2006).

Assim, os isolados previamente selecionados, mais eficientes na colonização e na promoção do crescimento das plantas, podem ser multiplicados e aplicados em larga escala. Porém, esse tipo de inoculante requer mão de obra especializada e fungos que possam ser isolados e que cresçam em meio de cultura (BRUNDRETT et al., 1996), não sendo, portanto, aplicável a todos os FEM. Alguns desses fungos não foram, até o presente, cultivados em meio de cultura, ou o fizeram com crescimento muito lento para uma produção economicamente viável. O custo relativamente alto da técnica, quando comparada aos inoculantes naturais, também é um fator que deve ser considerado.

Os inoculantes micelianos podem ser produzidos por dois procedimentos: cultivo em substrato sólido e cultivo submerso. Os dois processos utilizam meios de cultura artificiais. O meio MNM e variações do meio Pridham-Gottlieb – PGK e MC (ROSSI et al., 2002, 2007) têm sido utilizados com sucesso para o cultivo axênico de FEM. A composição desses meios é apresentada nas Tabelas 2 e 3, sendo que a quantidade de nitrogênio do meio MNM, originalmente de 0,25 g/L (C/N 50/1, mais apropriada para o armazenamento das culturas), foi alterada para 0,75 g/L, pois a modificação na formulação original feita por Marx (1969) deixou o meio desbalanceado para a finalidade de produção de biomassa. Também se recomenda a adição de 0,2% de carvão ativo neutralizado para os meios de cultura sólidos.

5.1. Cultivo em substrato sólido

No cultivo em substrato sólido, o fungo é multiplicado em material poroso suplementado com meio nutritivo líquido. Para a produção dos inoculantes de FEM, tem sido utilizada a mistura turfa-vermiculita embebida com meio de cultura em frascos de vidro ou em sacos plásticos, munidos de membranas ou dispositivos para troca de gases (MARX et al., 1992). Essa técnica é uma adaptação das técnicas de produção de inoculantes de fungos comestíveis. A vermiculita promove suporte mecânico às hifas do fungo, que crescem entre suas lâminas, mantendo sua viabilidade até a formação das raízes receptivas quando da inoculação, e a turfa permite o ajuste do pH a um valor mais adequado, na faixa usual entre 4,8 e 5,5 (ALVES et al., 2001; GARBAYE, 1990; SMITH; READ, 2008). Essa técnica tem sido bastante útil para inoculações em pequena escala, mas torna-se pouco viável quando se trata da produção de grandes quantidades de inoculante, normalmente necessárias para inocular o grande volume de mudas produzidas pelas empresas florestais (GARBAYE, 1990; LE TACON et al., 1983; SMITH; READ, 2008).

Inoculantes produzidos por substrato sólido (mistura turfa-vermiculita) têm sido utilizados extensivamente em alguns países, notadamente França e Estados Unidos, onde se registraram experiências de industrialização. No primeiro país, inoculante de Laccaria laccata (Scop.) Cooke foi produzido e utilizado comercialmente na década de 1980 por uma associação entre um instituto de pesquisa, viveiristas e uma empresa de produção de inoculantes, mas o empreendimento teve curta duração. Nos Estados Unidos, inoculantes de P. tinctorius (Pers.) Coker & Couch e de Hebeloma crustuliniforme (Bull.) Quél. constituem a linha de inoculantes Mycortree® da empresa Plant Health Care Inc.

A seguir, é descrito um protocolo para produzir inoculante em substrato sólido, que permite obter inoculante suficiente para 450 mudas. Para um número menor ou maior de plantas, as quantidades devem ser multiplicadas pelo fator de redução ou aumento de escala.

5.1.1. Material de meios de cultura

– Filme de PVC ou parafilme.

– Cortador de discos de meio de cultura com micélio (tubo de aço inox com Ø 7 mm a 8 mm e 6 cm comprimento, com um lado afiado).

– 6 frascos de vidro tipo conserva de 1 L de capacidade. As tampas devem ter 2 furos de Ø 10 mm para troca de gases. A esterilidade deve ser garantida pela colocação de 2 tiras de esparadrapo tipo Micropore® nos furos, uma internamente e outra externamente (Figura 1).

– 2,7 L de vermiculita com partículas tamanho médio.

– 0,7 L de turfa peneirada.

– 1,2 L de meio de cultura.

– 4 placas com meio de cultura sólido.

– Utensílios básicos para trabalhar em capela (alça de platina, bisturi, álcool etílico, algodão hidrofílico).

5.1.1.1. Inóculo e condições de cultivo

– 2 a 4 placas com o fungo cultivado durante 20 a 30 dias (Figura 1).

– Incubar em estufa a 25 °C.

– Todos os procedimentos com o fungo deverão ser realizados em capela de fluxo laminar.

5.1.1.2. Procedimento

1. Cortar cerca de 55 discos de cultura com micélio e distribuir em 2 placas com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias para verificar a viabilidade por meio da visualização, sob lupa, de hifas novas emergindo dos discos.

2. Preparar uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de 4:1.

3. Distribuir essa mistura em frascos de vidro até 1/2 do volume. Adicionar à mistura um volume de meio de cultura líquido de 45% do volume do substrato seco (225 mL para 500 mL de substrato) (Figura 1).

Figura 1. Representação de um sistema de produção de inoculante de FEM em substrato sólido. A partir da cultura inicial são feitos os discos de inóculo que, após a confirmação da viabilidade, são inoculados no substrato sólido dentro de frascos.
Ilustração: Márcio José Rossi

4. Autoclavar a mistura durante 20 minutos a 120 °C.

5. Inocular em capela de fluxo laminar o substrato de cada frasco com 8 discos de cultura com micélio (ou suspensão miceliana conforme o procedimento do item 5.2 – nesse caso diminuir o volume de meio para 35%).

6. Tampar e selar as bordas dos frascos com filme de PVC.

7. Incubar a 25 °C durante 30 dias, examinando o crescimento do fungo de 2 em 2 dias.

8. Após a colonização total do substrato, o inoculante pode ser armazenado sob refrigeração ou prontamente utilizado. Inocular uma pequena porção em 2 placas com meio sólido para verificar a viabilidade antes do uso.

Existem recomendações para lavagem do inoculante para remoção de açúcares residuais antes do uso. Essa operação resulta numa perda considerável de biomassa. Por outro lado, foi verificado que o inoculante lavado pode manter uma excelente viabilidade por até 6 meses de armazenamento (ROSSI, 2006). Durante o longo período de crescimento, além da incorporação de água pelo fungo, ocorre uma perda de umidade significativa através dos furos da tampa do frasco. Assim, a lavagem proporciona uma homogeneização da umidade, o que favorece a manutenção da viabilidade. O balanceamento correto do meio de cultura permite a exaustão completa dos açúcares e dispensa a etapa de lavagem. Desse modo, apenas uma hidratação do inoculante seria necessária para o caso de estocagem.

5.1.1.3. Aplicação do inoculante

O inoculante deve ser misturado ao substrato de plantio previamente umedecido na proporção de 10% em volume. O fósforo é um fator determinante para a colonização das raízes pelo fungo; se muito elevado, inibirá a colonização. Recomenda-se 0,25 g/recipiente de plantio (geralmente tubete de PVC de 60 mL) de adubo de liberação lenta (tipo Osmocote®) com N-P-K 14-8-8, o que equivale a 4 mg de P por planta. O substrato de plantio deve ser distribuído nos tubetes previamente desinfetados (com hipoclorito de sódio a 2% durante 12 horas e posterior enxágue), seguido da semeadura das sementes.

5.2. Cultivo em meio líquido

Uma técnica mais sofisticada consiste no cultivo desses fungos em meio líquido, permitindo o uso de fermentadores, com posterior inclusão (encapsulamento) do micélio num gel (LE TACON et al., 1983, 1985; MAUPERIN et al., 1987; ROSSI, 2006). Estudos em viveiros demonstraram que esse inoculante é mais eficiente que o inoculante sólido, provavelmente em virtude da maior proteção do micélio no interior do gel contra fatores bióticos e abióticos. Além disso, apresenta maior facilidade de armazenamento e transporte e maior longevidade, permitindo, dessa forma, reduzir a quantidade a ser empregada para inoculação das plantas (KUEK et al., 1992; LE TACON et al., 1983, 1985).

A primeira experiência de produção comercial de inoculante de FEM encapsulado ocorreu na Austrália na década de 1990 com o nome comercial Mycobeads® pela Biosynthetics Pty. Ltd. (KUEK et al., 1992). Nessa mesma década, a França iniciou a produção de inoculante ectomicorrízico em larga escala por esse método. Trata-se de uma união de empresas viveiristas (GIE Forêt-Mycorhizes) para produção de mudas de Pseudotsuga menziesii (Mirbel) Franco colonizadas por Laccaria bicolor (Maire) P.D. Orton, sob licença, supervisão e controle de qualidade do ‘Institut National de la Recherche Agronomique’ (Inra). O fungo é cultivado em meio líquido em biorreator e, em seguida, fragmentado e encapsulado em alginato de cálcio. Com esse método, reduziu-se consideravelmente a dose de inoculação necessária, em comparação com o inoculante em turfa-vermiculita. Apenas 100 mg de micélio (base seca) são suficientes para inocular 1 m2 de viveiro.

A técnica é promissora, mas sua utilização continua restrita apesar de quase duas décadas de estudos. A principal razão para isso está relacionada a dificuldades na multiplicação dos fungos ectomicorrízicos por processos submersos. O crescimento lento dos fungos ectomicorrízicos, em comparação aos fungos sapróbios, contribui para contaminações frequentes que inviabilizam a cultura. Contribui, também, para essa situação a falta de conhecimentos específicos de engenharia quanto aos fenômenos de transporte envolvidos. Partindo-se da premissa de que o fungo necessita de contato com nutrientes e com o oxigênio, a fermentação submersa é, apesar das dificuldades apontadas, a mais indicada para a produção comercial desses inoculantes.

Quando se necessita de uma maior transferência de massa gás-líquido, em condições de baixo cisalhamento, biorreatores do tipo airlift são mais apropriados. Estes são reatores pneumáticos, diferentes do reator de coluna de bolhas, dividindo-se em duas zonas de escoamento que possibilitam a circulação de líquido em grande escala ao redor do corpo do reator. Os mesmos são de construção simples, possibilitando uma manutenção fácil e barata. Como não existem partes mecânicas móveis necessárias para a agitação, há redução do risco de contaminação, pois facilita a limpeza e a esterilização. Estudos recentes demonstraram que esse tipo de biorreator é eficiente para a produção de biomassa de FEM (ROSSI, 2001, 2006), por apresentar produtividade superior aos biorreatores convencionais utilizados para esse fim.

A seguir é descrito um protocolo para produzir inoculante encapsulado em gel de alginato, suficiente para inocular cerca de 450 mudas. Para um aumento de escala de até 15 vezes, pode-se utilizar um Erlenmeyer de 3 L de capacidade com 2 L de meio de cultura. Nesse caso, o cultivo deverá ser aerado (pode-se utilizar uma bomba de ar do tipo aquário), com o ar de entrada sendo filtrado com membrana de até 0,2 µm. Como inóculo, deve ser utilizado uma suspensão miceliana preparada conforme o procedimento descrito a seguir.

A produção em série nesse modelo pode levar à multiplicação dessa escala para inoculação, que pode chegar à ordem de 1 milhão de mudas. Para inocular acima de 1 milhão de mudas, deve-se recorrer à utilização de biorreatores onde maiores volumes podem ser operados. Nessas condições de processo, outras importantes variáveis devem ser consideradas, sendo que os estudos ainda são poucos. Maiores informações para processos em biorreatores podem ser obtidas no trabalho de Rossi (2006). É importante salientar que alguns fungos não crescem nas condições de cultivo aerado. Além disso, observou-se que durante a preparação da suspensão miceliana pode ocorrer perda da viabilidade fúngica em virtude de uma autointoxicação por produtos intercelulares, liberados pela fragmentação e oxidados ao contato com o ar. Nesse caso, enquanto essas questões não forem resolvidas, deve-se procurar selecionar isolados que não apresentem essas limitações para as condições da fermentação submersa.

5.2.1. Material e meio de cultura

– Liquidificador com jarra esterilizável.

– Filme de PVC ou parafilme.

– Pinça grande (∼25 cm).

– Cortador de discos de cultura (tubo de aço inox com Ø 7 mm e 6 cm comprimento com um lado afiado).

– Pipeta de vidro ou ponteiras de 5 mL (para pipetas automáticas) protegidas com filtro de algodão.

– 1 frasco Erlenmeyer de 500 mL com 150 mL de solução de NaCl a 0,85%.

– 0,25 g de carvão ativo neutralizado num Erlenmeyer com 50 mL de água destilada.

– 3 placas com meio de cultura sólido.

– 125 mL de meio de cultura líquido distribuídos em 5 frascos Erlenmeyer de 250 mL capacidade. Os frascos devem ser tampados com 3 camadas de papel alumínio e 1 camada externa de papel Kraft presa com barbante ou elástico.

– Utensílios básicos para trabalhar em capela de fluxo laminar (alça de platina, bisturi, álcool, algodão hidrofílico, canetas para identificação).

5.2.1.1. Inóculo e condições de cultivo

– 2 placas com o fungo cultivado durante 20 a 30 dias.

– Incubar estaticamente em estufa a 25 °C.

– Todos os procedimentos com o fungo deverão ser realizados assepticamente em capela de fluxo laminar.

– Material e meios deverão ser esterilizados a 120 °C durante 20 minutos.

5.2.1.2. Procedimento

1. Cortar cerca de 30 discos de cultura com micélio e distribuir em 1 placa com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias (Figura 2) para verificar a viabilidade por meio da visualização, sob lupa, de hifas novas emergindo dos discos.

Figura 2. Representação da produção de inoculante de FEM em meio líquido. A partir da cultura inicial, são feitos os discos de inóculo que, após a confirmação da viabilidade, são inoculados em meio líquido em frascos. O micélio obtido é fragmentado em solução salina onde, em seguida, adiciona-se o carvão ativo.
Ilustração: Márcio José Rossi.

2. Destampar os frascos com cuidado e inocular 5 discos viáveis em cada frasco. Recolocar as camadas de alumínio e selar os frascos com o filme de PVC ou parafilme (importante para garantir a assepsia do cultivo).

3. Colocar os frascos na estufa para crescimento durante 10 a 15 dias. O tempo dependerá de cada isolado fúngico.

4. Utilizando a pinça, retirar o micélio dos frascos e transferir para a jarra do liquidificador (Figura 2). Adicionar a solução salina e fragmentar durante 20 segundos.

5. Transferir a suspensão (cerca de 0,4 g/L de biomassa) para o frasco de 500 mL, adicionar o carvão ativo e agitar com cuidado.

6. Pipetar e distribuir 1,5 mL da suspensão em 1 placa e incubar para verificar a viabilidade, que deve ocorrer no período de até 1 semana, dependendo do fungo. Também é aconselhável selar as placas com 2 camadas de filme de PVC.

7. Tampar o frasco com as camadas de alumínio, selar com filme de PVC e guardar a suspensão sob refrigeração até confirmação da viabilidade.

O inoculante (suspensão miceliana) produzido por esse processo, diferentemente do inoculante obtido em cultivo sólido, em que o micélio fica protegido pelas lâminas da vermiculita, contém a biomassa pura, e, se utilizado diretamente para inoculação de mudas, poderá sofrer uma desidratação brusca em contato com o substrato de plantio, podendo perder a viabilidade. Assim, é recomendado utilizar um veículo para proteção do micélio. Para esse fim, uma técnica interessante que vem sendo empregada é a do encapsulamento em gel de alginato.

5.3. Encapsulamento da biomassa em gel de alginato de cálcio

5.3.1. Material esterilizado necessário

– 1 béquer de 500 mL.

– 1 colher de sopa de inox.

– 1 placa de Petri grande (15 cm) com barra magnética.

– 1 frasco Erlenmeyer de 400 mL, com saída para gotejamento (tubo de Ø 3 mm com registro para controle da vazão) e com barra magnética.

– 1 peneira metálica.

– 2 agitadores magnéticos (desinfetar com álcool 70%).

– 1 frasco de 300 mL com tampa para armazenamento das cápsulas.

– Filme de PVC para vedação de placas e frascos.

– Béquer de 1 L para descartes.

– 1 frasco Erlenmeyer com 100 mL de solução de NaCl a 0,85%.

– 500 mL de água destilada.

– 400 mL de solução de CaCl2 0,5 M.

– 150 mL de solução de alginato de sódio a 2%.

– 2 placas com meio de cultura MNM sólido.

– Utensílios básicos para trabalhar em capela (alça de platina, bisturi, álcool etílico, algodão hidrofílico, canetas para identificação).

5.3.1.1. Procedimento

1. Juntar a suspensão miceliana obtida pelo processo descrito anteriormente com o alginato de sódio no frasco gotejador.

2. Montar o sistema para gotejamento (Figura 3) e ligar a agitação.

Figura 3. Encapsulamento da biomassa em gel de alginato. A suspensão miceliana é misturada com o alginato e gotejada em cloreto de cálcio. Após a solidificação completa, as cápsulas são lavadas com água destilada.
Fonte: adaptada de Rossi (2006).

3. Gotejar a suspensão biomassa + alginato no cloreto de cálcio.

4. À medida que as cápsulas vão sendo produzidas, removê-las da placa e colocá-las no béquer com um pouco de CaCl2 para ocorrer a cura (gelificação total da cápsula).

5. A cura demora cerca de 30 minutos, período em que as cápsulas irão sofrer desidratação e submergirão com o aumento da densidade, indicando o final do processo.

6. Retirar as cápsulas da solução de CaCl2 utilizando a peneira e lavá-las rapidamente 3 vezes para remover o excesso de cloretos.

7. Colocar as cápsulas no frasco de 300 mL para armazenamento e adicionar um pouco de solução salina.

8. Distribuir cerca de 20 cápsulas numa placa (em duplicata e seladas com 2 camadas de filme de PVC) para verificar a viabilidade.

9. Rotular e armazenar sob refrigeração, estando pronto para utilização.

Nessas condições, o inoculante pode permanecer viável por períodos superiores a seis meses. Entretanto, essa é uma característica que depende também de cada fungo.

5.3.1.2. Aplicação do inoculante

Para experimentos em condições de casa de vegetação, com pequeno número de repetições, 2 a 3 cápsulas do inoculante podem ser aplicadas individualmente em cada recipiente de plantio, geralmente tubete de PVC de 60 mL, e logo abaixo da semente. Para inoculação em escala maior, sob condições de viveiro, o inoculante pode ser misturado ao substrato de plantio no momento da adubação. Nesse caso, como o processo de mistura e fracionamento do substrato pode interferir na distribuição das cápsulas no interior do substrato, recomenda-se uma dosagem maior do inoculante, de modo a obter pelo menos 6 cápsulas por tubete de 60 mL (ou 100 cápsulas/L).

Diferentes substratos de plantio podem ser utilizados, mas alguns cuidados devem ser observados:

1) Desinfetar o substrato de plantio e os tubetes.

2) Desinfetar a betoneira ou o recipiente onde o inoculante será misturado ao substrato de plantio, o que pode ser feito com uma solução de hipoclorito de sódio a 2%, com posterior enxágue.

3) Com o substrato já na betoneira, este deverá ser umedecido com água ou com a solução fertilizante, para só depois adicionar-se o inoculante, evitando, assim, o estresse osmótico ao fungo.

4) Depois de umedecido, adicionar o inoculante e seguir o procedimento normal.

5) Recomenda-se, conforme o caso anterior, 0,25 g/tubete de adubo de liberação lenta (Osmocote) com N-P-K 14-8-8, equivalendo a 4 mg de P por planta.

6. Considerações finais

O uso de inoculantes micelianos de fungos ectomicorrízicos tem comprovado a sua capacidade de estimular o crescimento e sobrevivência de espécies florestais. Apesar disso, poucas empresas no mundo estão voltadas para essa atividade, tanto que no Brasil não se tem conhecimento de nenhuma empresa nessa área. Uma possível explicação, além das dificuldades tecnológicas e elevado grau de especialização que o processo requer, pode estar relacionada com a demora em se verificar os resultados da inoculação no campo. Durante o período de produção das mudas, geralmente de 3 meses, sua qualidade é facilmente alcançada com os adubos e defensivos químicos; logo, o produtor de mudas parece não se interessar suficientemente para encorajar empreendimentos com elevado risco de mercado, como o de inoculante de fungos ectomicorrízicos. Um plano governamental com incentivos para o controle da micorrização poderia ser a alavanca propulsora desse negócio no Brasil, que é um País notadamente expressivo na área florestal. Embora os ganhos com o controle da micorrização sejam elevados, novas tecnologias devem ser desenvolvidas com custos baixos e de fácil aplicação. Protocolos padronizados e testados nacionalmente são necessários para implantação de um sistema de produção de inoculante e inoculação de fungos ectomicorrízicos em espécies florestais, sejam elas cultivadas para fins econômicos ou para fins de preservação ambiental. Assim, recomenda-se que as empresas da área florestal procurem os laboratórios que realizam pesquisas com esses fungos para desenvolver parcerias para implantação de áreas experimentais e, dessa forma, a difusão do conhecimento e o desenvolvimento das técnicas, despertando cada vez mais a atenção do mercado e estabelecendo de forma permanente essa promissora tecnologia.

7. Referências

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Capítulo 8
Microrganismos solubilizadores de minerais

Newton Pereira Stamford
Ely Nahas

1. Introdução

Vários microrganismos apresentam potencial para produzir ácidos, principalmente ácidos orgânicos, e, portanto, podem disponibilizar minerais contidos nas rochas. Entretanto, dentre esses, as bactérias oxidantes do enxofre, que produzem ácido sulfúrico, possuem condições privilegiadas para promover a liberação de elementos contidos nos minerais. A atuação dos microrganismos reveste-se de maior importância quando utilizam rochas com fósforo e com potássio, tendo em vista a maior necessidade destes nutrientes para as plantas, em especial o caso do fósforo em solos tropicais.

1.1. Fungos solubilizadores de minerais

Em virtude da carência generalizada de fosfato solúvel e da alta capacidade de fixação do fósforo no solo, a produtividade vegetal é geralmente limitada nas regiões de clima tropical (FRANZLUEBBERS et al., 2002; OBERSON et al., 2001). Em solos ácidos e altamente intemperizados, a quantidade de fosfato disponível é baixa, constituindo uma pequena porção dos fosfatos inorgânicos totais. Os teores de P disponível observados em diversos solos variam de 4,8 mg/kg a 12,0 mg/kg e, de uma maneira geral, constituem apenas uma porcentagem muito baixa, menos de 10% de P total do solo (BARROSO; NAHAS, 2007). Outra perspectiva que se apresenta é a transformação da forma indisponível do fosfato ou adicionada no solo para a forma disponível, acessível para absorção pelas raízes das plantas (NAHAS, 2007).

A frequência de microrganismos com habilidade de produzir fosfatases no solo, enzimas que hidrolisam o P orgânico em fosfato inorgânico, pode ser bastante alta. Enquanto 9% a 45% do total de bactérias produziram fosfatase ácida e 7% a 47% fosfatase alcalina, o número de fungos produtores da fosfatase ácida variou de 14% a 98%, e da fosfatase alcalina de 6% a 47% (NAHAS et al., 1994).

O fósforo inorgânico ocorre em geral na forma de fosfatos de ferro e de alumínio em solos ácidos e fosfatos de cálcio em solo alcalinos (SYLVIA et al., 2005). A solubilidade desses fosfatos em água é extremamente baixa, e a sua dissolução no solo é bastante reduzida, mesmo considerando longo período de tempo. Contudo, microrganismos e raízes das plantas podem dissolver fosfatos insolúveis do solo produzindo fosfatos assimiláveis pelas plantas e proporcionar aumento da produtividade. Com essa perspectiva, esforços têm sido feitos para avaliar o papel dos microrganismos na solubilização de fosfatos inorgânicos e aumento da disponibilidade de fosfatos para o crescimento das plantas (NAHAS, 1999, 2007).

Os microrganismos solubilizadores de fosfato mineral atuam produzindo ácidos orgânicos ou inorgânicos ou diminuindo o pH (HE et al., 1996). Por exemplo, na solubilização da apatita há liberação de Ca2+, H2PO4- e de um íon que depende da composição da apatita, podendo ser OH- ou CO32- ou F-. A secreção de prótons resultantes da absorção de NH4+ é outro mecanismo sugerido para solubilização de fosfato. Esse mecanismo foi constatado em trabalhos com Penicillium aurantiogriseum e Pseudomonas sp., e possibilitaram a solubilização de fosfatos de cálcio como resultado da excreção de prótons acompanhando a respiração ou assimilação de NH4+ (ILLMER; SCHINNER, 1995).

Os ácidos orgânicos como acético, cetoglucônico, cítrico, glucônico, lático, oxálico, succínico, tartárico são os mais importantes e complexam cátions como Al3+, Ca2+ e Fe3+ dos fosfatos minerais, liberando P solúvel, ou seja, P disponível para as plantas (WHITELAW et al., 1999). A capacidade de solubilização dos ácidos orgânicos varia com o fosfato mineral e o tipo de ácido produzido pelos microrganismos. Os resultados de estudos em condições abióticas mostraram que os ácidos orgânicos solubilizam mais CaHPO4 do que AlPO4 (BARROSO et al., 2006). Além do mais, ficou comprovado que, enquanto a solubilização do CaHPO4 foi decrescente na seguinte ordem: maleico>ox-álico>cítrico=láctico>tartárico, a do AlPO4 seguiu a seguinte sequência: oxálico>cítrico>láctico>maleico>tartárico. Portanto, a dissolução do fosfato depende do ácido orgânico secretado pelo microrganismo.

Embora a capacidade de solubilização esteja relacionada com a produção de ácidos ou diminuição do pH pelos microrganismos, nem sempre esses fatores se correlacionam com a quantidade de fosfato solúvel produzida. Além desses fatores, deve-se considerar que o crescimento do fungo ou da bactéria constitui outro fator importante para a solubilização (BARROSO et al., 2006; NAHAS, 1999). No ambiente natural, como os solos, os microrganismos tendem a obter nutrientes necessários para o seu crescimento. A disponibilidade desses nutrientes influi bastante na habilidade de solubilização do fosfato no solo. Isso significa que a capacidade de produzir ácidos quantitativa e qualitativamente e/ou a diminuição do pH dependem da fonte de C, N e P (NAHAS, 2007). Em outros termos, esses fatores podem influir controlando o processo de solubilização. Esse fato foi demonstrado em diversos trabalhos que mostraram que a habilidade de solubilização dos diferentes fosfatos minerais depende do microrganismo e das fontes de C e de N (AHUJA et al., 2007; BARROSO et al., 2006; CHUN-CHAO et al., 2007; REDDY et al., 2002; REYES et al., 2006).

A presença de microrganismos solubilizadores de P já foi constatada na maioria dos solos (AHUJA et al., 2007; BARROSO; NAHAS, 2005; KANG et al., 2002; NAHAS et al., 1994; REYES et al., 2006; SILVA FILHO et al., 2002). Essas pesquisas envolveram tanto a constatação da presença e quantidade de microrganismos solubilizadores como de sua atividade de solubilização.

A constatação de fungos no solo com capacidade de solubilização de fosfatos inorgânicos possibilita o isolamento e também averiguar a habilidade de o microrganismo ser utilizado na produção de biofertilizantes de plantas. Inúmeros estudos mostraram a possibilidade de empregar esses fungos para solubilizar fosfatos minerais, propiciando fosfato solúvel, além das suas necessidades, com maior aproveitamento do nutriente pelas plantas (CHUN-CHAO et al., 2007; MEDINA et al., 2007; NARLOCH et al., 2002; VASSILEV et al., 2006).

1.2. Bactérias solubilizadoras de minerais

As bactérias oxidantes do enxofre, que possuem a propriedade de produzir ácido sulfúrico e, portanto, apresentam maior potencial para liberar nutrientes de minerais, estão presentes em quase todos os solos (GARCIA JÚNIOR, 1991). Em princípio as bactérias oxidantes do enxofre foram mais utilizadas visando melhorar o condicionamento de solos salinos e sódicos e, posteriormente, na liberação de minerais (STAMFORD et al., 2002, 2006); e, pela habilidade de produzir ácido sulfúrico, elas também foram utilizadas na biolixiviação de minérios com metais pesados como ouro, prata e urânio (GARCIA JÚNIOR, 1991; GARCIA JÚNIOR; BEVILAQUA, 2008).

O enxofre inorgânico pode apresentar vários estados de oxidação, mas predominam as formas de sulfetos (S2-), enxofre elementar (S0) e sulfatos (S6+). As bactérias oxidantes do enxofre do gênero Acidithiobacillus têm capacidade de obter energia para fixar o CO2 atmosférico a partir da oxidação do S. Elas têm seu crescimento acelerado em condições ácidas (pH < 2,0) e são organismos mesófilos (< 40 ºC) e somente oxidam formas reduzidas de enxofre sendo capazes de produzir ácido sulfúrico (GARCIA JUNIOR, 1992), de acordo com a seguinte reação:

S0 (S2)- + 11/2 O2 + H2O → H2SO4

No Brasil, a utilização de S elementar vem sendo estudada, tendo sido relatada a importância do efeito do enxofre elementar inoculado com Acidithiobacillus no condicionamento de solos salinos e principalmente sódicos em virtude do pH bastante elevado (STAMFORD et al., 2002, 2003). Mais recentemente, Stamford et al. (2007, 2008a) mostraram os efeitos da aplicação conjunta do enxofre inoculado com Acidithiobacillus em mistura com gesso como condicionador em solos sódicos, com resultados bastante satisfatórios. Também foi demonstrado que, com a atuação da bactéria, ocorre simultaneamente aumento no teor de nutrientes do solo, principalmente cátions trocáveis como potássio, cálcio e magnésio, e no fósforo disponível para as plantas (EL-TARABILY et al., 2006; STAMFORD et al., 2007, 2008a).

A formação de H2SO4, momentaneamente, promove redução no pH, e, em contato com as partículas de fosfato natural, favorece reações de solubilização de P (EL-TARABILY et al., 2006; HE et al., 1996; STAMFORD et al., 2005). No Brasil estão sendo desenvolvidas pesquisas objetivando avaliar o efeito de mistura do enxofre elementar com rochas fosfáticas (GABER; ABDEL-MOTAAL, 2005; RICHART et al., 2006; STAMFORD et al., 2004, 2006; STEINER et al., 2009) e com rochas potássicas (LIMA et al., 2007; MOURA et al., 2007; STAMFORD et al., 2007, 2008b).

2. Técnicas de isolamento de solubilizadores de minerais

2.1. Isolamento de fungos solubilizadores de minerais

2.1.1. Amostragens dos solos

Na coleta de amostras visando ao isolamento de fungos solubilizadores de minerais, a superfície do solo deve ser limpa, eliminando-se folhas caídas, detritos e restos de cultura. Retirar amostras, se possível com auxílio de trado, na profundidade de 0 cm a 20 cm, ou outra profundidade de acordo com o objetivo do trabalho. Em bandeja, separar raízes, insetos, folhas, etc., peneirar (peneira com 2 mm de malha), e em seguida armazenar as amostras à temperatura de 4 ºC, até o momento de utilização, que deve ser o mais breve possível. O número de repetições das amostras deve depender do delineamento experimental.

2.1.2. Contagem dos fungos totais e solubilizadores

As amostras devem ser diluídas em série, utilizando-se os procedimentos mais comuns para contagem de fungos. Alíquotas dessas diluições são usadas para inocular o meio de cultura (Tabela 1). Há duas opções: 1ª) utilizar meio para contagem e isolamento dos fungos totais (exemplo, meio de Martin, 1950); e 2ª) meio específico contendo fosfato insolúvel para contagem dos fungos totais e solubilizadores. Na 1ª opção, os fungos são isolados em tubos com meio complexo (por exemplo, Sabouraud ágar, BDA, batata-dextrose-ágar) e depois inoculados em meio específico contendo fosfato insolúvel para avaliar a capacidade de solubilização. Sugere-se o meio descrito por Nahas et al. (1994).

Tabela 1. Meio de cultura para avaliação da atividade de solubilização de fosfatos.

Reagente

Quantidade

NaCl

0,1 g

NH4 Cl

1,0 g

KCl

0,2 g

CaCl2.2H2O

0,1 g

MgSO4.7H2O

1,2 g

Glucose

10,0 g

Extrato de levedura

0,5 g

Fonte de P(1)

-

Ágar

20 g

H2O (q.s.p.)

1.000 mL

(1) Para cada 50 mL de meio são colocados 1,5 mL de solução de CaCl2 10% e 1 mL de solução de K2HPO4 10% (esterilizados separadamente), para produzir um precipitado de fosfato inorgânico, CaHPO4.

O pH do meio deve ser ajustado para 7,0 antes e após esterilização. A fonte de P poderá ser substituída por outro tipo de fosfato. O meio de cultura assim preparado torna-se opaco, como resultado da adição do fosfato insolúvel ou precipitado.

Diferentes tipos de fosfatos têm sido utilizados no meio de cultura para investigar a habilidade de solubilização dos fungos. Os mais genericamente utilizados são os fosfatos de cálcio, incluindo as apatitas, como fluorapatita, hidroxiapatita, fosfatos de rocha, fosfato tricálcico [(Ca3(PO4)2], fosfato dicálcico (CaHPO4) e hidroxiapatita recém-precipitada (ACHAL et al., 2007; MEDINA et al., 2007; NAHAS et al., 1994; REDDY et al., 2002; WAKELIN et al., 2004). Além desses, foram utilizados os fosfatos de alumínio e de ferro e os respectivos minerais (BARROSO; NAHAS, 2006, 2007; CHUN-CHAO et al., 2007; KANG et al., 2002; REYES et al., 2001).

2.1.3. Observação dos cultivos nas placas

Os fungos são incubados em temperatura que varia de 25 ºC a 30 ºC, dependendo do enfoque do trabalho, por tempo necessário até observação dos halos de solubilização. Em volta da colônia do fungo, forma-se uma zona clara onde o fosfato adicionado ao meio é solubilizado, contrastando com o resto do meio opaco.

2.1.4. Atividade de solubilização

A atividade de solubilização (AS) é determinada pela relação entre os diâmetros da colônia (Dc) e do halo de solubilização (Ds) após o crescimento do fungo nas placas. Quanto maior a relação, maior a AS.

A atividade de solubilização de cada fungo pode ser determinada utilizando-se meio líquido. Essa determinação tem sido adotada por inúmeros autores e dá informações do crescimento do fungo e a sua capacidade de solubilização.

Em linhas gerais, consiste em retirar inóculo do fungo cultivado em meio sólido e adicionar a um meio líquido. O inóculo pode ser um volume determinado de uma suspensão com concentração conhecida de esporos. A incubação do fungo é conduzida em condições agitadas ou não a determinadas temperaturas e tempos dependendo das condições estabelecidas no trabalho. O controle consistirá de meio de cultura não inoculado contendo a mesma composição e fonte de fósforo do meio inoculado. Após crescimento do fungo, alíquotas do meio de cultura após filtração serão utilizadas para determinar a quantidade de fosfato solubilizado, a acidez titulável e o pH final do meio de cultura (BARROSO; NAHAS, 2005). O crescimento do fungo pode ser determinado após secagem da massa de micélio retida na filtração por 24 horas a 105 oC. No meio de cultura, também podem ser determinados vários parâmetros como a fonte de C residual, a atividade enzimática, etc. que possibilitarão conclusões mais acertadas sobre a atividade de solubilização.

2.2. Isolamento de bactérias oxidantes do enxofre

Os meios mais utilizados para isolamento de bactérias oxidantes do enxofre são apresentados nas Tabelas 2, 3 e 4.

Tabela 2. Meio SMS (Starkey Mineral Salts) para oxidantes do enxofre.(1)

Reagente

Quantidade (g)

K2HPO4

1,0

MgSO4. 7H2O

0,2

FeSO4. 7H2O

0,05

CaCl2

0,02

MnCl2. 4 H2O

0,002

NaMoO4. 2 H2O

0,001

NH4Cl

0,1

S0 ou Na2S203. 7H2O

7,0

(1) Completar para 1.000 mL com água deionizada (ou destilada estéril) e ajustar o pH para 7,0.

Fonte: Starkey (1935).

Tabela 3. Meio 9K modificado para isolamento de Acidithiobacillus thiooxidans.

Reagente

Quantidade

(NH4)2 SO4

3,0 g

KCl

0,1 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7. H20

0,5 g

Ca (NO3)2 4H2O

0,01 g

H2SO410N

1,0 mL

Enxofre elementar (sublimado)

10,0 g

Fonte: Garcia Júnior (1991).

Completar para 1.000 mL com água deionizada (ou água destilada estéril) e ajustar o pH para 1,8. Esterilizar em autoclave. Na prática deve-se colocar 1 g de enxofre sublimado em microtubos e autoclavar em separado. Depois de autoclavados (meio e enxofre sublimado), adicionar 1 g de enxofre para cada 100 mL de meio (SMS ou 9K). Colocar em agitação por 15 dias.

Tabela 4. Meio 9K modificado para isolamento de Acidithiobacillus ferrooxidans.

Solução (a) fonte de sais

Reagente

Quantidade

(NH4)2 SO4

3,0 g

KCl

0,1 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4 7H20

0,5 g

Ca (NO3)2 4H2O

0,01 g

H2SO410N

1,0 mL

H2O

700 mL

Solução (b) fonte de energia

Reagente

Quantidade

Sulfato ferroso (FeSO4 7 H2O

44,22 g

H2O

300 mL

Para o preparo da solução (b), pesar 44,22 g de sulfato ferroso, colocar em balão volumétrico de 300 mL e completar o volume para 300 mL. Homogeneizar até a completa dissolução do sulfato ferroso e esterilizar por filtração em membrana com porosidade de 0,20 µm.

Para o preparo do meio, usar em mistura 700 mL da solução (a) (fonte de sais) e 300 mL da solução (b) (fonte de energia). Juntar as soluções (a) e (b), e com todos os cuidados de assepsia, distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio (16 mm x 150 mm), estéreis e tamponados. Os tubos de ensaio, contendo o meio 9K modificado, podem ser armazenados sob refrigeração durante o período máximo de 15 dias.

2.3. Técnicas para isolamento de bactérias oxidantes do enxofre

2.3.1. Amostragem do solo

Coletar amostras de cada área diferente. Se possível usar 10 amostras, por área. Passar em peneira de 2 mm; enriquecer com enxofre (em pó, de preferência enxofre sublimado), adicionando 300 g de S elementar por kg de solo. Adicionar água até a retenção máxima, sem lâmina excessiva. Adição de água correspondente à umidade equivalente. Análise que poderá ser determinada em laboratório de física do solo. Incubar as amostras a 30 oC ± 2 oC. Manter no escuro, visando aumentar a população e a atividade das bactérias oxidantes do enxofre.

Após 3 semanas, estocar as amostras em recipientes de vidro esterilizados e identificados ou em sacos de plástico selados e rotulados (identificados), mantendo a 5 oC et al., até o uso.

2.3.2. Protocolo utilizado para o isolamento

Se possível, usar 5 repetições para cada amostra (10 g de solo para cada amostra). Colocar em 100 mL de solução, contendo ágar estéril, de preferência Sigma (1 g/L). Usar água deionizada, e colocar por amostra 20 g de bolinhas de vidro (glass beads) com cerca de 3 mm de diâmetro.

Misturar a suspensão de solo (agitação manual), e em seguida colocar em ultrassonicador, na frequência de 55.000 ciclos/segundo, durante 20 segundos. Colocar a suspensão de solo em agitador rotatório (shaker) a 350 rpm (rotações por minuto), por 35 minutos, a 30 oC. Fazer diluições de 10-2 a 10-6, em água deionizada (ou destilada estéril) e fazer esfregaço (espalhar) ou adicionar alíquotas de 0,2 mL. Distribuir, com bastão de vidro (estéril), na superfície de meio mineral (SMS – Ágar) ou (meio 9K agarose) corrigido com tiosulfato de sódio e azul de bromotimol (pH 1,8). Utilizar placas de Petri, de preferência de plástico, esterilizadas. Usar 4 placas por diluição, secar em capela de fluxo laminar por 15 minutos, e incubar a 30 oC no escuro.

2.3.3. Observações nas placas

Colônias com coloração amarela ao redor e abaixo, em placas após 10 dias de incubação, devem ser consideradas como colônias de bactérias oxidantes do enxofre. Estas serão repicadas para placas com meio SMS – Ágar ou 9K agarose, corrigidas com tiosulfato de sódio. De preferência, para garantia de purificação, repicar duas vezes.

3. Uso de microrganismos solubilizadores de minerais na agricultura

3.1. Produção e eficiência de biofertilizantes de rochas

3.1.1. Biofertilizantes de rochas fosfatadas

O fósforo é o nutriente recomendado em maior proporção nas adubações de base e talvez seja o fator mais limitante de produtividade na maioria das culturas, principalmente em solos tropicais. Normalmente o fósforo é aplicado como fertilizante solúvel em doses superiores à extração e à exigência das plantas, e esse fato é explicado pela rápida reação de adsorção do nutriente com argilas, óxidos de ferro (Fe) e de alumínio (Al) e compostos orgânicos, além de reações de precipitação com Ca, Fe e Al (MALAVOLTA et al., 2002).

O aumento dos teores de P no solo pode ser obtido pela incorporação de fertilizantes minerais ou de matéria orgânica. Os fertilizantes fosfatados disponíveis no mercado oferecem concentração de P, na forma de P2O5, normalmente como superfosfato simples, superfosfato triplo, fosfato monoamônio (MAP) e fosfato diamônio (DAP).

Os fosfatos naturais apresentam menor eficiência agronômica em função da baixa solubilidade, principalmente para culturas anuais; entretanto, pelo baixo custo, pode ser uma alternativa de substituição a fertilizantes solúveis, principalmente pela liberação mais gradual, o que minimiza o processo de fixação do fósforo, principalmente em solos tropicais (STAMFORD et al., 2008).

As rochas fosfáticas de origem ígnea com estrutura cristalina dura apresentam baixa reatividade, e é o caso da maioria das rochas nacionais: fosfato natural de Araxá, fosfato natural de Patos, fosfato natural de Jacutinga e fosfato natural de Catalão. As rochas fosfáticas de origem sedimentar, conhecidas como fosfatos reativos, apresentam alta reatividade em função do maior grau de substituição isomórfica, resultante de cristalização imperfeita da rocha que confere maior porosidade e facilidade de hidrólise. Como exemplos, podem ser citados o fosfato natural de Arad (Israel), Bayovar (Peru), Carolina do Norte (EUA), Djebel Ônk (Argélia), Gafsa (Tunísia), Daoui (Marrocos), de acordo com Straaten (2002, 2007).

A solubilização dos fosfatos naturais é favorecida quando utilizados em solos ácidos, com pH em água inferior a 6,0. Na presença de H+, a rocha fosfática moída dissocia-se e libera moléculas de Ca2+ e fosfato (H2PO4-). Entretanto, Stamford et al. (2007, 2008) consideram que em função da produção de ácido sulfúrico, promovida por Acidithiobacillus, a utilização de biofertilizantes de rochas pode ser mais indicada em solos salinos e/ou sódicos, em razão da redução do pH do solo e lixiviação de sódio trocável.

Nos trabalhos desenvolvidos no Núcleo de Fixação Biológica do Nitrogênio nos Trópicos (NFBNT) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), para a produção de biofertilizantes é utilizado o sistema em laboratório (bandejas) e em escala piloto (campo). Para a produção em campo, são usados canteiros com 10 m de comprimento, 1 m de largura e profundidade de 0,5 cm. Adiciona-se 4 t de rocha e 400 kg de enxofre elementar, distribuídos em 3 camadas com a mesma quantidade dos produtos. Em cada camada o Acidithiobacillus é adicionado diluindo-se 1.000 mL de meio (108 UFC) em 10 L de água esterilizada, e pulverizando-se a camada de rocha e enxofre (20 cm) com um irrigador manual. A adição de água deve ser feita diariamente, mantendo a umidade próxima à capacidade de campo. Após 60 dias de incubação para a produção de biofertilizantes de rochas (fosfatadas e potássicas), determinou-se pH (H20), P e K disponíveis (Tabela 5).

Tabela 5. Resultados de pH e P disponível nos ensaios em placas de Petri e em bandejas para os biofertilizantes a partir de rocha fosfatada (apatita de Gafsa) e do superfosfato triplo (média de 6 repetições).

Fonte de P

Incubação em placas de Petri Bandejas

30 dias

45 dias

60 dias

60 dias pH

----------- P disponível - Mehlich 1 (%) -----------H2O

Fosfato de Gafsa

1,9bA

1,9bA

2,0bA

1,1c 5,4a

Biofertilizante 200 (FN+S)

-

-

-

1,6c 5,2a

Biofertilizante 50 (FN+S*)

6,5aA

7,6aA

7,7aA

4,7b 4,2b

Biofertilizante 100 (FN+S*)

6,1aA

6,5aA

6,5aA

5,5ab 4,1b

Biofertilizante 150 (FN+S*)

5,8aB

5,8aB

7,7aA

6,0a 4,1b

Biofertilizante 200 (FN+S*)

6,1aA

6,5aA

7,0aA

6,1a 4,1b

Superfosfato triplo (SFT)

-

-

-

6,0a 5,0b

C.V. (%)

8,93

7,56 6,78

(FN+S*) = fosfato natural mais enxofre inoculado com Acidithiobacillus. (FN+S) = fosfato natural mais enxofre sem Acidithiobacillus. Valores seguidos por letras diferentes são diferentes (Tukey a 5%).

3.1.2. Biofertilizantes de rochas potássicas

Em função dos resultados satisfatórios obtidos em experimentos realizados para produção de biofertilizantes com rochas fosfatadas, em seguida foram realizados trabalhos utilizando rocha com potássio. Os biofertilizantes foram inicialmente produzidos em laboratório (placas de Petri e bandejas) e posteriormente em campo. Para a produção de biofertilizante em campo, com rocha fosfatada, foi usada a apatita de Irecê (Bahia) contendo 28% de P total e 0,1% de P disponível e biofertilizante com K usando a rocha potássica biotita xisto de Santa Luzia (Paraíba), com 10% de K total e 0,01% de K disponível. Os resultados obtidos nos ensaios em placas de Petri (30, 45 e 60 dias), em bandeja (60 dias) e em campo encontram-se na Tabela 6.

Tabela 6. pH, P e K disponíveis nos biofertilizantes e nas rochas com P e K (apatita de Irecê, BA, e biotita de Santa Luzia, PB), nos ensaios em placas de Petri, em bandejas e no campo após 60 dias de incubação.

Ensaio

Material usado

pH

(H2O)

P disponível

K disponível

g/kg

Placa de Petri

Apatita

5,4

10

-

Biotita

8,8

-

1,0

Biofertilizante P

5,0

60

-

Biofertilizante K

3,9

-

3,2

Superfosfato triplo

5,4

67

-

KCl

-

-

-

Bandeja

Apatita

5,4

10

-

Biotita

8,8

-

0,8

Biofertilizante P

4,1

60

-

Biofertilizante K

3,4

-

3,0

Campo (canteiros)

Biofertilizante P

3,3

50

-

Biofertilizante K

3,0

-

1,5

3.2. Produção e eficiência de biofertilizantes orgânicos

Em geral é bastante discutida a definição de fertilizantes e de adubos, embora existam pontos que permitam a diferenciação entre os termos. Fertilizantes compreendem produtos que possuem formulação mais ou menos definida, e os seus componentes principais são devidamente conhecidos. Podem ser considerados como adubos produtos que normalmente tendem a aumentar a produtividade das culturas, mas que não apresentam formulação definida, ou seja, os seus componentes não são bem conhecidos e, de uma maneira geral, são passíveis de inúmeras transformações, principalmente microbianas. Em linhas gerais, pode-se considerar que todo fertilizante é basicamente um adubo, entretanto os adubos não devem ser considerados como fertilizantes.

É reconhecido que as fontes de matéria orgânica do solo participam no suprimento de nutrientes, e é importante a sua contribuição, principalmente no aporte de nitrogênio e fósforo liberados pelos microrganismos. A relação C:P foi considerada por Zaharah e Bah (1997) como o principal fator que controla a disponibilidade de P no solo.

A utilização de materiais orgânicos na adubação das plantas normalmente envolve várias transformações, e nesse aspecto os microrganismos exercem funções das mais importantes, como a mineralização da matéria orgânica, que promove a disponibilização de nutrientes, principalmente nitrogênio, fósforo e potássio e também alguns micronutrientes, em virtude da produção de ácidos orgânicos (OBERSON et al., 2001).

Pesquisa realizada por Illmer e Schinner (1995) relatam que, quando utilizado o fungo solubilizador de fosfatos Penicillium sp. em um meio com P inorgânico em pH neutro, nenhum dos 24 ácidos orgânicos avaliados foram produzidos em quantidade apreciável. Aspergillus niger e Trichoderma viride foram usados por Zayed e Abdel-Motaal (2005) como ativadores fúngicos na degradação de estrume de curral usando bagaço enriquecido com rocha fosfática, não tendo sido observado efeito da inoculação na qualidade do composto produzido, e os resultados mostraram que a decomposição não foi completa com até 105 dias de fermentação.

De maneira geral é reconhecido pela maioria dos pesquisadores que a solubilização de P por fungos é inferior à realizada por bactérias, em razão de características destes últimos em colonizar as raízes das plantas (CHUN-CHAO et al., 2007). Os fungos em geral são mais tolerantes a condições de acidez, o que, em determinadas situações, podem torná-los mais atuantes na solubilização de fósforo.

4. Considerações finais

A microbiologia do solo e, em sua plenitude, a biotecnologia aplicada na agricultura e no ambiente são aspectos da maior importância e representam função e papel estratégico na construção de modelos alternativos de produção agrícola. Por meio de estudos realizados com essas áreas do conhecimento, são descobertas condições que possibilitam aumento significativo de linhas de pesquisa, que permitem o desenvolvimento de novas tecnologias e processos, para incremento da produção agrícola com bases sustentáveis.

Em geral, os solos apresentam limitações nas quantidades de fósforo disponível para satisfazer as necessidades das plantas. Os microrganismos do solo têm reconhecido potencial em disponibilizar fosfatos assimiláveis para o crescimento das plantas a partir de fontes não disponíveis de fósforo. Uma dessas medidas envolve a utilização de biofertilizantes, isto é, a aplicação de microrganismos com a finalidade de melhorar a fertilidade do solo e promover o crescimento das plantas.

É importante conhecer os fatores que influem nos microrganismos, sua prevalência no solo e sua interação com as plantas. Considerando a complexidade das interações que ocorrem no solo, especialmente após a aplicação de biofertilizantes e adubos orgânicos, fatores de ordem fisiológica e bioquímica devem ser extensivamente estudados para tornar possível a obtenção de resultados satisfatórios.

Portanto, a utilização de microrganismos na agricultura depende do conhecimento sobre sua diversidade, mecanismos de interação bactéria-planta e da habilidade de manter, manipular e modificar populações benéficas, principalmente sob condições de campo.

A potencialidade dos microrganismos na agricultura ainda é bastante incipiente e restrita a alguns poucos grupos, e muitos problemas para o seu uso são decorrentes da descontinuidade e fragmentação das pesquisas no Brasil. Assim, torna-se necessária a adoção de um programa de grande amplitude e sem entraves metodológicos, o que só poderá ser conseguido com a unidade entre os diferentes grupos de pesquisa que atuam nas diversas regiões do País. Para que resultados mais consistentes e amplos sejam obtidos, são necessárias mais pesquisas com diferentes microrganismos com o objetivo de atender as individualidades das diferentes plantas cultivadas.

Visando aos efeitos desejados para a utilização das bactérias e fungos na biofertilização e na proteção de plantas (bioproteção), a introdução de bactérias benéficas diretamente no ambiente deve ser considerada como uma condição desafiadora em virtude dos problemas de competitividade no ambiente solo e principalmente pela complexa relação solo-planta-microrganismo.

5. Referências

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Capítulo 9
Determinação da biomassa microbiana do solo

Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Valdinar Bezerra dos Santos
Wanderley José de Melo
Philip C. Brookes

1. Introdução

A biomassa microbiana do solo (BMS) é definida como o componente vivo da matéria orgânica excluindo a macrofauna e as raízes das plantas. A proporção presente de células microbianas vivas contendo C (C-microbiano, em mg/kg de solo) geralmente compreende de 1% a 5% do carbono orgânico total (COT), enquanto que para o N (N-microbiano, em mg/kg de solo) compreende de 1% a 6% do nitrogênio total (NT) (JENKINSON; LADD, 1981).

A BMS é um dos componentes que controlam funções chaves no solo como a decomposição, o acúmulo de resíduos orgânicos e as transformações envolvendo a mineralização da matéria orgânica (Figura 1). Representa, ainda, uma reserva considerável de nutrientes (N, P e S), os quais são continuamente assimilados durante os ciclos de crescimento dos diferentes organismos que compõem o ecossistema. A BMS é considerada importante fonte e dreno de nutrientes no solo, ora promovendo a mineralização de compostos orgânicos em substâncias minerais solúveis ou gasosas (NH4+, NO3-, H2PO4-, SO42-, CO2) e a consequente liberação de nutrientes, ora imobilizando-os em sua biomassa para sua manutenção e crescimento (CERRI et al., 1992). Consequentemente, os solos que mantêm um alto conteúdo de BMS são capazes não somente de estocar, mas também de ciclar mais ativamente nutrientes no sistema (GREGORICH et al., 1994).

Figura 1. A função da biomassa microbiana do solo na ciclagem de nutrientes.
Fonte: adaptado de Brookes (2001).

A atividade da BMS é, geralmente, avaliada pela respiração do solo (ALEF, 1995), que é a oxidação biológica da matéria orgânica a CO2 pelos microrganismos aeróbios, e ocupa uma posição chave no ciclo do carbono nos ecossistemas terrestres. A combinação das medidas da BMS e a respiração do solo fornecem a quantidade de CO2 evoluída por unidade de biomassa, denominada quociente metabólico ou respiratório (qCO2). O qCO2 indica a eficiência da biomassa microbiana em utilizar o carbono disponível para biossíntese, sendo sensível indicador para estimar a atividade biológica e a qualidade do substrato.

A BMS pode ser avaliada por métodos diretos e indiretos. Os métodos diretos envolvem a microscopia dos componentes da biomassa microbiana (bactérias e fungos). A microscopia é o método mais antigo e vem sendo substituído, ultimamente, por métodos indiretos. Os métodos indiretos para determinação da biomassa microbiana são a fumigação-extração, fumigação-incubação e a respiração induzida pelo substrato. Recentemente, tem se utilizado a quantidade de ácidos graxos ligados a ésteres de fosfolipídios (PFLAs) em solo como um método alternativo de determinação da biomassa microbiana (BLOEM; BREURE, 2002). PFLAs são encontrados em membranas de bactérias e fungos e, após extração de amostras de solo, podem ser quantificados por cromatografia gasosa (ZELLES, 1999). A técnica de PFLAs pode, ainda, fornecer informações sobre a biodiversidade e a razão entre a biomassa fúngica e bacteriana.

2. Amostragem do solo e pré-tratamento das amostras

A correta amostragem do solo é vital para obtenção de resultados satisfatórios sobre a biomassa e atividade microbiana do solo. Esse passo, geralmente, é realizado de forma errada e ocasiona, com frequência, falhas nos resultados das análises. O solo, para estudos microbiológicos, normalmente é coletado na profundidade de 0 cm a 20 cm (camada arável) em solos agrícolas e de 0 cm a 10 cm em solos de florestas ou pastagens. As amostras de solo devem ser tomadas ao acaso em uma área homogênea e representativa quanto à textura e ao tipo de solo, manejo, tipo de vegetação, às características ambientais, observando-se a topografia, profundidade do solo, densidade, presença de pedras, umidade, etc. Usar um trado ou uma pá para a amostragem, e, dependendo do objetivo do trabalho, o trado é um equipamento mais adequado. Os pontos de coleta devem estar distribuídos ao acaso na área, garantindo uma amostragem significativa. Recomenda-se coletar, no mínimo, 20% mais solo do que irá realmente utilizar durante as análises.

Durante a amostragem, devem-se eliminar restos de plantas, insetos ou resíduos orgânicos que se encontram na superfície do solo. Em caso de encontrar o solo muito úmido ou encharcado, pode-se planejar outra ocasião para a amostragem. Caso contrário, pode-se coletar o solo úmido e proceder a secagem cuidadosamente, sem permitir que o solo seque totalmente. O ideal é que o solo apresente umidade por volta de 40% da capacidade de campo.

A amostra deve ser colocada em sacos plásticos (insira uma folha de papel toalha dobrada no topo do saco e amarre com elástico, para permitir as trocas gasosas) e transportadas do campo até o laboratório sob temperatura baixa (4 oC) utilizando caixas térmicas com gelo.

No laboratório, as amostras de solo devem ser peneiradas (2 mm de malha) e armazenadas, a 4 ºC, até o uso. Devem-se utilizar as amostras o mais rápido possível. Caso seja necessário armazenamento da amostra, este não deve ultrapassar três meses.

Após o período de armazenamento e antes de iniciar as análises, devem-se deixar as amostras em um período de pré-incubação para que sejam normalizados os processos biológicos do solo (STENBERG et al., 1998). A pré-incubação deve ser feita com o solo com umidade ajustada de 40% a 60% da capacidade de campo (CC) utilizando-se água deionizada. Deixa-se a amostra de solo incubada por uma semana (25 oC) e após esse período ela está pronta para análise.

2.1. Determinação da umidade (U) e capacidade de campo (CC)

Na determinação da umidade, subamostras de solo de no mínimo 10 g são pesadas, colocadas em recipientes tarados e levadas para secar em estufa à temperatura de 105 oC por 24 horas, em 3 repetições. Após esse período, os recipientes com as subamostras são colocadas em dessecador e em seguida são pesados. A umidade é determinada, em porcentagem, pela diferença das massas do solo antes e após a secagem em estufa.

em que

MSU = massa do solo úmido (g); MSS = massa do solo seco (g); 100 = fator para transformação em porcentagem.

Na determinação da capacidade de campo (CC), subamostra de 20 g de solo com umidade natural, em triplicata, deve ser colocada sobre papel de filtro acondicionado em funil e montado sobre um frasco coletor previamente pesado. Adicionam-se, lentamente, 100 g de água deionizada pesada em balança analítica e deixa-se por uma noite. Cobrir o conjunto com papel alumínio ou filme plástico, para evitar evaporação. Após esse período, dar uma pequena batida na haste do funil para liberar as últimas gotas de água. Pesar novamente o frasco coletor. A testemunha (sem solo), em triplicata, deve ser procedida da mesma forma.

em que

CC = capacidade de campo (%); MAP = massa da água percolada (g); U = umidade inicial do solo (%); MSS = massa do solo seco (g); 100 = fator para transformação em porcentagem.

3. Determinação da biomassa microbiana do solo (BMS)

3.1. Método da fumigação-incubação (JENKINSON; POWLSON, 1976)

3.1.1. Princípio

A fumigação-incubação foi o método pioneiro de quantificação da BMS. O método consiste na fumigação do solo com clorofórmio (CHCl3) causando um fluxo de CO2 e NH4 após a remoção do fumigante e posterior incubação do solo. O fluxo é gerado pela decomposição dos microrganismos mortos pela fumigação.

3.1.2. Metodologia

A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repetições, que passarão por fumigação seguida por incubação (subamostra fumigada) ou incubação imediata (subamostra não fumigada). O procedimento consiste na fumigação das subamostras, por 24 horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 25 g de solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação mantida no escuro, com temperatura controlada (25 ºC a 28 ºC), por 24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações sucessivas, aproximadamente 6 aspirações.

3.1.3. Determinação do C da BMS
(Cmic) pela técnica da fumigação-incubação

Após a fumigação e a retirada do clorofórmio, o solo fumigado é, normalmente, reinoculado com uma pequena subamostra de solo, geralmente em uma relação de peso de 1:9, inóculo:solo fumigado. Em seguida, as amostras fumigadas e não fumigadas (controle) são incubadas a 25 oC em jarros herméticos de 1 L a 2 L, juntamente com 10 mL a 20 mL de hidróxido de sódio (NaOH), em concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L. O CO2 liberado é medido por titulação do NaOH residual com ácido clorídrico (HCl), em concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L, após precipitação do carbonato com o cloreto de bário (BaCl2), usando fenolftaleína como indicador. O carbono fumigado e o não fumigado são calculados, respectivamente.

em que

CO2 F = CO2 liberado das amostras fumigadas (mgCO2/g solo/dia); CO2 NF = CO2 liberado das amostras não fumigadas (mgCO2/g solo/dia); B = volume de HCl consumido pelas provas em branco (mL); F = volume de HCl consumido pelas amostras fumigadas (mL); NF = volume de HCl consumido pelas amostras não fumigadas (mL); N = normalidade padronizada do HCl (mol/L); 22 = fator de correção para CO2; MSS = massa do solo seco (g).

O Cmicrobiano é calculado pela equação 5:

em que

Cmicrobiano = carbono da biomassa microbiana (µg/g); CO2 F = CO2 liberado das amostras fumigadas (mg CO2/g solo/dia); CO2 NF = CO2 liberado das amostras não fumigadas (mg CO2/g solo/dia); KIC = 0,41 (constante de incubação a 22 oC); KIC = 0,45 (constante de incubação a 25 oC).

3.2. Método da fumigação-extração (VANCE et al., 1987)

3.2.1. Princípio

A fumigação do solo com clorofórmio promove a lise celular dos microrganismos com consequente liberação do citoplasma para o ambiente. Assim, o C, N e P podem ser extraídos por K2SO4 e quantificados, estimando o C, N e P da BMS.

3.2.2. Metodologia

A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repetições, que passarão por fumigação seguida de extração (subamostra fumigada) ou extração imediata (subamostra não fumigada). O procedimento consiste na fumigação das subamostras, por 24 horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 20 g de solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação mantida no escuro, com temperatura controlada de 25 ºC a 28 ºC, por 24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações sucessivas (aproximadamente 6 aspirações).

As amostras fumigadas e não fumigadas são submetidas à extração com 80 mL K2SO4 0,5 mol/L por 30 minutos, em agitador rotatório circular. Deve-se observar que a proporção solo:extrator deve ser 1:4. Deixar decantar e filtrar em papel de filtro. O extrato pode ser armazenado em refrigerador por, no máximo, uma semana. Entretanto, o ideal é que seja quantificado logo após a extração.

3.2.2.1. Reagente para extração

K2SO4 0,5 mol/L – pesar 87,13 g de K2SO4, transferir para um becker de 1.000 mL e dissolver em ± 700 mL de água destilada. Transferir para um balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água destilada. O pH deve ser ajustado para 6,5 a 6,8 (com NaOH 1 mol/L ou H2SO4 a 20%).

3.2.3. Determinação do C da BMS (Cmic) pela técnica da fumigação-extração

A determinação do C nos extratos fumigados e não fumigados é feita utilizando-se de 10 mL a 20 mL do extrato e adicionando-se, em seguida, 2 mL de K2Cr2O7 (0,066 mol/L), 10 mL de H2SO4 concentrado e 5 mL de H3PO4 concentrado. Após o resfriamento, adicionam-se 50 mL de água deionizada. Adicionar 3 gotas de indicador ferroin e titular com [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 0,04 mol/L)].

A padronização do (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O é feita utilizando-se os valores das provas em branco.

em que

Npadronizada = normalidade padronizada do sulfato ferroso amoniacal; Vdicromato = volume do dicromato de potássio usado (2 mL); Cdicromato = concentração do dicromato de potássio usada (0,066 mol/L); Vgasto = volume do sulfato ferroso gasto na prova em branco (L).

O C extraído do solo é calculado pela equação 7.

em que

C extratos F e NF = carbono dos extratos fumigados e não fumigados (ug/g); Vbranco = volume do (NH4)2Fe(SO4)2 gasto na titulação da solução controle (branco) (mL); Vamostra = volume do (NH4)2Fe(SO4)2 gasto na titulação da amostra (mL); N = normalidade padronizada do (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (calculada na equação 6); Vextrator = volume do extrator (mL); Vextrato = volume do extrato (mL); MSS = massa de solo seco (g).

O Cmic é calculado pela equação 8.

em que

Cmic = carbono microbiano (μg/g); C extrato F = carbono do extrato fumigado (μg/g); C extrato NF = carbono do extrato não fumigado (μg/g); KEC = constante proposta por 0,38.

É recomendado que o volume gasto de sulfato ferroso amoniacal na titulação das amostras fumigadas e não fumigadas esteja entre 10% e 75% do valor do branco, conforme equação.

3.2.3.1. Reagentes para Cmic

Dicromato de potássio (K2Cr2O7) 0,066 mol/L – pesar 19,62 g de dicromato de potássio seco em estufa por 2 horas a 105 oC, transferir para um becker de 1.000 mL e dissolver em 500 mL de água destilada. Transferir para um balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água destilada.

Sulfato ferroso amoniacal [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O] 0,040 mol/L – pesar 15,68 g de sulfato ferroso amoniacal, transferir para um becker de 100 mL e adicionar com cuidado 10 mL de H2SO4 concentrado e com um bastão de vidro agitar para dissolver completamente. Após esfriar, transferir todo o conteúdo do becker para um balão de 1.000 mL e completar o volume com água destilada.

Indicador Ferroin – pesar 1,48 g de o-fenantrolina, 0,695 g de sulfato ferroso hepta-hidratado, transferir para um becker de 100 mL e dissolver em ± 70 mL de água destilada. Transferir todo o conteúdo do becker para um balão de 100 mL e completar o volume com água destilada.

3.2.4. Determinação do N da BMS (Nmic) pela técnica da fumigação-extração

O mesmo extrato de solo utilizado para determinação do Cmic pode ser utilizado para determinação do Nmic. Nesse caso, utilizam-se 20 mL do extrato e adicionam-se em tubos de digestão de 100 mL. Em seguida adicionam-se 0,7 g da mistura digestora e 5 mL de H2SO4. Colocar os tubos em um bloco digestor e aquecê-lo cuidadosamente até a temperatura de 360 oC, de forma que o conteúdo do frasco fique claro, depois deixar em ebulição (cerca de 360 oC) por 2 horas.

Devem-se cobrir os tubos com um pequeno funil de vidro (diâmetro de 25 mm). Para evitar perda do extrato, a temperatura do bloco deve ser regulada de modo que o H2SO4 se condense a uma altura de cerca de 1/3 do tubo digestor. Sugerimos a Tabela 1 como recomendação para aumento regulado da temperatura do bloco digestor.

Tabela 1. Recomendação para aumento regulado da temperatura do bloco digestor.

Tempo

Aumento regulado

Até a 1a h

Elevar a temperatura para 120 oC

Após a 1a h

Elevar a temperatura para 180 oC

Após a 2a h

Elevar a temperatura para 250 oC

Após a 3a h

Elevar a temperatura para 360 oC

Após esse período, espera o resfriamento dos tubos e adicionam-se 10 mL de água. A destilação do N é realizada acrescentando-se 20 mL de NaOH 10 mol/L aos tubos. O destilado é coletado em 5 mL de ácido bórico a 2% e titulado com HCl 0,1 mol/L. O nitrogênio presente na BMS é calculado pela equação:

em que

N extrato F e NF = nitrogênio microbiano (μg/g); Vamostra = volume do HCl gasto na titulação da amostra (mL); Vbranco = volume do HCl gasto na titulação da solução controle (branco) (mL); N = normalidade padronizada do HCl; 14 = massa do nitrogênio (g); 1.000 = fator para conversão em micrograma; Vextrator = volume do extrator (L); Vextrato = volume do extrato (L); MSS = massa de solo seco (g).

O Nmic é calculado pela equação 11:

em que

Nmic = nitrogênio microbiano (μg/g); Nextrato fumigado = nitrogênio do extrato fumigado (μg/g); Nextrato não fumigado = nitrogênio do extrato não fumigado (μg/g); KEN = 0,45.

3.2.4.1. Reagentes para Nmic

Mistura digestora – moer em almofariz separadamente 100 g de K2SO4 seco em estufa a 105 oC, 10 g de CuSO4.5H2O e 1 g de selênio (metálico).

Ácido bórico a 2% – pesar e dissolver 20 g de ácido bórico, em becker de 500 mL, com água destilada quente. Deixar esfriar (solução 1). Pesar e dissolver 0,660 g de verde de bromocresol e 0,330 g de vermelho de metila em 1.000 mL de etanol 95% (solução 2). Transferir a solução 1 para balão de 1.000 mL e adicionar 20 mL da solução 2. Misturar a solução e completar o volume para 1.000 mL com água deionizada.

3.2.5. Determinação do P da BMS (Pmic)

O P da biomassa microbiana do solo (Pmic) pode ser determinado pelo método proposto por Brookes et al. (1982). O Pmic é calculado pela diferença entre o P extraído, utilizando reagente de Olsen, de um solo fumigado e outro não fumigado. A determinação do P inorgânico é realizada por colorimetria (MURPHY; RILEY, 1962).

3.2.5.1. Extração do solo

Para cada solo, amostra fumigada e não fumigada, 200 mL do reagente de Olsen são adicionados a 9 frascos de 250 mL, devidamente numerados. Adicionar 1 mL de água em cada frasco e em seguida 1 mL de KH2PO4 (250 µg P/mL). As amostras são agitadas por 30 minutos a 150 rpm, sendo em seguida filtradas (Whatman 42) em plásticos limpos.

3.2.5.2. Procedimento

Adicionar 1 mL de ácido clorídrico (5 mol/L) a 10 mL de água, em frasco volumétrico. Em seguida, 10 mL do extrato de solo extraído por Olsen ou o branco, apenas o reagente de Olsen, são adicionados ao frasco. Após cessar a efervescência do conteúdo no frasco, adicionar 8 mL do reagente de Murphy-Riley e misturar. Após cessar a efervescência do conteúdo no frasco, o volume é ajustado para 100 mL. A leitura é feita em espectrofotômetro a 710 nm ou 882 nm.

O Pmic é calculado pela equação a seguir.

P mic = nitrogênio microbiano (μg g-1); P extrato fumigado = fósforo do extrato fumigado (μg/g); P extrato não fumigado = fósforo do extrato não fumigado (μg/g); KP = 0,40 (constante para conversão de P em Pmic); R = porcentagem de recuperação da curva para P.

3.2.5.3. Reagentes para Pmic

Reagente de Olsen, 0,5 mol/L – pesar 420 g de NaHCO3 em aproximadamente 9 L de água. Dissolver 7,2 g de NaOH, em água, e adicionar ao volume anterior. Ajustar o pH para 8,5, com NaOH 10 mol/L, e completar o volume para 10 L.

Solução padrão de P – transferir 1,0975 g de KH2PO4 para balão de 1.000 mL e ajustar o volume com água. Esta solução tem concentração de 250 μg/mL.

Molibdato de amônio – pesar 40 g de (NH4)6MO7O24.4H2O e dissolver em 900 mL de água e ajustar o volume para 1 L.

Tartarato de potássio e antimônio – pesar 1,454 g de KSbO.C4H4O6 e dissolver em 450 mL de água.

Ácido ascórbico – dissolver 26,4 g de C6H8O6 em 1 L de água (preparar antes da análise).

Ácido sulfúrico 2,5 mol/L – aproximadamente 1,5 L de água são colocados em um balão e adicionados, lentamente, 278 mL de H2SO4, misturando cuidadosamente. Ajustar o volume para 2 L.

Reagente de Murphy-Riley – adicionar 250 mL de ácido sulfúrico juntamente com 75 mL de molibdato de amônio. Em seguida, adicionar 50 mL de ácido ascórbico e misturar. Adicionar 25 mL de tartarato de potássio e antimônio. Finalmente, ajustar o volume para 500 mL com água.

Solução padrão contendo 40 mg P/L – dissolver 0,1757 g de KH2PO4 em 900 mL de água e completar o volume para 1 L. Esta solução pode ser diluída para 5 µg/L, 10 µg/L, 25 µg/L, 50 µg/L, 75 µg/L, 100 µg/L.

3.3. Determinação da BMS pela técnica dos compostos reativos à ninidrina (JOERGENSEN; BROOKES, 1990)

3.3.1. Princípio

Ninidrina forma um complexo púrpuro com moléculas contendo aminoácidos, proteínas e peptídeos. A quantidade de compostos reativos com a ninidrina, liberados pela BMS após a fumigação, é fortemente correlacionada com o conteúdo de C da biomassa microbiana (AMATO; LADD, 1988).

3.3.2. Metodologia

Utilizando o extrato de solo após a extração com K2SO4, retira-se uma alíquota de 0,6 mL do extrato + 1,4 mL de ácido cítrico (0,2 mol/L), pH 5,0, e adiciona-se em tubo de ensaio de 20 mL. Em seguida, adiciona-se, lentamente, 1 mL de reagente ninidrina. O tubo é incubado a 100 oC, em banho-maria, por 25 minutos. Após resfriamento, adiciona-se 4 mL da mistura etanol:água (1:1) e procede-se a leitura em espectrofotômetro a 570 nm. Os resultados são comparados a uma curva padrão de leucina.

Cálculos:

em que

N-ninF = quantidade de compostos reativos à ninidrina (µg/g solo) na amostra fumigada; N-ninNF = quantidade de compostos reativos à ninidrina (µg/g solo) na amostra não fumigada; 20,5 = fator de correção para Cmic; 6,5 = fator de correção para Nmic.

3.3.3. Reagentes para Nnin

Reagente ninidrina – pesar 2 g de ninidrina + 0,3 g de hydrindatina e dissolver em 75 mL de dimetilsulfoxido (DMSO); adicionar, em seguida, 25 mL de acetato de lítio (4 mol/L), pH 5,2.

Ácido cítrico (0,2 mol/L, pH 5,0) – pesar 42 g de ácido cítrico + 16 g de NaOH e dissolver em 900 mL de água. Ajustar o pH para 5,0 com NaOH e completar o volume para 1.000 mL.

3.4. Irradiação-extração e irradiação-incubação

Recentemente o uso da irradiação vem sendo proposto como uma alternativa ao clorofórmio. Esse método consiste na exposição de uma amostra de solo à irradiação com micro-ondas durante alguns minutos. Após a irradiação, as amostras irradiadas e não irradiadas são analisadas conforme os métodos da extração ou incubação, descritos anteriormente.

No procedimento de irradiação, devem-se pesar 2 amostras de 25 g de solo de cada tratamento e colocar 1 das amostras em Erlenmeyer de 125 mL. Deve-se irradiar a amostra em micro-ondas com cálculo da potência real do micro-ondas. Proceder a extração ou incubação conforme descrito anteriormente.

Devem-se colocar apenas Erlenmeyers no micro-ondas e irradiá-los por 4 vezes dividindo-se o tempo real de exposição por 4. Em cada etapa, mudar os frascos de lugar e proceder uma breve agitação, a fim de favorecer a irradiação completa da amostra.

Cálculo da potência do micro-ondas e o tempo de exposição da amostra – aquecer 1 L de água e medir a variação de temperatura da água antes e após 120 segundos da exposição ao micro-ondas. Calcular a potência real do aparelho pela equação 15:

em que

P = potência real do aparelho (W); Cp = 1 J/mL/ok, capacidade da água de receber calor; K = 4,184, fator de correção de cal/m/oK para Watts (J/s); ∆t = variação de temperatura de 1 L de água em 2 minutos de exposição, em oC; m = 1.000, massa da água (g); t = 120, tempo de exposição da água ao micro-ondas (s).

Em seguida determinar o tempo de exposição das amostras de solo à irradiação do micro-ondas pela equação 16.

em que

t = tempo real de exposição das amostras ao micro-ondas (s); r = 800 J/g de solo, quantidade de energia necessária para a exposição; mt = peso total das amostras a serem irradiadas (g); P = potência real do aparelho (W).

3.5. Respiração induzida pelo substrato (ANDERSON; DOMSCH, 1978)

O método da respiração induzida pelo substrato consiste na adição de glicose em uma amostra de solo e posterior avaliação da respiração, antes que o crescimento microbiano ocorra. Aproximadamente após 2 horas, o aumento no CO2 é proporcional ao tamanho do Cmic.

A amostra de solo, com umidade ajustada entre 50% e 75% da CC, é dividida em subamostra, em três repetições. Pesar a subamostra e em seguida adicionar entre 4 mg e 6 mg de glicose PA por grama de solo utilizado, misturando completamente. Colocar em recipientes hermeticamente fechados e medir a liberação de CO2, durante o período de 2 horas, utilizando cromatógrafo gasoso.

O Cmic é calculado pela equação 17.

em que X = respiração do solo.

3.6. Determinação de ácidos graxos ligados a ésteres de fosfolipídios (PFLA)

Os ácidos graxos ligados a ésteres de fosfolípidios (PFLAs) são encontrados em todas as células vivas. Exocelularmente, os PFLAs existem em pequena concentração comparados à biomassa microbiana total e são rapidamente degradados em células mortas, solos e sedimentos. Os PFLAs microbianos podem ser extraídos do solo, e a sua identificação e quantificação podem fornecer informações importantes sobre a estrutura da comunidade microbiana do solo.

3.6.1. Extração e separação dos lípidios (WHITE et al., 1979)

Amostra de solo (25 g) é congelada durante a noite, sendo então colocada em frascos de 250 mL. Adicionam-se 30 mL de tampão fosfato (50 mM), 75 mL de metanol anidro e 37,5 mL de clorofórmio. A mistura é agitada no escuro a 200 rpm (2 horas, oC) para extrair os lipídios. Volumes iguais de (37,5 mL) água e clorofórmio são adicionados e os frascos são agitados novamente (100 rpm, 5 minutos) sendo os componentes separados durante a noite a 4 oC. As próximas etapas devem ser realizadas a 4 oC e em luz reduzida.

A fase água-metanol é removida por sucção, e a fase clorofórmio contendo os lipídios é separada por filtração usando um funil contendo uma camada de 2 cm de Celite 545. O extrato é filtrado, novamente, com água (Whatman 2) contendo 20 g de Na2SO4 anidro. O clorofórmio é evaporado utilizando um rotaevaporador a 30 oC, obtendo-se um volume final de 1 mL, sendo transferido para tubos de vidro.

O clorofórmio é evaporado sob N2 e chamado de lipídios totais, sendo armazenado a -20 oC. O total de PFLA nos lipídios totais é medido após digestão com ácido sulfúrico concentrado e green malachite (MURPHY; RILEY, 1962) e estimado o total de ácidos graxos (FINDLAY, 1996; WHITE et al., 1979).

3.6.2. Reagentes

Tampão fosfato – (8,7 g K2HPO4 em 1 L de água deionizada) com pH ajustado para 7,4 com HCl 1 mol/L.

Cellite 545 (diatomaceous silica).

3.6.3. Separação dos fosfolipídios

Os lipídios são fracionados em colunas com glicol e fosfolipídios sobre sílica (SPE-Si, Supelco, Bellefonte, USA). As colunas são conectadas a bombas de vácuo.

Extração dos PFLAs – inicialmente, 2 mL de metanol são adicionados às colunas e succionados pela bomba de vácuo, para condicionamento da coluna. Em seguida, 1 mL de clorofórmio é adicionado e passa pela coluna por gravidade. O procedimento é repetido mais uma vez, com adição de 2 mL de água no intervalo. A fração lipídica é dissolvida em clorofórmio (200 µL) sendo adicionada no tubo. O tubo é lavado 3 vezes com 200 mL. Os lipídios são eluídos com clorofórmio, e os glicolipídios e fosfolipídios são eluídos com acetona-metanol (1:1). Em cada caso, alíquotas de 1 mL e 3 separações são usadas. As 3 frações são separadas em tubos de vidro, e os solventes evaporados sob N2. Os resíduos são armazenados a -20 oC, até a análise.

A fração de PLFA é dissolvida em metanol:tolueno (1:1 v:v) e adicionada a 0,5 mL de KOH 0,2 mol/L. Os tubos são selados com PTFE, agitados em vórtex e aquecidos (37 oC, 15 minutos) em chapa aquecedora. Em seguida, os tubos são esfriados à temperatura ambiente e neutralizados com 0,5 mL de ácido acético 0,2 mol/L. Após isso, são adicionados 2 mL de clorofórmio e 2 mL de água e agitados em vórtex. A mistura é separada em 2 fases. A separação pode ser melhorada utilizando uma centrifugação a 2.500 rpm por 5 minutos. A solução com clorofórmio é transferida para tubos limpos, utilizando pipeta Pasteur, e evaporada sob N2.

3.6.4. Separação dos PFLAs

Colunas de aminopropil (SPE-NH2, Supelco, Supelco, Bellefonte, USA) são condicionadas com diclorometano e hexano (1 mL cada). Essas são conectadas a uma bomba de vácuo. Os PFLAs são redissolvidos em hexane-diclorometano (200 µL) e adicionados à coluna, usando uma pipeta Pasteur.

As frações dos PFLAs são eluídas consecutivamente com 2 mL, cada, de hexane-diclorometano (3:1,v/v), diclorometano-etilacetato (9:1v/v) e ácido acético diluído em metanol (2%) para as frações não substituídas, hidroxilas-substituídas e não saponificadas dos PFLAs, respectivamente. Cada fração é coletada separadamente, e os solventes são evaporados sob N2. Os fosfolipídios são armazenados a -20 oC até a análise. Somente as frações não substituídas e as hidroxilas-substituídas serão determinadas.

3.6.5. Cromatografia gasosa

Os PFLAs são dissolvidos em 200 µL de hexano, sendo 0,7 µL ou 1 µL do extrato injetado no cromatógrafo. No Laboratório de Solos da Estação de Rothamsted (UK), o grupo do Dr. Philip Brookes utiliza cromatógrafos Shimadzu GC-9A ou Hewlett Packard GC series 5980.

Os resultados do PLFA são expressos como nmol PLFA/g/solo; % PFLA; µg individual PLFA g/solo.

3.7. Determinação da adenosina trifosfato (ATP)

Adenosina trifosfato (ATP) é um importante componente energético para o metabolismo dos organismos vivos. O ATP do solo é fortemente correlacionado com outros indicadores, tais como C e N, podendo servir para estimar o conteúdo de biomassa microbiana do solo.

3.7.1. Extração do ATP

Seis porções de solo (cada porção de 5 g de solo seco) são colocadas em tubos de centrífuga e mantidas em gelo. O extrator A é adicionado ao primeiro tubo e ultrassonicado por 2 minutos a 760 MHz. O tubo é esfriado, em gelo, por 5 minutos. Os próximos 2 tubos são tratados da mesma forma. Em seguida, procede-se a extração com o extrato B. 3 tubos contendo o extrato A e 3 tubos contendo o extrato B, cada um sem solo, servem como a prova em branco. Os extratos são filtrados (Whatman 42) e aproximadamente 5 mL do extrato ou branco são coletados, esfriados em gelo e armazenados a -15 oC. Esses extratos são estáveis por 3 meses.

3.7.2. Determinação do ATP (JENKINSON; OADES, 1979)

O método é baseado na extração do ATP com reagente TCA. O ATP é determinado após a adição da enzima luciferina-luciferase. O ensaio enzimático é realizado seguindo as recomendações do fabricante da enzima.

3.7.3. Solução padrão de ATP (0,1 mM)

A solução estoque de ATP é preparada dissolvendo di-Na ATP tetra-hidratado (59,9 mg) em água deionizada e completando o volume para 1 L. Essa solução deve ser armazenada a -15 oC e em alíquotas menores (150 mL ou 200 mL) para facilitar o uso. A solução é estável por 1 mês.

3.7.4. Preparação do reagente de extração do ATP

Ácido tricloroacético (TCA) (81,6 g) e Na2HPO4.12H2O (89,6 g) são dissolvidos em 600 mL de água. Em seguida, adiciona-se Paraquat (1,1-dimethyl-4,4’-bipyridinium dichloride) (70 mL, 36%) e ajusta-se a solução para 1.000 mL com água. A solução é esfriada em gelo para evitar a formação de cristais e armazenada a -15 oC.

Extrator A – preparar utilizando 5 mL da solução estoque de ATP (0,1 mM) em 1 L de água.

Extrator B – preparar utilizando 10 mL da solução estoque de ATP (0,1 mM) em 950 mL do extrator A e completando o volume para 1 L.

Preparação das soluções padrão de ATP – 1 mL de ATP 0,1 mM é pipetado em balão volumétrico de 50 mL e completado o volume com o extrator A. Essa solução é de 100 pmol ATP/50 μL de solução padrão. As outras diluições podem ser feitas a partir desta. A curva de calibração é linear.

4. Respiração do solo

A respiração é um dos mais frequentes métodos para estimar a atividade microbiana do solo (ALEF, 1995). A taxa de respiração do solo pode ser quantificada em laboratório e em campo e consiste na quantificação do fluxo de CO2 liberado pelos microrganismos durante um período de tempo. A respiração pode ser determinada usando técnicas simples, absorção de CO2 por NaOH e determinação por titulação com HCl, ou sofisticadas, equipamento cromatógrafo a gás. Os principais métodos de determinação da respiração em campo ou laboratório serão descritos a seguir.

4.1. Respiração do solo em laboratório

O método consiste na estimativa do CO2 liberado durante a incubação do solo em um sistema fechado. O CO2 é capturado por uma solução de NaOH, que posteriormente é titulada com HCl.

O procedimento padrão consiste na incubação de uma amostra de solo, geralmente de 50 g a 100 g, em 3 repetições, com umidade ajustada para 50% a 60% da capacidade de campo durante 3 dias (25 oC) em jarros herméticos de 1 L a 2 L, juntamente com 10 mL a 20 mL de hidróxido de sódio (NaOH), em concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L. O CO2 liberado é medido por titulação do NaOH residual com ácido clorídrico (HCl), em concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L, após precipitação do carbonato com 1,0 mL a 5,0 mL de cloreto de bário (BaCl2), em concentrações que podem variar de 0,5 mol/L a 3,0 mol/L, usando fenolftaleína a 1% como indicador.

A taxa de respiração é calculada pela equação 18.

em que

Resp_basal = respiração basal ou atividade microbiana (mg CO2/g solo/h); Vbranco = volume de HCl consumido pelas provas em branco (mL); Vamostra = volume de HCl consumido pelas amostras (mL); N = normalidade do HCl (mol/L); fc = fator de correção para CO2 (22) ou C (6); NH = número de horas da incubação (h).

4.2. Respiração do solo em campo

Este método é baseado na determinação do CO2 liberado em solo não perturbado. A solução de NaOH é colocada sobre a superfície do solo dentro de um tubo de plástico ou metal com área conhecida e tampado na parte superior. O CO2 é capturado pela solução e posteriormente é titulado com HCl.

O procedimento consiste na colocação de um recipiente contendo 20 mL de uma solução de NaOH, geralmente 1,0 mol/L, sobre um tripé na superfície do solo e dentro de um cilindro de metal ou plástico com área conhecida, em que a extremidade inferior está enterrada até 5 cm, e a extremidade superior é fechada com tampa removível. Após incubação de 24 horas, a tampa do cilindro é retirada, sendo coletada a solução de NaOH e transportada ao laboratório. A titulação é feita de acordo com a descrição anterior, utilizando HCl 1,0 mol/L, após precipitação com BaCL2. O controle é feito utilizando a incubação de uma solução de NaOH em um cilindro fechado nas duas extremidades.

A taxa de respiração é calculada pela seguinte equação.

em que

Taxa_resp = taxa de respiração ou atividade microbiana (mg CO2/m2/h); Vbranco = volume de HCl consumido pelas provas em branco; Vamostra = volume de HCl consumido pelas amostras; Nreal = normalidade real do HCl; Fc = fator de correção para CO2 (22) ou C (6); Acilindro = área do cilindro de metal ou plástico (m2); NH = número de horas da incubação (h).

5. Quociente respiratório ou atividade respiratória específica (qCO2)

O quociente respiratório é obtido pela expressão da taxa de respiração em termos de biomassa microbiana. Essa medida é conhecida, também, por respiração específica e é usualmente expressa como µg CO2/dia/mg de carbono da biomassa microbiana ou unidades equivalentes.

6. Referências

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Parte 5
Técnicas biotecnológicas aplicadas à agricultura

Capítulo 1
Produção de biolarvicidas à base de bacillus sphaericuse Bacillus thuringiensis var. israelensis para o controle de insetos

Christine Lamenha Luna Finkler
Amaro de Castro Lira Neto
Carlos Henrique Madeiros Castelletti
Liane Maria de Almeida Castro Maranhão

1. Introdução

A crescente demanda pela proteção ambiental tem incentivado a adoção de métodos alternativos de controle de pragas da agricultura e vetores de doenças humanas visando à redução dos riscos do uso intensivo de produtos químicos e de sua permanência no ambiente. Nesse contexto, os agentes de controle biológico têm propiciado muitos benefícios para a humanidade, pois, além de não poluírem o meio ambiente, são inócuos a animais e plantas. Entre esses, a utilização de produtos à base de microrganismos tem se tornado cada vez mais importante nas áreas de agropecuária, saúde e indústria.

O interesse pela utilização de microrganismos entomopatogênicos para o controle de populações de insetos prejudiciais levou o homem a pesquisar com maior profundidade as bactérias esporulantes. A produção de esporos, por se tratar de uma característica de persistência, tem sido considerada como um pré-requisito para que um agente possa ser produzido em escala comercial. Entre as bactérias promissoras estão às pertencentes ao gênero Bacillus (família Bacillacea) em virtude, principalmente, de características como formação de endósporo e produção de uma grande variedade de toxinas e enzimas. De acordo com Habib e Andrade (1998), dentre as espécies com entomopatogenicidade relatada destacam-se B. alvei (Cheshire & Cheine, 1885), B. cereus (Frankland & Frankland, 1887), B. sphaericus (Neide, 1904), B. larvae (White, 1906), B. thuringiensis (Berliner, 1909), B. popilliae e B. lentimorbus (Dutky, 1940). A espécie mais estudada e utilizada em campo é B. thuringiensis, que apresenta dezenas de variedades tóxicas contra insetos das ordens Lepidoptera (lagartas), Coleoptera (besouros) e Diptera (mosquitos e moscas), enquanto que B. sphaericus apresenta maior especificidade contra insetos da ordem Diptera.

B. sphaericus é uma bactéria aeróbica Gram positiva que produz um esporo esférico na porção terminal da cápsula bacteriana. Seu efeito larvicida é produzido principalmente a partir de duas toxinas (Bin 1 e Bin 2) que atuam em sinergia. As toxinas apresentam uma alta toxicidade às larvas de Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae), o que resulta no sucesso da sua utilização como biolarvicida para o controle dessa espécie de Culicidae. Além disso, B. sphaericus apresenta a característica de persistir no ambiente por até 60 semanas, reciclando-se no tecido de larvas mortas (GANUSHKINA et al., 2000).

No Brasil, biolarvicidas produzidos com o princípio ativo de B. sphaericus vêm sendo desenvolvidos e comercializados para o controle biológico de algumas espécies de mosquitos da família Culicidae (SILVA-FILHA et al., 2001). Contudo, é importante ressaltar que melhores resultados podem ser obtidos a partir da implementação de estudos que permitam desenvolver meios de cultivo de baixo custo e elevada concentração de toxinas e processos de separação de biomassa viáveis economicamente.

B. thuringiensis é uma bactéria aeróbica ou anaeróbica facultativa formadora de esporo, do mesmo grupo de B. cereus, distinguindo-se pela sua capacidade de produzir δ-endotoxinas durante sua fase de esporulação (BRAVO et al., 2005). Essas δ-endotoxinas, também chamadas de proteínas Cry, são específicas para os insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera e Diptera (BRAVO et al., 2005; SCHNEPF et al., 1998). Uma característica marcante dessas toxinas é sua a especificidade, sendo, portanto, tóxicas apenas para os insetos alvo e inofensivas para o homem e demais vertebrados. Por essa razão, essas proteínas têm sido largamente utilizadas contra vetores de doenças humanas e pragas agrícolas, tanto na forma de produtos biológicos quanto em plantas transgênicas (BRAVO et al., 2005).

Os bacilos apresentam atividade entomopatogênica em virtude das pró-toxinas que são produzidas durante a fase de esporulação. Essas estruturas proteicas são ingeridas pelas larvas dos mosquitos, e os intestinos das mesmas, sofrendo a ação de enzimas, as transformam em proteínas que se interligam a receptores situados nas membranas celulares e causam desarranjos nessas células, que levam à paralisia e à morte das larvas.

O Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) vem desenvolvendo com sucesso, desde 1996, a produção de um caldo fermentado à base de B. sphaericus (BS-1) para o controle da larva da muriçoca (C. quinquefasciatus) no Estado de Pernambuco. Os resultados de controle obtidos alcançam entre 80% e 100% de mortalidade larval, na dependência do tipo e da característica dos criadouros (dados não publicados). Todo o desenvolvimento tecnológico da pesquisa e produção desse larvicida foi obtido localmente, por meio de cooperação técnica com outras instituições parceiras, a exemplo do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco e do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (Fiocruz). Testes que também comprovaram a eficiência do caldo fermentado BS-1 em campo e o desenvolvimento de formulações à base desse biolarvicida são verificados nos trabalhos de Medeiros (2001) e Silva (2000).

Luna (2004) desenvolveu uma formulação em comprimido à base de B. thuringiensis var. israelensis contra larvas de Aedes aegypti, sendo observada uma mortalidade de 100% quando o produto era aplicado em recipientes contendo de 30 L a 50 L de água, enquanto que para um volume de 100 L a mortalidade observada foi de 88%.

2. Técnicas de preservação

A manutenção de uma coleção de isolados em um laboratório de biotecnologia é de extrema importância e tem como principal objetivo assegurar a viabilidade dos organismos utilizados, além de proporcionar um banco genético para estudos posteriores. As culturas devem ser mantidas em condições que garantam as suas características fenotípicas e genotípicas originais, sendo, para isso, utilizadas técnicas padronizadas de preservação.

Nem todas as espécies respondem de maneira similar aos métodos de preservação. No entanto, é importante enfatizar que o seu sucesso depende da escolha apropriada do meio de cultura, dos procedimentos de cultivo e do tempo de conservação.

Alguns dos principais métodos para a preservação de linhagens de Bacillus são citados abaixo.

2.1. Tiras de papel de filtro

Nesta técnica, as cepas de Bacillus podem ser mantidas sob a forma de esporos sobre a superfície de papel de filtro. Inicialmente as estirpes são cultivadas por 48 horas em meio Ágar Nutriente (AN), observando-se microscopicamente a esporulação do microrganismo e a pureza do material. Uma suspensão densa é então realizada, e a concentração dos esporos determinada por contagem de colônias crescidas sobre a superfície de placas de Petri contendo o mesmo meio.

Para quantificar a concentração de esporos, a suspensão é diluída 10 vezes em tubo contendo água estéril e submetida a choque térmico a 80 °C durante 12 minutos e em gelo por 5 minutos, para eliminação das células vegetativas. Após diluições sucessivas, o microrganismo é distribuído por meio de 5 semeaduras de volume conhecido (10 µL ou 5 µL) por placa e incubado a 30 °C durante 20 a 22 horas. As colônias são contadas, e os resultados analisados estatisticamente para o cálculo da concentração de esporos na amostra, sendo expressos em Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL).

As tiras de papel de filtro, previamente autoclavadas em placas de Petri, são impregnadas com alíquotas de 20 µL da suspensão bacteriana. Posteriormente, as mesmas são colocadas para secar em estufa a 35 ± 1 ºC durante 24 horas, transferidas para tubos de ensaio estéreis e conservadas sob refrigeração a 5 ± 1 ºC.

2.2. Método de subculturas periódicas

Este método é indicado apenas para culturas temporárias, em que a técnica de preservação de longo prazo ainda não foi definida. Para linhagens de Bacillus, recomenda-se que as células sejam cultivadas semanalmente (FLICKINGER; DREW, 1999).

Consiste em transferir o microrganismo para tubos inclinados contendo meio adequado, sendo incubado por 48 a 72 horas. A cultura deve ser observada microscopicamente para verificação de sua pureza, e os tubos conservados em geladeira ou câmara fria a 4 ± 1 ºC.

A principal desvantagem deste método é a facilidade de contaminação e a possibilidade de seleção de uma cepa modificada geneticamente. Dessa forma, a pureza das culturas deve ser examinada a cada transferência, sendo ainda recomendada a realização de testes periódicos de caracterização.

2.3. Método do óleo mineral

Este método é similar ao anterior, entretanto com a vantagem de que a preservação pode se estender por vários anos. Consiste no impedimento da dessecação e oxigenação das células por uma camada de óleo mineral, deixando o microrganismo em estado de latência.

A cepa é cultivada em tubos de penicilina contendo meio sólido por 48 a 72 horas. Após a incubação e verificação da sua pureza, a cultura é recoberta com uma camada de aproximadamente 2 cm de óleo mineral tipo Nujol, previamente autoclavado por 60 minutos a 121 ºC e posteriormente em estufa a 110 ºC por 1 hora. O armazenamento dos tubos de penicilina pode ser realizado à temperatura ambiente (28 ± 1 ºC).

2.4. Método da liofilização (freeze-drying)

A liofilização é o método mais empregado para a preservação de microrganismos em longo prazo. De acordo com Flickinger e Drew (1999), muitas espécies bacterianas têm sido preservadas e permanecidas viáveis por mais de 60 anos.

O processo consiste na remoção de água por sublimação a partir do estado de congelamento, sendo dividido em 3 estágios: (1) congelamento da suspensão; (2) secagem primária durante a qual a maioria da água presente na amostra é removida por sublimação; (3) secagem secundária para a remoção da água ligada.

Uma pequena quantidade da suspensão bacteriana (de 0,1 mL a 0,2 mL) contendo um agente crioprotetor é transferida para ampolas estéreis, sendo estas imersas em um banho de gelo seco contendo etileno glicol (50%) de forma a promover o congelamento da suspensão. A secagem é então iniciada, sendo feito o vácuo e retirada a umidade. No final do ciclo de secagem, as ampolas são seladas e mantidas em geladeira a temperaturas de 2 oC a 8 oC.

3. Preparo do inóculo

A etapa de preparação do inóculo é de fundamental importância para o sucesso de um cultivo microbiano. Deve ser garantido o desenvolvimento do microrganismo em condições que assegurem uma produção de células viáveis para a etapa de acúmulo de biomassa ou formação do produto desejado.

Os principais fatores que influenciam a preparação do inóculo são: condições de estocagem do microrganismo; condições de desenvolvimento do inóculo; dinâmica de crescimento microbiano; critérios de transferência do inóculo (número de transferências, volume e concentração de células).

Qualquer possível variação nas características genotípicas ou fenotípicas da cultura estoque influencia diretamente no cultivo microbiano, de forma que o processo fermentativo deve envolver um sistema robusto de manutenção do microrganismo, incluindo o estabelecimento de um protocolo padrão para assegurar o seu manuseio e a sua preservação.

O estabelecimento dos critérios para a obtenção das condições ótimas de propagação do inóculo deve ser determinado experimentalmente, avaliando-se cada estágio do processo de maneira individual. Vale salientar que o uso de meios de cultura complexos pode ocasionar variações no processo, exigindo um maior controle da operação e das condições de crescimento.

Embora existam poucos estudos sobre a influência do inóculo nos estágios finais da fermentação de bactérias entomopatógenas, certamente a etapa de preparo do inóculo irá afetar o estágio final do processo fermentativo. Alguns dos principais fatores incluem as condições de estocagem da cultura, o tipo de meio de cultivo, tamanho do inóculo, as condições de incubação e os critérios de transferência do inóculo. Esses critérios devem ser determinados experimentalmente e cada estágio examinado individualmente, de forma a ser estabelecido um protocolo experimental do processo. A Figura 1 ilustra como estudos relacionados ao desenvolvimento do inóculo podem ser incorporados de forma a ser obtida uma elevada produtividade do processo.

Figura 1. Estágios para o desenvolvimento de um processo fermentativo com alta produtividade.
Fonte: adaptado de Flickinger e Drew (1999).

O preparo do inóculo na produção de Bacillus entomopatógenos em larga escala necessita de estágios múltiplos de crescimento. A formulação do meio de cultura na etapa inicial deve garantir um bom crescimento vegetativo em um curto período de tempo. Além disso, a metodologia deve ser escolhida com base no tipo de protocolo de preservação da cultura. No Laboratório de Produção de Bactérias Entomopatogênicas do IPA, o cultivo de B. sphaericus segue as etapas apresentadas na Figura 2.

Figura 2. Etapas do desenvolvimento do inóculo realizadas no Laboratório de Produção de Bactérias Entomopatogênicas do IPA.

3.1. Pré-inóculo (Inóculo I)

Esta etapa é realizada a partir de duas tiras de papel impregnadas com a cultura esporulada. O crescimento vegetativo das cepas de Bacillus ocorre em frasco do tipo Erlenmeyer de 250 mL de capacidade, contendo 100 mL do meio de cultura CSEL (Tabela 1), sob agitação de 200 rpm, durante 12 horas a 28 ºC ± 2 ºC.

Tabela 1. Composição do meio CSEL.

Componente

Quantidade

Extrato de levedura

5,0 g

Extrato de carne

3,0 g

Peptona de carne

5,0 g

Água destilada

1.000 mL

pH 7,0

3.2. Inóculo II

São utilizados frascos do tipo Erlenmeyer de 250 mL de capacidade, contendo 85 mL do meio de cultura CSEL adicionado de 10 mL do inóculo e 5 mL de uma solução de CaCl2 a 0,2% (v/v). O inóculo I é transferido para o inóculo II a uma concentração de cerca de 10% (v/v) em cada frasco, e o cultivo realizado sob as mesmas condições do inóculo I.

3.3. Inóculo III

Nesta etapa é utilizado um garrafão de 20 L de capacidade contendo 14,16 L do meio de cultura CSEL, 15 mL de solução de CaCl2 a 10% (v/v), 15 mL da solução de micronutrientes (Tabela 2) e 10 mL de antiespumante. O sistema é inoculado a uma concentração de 5,3% (v/v), sendo aerado a 0,5 vvm. A temperatura é controlada a 28 oC ± 2 oC, e o cultivo ocorre durante 12 horas.

Tabela 2. Composição da solução de micronutrientes.

Componente

Quantidade

Sulfato de zinco

10 g

Sulfato ferroso

10 g

Sulfato de manganês

10 g

Água destilada

1.000 mL(1)

(1) Adicionar 1 mL de ácido sulfúrico.

4. Cultivo de B. sphaericus em reator

Nesta fase, a produção de B. sphaericus é conduzida em reator de 1.000 L operado em batelada, contendo 800 L de volume útil. Os cultivos são realizados utilizando-se um meio de cultura industrial baseado em substratos de baixo custo, à base de leite desnatado, milhocina e sais minerais, a uma temperatura de 30 ºC ± 2 oC, sem controle de pH e de aeração, durante 48 horas. O reator possui 4 chicanas diametralmente opostas e um sistema de agitação mecânica contendo 1 turbina com 2 hélices de 8 pás planas.

Após a esterilização e o resfriamento do meio de cultura até 30 oC, o inóculo III é transferido para o fermentador por pressurização estéril de forma a ser obtida uma concentração de 1,5% a 2,0% (v/v). Durante o cultivo é adicionado periodicamente o antiespumante, visando controlar a formação de espuma. As adições são realizadas a cada 12 horas, com volumes variando entre 20 mL e 40 mL. Durante a adição do antiespumante, a válvula de entrada de ar é fechada, enquanto que a válvula de quebra-vácuo é aberta, visando evitar uma pressurização do reator.

Vale salientar que uma avaliação microscópica para verificação das características morfológicas e pureza do cultivo é efetuada durante cada estágio do desenvolvimento do inóculo e do processo fermentativo, sendo retiradas amostras do reator com 24, 36 e 48 horas após a inoculação. Testes de pureza microbiológica também são realizados por meio de plaqueamento em meio de cultura específico, avaliando-se a possível presença de fungos, leveduras e bactérias contaminantes, como as do tipo coliformes.

Após o término da fermentação, o material é bombeado para o sistema de envase (tanque, tubulações e torneiras), previamente submetido às esterilizações a vapor e química com hipoclorito de sódio. Posteriormente, o caldo fermentado é distribuído em bombonas de 5 L e acondicionado em câmara fria a 5 ºC ± 1 oC.

Como o meio de cultura utilizado nesta etapa contém um elevado teor de partículas insolúveis, a esterilização é realizada de acordo com as seguintes etapas:

– Esterilização do corpo do fermentador, tubulações, conexões, caixa de envase, torneiras de envase, válvula de retirada de amostras e tubo de entrada de antiespumante – colocam-se 200 L de água no interior do fermentador aguardando que a temperatura alcance 120 oC por meio de uma caldeira, quando então as válvulas que compõem todos os sistemas são abertas uma de cada vez, com saída de vapor fluente durante cerca de 3 minutos. Terminado o expurgo, as válvulas são fechadas uma a uma.

– Resfriamento do fermentador por meio de circulação de água fria na camisa com auxílio de uma torre de resfriamento.

– Esterilização da água de processo – adição de 600 L de água no interior do fermentador, fechamento das válvulas e esterilização a 120 oC por 2 horas.

– Resfriamento da água até uma temperatura de aproximadamente 45 oC. Nesta etapa são retiradas amostras para a realização de testes microbiológicos de pureza da água de processo. Caso os testes sejam satisfatórios, prossegue-se com o processo de esterilização do meio de cultura.

– Esterilização do meio de cultura – introdução dos componentes do meio de cultura, fechamento das válvulas e esterilização a 110 oC por 1 hora.

A maioria das espécies de Bacillus pode ser cultivada em meios à base de sais contendo amônia ou aminoácidos como fonte de nitrogênio. É o caso das espécies B. larvae e B. popilliae, que requerem a adição de tiamina para seu crescimento. Glicose ou outros açúcares simples são utilizados como fonte de carbono e energia, por exemplo, B. thuringiensis que utiliza a glicose, assim como a L-arabinose, D-xilose e D-manitol, sendo que algumas cepas utilizam a sacarose. Por outro lado, B. sphaericus não é capaz de utilizar açúcares, necessitando de meios de crescimento à base de proteínas (LUNA, 2004).

Embora muitas espécies esporulem facilmente, alguns cuidados são necessários para uma esporulação eficiente, como a adição de íons Ca++ e Mg++. Os principais componentes dos meios de cultivo para a produção de B. sphaericus e B. thuringiensis var. israelensis são fontes de carbono e nitrogênio e elementos traços.

Como observado na Tabela 3, diversos substratos de baixo custo podem ser utilizados na composição dos meios. A escolha adequada dos ingredientes do meio é fundamental para o sucesso da produção comercial, tendo como objetivo a obtenção de uma maior atividade tóxica por volume de caldo fermentado.

Tabela 3. Ingredientes para fermentações de Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis var. israelensis.

Ingrediente

Concentração (g/L)

Farinha de soja

20–40

Farinha de semente de algodão

14–30

Milhocina

15–30

Glicose

10–30

Peptona

2–5

Xarope de milho

20–45

Melaço

1–18,6

Glicerol

2–10

Amido de milho

10–15

Extrato de levedura

2

KH2PO4

1

K2HPO4

1

FeSO4

0,02

FeSO4.7H2O

0,0005–0,02

MgSO4.7H2O

0,3

MnSO4.H2O

0,02

ZnSO4.7H2O

0,02

(NH4)2SO4

2

CaCO3

1–1,5

Fonte: Beegle et al. (1991) e Rowe et al. (1987).

As fermentações comerciais das bactérias entomopatógenas podem ser realizadas em batelada, batelada alimentada e na forma contínua. Os principais parâmetros monitorados durante o processo fermentativo são temperatura, oxigênio dissolvido, pH e concentração de açúcar. Em virtude do grande consumo de oxigênio durante o cultivo, o controle deste parâmetro é muito importante, não devendo atingir valores abaixo de 20% (COUCH, 2000). A maioria das espécies entomopatogênicas de Bacillus crescem sob condições aeróbias, sendo utilizados normalmente frascos sob agitação orbital a 200 rpm.

Existem controvérsias com relação à necessidade do controle de pH durante a fermentação. Segundo Couch (2000), alguns produtores utilizam meios tamponados por não possuírem um sistema adequado de controle. Outros autores verificaram um aumento na atividade inseticida dos caldos fermentados de B. sphaericus (YOUSTEN; WALLIS, 1987) e de B. thuringiensis var. israelensis (SMITH, 1982) quando a fermentação era realizada sem controle de pH.

Em bateladas alimentadas, os níveis de açúcar para o caso de B. thuringiensis var. israelensis não devem ser inferiores a 2 g/L. A temperatura deve ser mantida em 30 °C ± 2 °C; valores maiores inibem a produção das toxinas (ROWE et al., 1987).

Normalmente os nutrientes são disponibilizados em excesso, e o crescimento continua até que um substrato particular seja exaurido, ou os níveis de oxigênio decresçam até concentrações inibitórias.

A esterilização do meio deve ser planejada de forma a minimizar a perda de vitaminas e prevenir a precipitação dos elementos traços. Dessa forma, os sais de cálcio, magnésio e ferro são esterilizados separadamente, assim como quando é utilizada a glicose ou outro açúcar.

5. Recuperação e concentração de células

A remoção de células microbianas de caldos fermentados constitui uma das etapas mais importantes da maioria dos processos biotecnológicos. Essas partículas, por possuírem dimensões da ordem de micrômetros e baixa densidade, muitas vezes necessitam de pré-tratamentos para a obtenção de recuperações eficientes nos processos de separação por filtração ou sedimentação gravitacional, e a indução da floculação das células é uma das alternativas mais utilizadas.

A separação de células de Bacillus sp. pode ser realizada a partir de um processo de floculação, seguindo-se de uma sedimentação gravitacional. Esse processo foi investigado por Luna (2004), que avaliou o efeito do pH e a adição de agentes floculantes sobre a eficiência de separação de células de B. sphaericus e B. thuringiensis var. israelensis, sendo obtidos resultados de eficiência de recuperação acima de 90%. O processo possui a vantagem de substituir o uso de centrífugas, uma operação de alto custo em se tratando de processos em larga escala.

A etapa de separação de células de Bacillus sp. consiste inicialmente na adição de um floculante em uma concentração que proporcione a melhor eficiência de floculação das células. Podem ser empregadas as substâncias CaCl2.2H2O, FeCl3.6H2O, Al2(SO4)3 e tanino (Tanfloc SG), conforme descrito por Luna (2004). Após a floculação das células, a suspensão é submetida à sedimentação gravitacional em um tanque de sedimentação, sendo retirado o sobrenadante. O sedimento obtido pode então ser utilizado nas etapas posteriores visando à formulação do produto final desejado.

6. Considerações finais

Agentes de controle biológico à base de bactérias entomopatogênicas têm se destacado entre os diversos métodos utilizados nos programas de manejo integrado de larvas de mosquitos. A utilização de biolarvicidas à base de B. sphaericus e B. thuringiensis var. israelensis constitui uma importante alternativa no combate a culicídeos vetores de doenças. A eficácia desses agentes em programas de controle biológico requer a aplicação de manejo adequado, baseada nos estudos do modo de ação das toxinas inseticidas e dos mecanismos de resistência, de forma a se evitar a seleção de populações de insetos resistentes, sobretudo ao B. sphaericus.

Pesquisas de isolamento e avaliação de novas linhagens de Bacillus estão sendo desenvolvidas em nosso País com o objetivo de se obter estirpes que apresentem alta atividade letal contra mosquitos transmissores de doenças humanas e de pragas agrícolas. Apesar da eficácia no controle de insetos, poucos biolarvicidas estão disponíveis no mercado brasileiro. O desenvolvimento de larvicidas microbianos nacionais, adequados ao combate a vetores regionais, traz resultados mais eficazes e econômicos. Medidas de incentivo por parte dos órgãos governamentais e o interesse da iniciativa privada, com a parceria público-privada, devem ser intensificadas para o desenvolvimento de novas tecnologias e da produção comercial ampliando a disponibilidade desses produtos no mercado interno.

7. Referências

BEEGLE, C. C.; ROSE, R. I.; ZINIU, Y. Mass Production of Bacillus thuringiensis and B. sphaericus for microbial control of insect pests. In: MARAMOROSCH, K. B. Biotechnology for biological control of pests and vectors. Boca Raton: CRC, 1991. p. 195-216.

BRAVO, A.; GILL, S. S.; SOBERÓN, M. Bacillus thuringiensis mechanisms and use. In: GILBERT, L. I.; IATROU, K.; GILL, S. S. Comprehensive molecular insect science. New York: Elsevier, 2005. p. 175-206.

COUCH, T. L. Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic bacteria. In: CHARLES, J. F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSEN-LEROUX, C. Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Dordrecht: Kluwer Academic, 2000. p. 297-314.

FLICKINGER, M. C.; DREW, S. W. Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis, and bioseparation. New York: John Wiley & Sons, 1999. 2756 p.

GANUSHKINA, L. A.; LEBEDEVA, N. N.; AZIZBEKYAN, R. R.; SERGIYEV, V. P. The duration of the larvicidal effects of sporocrystalline mass of the bacteria Bacillus thuringiensis spp. israelensis and Bacillus sphaericus in the laboratory setting. Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni, Moscow, RU, n. 4, p. 25-29, 2000.

HABIB, M. E. M.; ANDRADE, C. F. S. Bactérias entomopatogênicas. In: ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. 2. ed. Piracicaba: FEALQ, 1998. p. 383-446.

LUNA, C. L. Avaliação de técnicas de separação fluido-sólido na produção de bioinseticidas a partir de Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis var. israelensis. 2004. 130 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - COPPE, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

MEDEIROS, F. P. M. Desenvolvimento de formulações à base de Bacillus sphaericus para obtenção de um biolarvicida. 2001. 105 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife.

ROWE, G. E.; MARGARITIS, A. DULMAGE, H. T. Bioprocess developments in the production of bioinsecticides by Bacillus thuringiensis. CRC Critical Reviews in Biotechnology, Boca Raton, v. 6, n. 1, p. 87-127, 1987.

SCHNEPF, E.; CRICKMORE, N.; RIE, J. von; LERECLUS, D.; BAUM, J.; FEITELSON, J.; ZEIGLER, D. R.; DEAN, D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, p. 775–806, 1998.

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SMITH, R. A. Effect of strain and medium variation on mosquito toxin production by Bacillus thuringiensis var. israelensis. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, CA, v. 28, n. 9, p. 1089-1092, 1982.

YOUSTEN, A. A.; WALLIS, D. A. Batch and continuous culture of the mosquito larval toxin of Bacillus sphaericus 2362. Journal of Industrial Microbiology, Amsterdam, NL, p. 277-283, 1987.

Capítulo 2
Controle biológico de pragas: considerações e aplicabilidade em Pernambuco

Deise Maria Passos da Silva

Vanildo Alberto L. B. Cavalcanti
Romualdo Camelo Sena
Geraldo Pereira de Arruda

1. Introdução

Nos últimos anos a produção agrícola de alimentos e fibras foi suficiente para atender a demanda mundial de uma população crescente. Segundo a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO, 2009), a população mundial tinha aumentado em 93,5% chegando a 6,453 bilhões de habitantes e uma produção de 2.219,4 bilhões de toneladas, em uma área colhida de 681,7 milhões de hectares. Estudo elaborado, em 2002, pela FAO, mostra o panorama da agricultura para o período de 2015 a 2030, indicando que os países em desenvolvimento deverão tornar-se cada vez mais dependentes das importações de cereais, carnes e produtos lácteos, visto que a produção local não será capaz de atender as necessidades alimentares da população. Com isso, estima-se que serão necessários 1 bilhão de tonelada de cereais adicionais para atender a demanda (CAMARGO, 2009).

Nesse contexto, o Brasil é um dos principais produtores mundiais de alimentos e fibras participando com mais de 4% do valor total das exportações mundiais do agronegócio. Mesmo assim, em 2003 ocupou o 7º lugar no ranking mundial das exportações agrícolas, com o valor de US$ 21,442 bilhões. Além disso, há perspectivas de aumento da participação do Brasil no comércio internacional de produtos do agronegócio, por possuir áreas agricultáveis ainda inexploradas e em várias cadeias produtivas com possibilidade concreta de iniciar ou dar continuidade aos ganhos expressivos de produtividade motivados por inovações tecnológicas (SCOLARI, 2006).

As perdas ocasionadas por organismos nocivos, especialmente os insetos pragas, atingem aproximadamente 30% da produção mundial (ESTRUCH et al., 1997). Estima-se que cerca de 67 mil espécies de insetos causem danos às plantações, sendo as regiões tropicais, normalmente as mais pobres do mundo, as que mais sofrem com a alta incidência de pragas (HERRERA-ESTRELLA, 1999). Diante disso, o setor agrícola vem buscando alternativas biotecnológicas que possibilitem soluções para uma agricultura sustentável que considere a integração de fatores econômicos, sociais e ecológicos (ALTIERI, 1987, 1989, 1991, 2002).

Os insetos são o maior grupamento animal representando cerca de 70% de todo o reino (MARANHÃO, 1976). Desse modo são considerados implacáveis concorrentes do homem no usufruto e domínio da terra (CARRERA, 1980). Diante dessa perspectiva, o método de controle biológico de pragas torna-se uma ferramenta fundamental no manejo de pragas agrícolas, pelos benefícios voltados à preservação e qualidade do meio ambiente, por agir de forma específica, não deixar resíduos, por ser de custo relativamente mais baixo e de menor risco à saúde humana e aos agroecossistemas (GALLO et al., 2002).

2. Considerações sobre controle biológico de pragas

O controle biológico é uma expressão que foi usada pela primeira vez em 1919, pelo pesquisador Harry S. Smith, quando se referiu ao uso de inimigos naturais no controle de insetos pragas (BERTI FILHO; CIOCIOLA, 2002). O termo praga aplica-se a animais que são capazes de reduzir a quantidade de alimentos, rações, fibras, flores, madeiras, etc. (PASCHOAL, 1979). No entanto, as pragas, especialmente os insetos, não são de modo algum calamidades acidentais, devendo ser consideradas como consequências das práticas e das transformações efetuadas pelo homem nos habitats naturais (KUENEN, 1960).

De acordo com DeBach (1964), controle biológico é a ação de parasitos, predadores ou patógenos que mantêm a densidade populacional de outros organismos numa média mais baixa do que ocorreria em sua ausência. Já Caltagirone (1988) considera que esse método consiste na regulação de populações de organismos vivos resultantes de interações antagonísticas como parasitismo, predatismo e competição. Para Gallo et al. (2002), o controle biológico é um fenômeno natural que se fundamenta na regulação do número de plantas e animais por meio de inimigos naturais, denominados agentes de mortalidade biótica. Esse método visa à redução de prejuízos por meio de ações selecionadas, após os conhecimentos dos processos biológicos tanto dos inimigos naturais como das pragas terem sido compreendidos, e as consequências ecológicas, bem como as econômicas, tenham sido previstas, o mais acuradamente possível, para o melhor interesse da sociedade (AGUIAR-MENEZES, 2003).

Um programa estruturado de controle biológico envolve uma ampla gama de atividades, desde a simples conservação de inimigos naturais por meio de uma criteriosa seleção no uso de um pesticida que lhes seja menos tóxico, até a liberação deliberada ou introdução de inimigos naturais (MORETTI, 2008). Nesse contexto, esse método é comumente operacionalizado dentro de programas inter e multidisciplinares de Manejo Integrado de Pragas (MIP). Esse se conceitua como sendo um sistema de decisão para uso de táticas de controle empregadas de forma isolada ou associadas harmonicamente e baseadas em análises custo-benefício considerando o interesse e/ou impacto nos produtores, sociedade e ambiente (GALLO et al., 2002). Esta combinação de técnicas e recursos tem por objetivo manter a população de insetos a níveis abaixo da densidade em que acarrete prejuízos econômicos à cultura (CROCOMO, 1990; PEREIRA et al., 1998).

O controle biológico operacionalmente é aplicado de três formas denominadas controle biológico clássico, natural e aplicado.

2.1. Controle biológico clássico

Este tipo de controle envolve a importação de agentes de controle biológico da região de origem da praga, seja de um país para outro, ou de uma região para outra, de modo a estabelecê-los permanentemente como novos elementos da fauna local. No Brasil, a instituição credenciada para operar neste controle é o Laboratório de Quarentena Costa Lima vinculado ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa). Este iniciou suas atividades em 1991 e está localizado na Embrapa Meio Ambiente (Jaguariúna, SP). Desempenha funções relativas à introdução de agentes de controle biológico, fazendo trabalho de quarentena e mantendo informações sobre as espécies de organismos úteis introduzidas no Brasil (MORETTI, 2008).

2.2. Controle biológico natural ou conservação

Consiste na manutenção dos inimigos naturais nos agroecossistemas favorecendo ou fornecendo condições de sobrevivência e reprodução e, consequentemente, aumentando sua efetividade. Nesse sentido, essa estratégia envolve o manejo do habitat por meio de práticas agronômicas adequadas que vise ao aumento e à preservação desses biocontroladores.

2.3. Controle biológico aplicado ou propagação

Compreende a produção massal de predadores ou parasitoides em laboratório, visando liberá-los em campo em momentos adequados, baseando-se na biologia da praga alvo, de modo a sincronizar as liberações quando a praga encontra-se em seu estágio mais susceptível. Nos últimos anos, este método evoluiu consideravelmente com o avanço dos estudos das dietas artificiais para insetos.

Os inimigos naturais ou agentes biocontroladores de insetos pragas são agrupados em três categorias: predadores, parasitoides e patógenos. Os dois primeiros são denominados agentes entomófagos e podem ser vertebrados (sapo, pássaro, morcego, peixe, etc.) ou invertebrados (insetos, ácaros, aranhas, etc.), sendo que apenas os insetos estão na categoria parasitoides. A última categoria compreende os entomopatógenos (fungos, vírus, bactérias, nematoides e outros microrganismos) capazes de causar doença em insetos (AGUIAR-MENEZES, 2003; GALLO et al., 2002).

Registros de controle biológico datam desde o século III a.C., quando os chineses observaram que as formigas predadoras reduziam as populações de pragas dos citros. Outro marco importante foi a descoberta de Aldrovandi, em 1602, que relatou o parasitismo da lagarta-das-crucíferas por Apanteles glomeratus, considerado o primeiro registro de controle biológico com parasitoides. Entretanto, em 1888, na Califórnia, EUA, é que foi realizado o primeiro programa de controle biológico clássico de sucesso com a introdução da joaninha Rodolia cardinalis, trazida da Austrália, para o controle da cochonilha Icerya purchasi. Desde então, o controle biológico aplicado tem sido praticado, utilizando-se, aproximadamente, mil espécies de inimigos naturais no controle de cerca de 300 espécies de pragas em 350 programas de controle biológico desenvolvidos mundialmente. No Brasil, há casos de sucesso, como os programas de controle biológico das pragas da cana-de-açúcar, dos pulgões-do-trigo, da lagarta e do percevejo-da-cana, da cochonilha-das-pastagens, da minadora-dos-citros, da cochonilha-da-mandioca e de lepidópteros – pragas, utilizando-se tanto insetos entomófagos como agentes entomopatogênicos: Trichogramma spp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Cotesia flavipes (Cam.,1891) (Hym., Braconidae), Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. (Hyphomycetes, Moniliaceae), Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., dentre outros. (AGUIAR-MENEZES, 2003; NAVA, 2007).

3. Exemplos de controle biológico no agroecossistema pernambucano

3.1. Cigarrinhas-da-cana-de-açúcar

O cultivo da cana-de-açúcar no Brasil encontra-se, atualmente, em expansão, em virtude da adoção de técnicas agrícolas avançadas. A aquisição de novas cultivares obtidas em programas de melhoramento, a utilização de controle biológico de pragas e doenças, aplicação de tratamentos fitossanitários, dentre outros parâmetros, têm levado a aumentos significativos na produção de açúcar e álcool (CASTRO; CHRISTOFFOLETI, 2005).

De acordo com dados da Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), a estimativa da safra de cana-de-açúcar para a região Nordeste, representada pelos estados de Alagoas, Pernambuco e Paraíba, foi de 67,8 milhões de toneladas. Para o açúcar, a estimativa foi de crescimento, passando de 4,86 milhões de toneladas na safra passada para 5,01 milhões, significando um aumento de 3,13%. No que confere ao álcool, estimou-se um aumento de 2,75%, passando de um total de 2,22 bilhões de litros para 2,28 bilhões (CONAB, 2008).

A família Cercopidae (ordem Hemíptera) envolve todos os gêneros de cigarrinhas-da-cana-de-açúcar e das-pastagens. Apresenta distribuição geográfica desde o México (América Central) até a América do Sul, e tem como plantas hospedeiras as gramíneas e algumas ciperáceas (MENDONÇA et al., 2005).

A classificação taxonômica, segundo Fennah (1968) e Gallo et al. (2002), compreende a seguinte etapa: ordem – Hemíptera; subordem – Auchenorrhyncha; superfamília – Cercopoidea; família – Cercopidae; subfamília – Tomaspidinae; tribo – Tomaspidini; Gêneros – Aeneolamia, Deois, Mahanarva, Prosapia e Zulia. Os gêneros que ocorrem no Brasil e que apresentam pouca expressão econômica são: Deois, Aeneolamia e Zulia (GUAGLIUMI, 1962; MENEZES, 1982). No entanto, o gênero Mahanarva possui quatro espécies de grande importância econômica: M. posticata (Stal), M. fimbriolata (Stal), M. andígena (Jacobi) e M. rubicunda (Walker) (MENDONÇA et al., 2005).

3.1.1. Cigarrinha-da-folha – Mahanarva posticata

M. posticata é considerada uma das principais pragas da cana-de-açúcar no Nordeste, principalmente nos estados da Paraíba, de Pernambuco e de Alagoas, onde são registrados os maiores danos econômicos. No entanto, sua distribuição no Brasil ficou, até a década de 1960, limitada aos estados: Rio de Janeiro, Espírito Santo, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina (GUAGLIUMI, 1973).

Os machos adultos medem de 12 mm a 13 mm de comprimento por 5 mm de largura. As fêmeas são um pouco maiores com 16 mm de comprimento por 6 mm de largura. Possuem coloração castanha, sendo mais escura nas fêmeas. Apresentam nas asas duas pequenas manchas circulares ou pintas, de cores variando do amarelo até o vermelho, sendo mais acentuadas nos machos (MENEZES, 1982). O ciclo biológico dura aproximadamente 67 dias, e a longevidade média dos machos adultos é de sete dias, e a das fêmeas de 11 dias. No Nordeste, é comum durante o período de inverno ocorrer em média três gerações anuais (GUAGLIUMI, 1973; MENDONÇA et al., 1996).

3.1.1.1. Sintomatologia e perdas da cigarrinha-das-folhas

Em virtude do hábito alimentar de sucção contínua de seiva e injeção de toxina, a cigarrinha-das-folhas provoca a queima das folhas e o aparecimento de estrias longitudinais de coloração amarelada. Consequentemente desencadeia intoxicação sistêmica e seca das folhas, definhamento da planta, redução dos colmos e diminuição da concentração de açúcar (GALLO et al., 2002). As perdas econômicas foram estudadas por Marques e Vilas Boas (1978) e Marques et al. (1981), e demonstraram que infestações médias de 0,81 adulto por colmo e de 10 ninfas por colmo causaram reduções de 11,2% na produção agrícola e 14,9% no rendimento industrial.

3.1.1.2. Nível de dano econômico e nível de controle

A pesquisa recomenda que o nível de dano econômico (NDE) seja de 5 ninfas por cana e de 1 adulto por cana. O nível de controle (NC) corresponde às infestações a partir de 2,5 ninfas por cana e de 0,5 adulto por cana (MENDONÇA; MARQUES, 2005).

3.1.1.3. Considerações sobre a praga

A primeira referência dessa praga no Brasil foi feita por Moreira (1921) em Campos, no Rio de Janeiro, identificada como Tomaspis (Mahanarva) indicata. Seu registro em Pernambuco ocorreu em 1960, por Pietro Guagliumi, consultor da FAO e pesquisador do Instituto do Açúcar e Álcool (IAA). Esse pesquisador, em 1968, enviou amostras desse inseto ao Museu de Londres, cujo taxonomista R. G. Fennah informou tratar-se da espécie Mahanarva posticata (Stal, 1855) (GUAGLIUMI, 1973). A introdução dessa praga nos canaviais pernambucanos ocorreu possivelmente pelo transporte de canas – sementes, e daí partiu para os canaviais de Alagoas. Poucos anos depois sua disseminação atingiu os outros estados do Nordeste (MENDONÇA; MARQUES, 2005).

Um grande projeto governamental executado em Pernambuco, nas décadas de 1960 e 1970, pelo IAA e pela Comissão Executiva de Defesa Fitossanitária da Lavoura Canavieira de Pernambuco (Codecap), deu início a várias pesquisas na área de controle biológico dessa cigarrinha, utilizando o fungo entomopatogênico M. anisopliae (Metsch.) Sorok. As aplicações foram realizadas em larga escala e em grandes áreas nos canaviais nordestinos (GUAGLIUMI, 1969, 1971, 1973). A tecnologia de produção massal de M. anisopliae no Brasil foi melhorada por Aquino et al. (1975), empregando a utilização de arroz autoclavado como substrato sólido em sacos plásticos feitos de polipropileno, o que serviu de modelo básico para vários outros cientistas brasileiros e até de outros países.

O pioneirismo desse programa no Nordeste (Pernambuco e Alagoas) possibilitou a implantação de uma grande rede constituída por 16 laboratórios oficiais e particulares (9 instalados em Alagoas, 6 em Pernambuco e 1 na Paraíba). A produção foi em torno de 70 toneladas de conídios de fungo, cobrindo uma área de aproximadamente 800 mil hectares de cana-de-açúcar (MENDONÇA; MARQUES, 2005). Atualmente encontram-se em funcionamento os laboratórios de produção de fungo do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), a Associação dos Fornecedores de Cana de Pernambuco, Usinas Central Olho Dágua, Cruangi e União Indústria. A empresa Biotech Controle Biológico Ltda., com matriz em Maceió, AL, e filial em Ribeirão Preto, SP, atualmente com 26 anos de existência, tem capacidade de produção mensal de aproximadamente 60 toneladas de fungo Biotech-G. (MARQUES et al., 2005; MENDONÇA; MARQUES, 2005).

3.1.2. Cigarrinha-das-raízes – Mahanarva fimbriolata

3.1.2.1. Bioecologia de Mahanarva fimbriolata (Stal) (Hemiptera; Cercopidae)

Esta espécie encontra-se largamente disseminada nos estados de São Paulo, Paraná, Mato Grosso e sul de Minas Gerais. O aumento das áreas de corte mecanizado da cana crua, deixando sobre o solo as camadas de palha, tem contribuído para o desenvolvimento dessa praga. O macho apresenta 13 mm de comprimento por 6,4 de largura. A coloração do macho é vermelha com as tégminas orladas de preto, formando uma faixa longitudinal de mesma cor. A fêmea é mais escura marrom-avermelhada. Há variações intraespecíficas na coloração dos machos, acentuando o dimorfismo entre os sexos. A fêmea deposita os ovos no solo, próximo às touceiras, porém nunca são encontrados nas bainhas da planta. As ninfas habitam as raízes onde se fixam para sugar a seiva. O ciclo evolutivo completo, sem envolver o tempo em que os ovos passam em diapausa, que pode durar de 2 a 3 meses, pode variar de 30 a 40 dias (GALLO et al., 2002). No entanto, pode desenvolver de 3 a 4 gerações anuais dependendo do período do ano (MENDONÇA; MENDONÇA, 2005).

O nível de controle para essa praga, segundo Mendonça (2003), é de 0,5 ninfa por metro linear de sulco. Essa recomendação concorda com a indicada por Dinardo-Miranda (2003), sendo de 0,5 a 1,0 inseto por metro.

3.2. Broca comum Diatraea spp. (Lepidoptera; Crambidae)

Praga muito comum no Nordeste do Brasil, é responsável por prejuízos aos canaviais pela ação conjunta do complexo com as podridões vermelhas. Em canas jovens, provoca o coração morto pela morte da gema apical. Em cana adulta, também provoca a morte da gema apical, brotações laterais, atrofia dos entrenós e, em decorrência disso, sérias perdas industriais, sobretudo em virtude da ação do complexo broca-podridões. Seu ciclo biológico é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Ciclo biológico de Diatraea saccharalis e Diatraea flavipennella em cana-de-açúcar.

Espécie

Longevidade em dias (média)

Ovo

Lagarta

Pupa

Adulto

D. saccharalis(1)

4 a 8

40

6 a 14

7

D. flavipennella(2)

4 a 8

25 a 27

10 a 17

7

(1) Ciclo médio de 52 a 62 dias. Podem ocorrer até 4 gerações/ano dessa espécie, e a lagarta
poderá também entrar em diapausa por um período de 100 a 150 dias, com predomínio de
inverno frio e/ou seco.

(2) Ciclo médio de 39 a 51 dias.

Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).

3.2.1. Roteiro para levantamento de infestação

Entre os métodos de avaliação de perdas provocadas pela broca comum, também chamada de broca pequena, em nível de campo e usina, sugerimos o seguinte roteiro:

• Dentro de seu universo, ao acaso, examinar no campo, durante o corte, 100 canas inteiras.

• Anotar para cada uma o nº total de entrenós e os dos perfurados pela broca.

• Para o cálculo de infestações – o valor é direto, ou seja, a porcentagem de colmos perfurados entre o total dos examinados.

• Para intensidade de infestação, em que a precisão é maior em termos de levantamentos para uma possível ação de controle, abre-se longitudinalmente cada colmo e contam-se os internódios brocados.

• O cálculo da intensidade de infestação é fornecido pela fórmula:

em que

I = intensidade de infestação; Ib = nº de internódios brocados; Ic = nº total de internódios contados na amostra.

Após as análises dos dados e catalogação dos resultados, determina-se o grau de infestação, utilizando a Tabela 2.

Tabela 2. Parâmetros do grau e da intensidade de infestação utilizados para Diatraea saccharalis e Telchin licus em cana-de-açúcar.

Infestação (%)

Intensidade(%)

Grau de infestação

0 a 25

0 a 5

Baixo

26 a 50

6 a 10

Moderado

51 a 75

11 a 15

Mediano

76 a 95

16 a 25

Elevado

96 a 100

Além de 26

Muito elevado

Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).

3.2.2. Controle biológico

Quando a intensidade de infestação do canavial for acima de 10%, de imediato deve-se realizar a liberação de Cotesia flavipes (Cam., 1891) (Hym., Braconidae), na razão de 4 mil a 5 mil indivíduos por hectare, em locais pré-definidos pelos levantamentos.

Em Pernambuco, experiência em controle biológico utilizando C. flavipes data de 1973, com a implantação de um programa nacional de melhoramento da cana e controle da D. saccharalis pelo (IAA/Planalsucar). Foram implantados vários laboratórios em unidades industriais e com associações de plantadores de cana para multiplicação em larga escala desse parasitoide (ARAÚJO, 1987).

3.3. Controle biológico da palma forrageira

O Semiárido do Nordeste ocupa uma área de aproximadamente 900 mil km, representando cerca de 10% da área total do País. Abriga uma vegetação composta por plantas xerófilas, de composição florística bastante variada denominada caatinga. Essa ocupa cerca de 800 mil km2 do Nordeste, o que corresponde a 70% dessa região (RANGEL et al., 2009).

As condições edafoclimáticas são bastante complexas, em razão de uma acentuada variabilidade das precipitações pluviométricas, diferenciações térmicas, além de solos rasos, pedregosos e/ ou arenosos dispondo de baixos teores de matéria orgânica (EMBRAPA, 1993). Nessa região, é comum a ocorrência do fenômeno natural da seca, ocasionando graves prejuízos aos pecuaristas, como a perda de peso dos animais, queda na produção de leite e o aumento da mortalidade do rebanho, resultante do déficit parcial ou total de água e forragem (FARIAS et al., 2000).

Nesse contexto, a palma forrageira, representada pelas espécies Opuntia ficus-indica Mill, com as cultivares Gigante e Redonda e Nopalea cochenillifera Salm Dyck, conhecida como palma Miúda ou Doce, constitui o principal alimento de subsistência para os rebanhos. Atualmente, seu cultivo no Nordeste ocupa uma área de aproximadamente 600 mil hectares, sendo considerada a maior reserva de forragem do mundo (PRADO, 2008). Sua importância está relacionada ao elevado grau de resistência à seca e às altas temperaturas, adaptabilidade a solos pouco férteis, à alta produtividade, a qualidades nutricionais e de palatabilidade, além de suas múltiplas utilidades. A palma forrageira, dependendo da espécie e variedade, produz inúmeros rendimentos econômicos ao agricultor, tais como produção de frutas e verduras para consumo humano, produtos farmacêuticos, cosméticos, mucilagens para indústrias alimentícias, além do seu uso como substrato na multiplicação da cochonilha-do-carmim, que origina o corante natural carmim, produzido em países como o Peru, Chile, México, dentre outros (BARBERA et al., 2001; MENEZES et al., 2005).

Apesar de apresentar poucas exigências edafoclimáticas ao seu desenvolvimento vegetativo, tem como fator limitante a ocorrência de pragas e doenças. Dentre as pragas, estão as cochonilhas Diaspis echinocacti (Bouché, 1833) (Hemiptera: Diaspididae), conhecida como cochonilha-de-escamas, e a Dactylopius spp. (Hemiptera: Dactylopiidae), conhecida vulgarmente como cochonilha-de-sangue. Esta última, atualmente, vem sendo considerada a principal praga da cultura, especialmente nos estados de Pernambuco e da Paraíba (SANTOS et al., 2006). Em Pernambuco, nos últimos anos, a sua disseminação nos sertões do Pajeú, Moxotó e Central vem ocasionando graves prejuízos aos pecuaristas.

3.3.1. Considerações sobre Diaspis echinocacti – cochonilha-de-escama

A cochonilha-de-escama é um inseto cosmopolita e específico das cactáceas (ALBUQUERQUE; SANTOS, 2005). Ocorreu pela primeira vez no Brasil, em 1900, na cidade do Rio de Janeiro (HEMPEL, 1900), provavelmente junto com as cactáceas Opuntia e Nopalea, trazidas do México pelos portugueses na época da colonização, com objetivo de cultivo da cochonilha que produzia o corante carmim (DOMINGUES, 1963). Em Pernambuco, o primeiro registro dessa praga ocorreu nos municípios de Caruaru, São Bento do Una, Arcoverde Pedra, em 1966, na oportunidade de uma expedição de pesquisa por técnicos do IPA. Naquele momento, foram assinalados ainda o predador Coccidophilus citricola (Brethes) e os parasitoides Plagiomerus cyaneus (Ashmead) e Prospaltella aurantii (Howard). No final dos anos 1960, houve a ocorrência dessa praga na região da bacia leiteira do Estado de Alagoas (CARVALHO et al., 1978; WARUMBY et al., 1993). Atualmente, encontra-se distribuída nos estados da Bahia, de Sergipe, de Alagoas, de Pernambuco, da Paraíba, do Rio Grande do Norte e do Ceará (WARUMBY et al., 2005).

No México, é conhecida como escama blindada por apresentar dificuldades às medidas de controle. É facilmente reconhecida no campo pela forma aglomerada e irregular de se estabelecer, apresentando duas formas de escamas: arredondada (fêmeas) e alongada (machos), ambas de coloração marrom-clara. Formas em desenvolvimento e fêmeas adultas causam dano direto pela sucção contínua da seiva desencadeando clorose. Consequentemente, ocorrem os danos indiretos pela injeção de toxinas, possibilitando a penetração de microrganismos que provocam apodrecimento e queda das raquetes, chegando a matar a planta (ALBUQUERQUE; SANTOS, 2005; WARUMBY et al., 2005).

O ciclo biológico completo desta praga é de aproximadamente 35 dias, passando por 3 fases de ninfa. Os ovos são depositados sob as carapaças das fêmeas maduras, levando de 2 a 3 dias para eclodirem. As ninfas caminhantes deslocam-se de uma planta para outra, e o período até seu estabelecimento leva aproximadamente dois dias. A partir da fixação, essas ninfas de primeiro estádio passam um período de 9,1 ± 0,2 a 10,0 ± 0,4 dias para transformarem em ninfas de segundo estádio. Esse segundo estádio ninfal dura 7,8 ± 0,3 a 8,7 ± 0,3 dias para alcançarem o terceiro estádio. Essas completam seu desenvolvimento no período de 11,2 ± 0,2 a 12,5 ± 0,3 dias. A reprodução se dá por anfigonia e por partenogênese telítoca, que é a forma mais comum observada em campo. O potencial reprodutivo anual de uma fêmea chega a atingir 64 bilhões de indivíduos cultivados em palma doce e 54 bilhões de indivíduos para a palma gigante, com um número de até 7 gerações (ARRUDA, 1983; ARRUDA FILHO; ARRUDA, 2002; SILVA; BARBOSA, 1988).

Os inimigos naturais registrados para a cultura da palma forrageira são os parasitoides Plagiomerus cyaneus (Hymenoptera, Encyrtidae); Prospaltella aurantii (Hymenoptera, Aphelinidae), e os predadores Zagreus bimaculosus (Mulsant), Coccidophilus citricola Brèthes, Chilocorus nigrita (Fabricius) (Figura 1), Pentilia sp., Zagloba beautimonti, Calloeneis sp. (Coleoptera: Coccinelidae) e o sirfídeo Salpingogaster conopida Philipi (Diptera: Syrphidae) (CARVALHO et al., 1978; LIMA et al., 1991; LOPES et al., 2007; SILVA, 1990; SILVA; BARBOSA, 1988; SILVA et al., 2006; WARUMBY et al., 1993).

Figura 1. Ninfas e adultos de Chilocorus nigrita – predador da cochonilha-de-escama Diaspis echinocacti em palma forrageira.
Foto: Deise Maria Passos da Silva

O controle biológico aplicado dessa praga foi pioneiro em Pernambuco com a multiplicação e liberação dos predadores Chilocorus nigrita (Coleoptera, Coccinellidae) e Zagreus bimaculosus (Coleoptera, Coccinellidae), anteriormente denominados Curinus sp. e Fagreus bimaculosus, respectivamente. Foi desenvolvido pelo Laboratório de Entomologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) em parceria com o IPA, no período entre 1978 e 1985. Trabalho semelhante foi conduzido em Alagoas, no período de 1983 a 1987, pela Empresa de Pesquisas Agropecuária do Estado de Alagoas (Epeal), que realizou no Município de Batalha a produção em larga escala do predador Curinus sp. (Coleoptera; Coccinellidae). A técnica de criação em larga escala para Chilocorus nigrita, tanto em insetário como em propriedades particulares, foi desenvolvida por Silva e Silva (1991). Neste trabalho, recomenda-se uma quantidade de 3.200 C. nigrita para cada 1 hectare. Uma proposta de avaliação de controle biológico dessa praga foi realizada por Silva (1991) em 14 propriedades particulares distribuídas em 4 municípios de Pernambuco: Venturosa, Pedra, Afogados da Ingazeira e Floresta. Utilizou-se uma escala de notas de 0 a 4 para avaliar a intensidade de infestação da praga e liberação dos predadores Z. bimaculosus, C. citricola e C. nigrita. Os resultados mostraram a eficiência na aplicabilidade da escala, e o percentual de controle foi em torno de 33% a 80%.

3.3.1.1. Recomendações de controle

O controle mais indicado para D. Echinocacti é o manejo integrado de pragas com ênfase ao biológico, uma vez que já são conhecidos diversos inimigos naturais, atuando principalmente nos estados de Pernambuco e Alagoas (ALMEIDA, 1990; CARVALHO et al., 1978; SILVA, 1990). O manejo integrado dessa praga reúne algumas técnicas possíveis de serem aplicadas e que foram baseadas em trabalhos desenvolvidos nos Estados de Pernambuco e Alagoas (ARRUDA FILHO; ARRUDA, 2006; SILVA, 1991; WARUMBY et al., 2005), com as seguintes recomendações:

• Realizar corretamente o plantio na época indicada, com raquetes sadias sem vestígios da praga, procurando certificar-se sobre a procedência deste material.

• Procurar identificar a presença da cochonilha na área cultivada com a palma logo no início. Esse monitoramento facilitará a erradicação das plantas infestadas.

• Manter a cultura no limpo para evitar competição com ervas daninhas, procurando efetuar adubação química ou orgânica, de acordo com as recomendações da cultura.

• Procurar identificar novos focos em outras propriedades para evitar que homens e animais possam transitar de um local para outro, facilitando a disseminação da praga.

• Eliminar os focos da cochonilha nas áreas cultivadas, desde que as raquetes infestadas não apresentem os inimigos naturais. Essa eliminação consiste em cortar as raquetes atacadas e utilizá-las na alimentação do gado. Essa medida reduz consideravelmente a população da praga.

• Realizar o controle biológico utilizando os inimigos naturais da praga, como joaninhas (predadores), especialmente a espécie C. nigrita, e vespinhas (parasitoides). Esses agentes são liberados ou remanejados de uma área atacada para outra, por meio de coleta e novas colonizações. O procedimento dessa técnica deve ser orientado por um técnico da área. Esse facilitará as orientações para o conhecimento dos inimigos naturais, assim como para a obtenção dos inimigos naturais em laboratório.

• Reconhecimento e separação de machos e fêmeas. O procedimento consiste na introdução de machos nas áreas onde só ocorrem fêmeas visando auxiliar no controle da praga. Para isso, basta coletar raquetes infestadas onde predominem escamas alongadas que representam os machos e, posteriormente, levá-las para outras áreas que estejam infestadas com predominância de fêmeas. Em seguida é só amarrar as raquetes nas plantas atacadas com auxílio de um cordão. Essa medida pode reduzir em até 50% a população de fêmeas.

• Utilizar novos plantios de cultivares que apresentem resistência a essa praga. A palma doce ou miúda é a mais suscetível à praga do que a gigante ou a redonda.

• Antes de tomar qualquer medida é importante constatar se as cochonilhas estão realmente vivas em desenvolvimento. Para isso, basta realizar um simples atrito com os dedos sobre as colônias, e se as carapaças se soltarem facilmente, mostrando estarem ressecadas, isso comprova que elas já estão mortas, não havendo necessidade da aplicação de medidas de controle (CAVALCANTI et al., 2001; WARUMBY et al., 1993).

• Não há registro de produto químico para essa cultura.

Atualmente, a multiplicação de predadores, especialmente C. nigrita, vem sendo desenvolvida, em pequena escala no Laboratório de Entomologia do IPA, objetivando conduzir as pesquisas relacionadas com o programa de manejo integrado de pragas, com ênfase no controle biológico dessa praga.

3.3.2. Considerações sobre Dactylopius opuntiae – cochonilha-do-carmim

Nos últimos anos, a produção de palma vem sofrendo sérios prejuízos causados principalmente pelo ataque da cochonilha-do-carmim, considerada atualmente a principal praga da palma forrageira, principalmente nos estados de Pernambuco e da Paraíba (SANTOS et al., 2006). Foi identificada recentemente pelo Museu Natural de Londres como pertencente à espécie Dactylopius opuntiae (Cockerell) (Hemiptera: Dactylopiidae) (LOPES et al., 2007). No entanto, segundo Costa (1958), esse gênero foi registrado em Pernambuco em 1830 por Luis Jacques Brunet. Outras três espécies nativas, D. ceylonicus, D. indicus e D. subterraneus, são citadas por Silva et al. (1968) em território nacional.

O gênero Dactylopius é o único da família Dactylopiidae (superfamília Coccoidea: Hemiptera) que apresenta nove espécies: D. tomentosus Lamark 1801, D. confusus Cockerell 1893, D. opuntiae Cockerell 1896, D. ceylonicus Green 1896, D. confertus De Lotto 1974, D. austrinus De Lotto 1974, D. salmianus De Lotto 1974, D. zimmermanni De Lotto 1974 e D. coccus Costa 1829 (PORTILLO, 2005).

D. opuntiae é um inseto pequeno, parasito e fitófago, que vive como hospedeiro específico das cactáceas, preferencialmente O. ficus-indica (FLORES-FLORES; TEKELENBURG, 2001). Suas colônias formadas de cera branca flocada são semelhantes a flocos de algodão que abrigam as formas biológicas do inseto. As fêmeas adultas apresentam um corpo ovalado, de cor vermelho-escura, intumescido de ácido carmínico. Os machos se desenvolvem em casulos de cera alongados, aglomerados, semelhantes a pencas (WARUMBY et al., 2005). Um recente estudo da biologia desse inseto, criada sobre O. megacantha Salm Dyck, foi realizado no Nordeste do México, obtendo os seguintes dados biológicos: a duração das fêmeas adultas foi de 38,4 dias, e a do macho de 4,2 dias. O ciclo biológico da fêmea foi de 77 dias, e o do macho de 43 dias. As fases ninfais tiveram períodos semelhantes entre 18,1 e 19,8 dias. O período de pré-oviposição foi de 18,8 dias, e o período de oviposição foi de 21 dias, com uma média de 131 insetos por fêmea. A razão sexual foi de 1:1, podendo também ocorrer partenogênese (FLORES-HERNÁNDEZ et al., 2006). Aspectos biológicos de Dactylopius sp. também foram observados no Laboratório de Entomologia do IPA em Recife, PE, por Warumby et al. (1998). Verificaram que a duração do ciclo de vida foi de aproximadamente 35 dias para o período de verão e de 45 dias nos meses mais frios. O período de oviposição durou cerca de 15 dias. A duração das formas migrantes ou ninfas de primeiro estádio foi de 24 horas, período que corresponde à fase de disseminação da praga em campo.

Nas condições do agreste e sertões do Pajeú, Moxotó e Central, essa praga encontrou condições apropriadas para o seu desenvolvimento. No período de seca, quando as raquetes encontram-se naturalmente em estresse hídrico, o ataque é mais intenso, levando à exaustão das plantas e à queda das raquetes. Em virtude do seu hábito alimentar, as feridas causadas pela sucção do inseto possibilitam a instalação e estabelecimento de patógenos, mais intensamente logo após o período chuvoso.

Poucos são os estudos realizados sobre os inimigos naturais das espécies de Dactylopius, mesmo nos países produtores de carmim como o Perú, Chile, México, Bolívia e Ilhas Canárias onde esses agentes são considerados ofensivos. Esse conceito refere-se à necessidade de se manter a produção da cochonilha-do-carmim D. coccus (Costa, 1829), conhecida como gram fina, sem interferências de agentes de mortalidade biótica, visando à qualidade na obtenção do ácido carmínico (FLORES-FLORES; TEKELENBURG, 2001). Os trabalhos de Diodato et al. (2004), Mena Covarrubias e Rosas Gallegos (2007) e Portillo e Vigueras (2006) apontam diversos insetos entomófagos, destacando principalmente os coleópteros da família Coccinellidae, com os representantes Chilocorus cacti, Chilocorus sp., Exochomus flavipes, Hyperaspis conclusa, Scymnus intrusus, Cryptolaemus montrouzieri, Cybocephalus sp. Um dos levantamentos mais completos de inimigos naturais que citam a ocorrência dos parasitoides Salambona analamprella (Lepidoptera, Pyralidae) e Simpherobius marmoratipennis (Neuroptera, Hemerobidae) foi realizado por Diodato et al. (2004). Esse trabalho registra ainda a ocorrência de mais uma espécie de cochonilha do gênero Dactylopius, o qual assinalou pela primeira vez a espécie D. bassi (Targioni Tozzetti 1866).

Estudos relacionados com o levantamento de inimigos naturais de Dactylopius sp. vem sendo conduzidos por pesquisadores do IPA, desde 2005, em diversos municípios infestados de Pernambuco. Silva et al. (2006) registraram os predadores Zagreus bimaculosus (Mulsant), Coccidophilus citricola Brèthes, Salpingogaster conopida (Philipi) (Diptera: Syrphidae). Recentemente foram encontrados Exochomus sp. (Coleoptera, Coccinellidae) e Chrysopa sp. (Neuroptera, Chrysopidae). Até o momento não foi observado em campo presença de parasitoides dessa praga. O predador C. montrouzieri Mulsant vem sendo multiplicado sobre Dactylopius sp. no Laboratório de Entomologia da Embrapa Semiárido.

Estudos da bioecologia dessa praga vêm sendo desenvolvidos em duas áreas experimentais nos municípios de Pedra e Serra Talhada, por meio de um projeto em parceria entre o IPA e a Embrapa Semiárido.

O estudo de variedades resistentes de palma forrageira vem sendo desenvolvido há anos pelo IPA e recentemente em parceria com a Embrapa. As variedades miúda, orelha de elefante mexicana e a IPA Sertânia são as mais promissoras e estão sendo multiplicadas, em cultura de tecido, em pequena escala (SANTOS et al., 2005). Entretanto, a substituição desses materiais na comunidade agrícola será em longo prazo, necessitando de novas alternativas de controle.

4. Considerações finais

As pragas de importância agrícola que acometem as culturas da cana-de-açúcar e da palma forrageira representam ainda uma diversidade a ser explorada, principalmente em razão da sua elevada capacidade de disseminação e adaptação às condições adversas do meio ambiente.

No Nordeste, os resultados já alcançados nos programas de manejo integrado, especialmente o controle biológico das cigarrinhas-da-cana-de-açúcar e da broca D. saccharalis, incentivam o desafio para novas pesquisas voltadas para o controle da cochonilha-do-carmim Dactylopius spp. Para isso, o conhecimento da bioecologia, biologia, identificações moleculares das demais espécies ocorrentes e de seus inimigos naturais precisam ser desvendados para consolidar direcionamentos efetivos nos programas de manejo integrado da cochonilha-da-palma-forrageira.

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Capítulo 3
Cultura de tecidos vegetais: técnicas utilizadas para multiplicação acelerada da palma forrageira

Andréa Guimarães Vieira de Vasconcelos
Virginia Maria Tenório Sabino Donato
Júlio Zoé de Brito
Mario de Andrade Lira

1. Introdução

As palmas forrageiras (Opuntia e Nopalea) são plantas adaptadas às condições edafoclimáticas da região semiárida e se constituem na base da alimentação de ruminantes nessa região. Apresentam altas produções de matéria seca por unidades de área, é uma excelente fonte de energia, rica em carboidratos não fibrosos e nutrientes digestíveis totais, além de suprir parte das necessidades de água dos animais. Acredita-se que existam atualmente 600 mil hectares de palma plantados no Nordeste, dos quais 100 mil no Estado de Pernambuco (SANTOS et al., 2006).

Apesar da sua adaptação às condições de cultivo da região semiárida, a ocorrência de pragas e doenças vem provocando restrições na exploração da cultura. Assim, de forma a evitar um decréscimo da produção, pesquisas vêm sendo realizadas no sentido de obter clones mais adaptados às condições de cultivo em parte do Semiárido nordestino, que apresentam restrições edafoclimáticas e fitossanitárias para o desenvolvimento da cultura.

A palma se multiplica de forma vegetativa (assexuada) por estaquia de cladódios. A propagação sexual, por sementes, apresenta problemas, dentre eles a segregação genética, uma longa fase juvenil e uma baixa velocidade de crescimento.

A fonte de material vegetativo para implantação da palma são as plantações comerciais, apesar de essas apresentarem as desvantagens de propagação de doença e falta de certificação genética. Além disso, a necessidade de grande quantidade de material demandada para implantação da cultura é um sério problema prático.

A limitação desse sistema de propagação pode ser superada pela utilização de tecnologias disponíveis, como a cultura de tecidos vegetais. O cultivo in vitro de tecidos vegetais apresenta grande aplicação na agricultura. No caso de plantas que se propagam de forma lenta, como a palma, é uma alternativa possível de ser utilizada para a multiplicação e difusão de cultivares promissoras.

A cultura de tecidos vegetais se fundamenta na teoria da totipotência vegetal, que considera que células vegetais manifestam, em momentos diferentes e sob estímulo apropriado, a potencialidade de iniciar um novo indivíduo multicelular (KERBAUY, 1997). Assim, utilizando fragmentos de tecidos vegetais, sob adequadas condições de assepsia, nutrição e fatores ambientais como luz, temperatura, 02 e CO2, é possível a regeneração de uma planta inteira com as mesmas características das plantas originais.

Com o advento da biotecnologia, a técnica de micropropagação teve um forte impacto sobre a produção de plantas em larga escala, e centenas de protocolos foram estabelecidos visando à produção comercial de mudas e à preservação de espécies vegetais ameaçadas de extinção (SOUZA; PEREIRA, 2007).

Segundo Hartmann et al. (1998), a propagação de plantas in vitro é constituída de quatro fases: estabelecimento dos explantes in vitro; multiplicação dos explantes; enraizamento das brotações e aclimatação de plantas. A fase de estabelecimento dos explantes tem como objetivo a obtenção de uma cultura isenta de patógenos. A fase de multiplicação visa estimular a produção do maior número possível de brotações. Para isso, são utilizados reguladores de crescimento, geralmente auxinas, citocininas e giberelinas. Para o estímulo à formação de raízes, as brotações são transferidas para um meio de cultura específico de enraizamento, suplementado com reguladores de crescimento, geralmente auxinas como o ácido indolbutírico (IBA) e ácido naftalenoacético (ANA). Finalmente a última fase, a aclimatização, consiste na adaptação da planta a um novo ambiente, onde não mais terá os nutrientes prontamente disponíveis do meio de cultura, iniciando-se assim a fase de autotrofia (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

Para o estabelecimento in vitro, é necessário estudos de combinações ótimas de fatores (genótipo x fonte de explante x condições de cultivo) para que o processo seja bem sucedido. Llamoca-Zárate (1999) iniciou o desenvolvimento de protocolo para multiplicação in vitro da Opuntia fícus-indica. Vasconcelos et al. (2002) trabalharam na multiplicação da espécie Nopalea cochenellifera. A partir desses trabalhos, foi possível identificar que um dos principais problemas na micropropagação da cultura é a etapa de multiplicação. O número de brotos obtidos tem se mostrado bem inferior às brotações de outros vegetais como o abacaxi e a cana-de-açúcar, que têm protocolos comerciais de micropropagação estabelecidos (LORENZO et al., 1998; SILVA et al., 2007).

A definição completa de um protocolo precisa contemplar todas as etapas envolvidas na multiplicação até a disponibilização de material vegetativo para plantio de novos clones. Esse texto visa descrever as etapas e protocolos definidos para a multiplicação in vitro da palma forrageira.

2. Estabelecimento dos explantes in vitro

2.1. Explantes

Dentro da terminologia da cultura de tecidos, explante é qualquer segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura in vitro.

Geralmente, para iniciar-se o cultivo in vitro são utilizados explantes de tecidos jovens com tamanhos que podem variar de 0,2 mm a 20 mm ou mais. O tamanho do explante, em geral, está relacionado com o objetivo do trabalho, devendo ser o menor possível quando se trata de obter a limpeza clonal. Por outro lado, o tamanho do explante determina suas chances de sobrevivência e desenvolvimento.

A planta matriz é aquela da qual serão retirados os explantes. A sanidade da planta matriz é um importante fator no que tange à facilidade de descontaminação do explante no processo de estabelecimento da cultura in vitro. Para a cultura da palma, verificou-se a viabilidade de inoculação de seguimentos contendo pelo menos 1 gema com tamanho variando entre 0,5 cm2 e 1 cm2 obtidos de cladódios jovens, brotados das plantas matrizes colhidas nos campos de produção.

2.2. Desinfestação

A desinfestação é um processo de esterilização da superfície do explante, visando eliminar os microrganismos como bactérias, fungos e leveduras. Esse processo é necessário, pois além de competir pelos nutrientes do meio de cultura, esses agentes podem produzir toxinas que influenciam o processo de regeneração do explante.

Para assegurar a sanidade dos explantes utilizados na introdução da cultura, sugere-se um pré-tratamento aplicado no cladódio matriz. Os cladódios colhidos no campo devem ser lavados com o auxílio de uma esponja e detergente neutro e em seguida tratados com solução de fungicida (Carbendazin 1,3 mL/L), secos ao ar e acondicionados em câmara de germinação tipo BOD (30 oC ±1 oC e 16 horas de luz). Esse acondicionamento visa estimular a formação dos brotos que serão utilizados como fonte de explantes para início do processo de multiplicação in vitro.

As brotações devem ser pulverizadas com o mesmo fungicida, e, após 15 dias, os cladódios jovens, entre 5 cm e 8 cm, podem ser submetidos ao processo de desinfestação para introdução in vitro.

Para desinfestação dos explantes, podem ser utilizadas diversas substâncias de ação germicida. Entre as mais utilizadas estão o etanol, o hipoclorito de sódio e o de cálcio. Além desses, também são usados o cloreto de mercúrio, ácido clorídrico, peróxido de hidrogênio, entre outros.

Para a palma forrageira, um método eficiente de desinfestação consiste na lavagem do material com álcool etílico a 70% durante um minuto, seguida de imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2% por 10 minutos.

Após esse processo de desinfestação, os tecidos devem ser lavados por três vezes com água destilada autoclavada, já em ambiente estéril (câmara de fluxo laminar), para em seguida proceder o isolamento e a inoculação dos explantes no meio de cultivo.

2.3. Isolamento

O isolamento dos explantes consiste na sua extração, propriamente dita, e só deve ser feita em câmara de fluxo estéril, com flambagem de todos os instrumentos utilizados. É recomendável utilizar mais de um conjunto de pinças e bisturis, de maneira que, após a flambagem, o material possa esfriar antes de ser utilizado.

Antes do início dos trabalhos, a câmara deve ser limpa com etanol e esterilizada com lâmpada germicida por um mínimo de 20 minutos. O fluxo de ar deve ser acionado antes que seja desconectada a luz germicida. A manipulação do explante deve ser rápida e precisa para evitar sua desidratação. Após o isolamento, os explantes devem ser inoculados no meio de cultura adequado.

2.4. Meios de cultura

Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas são conservadas nas células cultivadas, embora alguns processos, como fotossíntese, possam ser inativados pelas condições de cultivo e pelo estado de diferenciação das células. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às necessidades específicas in vitro. Complementando as substâncias biossintetizadas pelas células, vários compostos orgânicos são adicionados ao meio para suprirem as necessidades metabólicas, energéticas e estruturais das células.

As formulações dos meios de cultura básicos são inúmeras, não existindo um meio padrão, embora o mais amplamente difundido seja o meio idealizado por Murashige e Skoog, em 1962, conhecido mundialmente como meio MS, descrito na Tabela 1.

Tabela 1. Composição do meio de cultura de Murashige e Skoog (1962).

Constituinte

Quantidade (mg/L)

Inorgânico

NH4NO3

1.650

KNO3

1.900

CaCl2 2 H2O

440

MgSO4 7 H2O

370

KH2PO4

170

KI

0,83

H3BO3

6,2

MnSO4 4 H2O

22,3

ZnSO4 7 H2O

8,6

Na2MoO4 2 H2O

0,25

CuSO4 5 H2O

0,025

CoCl2 6 H2O

0,025

FeSO4 7 H2O

27,8

Na2 EDTA 2 H2O

37,3

Orgânico

Inositol

100

Tiamina Hl

0,1

Ácido nicotínico

0,5

Piridoxina HCl

0,5

Glicina

2,0

Sacarose

30.000

Ágar

0,8%

Fonte: Murashige e Skoog (1962).

2.4.1. Componentes de meios nutritivos

A composição dos meios nutritivos deve abranger todos os minerais essenciais à nutrição vegetal, além de fornecer uma fonte de carbono, em geral um carboidrato, tendo em vista a reduzida capacidade, ou mesmo a total incapacidade, fotossintética dos explantes. Algumas vitaminas e aminoácidos também podem ser incorporados ao meio nutritivo. No desenvolvimento dos meios nutritivos para a cultura de tecidos de plantas, houve, desde o início, uma procura de meios definidos de composição conhecida e controlada. Assim, torna-se possível a reprodução dos resultados em qualquer época ou lugar.

2.4.1.1. Água

A água é o componente de maior quantidade no meio. É uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de tecidos in vitro. A água destilada e deionizada, ou bidestilada, normalmente, é suficiente pura para uso nos meios. No entanto, dependendo da fonte da água do laboratório (poço artesiano, por exemplo), podem ser encontrados contaminantes orgânicos voláteis, que permanecem após a destilação e inibem o crescimento das culturas.

2.4.1.2. Macronutrientes

Os nutrientes empregados nos meios de cultura são os mesmos estabelecidos para a nutrição mineral básica das plantas no campo.

Os elementos exigidos em maiores quantidades para o crescimento de plantas inteiras são incluídos nos meios nutritivos na forma de sais inorgânicos; são eles o nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre.

2.4.1.3. Micronutrientes

Os micronutrientes incluem todos aqueles elementos minerais aceitos atualmente como essenciais para plantas clorofiladas (manganês, zinco, boro, cobre, cloro, ferro e molibdênio, além do cobalto e iodo).

2.4.1.4. Carboidratos

As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às vezes, não apresentam teores de clorofila suficiente para realizar fotossíntese que sustenta o crescimento. Portanto, a sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos, sendo que esse açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das espécies. A concentração de sacarose também é um fator importante para obter crescimento ótimo, dependendo do explante.

Os carboidratos mais usados nos meios de cultura são a sacarose, a glicose e a frutose nos níveis de 2% a 5% (p/p) (GEORGE, 1993). A concentração de 3% é a mais usada. Concentrações de sacarose entre 6% e 12% podem ser usadas em cultura de embriões, frutos e anteras, enquanto que o nível de 1,5% é usado em cultura de protoplastos.

No que se refere à concentração de sacarose, para a palma forrageira, Vasconcelos et al. (2002) observaram as maiores porcentagens de multiplicação no material cultivado com 30 g/L de sacarose. Entretanto, diversos autores (ESCOBAR et al., 1986; LLAMOCA-ZÁRATE, 1999; VILLALOBOS et al., 2001) relatam que, para cactáceas do gênero Opuntia, a concentração ideal de sacarose é de 50 g/L.

A sacarose, além de fornecer energia metabólica e esqueleto carbônico para uma diversidade de compostos orgânicos, desempenha um importante papel como componente do potencial osmótico do meio de cultura.

2.4.1.5. Vitaminas

Os primeiros estudos com cultura de raízes definiram a mistura básica de vitaminas utilizadas até hoje. Essa mistura consiste de tiamina (vitamina B1), ácido nicotínico (niacina) e piridoxina (vitamina B6), a qual normalmente se adiciona o aminoácido glicina.

2.4.1.6. Mio-Inositol

O mio-inositol é um componente do meio MS e da maioria dos outros meios em uso atualmente. A concentração mais usada de mio-inositol nos meios é de 100 mg/L.

2.4.1.7. Reguladores de crescimento

A composição e concentração de hormônios no meio são fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos. As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos. A formação de raiz, parte aérea e calo em cultura de tecidos é regulada pela disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento.

Existem várias substâncias que pertencem a cada uma dessas classes de reguladores e que são usadas, de acordo com o objetivo do estudo, nos meios de cultura. As várias auxinas (AIA – ácido 3-indolacético, AIB – ácido indolbutírico e 2,4-D ácido 2,4-diclorofenoxiacético, entre outras) dão respostas diferentes in vitro. As auxinas nos meios variam de 0,01 mg/L a 10 mg/L. As auxinas mais usadas são AIA, AIB, ANA (ácido naftaleno acético), 2,4-D e picloran. O AIA é a auxina natural e a menos estável, sendo destruído em pH baixo. A não ser o 2,4-D e ANA, as soluções estoques não devem ser armazenadas por mais de uma semana. A dissolução das auxinas é feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10 mg de auxina.

Também existem diferenças entre as citocininas, sendo que o BAP – 6-benzilaminopurina induz a formação de grandes números de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação.

As citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um papel fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na maioria das espécies (SANTIAGO et al., 2001). Induzem a divisão celular, proliferação e morfogênese da parte aérea. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos são a cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).

Poucas culturas in vitro mostram respostas às giberelinas. Também não verificamos relatos da utilização desse regulador para a palma forrageira.

2.4.1.8. Ágar e semelhantes

Os meios nutritivos podem ser líquidos ou sólidos, sendo que a cultura em meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitação para fornecer o oxigênio necessário para a respiração do explante. Os meios líquidos possuem a vantagem de preparo mais rápido e mais barato do que os sólidos.

Os meios sólidos ou semissólidos, tradicionalmente, são solidificados com ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas). A concentração de ágar usada varia de 0,6% a 1% (de 6 g/L a 10 g/L) o qual é dissolvido em água fervente sendo responsável pela consistência do meio que depende de sua concentração. É necessária a aquisição de ágar de boa qualidade, pois este pode ser tóxico em algumas condições de cultivo.

Outros produtos gelificantes são Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). São mais puros que o ágar e provenientes de fermentações bacterianas e usados na concentração de 0,2%.

Alguns laboratórios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes, porém apresentam restrições quanto à longevidade por degradar ao longo do cultivo.

2.4.1.9. pH

O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente ácido, entre 5 e 6, normalmente 5,8 (TORRES et al., 1998). Recomenda-se este valor para formulações líquidas. Em meios gelificados com ágar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0 ocorre a hidrólise de polissacarídeos, enquanto que em pH 6,0–6,2 verifica-se a precipitação de sais. No ajuste do pH, lava-se primeiramente o eletrôdo, e, em seguida, faz-se a leitura em tampão 4,0. Posteriormente lava-se o eletrôdo e dessa maneira o potenciômetro estará calibrado para uso. O pH varia durante o período de cultura.

2.4.2. Preparação dos meios

Em diferentes laboratórios, procedimentos diversos são utilizados para preparar os meios nutritivos. Normalmente, mantêm-se soluções estoque dos sais minerais na geladeira em concentrações mais elevadas, a partir das quais a preparação do meio é efetuada.

O preparo de soluções estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e precisão na dosagem dos componentes.

Normalmente mantêm-se os macronutrientes em soluções estoque em concentrações 10 vezes superiores ao da concentração final (TORRES et al., 1998). Os micronutrientes são mantidos em concentração estoque, 1.000 vezes superior à concentração final; e os quelatos EDTA Fe são mantidos em solução estoque 50 vezes superior. As porções são mantidas em geladeira e por um período não superior a uma semana para a maioria das soluções estoque, principalmente aquelas que apresentam precipitação.

Soluções estoque das vitaminas podem ser mantidas na geladeira ou no congelador; a sacarose e o mio-inositol, que são utilizados em quantidades elevadas, são pesados sempre que se prepara um meio nutritivo.

Após preparação, os meios são esterilizados após serem distribuídos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem, a 121 oC (1 kg/cm2) por 15 a 20 minutos.

2.4.3. Meio de introdução para palma forrageira

Vasconcelos et al. (2007) definiram a associação de 2,0 mg/L de BAP (Benzilaminopurina) e 0,1 mg/L de AIA (Ácido Indolacético) em meio de cultura MS completo, suplementado com de 30 g/L de sacarose e solidificado com 6,5 g/L de ágar-ágar, para introdução da espécie Nopalea cochenellifera. Os explantes submetidos a esse tratamento apresentaram maior número de brotações e menor índice de necrose ou de explantes sem brotação, quando comparados aos inoculados sem AIA ou na concentração de 0,25 mg/L. Frota et al. (2004) sugerem a associação de BAP a 2,00 mg/L e AIA a 0,25 mg/L com 50 g/L de sacarose para a espécie Opuntia fícus indica.

No laboratório de cultura de tecidos vegetais do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), a rotina de introdução da cultura in vitro, para as diferentes espécies, é a associação de 1,0 mg/L de BAP e 0,1 mg/L de AIA em meio de cultura MS completo, suplementado com de 30 g/L de sacarose. O resumo do estabelecimento da palma forrageira in vitro pode ser verificado na Figura 1.

Figura 1. Esquema resumido para estabelecimento da cultura da palma forrageira in vitro.

3. Multiplicação dos explantes

A micropropagação permite uma propagação segura de cultivares desejáveis, de forma rápida e com alto coeficiente de multiplicação. O estoque de plantas in vitro permite um fluxo contínuo de produção de mudas livre de patógeno em todas as épocas do ano e com uniformidade genética.

3.1. Regeneração dos explantes

Existem três fatores que afetam a regeneração da planta in vitro: o genótipo (espécie, cultivar ou variedade), a fonte de explante (raiz, caule, meristemas, etc.), e a condição da cultura (meio de cultivo, luz, temperatura, etc.).

É interessante notar que variedades de uma mesma espécie respondem de maneira diferente às condições de cultivo. No entanto, alguns autores consideram que toda espécie e toda cultivar são capazes de responder às condições de cultivo in vitro desde que sejam utilizadas combinações corretas dos demais fatores (MANTELL et al., 1994).

A fonte de explante também é um fator importante no sucesso de regeneração in vitro, pois a capacidade de regeneração, entre outros fatores, depende da maturidade, do estado fisiológico e do tecido utilizado. Segundo Taiz e Zeiger (2004), as gemas axilares são meristemas secundários que apresentam estrutura e potencial de desenvolvimento similar àquele do meristema apical. Ápices caulinares, gemas axilares e meristemas isolados são os explantes mais indicados na propagação clonal in vitro. Eles possuem determinação para o crescimento vegetativo e, satisfeitas as necessidades nutricionais, irão se desenvolver naturalmente em plantas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Seu desenvolvimento se dá por meio de divisões celulares e requer substâncias de reserva, por isso o tamanho do explante é um fator que determina suas possibilidades de sobrevivência e capacidade de crescimento.

As condições de cultura, principalmente o meio de cultura, são decisivas para o sucesso da regeneração in vitro. O meio de cultura é constituído de sais minerais, nitrogênio reduzido, uma fonte de carbono, vitaminas e reguladores de crescimento, necessários para manter a divisão celular e a proliferação dos explantes (ANDRADE et al., 2000).

Para palma forrageira, foi testado o meio MS com modificações nas concentrações de sacarose e associações de dosagens de hormônios nos diversos processos de micropropagação, desde a introdução ao enraizamento. Para introdução, a depender da espécie a ser utilizada, a composição mais recomendada é a associação de 1,0 mg/L de BAP e 0,1 mg/L de AIA em meio de cultura MS completo, suplementado com de 30 g/L de sacarose.

As condições ambientais em que serão mantidos os explantes após sua inoculação no meio nutritivo também interferem na regeneração dos explantes. Luz e temperatura são dois fatores importantes nas salas de cultura, onde devem ser controlados para que as plantas ali mantidas se desenvolvam adequadamente.

São raras as salas de cultura com iluminação constante. A luz é importante para a planta sob três pontos de vista: do ponto de vista da fotossíntese, da fotomorfogênese e do fototropismo. As condições de luminosidade podem variar desde o escuro total, especialmente no início do cultivo, até uma faixa de 100 mmol/m2/s a 110 mmol/m2/s, com um fotoperíodo de 12 a 16 horas. No laboratório de cultura de tecidos vegetais do IPA, a palma forrageira é mantida sob luz fluorescente com intensidade de 90 mmol/m2/s a 110 mmol/m2/s com fotoperíodo de 16 horas.

A maioria das culturas desenvolve-se bem na faixa de 20 oC a 27 oC. A temperatura nas salas de incubação ou crescimento, em geral, é mantida na faixa dos 25 oC ± 2 oC. É importantíssimo contar com um sistema de refrigeração acionado por termostato para manter fixa a temperatura. A palma forrageira se desenvolve bem quando mantida em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC ± 2 ºC.

3.2. Crescimento e multiplicação

Os protocolos estabelecidos para multiplicação da palma e crescimento dos brotos envolvem o cultivo sequencial dos explantes em meio semissólido advindos de gemas axilares (ESCOBAR et al., 1986; LLAMOCA-ZÁRATE, 1999; VASCONCELOS et al., 2007). Entretanto, o emprego comercial dessa técnica é reduzido em virtude dos altos custos de produção, principalmente com mão de obra, baixa taxa de multiplicação e perdas durante o processo.

Para utilizar essa técnica com a finalidade de disponibilizar novos clones da cultura, existe a necessidade de aumentar a velocidade de multiplicação dessa cultura. Assim, novas alternativas de multiplicação acelerada, por meio da utilização do fracionamento de explantes in vitro e do sistema de imersão temporária, vêm sendo estudadas para os diversos clones.

Para a Nopalea cochenellifera, o fracionamento longitudinal dos explantes, inoculados no meio semissólido, promoveu um aumento significativo nas brotações. A realização do corte longitudinal proporcionou um aumento em torno de 70% no número de brotos obtidos. Essa maior multiplicação do material se justifica pela exposição de uma área maior do broto ao BAP, facilitando o desenvolvimento de novos brotos a partir das gemas axilares pré-existentes. Além disso, o corte também possibilitou a quebra da dominância apical, favorecendo uma maior brotação das gemas laterais. Nesse trabalho, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC ± 2 ºC, sob luz fluorescente com intensidade de 50 µmols/m2/s a 60 µmols m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas.

Para a espécie Opuntia stricta Haw., conhecida como Orelha de Elefante Mexicana, os explantes inoculados sem corte proporcionaram maior número de brotações, aproximadamente 6,0 brotações por explante, demonstrando que, para esse clone, o corte, tanto longitudinal como transversal, dos explantes não favorece o aumento da multiplicação. Nesse trabalho, os explantes foram mantidos em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC + 2 ºC, sob luz fluorescente com intensidade de 90 µmols/m2/s a 110 µmols/m2/s com fotoperíodo de 16 horas. Os explantes (brotações de 2,0 cm de comprimento e 0,5 cm de largura, com aproximadamente 100 dias de cultivo) foram cultivados em meio MS completo, suplementado com de 30 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de BAP (benzilaminopurina) e 0,1 mg/L de AIA (ácido indolacético) e solidificados com 6,5 g/L de ágar-ágar.

A brotação in vitro está relacionada com as concentrações endógenas e exógenas de citocininas e o balanço auxina x citocinina. As citocininas são necessárias para a divisão das células vegetais in vitro (TAIZ; ZEIGER, 2004). O tipo de citocinina e sua concentração são os fatores que mais influenciam o sucesso da multiplicação in vitro (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Assim, é fundamental a utilização de citocinina no meio de cultura para obter boas taxas de multiplicação. A escolha de citocinina e da concentração utilizada dependerá do material utilizado. O BAP tem sido muito eficaz para promover multiplicação em diversas espécies, e parece ser a citocinina por excelência para multiplicação de partes aéreas e indução de gemas adventícias, além de ser a mais barata de todas. As citocininas apresentam grande habilidade na indução da divisão celular em culturas de tecido, juntamente com as auxinas.

A maior produção de citocininas ocorre nos meristemas das raízes, sendo que elas se translocam para as outras partes a partir do xilema. As auxinas fazem o caminho inverso e, por meio do floema, vai do ápice caulinar para a base. Segundo Raven et al. (1999), em plantas intactas, as citocininas promovem o crescimento das gemas laterais, atuando de maneira oposta aos efeitos das auxinas.

As auxinas estão relacionadas com a extensão do caule, principalmente pela promoção do alongamento celular. Também exerce papel na diferenciação de tecidos vasculares e inicia a divisão do câmbio vascular. Frequentemente inibe o crescimento de gemas laterais, mantendo a dominância apical (RAVEN et al., 1999).

A proliferação de brotos in vitro pode ser maximizada com o emprego de dois ou mais reguladores de crescimento. Andrade et al. (2000) e Sabá et al. (2002) verificaram que baixas concentrações de BAP promoveram maior número de brotos em jaborandi (Polycarpus microphyllus) e aroeira (Myracrodrum urundeuva). Contudo, Guerra et al. (1999) observaram que altas concentrações de BAP propiciaram melhores resultados na multiplicação de brotos de abacaxizeiro.

É interessante ressaltar que os reguladores de crescimento vegetal e suas concentrações adequadas para proporcionar a maior quantidade de brotos variam de acordo com o genótipo da planta considerada e devem ser determinados para cada espécie. Segundo Serafini et al. (2001), os tratamentos acrescidos de pequenas concentrações de citocininas, além de menos onerosos, apresentam ainda menor probabilidade de indução de variação somaclonal, que é uma característica imprópria para um protocolo de micropropagação por promover alterações genéticas nesses indivíduos que podem levar à perda das características desejadas.

Face ao exposto, a definição do tipo de concentração ótima de citocinina para a multiplicação constitui em passo importante para determinação de protocolo de micropropagação. Experimentos testando diversas combinações de citocininas com outros fitorreguladores são muito comuns para o ajustamento de meios. Muito ainda precisa ser conhecido sobre os mecanismos de hormônios vegetais e sobre os processos que controlam as brotações da palma forrageira. Possivelmente uma maior proliferação de brotos de palma necessite da combinação de citocininas com maiores níveis de auxinas.

No trabalho de Vasconcelos et al. (2002), o maior número médio de brotos (15/explante) obteve-se a partir de explantes cortados e mantidos em meio com 30 g/L de sacarose que proporciona a obtenção de 8.910 plantas enraizadas em 6 meses de cultivo, considerando uma contaminação de 10% e uma indução de 60% dos explantes inoculados e 60% dos brotos cortados. Sem considerar perdas nos processo de multiplicação, é possível a obtenção de 24.300 plantas em 6 meses de cultivo. Escobar et al. (1986), trabalhando com Opuntia amylacea, obteve também uma média de 15 brotos por cada explante inoculado em meio MS com 50 g/L de sacarose e 10 µM de BA, 25 dias após o corte longitudinal dos brotos iniciais. Assim, partindo de uma raquete de 5 cm e inoculando 30 gemas, foi possível a obtenção de 25 mil plantas em 85 dias de cultivo, sem considerar as perdas do processo. Para a Opuntia ficus-indica cv. Gigante, Llamoca-Zárate (1999) obteve 1.258 plantas em um ciclo de cultivo (120 dias), partindo de uma raquete com, aproximadamente, 50 explantes.

Em contraste com o cultivo em meio semissólido, o cultivo de explantes em meio líquido possibilita a automação do processo de micropropagação, redução de trabalho e, consequentemente, a redução dos custos relativos à mão de obra. Várias pesquisas utilizando sistemas de automação, principalmente o uso de biorreatores para a micropropagação em meio líquido, têm sido relatadas (ESCALONA et al., 1999; LEMOS et al., 2001; SILVA et al., 2007). O emprego de biorreatores em cultivo líquido pode apresentar maior eficiência na produção de biomassa, maior número de brotos viáveis à aclimatização e maior crescimento dos explantes quando comparado com a micropropagação convencional.

O sistema de biorreator de imersão temporária é constituído por dois frascos conectados por tubos de silicone; um dos frascos contém o meio de cultura e no outro ocorre o cultivo dos explantes, modelo similar ao sistema de frascos gêmeos-BIT, utilizado por Escalona et al. (1999), que foi desenvolvido por Teixeira (2002). Nesse sistema, o ar fornecido por um compressor é esterilizado por uma membrana de 0,22 μm, entra no frasco que contém o meio de cultura e faz com que o líquido chegue ao outro frasco que contém os explantes.

Após um tempo de imersão, ocorre reversão do processo, e o meio nutritivo retorna para seu frasco. A frequência e o tempo de imersão são controlados por timers eletrônicos e válvulas solenoides (ESCALONA et al., 1999). O tempo de imersão pode variar, e o ar promove a renovação da atmosfera do frasco.

No laboratório de cultura de tecidos do IPA, o sistema de imersão temporária vem sendo testado a fim de definir um protocolo que promova o aumento da brotação, crescimento e até enraizamento das plantas. Nesses trabalhos, são usados frascos de 5 L, contendo 1.000 mL de meio de cultura. Em função dos trabalhos experimentais, são usados 10, 15 e até 30 explantes por frasco, mantidos em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC + 2 ºC, sob luz fluorescente com intensidade de 90 µmols/m2/s a 110 µmols/m2/s com fotoperíodo de 16 horas. Nesse sistema, os primeiros estudos testaram a imersão no meio de cultura a cada 3, 6 e 8 horas, por 4 minutos, sendo 3 minutos de imersão, mais 1 minuto de bombeamento do meio, que permanece em contato com os explantes. Foi utilizado meio MS suplementado com 1 mg/L de BAP, 0,1 mg/L de ANA, pH ajustado para 5,8.

O que se tem observado na utilização desse processo é que, apesar da promoção de uma maior brotação, quando comparado ao sistema convencional de micropropagação, o maior tempo de exposição dos explantes ao meio de cultura promove a hiperidricidade dos brotos. Essa não é uma característica desejada, uma vez que esse fenômeno pode afetar a sobrevivência e adaptação das plantas cultivadas in vitro após sua transferência para o solo.

Como alternativa a esse problema, vem sendo testada uma redução no tempo de imersão associada a uma redução na frequência. Mas não existem resultados conclusivos sobre esse processo.

4. Enraizamento

O enraizamento é uma etapa que define o resultado final da microropagação, é a etapa onde ocorre a formação de raízes adventícias nas partes aéreas. Pode ser dividido em indução, iniciação e alongamento das raízes (TORRES et al., 1998). Pode ser realizado in vitro como no ambiente externo, porém resultados mais satisfatórios para a maioria das espécies têm sido obtidos no enraizamento ex vitro.

A vantagem do enraizamento in vitro é o melhor controle das condições em que se trabalha, e, com isso, a obtenção de um alto percentual de enraizamento. Por outro lado, a desvantagem do método é que as raízes formadas in vitro nem sempre são eficientes na absorção de água e de nutrientes, no momento da passagem das mudas para o substrato. Raízes produzidas in vitro podem possuir poucos pêlos radiculares e conexões vasculares, e só começarem a desenvolver o câmbio secundário quando são removidas do frasco de cultura.

Auxinas como o AIB (ácido indolbutírico), AIA (ácido indolacético) e ANA (ácido naftalenoacético) são os principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro. As concentrações mais utilizadas para induzir rizogênese normalmente estão entre 1,0 mg/L e 10,0 mg/L para AIA; 0,05 mg/L e 1,0 mg/L para ANA; e 0,5 mg/L e 3,0 mg/L para AIB (SOARES et al., 2001).

Associadas às auxinas, outras substâncias também interferem de forma direta ou indireta no enraizamento dos explantes. Poliaminas, ácido sulfúrico, cloreto de magnésio e compostos fenólicos, como o floroglucin, atuam, por exemplo, estimulando a síntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. Já as citocininas, geralmente utilizadas para estimular a formação de brotações, costumam inibir o enraizamento. Existem poucos casos em que uma citocinina não interfere ou estimula a formação das raízes. As giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das vezes, a rizogênese.

A concentração de sais no meio de cultura pode ser regulada de acordo com cada espécie, de forma que a redução da concentração iônica dos meios (50% ou 75% da força total do meio) também pode favorecer essa etapa do processo.

Vasconcelos et al. (2007) obtiveram bons resultados de enraizamento em meio de cultura MS básico, suplementado com 30 g/L de sacarose. Frota et al. (2004) recomendam a suplementação do meio de cultura com 5,0 mg de ANA para desenvolvimento, enraizamento e posterior aclimatização. No laboratório de cultura de tecidos do IPA, o que se tem verificado é que brotos transferidos para meio MS sem adição de reguladores de crescimento e com 30 g/L de sacarose apresentaram raízes em quantidade e com um grau de desenvolvimento compatíveis com aclimatação, 30 dias após essa transferência.

No cultivo em sistema de imersão, o enraizamento é bastante reduzido. É preciso realizar estudos a partir de estímulos hormonais para promoção do enraizamento dos explantes nessa condição de cultivo.

5. Aclimatização

Aclimatização e aclimatação são termos que apresentam conotações diferentes. O primeiro trata dos processos para a passagem da planta que está in vitro para o ambiente e é definido como a adaptação climática de um organismo, especialmente uma planta, que é transferido para um novo ambiente, sendo todo esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatação tem um significado similar, mas é um processo no qual as plantas ou outros organismos se tornam ajustados a um novo clima ou situação, como resultado de um processo essencialmente natural.

Os principais problemas dessa etapa do processo são:

a) Baixa capacidade fotossintética

A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas são, inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em condições de campo. Essa variação na anatomia ou ultraestrutura pode afetar o processo de fotossíntese. As organelas que apresentam capacidade autotrófica não estão bem desenvolvidas, e, consequentemente, existe uma dificuldade em aclimatização.

No estágio de aclimatização, as plântulas sofrem uma mudança drástica quando são removidas dos frascos onde a luz e as trocas gasosas são limitadas, e existe grande disponibilidade de açúcar. Essa passagem faz com que mudem de heterotróficas para autotróficas, com grande gasto de energia.

b) Desidratação

A desidratação é causada pela elevada perda de água pelas plantas, principalmente nas folhas, ou por absorção inadequada de água pelas raízes. Em geral, é o maior problema no processo de transplante e aclimatização. In vitro, as plântulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada umidade relativa com consequente redução do fluxo respiratório. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de transpiração aumenta, surgindo um déficit hídrico na planta.

As plantas que são levadas às casas de vegetação são desprovidas de cutícula na folha e possuem muitos estômatos não funcionais. Quando expostas ao ambiente, ocorrem elevada perda de água e um agravamento osmótico intracelular.

c) Absorção de nutrientes

Plantas in vitro quase sempre produzem raízes não funcionais, ou seja, não apresentam capacidade de absorção de água e nutrientes quando colocadas em contato com o solo. As plântulas in vitro, ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde tem à disposição alta concentração de nutrientes para um substrato no qual são forçadas a iniciar o processo de absorção de sais para seu desenvolvimento. A emissão de novas raízes é muito importante, pois as formadas in vitro têm pouca capacidade de absorção e não respondem imediatamente ao momento do transplante, além de serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de microrganismos.

d) Doenças

Problemas de doenças podem facilmente aparecer nas culturas que são levadas às casas de vegetação, pois a falta de pressão de inóculo e a dependência do meio não estimularam as plantas a desenvolver o sistema de defesa contra microrganismos. A fragilidade da plântula in vitro aliada à alta umidade relativa, na qual é aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactérias. É essencial, portanto, que se faça uma prevenção de doenças para o sucesso do transplante, durante e após a aclimatização.

Vasconcelos et al. (2002) aclimatizaram as plantas em bandeja de inoculação com 40 células. As plantas foram aclimatizadas com um comprimento médio de 2,71 cm em areia lavada e de 2,89 cm no substrato Plant Mix, num total de 20 repetições. As plantas foram regadas 3 vezes por semana, utilizando 20 mL de solução nutritiva, composta pelo fertilizante solúvel Kristalon® (742,86 mg/L) e Barco Viking® (840 mg/L). A solução de irrigação continha a seguinte composição: 18% de N, 11% de P2O5, 38% de K2O, 4% de MgO, 11% de S, 19% de Ca e micronutrientes.

Trinta dias após a aclimatização, a altura média das plantas era 6,06 cm para areia lavada e 5,11 cm no substrato comercial. Nesse período não ocorreu morte de nenhuma planta, totalizando uma eficiência de 100% na aclimatação.

6. Considerações finais

A micropropagação convencional, pelo cultivo sequenciado de explantes em meio semissólido, promove uma taxa de multiplicação bem superior à propagação convencional da palma forrageira, entretanto técnicas precisam ser mais estudas de forma a aumentar essa taxa de multiplicação e eficiência no enraizamento.

Para cultura da palma forrageira, é clara a variabilidade existente entre genótipos em resposta ao cultivo in vitro.

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Capítulo 4
Fermentação semissólida no enriquecimento proteico de produtos para a alimentação animal a partir da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e da palma forrageira

José Nildo Tabosa
Fernando Gomes da Silva
José Teodorico de Araújo Filho
Edma Carvalho de Miranda

1. Introdução

A bioconversão de resíduos agrícolas apresenta importância fundamental e necessária para o desenvolvimento das cadeias produtivas no âmbito das agroindústrias. Nesse sentido, os resíduos oriundos de agroindústrias e que seriam destinados a aterros sanitários ou mesmo usados sem tratamento devido para ração animal poderão ser redirecionados para o uso da bioconversão (LAUFENBERG et al., 2003). Assim há a possibilidade desses materiais residuais representarem condições para a síntese de produtos utilizáveis na alimentação animal, dentre outras aplicações (PINTO et al., 2005). Todavia, a bioconversão não é só utilizada no aproveitamento de resíduos agroindustriais com vistas à alimentação animal e ao processamento de fertilizantes. Esse segmento pode ser de importante utilização no enriquecimento proteico de material vegetal deficiente em nitrogênio, fósforo e outros elementos, como é o caso de produtos usados na alimentação animal elaborados a partir da biomassa vegetal, por exemplo, a da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e da palma forrageira.

Nesse contexto, é relatada, no presente documento, parte das atividades que vem sendo desenvolvidas e recomendadas pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), visando à geração de produtos para a alimentação animal (sacharina da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e obtenção e enriquecimento de farelos a partir de resíduos vegetais das Centrais de Abastecimento – Ceasas). Além disso, é também relatada a tecnologia de obtenção e enriquecimento do farelo da palma forrageira, desenvolvida pela Diretoria de Pesquisa da Secretaria de Agricultura de Alagoas (Seagri), com o apoio da Universidade Federal de Alagoas (Ufal) e do IPA. Em todas as atividades foi utilizada a bioconversão a partir da fermentação em estado sólido.

A fermentação em estado sólido (FES) é importante no enriquecimento de farelos vegetais, notadamente pelo crescimento microbiano, favorecendo a síntese de diversos compostos que apresentam interesse econômico (PINTO et al., 2005). Atualmente, em muitos países, no âmbito da fermentação em estado sólido, desponta a técnica do enriquecimento proteico de resíduos agroindustriais, em que por meio de microrganismos há aumento do teor de proteína microbiana. Com isso há a possibilidade desses materiais serem utilizados na alimentação animal dentre outros usos (PANDEY, 2003; RAIMBAULT, 1998). Além do uso no aproveitamento de resíduos agroindustriais, essa tecnologia poderá também ser utilizada no enriquecimento proteico de farelos elaborados e desidratados a partir do colmo integral do sorgo sacarino, da cana-de-açúcar e do segmento articular da palma forrageira visando à elaboração da proteína microbiana (TABOSA et al., 2006).

De acordo com Raimbault (1998), esse tipo de fermentação refere-se à fermentação em estado sólido, fermentação semissólida ou mesmo fermentação em meio sólido, e aplica-se ao processo de crescimento microbiano sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. Por sua vez, a fração aquosa presente no sistema encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada superficial sobre as partículas. As principais características da fermentação em estado sólido são as seguintes, de acordo com Pinto et al. (2005): a) a fase sólida atua como fonte de carbono e nitrogênio e funciona como suporte para o crescimento de células microbianas; b) o crescimento dos microrganismos ocorre em condições mais próximas às dos habitats naturais; c) o meio representa elevada heterogeneidade, e os substratos não estão prontamente acessíveis aos microrganismos. Assim, diferentes tipos de microrganismos como bactérias, leveduras e fungos filamentosos podem crescer em substratos sólidos (AIDOO et al., 1982). Além disso, de acordo com Gervais e Molin (2003), de todos os parâmetros que influenciaram o processo fermentativo, a água apresenta papel de destaque na fermentação em estado sólido, em face do seu elevado grau de interação com as substâncias.

No caso da elaboração da sacharina da cana-de-açúcar, a fermentação em estado sólido é empregada no produto integral a partir de colmos picados sem a presença de pontas e palhas. A partir daí, é adicionada uma mistura mineral à biomassa vegetal com vistas à ocorrência de um processo fermentativo. Elias et al. (1990), no Instituto de Ciência Animal (ICA) em Cuba, relataram que a produção desse produto denominado de sacharina baseia-se na disponibilidade dos carboidratos solúveis e do conteúdo celular. Além disso, nesse processo, os açúcares da cana-de-açúcar e o nitrogênio que foram adicionados a partir da mistura mineral são utilizados para o crescimento da microbiota epifítica da cana-de-açúcar, o que por sua vez resultará no aumento da proteína microbiana (proteína verdadeira), presente no produto final. Nesse caso, o produto resultante apresenta menores teores de carboidratos solúveis e maiores teores de proteína bruta e nitrogênio precipitável em ácido tricloroacético, o qual corresponde ao nitrogênio presente na proteína verdadeira.

Ações de pesquisa foram desenvolvidas no IPA em 1989 (ENRIQUECIMENTO..., 1992) na elaboração da sacharina a partir da cana-de-açúcar e também a partir de colmos integrais de sorgo sacarino. Essa tecnologia foi adaptada do processo de fermentação em estado sólido da cana-de-açúcar desenvolvido por pesquisadores do ICA e descrito por Elias (1990). Nessa pesquisa, a sacharina obtida a partir da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino apresentou teores de 6% de proteína microbiana e de 12% de proteína bruta. Vale frisar que a biomassa original apresentava, antes do processo fermentativo, teores de 3% e 2% de proteína bruta, para o sorgo sacarino e para a cana-de-açúcar, respectivamente. A mistura mineral utilizada e adicionada à biomassa vegetal em ambos os casos (cana-de-açúcar e sorgo sacarino) funcionou basicamente como combustível utilizado pela flora microbiana na elevação da proteína, no transcurso do processo fermentativo (ALMEIDA, 1997; ENRIQUECIMENTO..., 1992; VIVAS; CARVAJAL, 2004).

Segundo Ricardo e Sanches (2007), tanto a cana-de-açúcar como os seus resíduos agroindustriais podem ser utilizados para a produção de alimento animal enriquecido pela fermentação em estado sólido – a sacharina. Assim, de acordo com o procedimento empregado para a fermentação e a forma de desidratar o produto final podem-se obter três tipos de sacharina: industrial (condições controladas de fermentação e de secagem), semi-industrial (condições controladas de fermentação, porém com secagem ao sol) e rústica (todo processo de fermentação e de secagem ocorrem em uma plataforma cimentada) (STUART, 2002). Por sua vez, o processo de obtenção da sacharina da cana-de-açúcar é relativamente simples, porém com resultados muito variáveis quanto à eficácia de conversão dos açúcares da matéria-prima em proteína de origem unicelular. Esse fato se deve fundamentalmente em utilizar como inóculo a flora epifítica da cana-de-açúcar. Além disso, considerando outras variantes do processo, podem-se ainda incluir níveis de farelo de milho no processo fermentativo da sacharina, buscando assim melhores resultados da alimentação de monogástricos (ELIAS; LEZCANO, 1994). Também a partir da cana-de-açúcar integral triturada pode-se utilizar uma cepa de Aspergillus Níger + sulfato de amônio + fosfato monobásico de amônio, objetivando o enriquecimento microbiano do produto final (ROURA et al., 1992).

A tecnologia para produção do farelo enriquecido da palma forrageira como alimento animal foi adaptada a partir da sacharina da cana-de-açúcar, tecnologia definida e recomendada. Desenvolvida inicialmente pelo ICA, foi introduzida em 1989, sendo adaptada pelo IPA, visando atender as condições locais juntamente com a tecnologia de desenvolvimento da sacharina do sorgo sacarino, que foi concebida pelo IPA. O farelo enriquecido da palma forrageira é fruto de uma tecnologia que vem sendo desenvolvida pela Secretaria Executiva de Agricultura de Alagoas (Seagri), em parceria com o Governo do Estado, Banco do Nordeste do Brasil (BNB), e com o apoio das cooperativas de laticínios locais. Tabosa et al. (2006) evidenciaram a importância do farelo enriquecido da palma forrageira obtido a partir do processo fermentativo em estado sólido. Na confecção do produto foi adicionada uma mistura mineral (ureia, micronutrientes, sulfato de magnésio, cloreto de sódio e MAP – fosfato monobásico) para cada tonelada de biomassa da palma forrageira. Após 24 horas de fermentação, os principais resultados experimentais atingiram os seguintes valores levando em consideração o farelo da palma in natura em comparação com o farelo enriquecido: a) os valores de proteína microbiana passaram de 1,5% para 20%; b) o teor de fósforo foi praticamente triplicado, passando de 0,08% para 0,26%.

2. A importância da cana-de-açúcar (matéria-prima na confecção da sacharina)

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, atingindo cerca de 528 milhões de toneladas em uma área de plantio de 6,6 milhões de hectares. A produtividade média é de 80 t/ha. Dessa produção, 89% destina-se à indústria sucroalcooleira (CONAB, 2007). As principais regiões produtoras são a Centro-Sul com 82% da produção nacional e a região Norte-Nordeste com 18%. O Estado de São Paulo detém 60% da produção nacional com produtividade de 89 t/ha, Minas Gerais com cerca de 8% e produtividade de 83 t/ha, Alagoas com 5,2% e produtividade de 63 t/ha e Pernambuco com 3,5% e produtividade média de 52,5 t/ha (ANUÁRIO..., 2007; CONAB, 2007).

2.1. Valor nutricional da cana-de-açúcar

Esta característica está correlacionada diretamente com o seu elevado teor de açúcar, que fica em torno de 40% a 50% na matéria seca. Por outro lado, o teor de proteína bruta é baixíssimo, ficando em torno de 1% a 3%. Desse modo, configura-se como um alimento animal nutricionalmente desbalanceado. Quando oferecido como único componente da dieta, o consumo é baixo, não sendo capaz de atender nem mesmo as necessidades de mantença dos animais. Assim, para suprir essa deficiência e possibilitar ganho de peso nos animais, é necessário ser suplementado. Nesse âmbito, de acordo com Thiago e Vieira (2002), a opção mais simples é usar o nitrogênio não proteico (ureia + sulfato de amônio). Desse modo, há necessidade de enriquecimento desse alimento, visando sobretudo aos aspectos econômicos, sem que haja necessidade de complementação com concentrados comerciais.

2.2. Sacharina da cana-de-açúcar

Produto inicialmente desenvolvido em Cuba, no ICA, conforme metodologia de Elias et al. (1990). Consiste na transformação da cana-de-açúcar picada em um farelo enriquecido pelo processo de fermentação em estado sólido. Nesse contexto, há antes do processo fermentativo a adição ao material picado de uma mistura mineral (ureia + micronutrientes + cloreto de sódio + fonte de fósforo), na proporção de 22 kg desta mistura para cada tonelada de biomassa da cana-de-açúcar.

2.2.1. Dinâmica da fermentação – sacharina da cana-de-açúcar

Segundo Elias et al. (1990), deve-se considerar no processo fermentativo (fermentação em estado sólido) a composição da cana-de-açúcar, que, por sua vez, apresenta elevados teores de carboidratos solúveis e conteúdo celular. Esses componentes estão provavelmente relacionados com a elevada digestibilidade de matéria orgânica. Além disso, face ao baixo teor de proteína bruta no produto final, há a possibilidade de uso de uma fonte de nitrogênio não proteico com o objetivo de adequação à síntese de proteína microbiana ou verdadeira. Outro fato observado, segundo Pereira (1995), é que, com o crescimento da proteína microbiana, há uma diminuição dos teores de carboidratos solúveis, indicando assim que estes foram utilizados para o crescimento dos microrganismos formadores da mencionada proteína. Outro ponto importante observado se prende ao tempo transcorrido entre o corte da cana-de-açúcar e o transporte, que pode provocar mudanças morfofisiológicas favorecendo o crescimento microbiano. Isso se dá por meio da velocidade de crescimento e pelo tamanho das células, de acordo com Elias et al. (1990). Nesse aspecto, Valiño et al. (1992), avaliando a dinâmica de crescimento da microbiota da cana-de-açúcar na produção da sacharina, verificaram que a contagem máxima de leveduras e bactérias viáveis era ocorrida 24 horas após a colheita. Todavia, vale frisar que há evidências de uma grande variabilidade na composição das sacharinas produzidas em diversas regiões do Brasil. Esse fato é em razão, de acordo com Resende e Inácio Neto (2001), dos diferentes tipos varietais de cana-de-açúcar utilizadas, idade de corte, teor de carboidratos presentes, características edáficas do substrato, umidade relativa do ar, amplitude térmica das regiões produtoras, etc. Com relação às espécies de bactérias identificadas na sacharina, as ureolíticas como Acinetobacter cacoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris exercem papel fundamental na hidrólise da ureia e amônia. Esse fato é importante para a síntese celular de algumas espécies (ELIAS et al., 1990). Dentre as leveduras, foram identificadas a Candida maltosa e C. guillesmonddi como mais eficientes durante o processo fermentativo. Além disso, de acordo com Vivas e Carvajal (2004), os microrganismos que se desenvolveram a partir da microflora epifítica presente na biomassa da cana-de-açúcar utilizam os açúcares presentes onde o crescimento dessa é favorecido pela adição de ureia e sais minerais. Esse processo se realiza mediante a fermentação em estado sólido. Ainda segundo esses autores, tendo em vista as condições de elevação da proteína microbiana no processo fermentativo, fica evidenciada uma alternativa de resolução da relação proteína-energia, que está presente na cana-de-açúcar. Os principais grupos de leveduras que participam do processo (ELIAS et al., 1990) são: Candida pentolopessi, Sacharomyces cervisiae, Candida tropicalis, Candida intermédia, Candida crusei, etc. É atribuído a Candida crusei a atividade ureológica, que não utiliza sacarose e depende para o suporte energético, desdobrando a ureia para fornecer amoníaco na síntese proteica. Com respeito às bactérias, uma parte é autóctone e o restante é adquirido durante a manipulação.

2.2.2. Resultados obtidos da sacharina da cana-de-açúcar – antecedentes

A formulação original empregada no processo produtivo da sacharina, conforme orientação de Elias et al. (1990), consiste em 15 kg de ureia, 5 kg de uma mistura mineral com macro e micronutrientes, e mais 2 kg de sulfato de amônio. Essa mistura é adicionada à biomassa da cana-de-açúcar picada. A cana com a mistura mineral é distribuída em um piso de revestido (camadas de 5 cm a 10 cm), coberto, mas bem ventilado (à sombra). Deve-se manter a cana mais a mistura em uma camada espessa, entre 20 cm e 25 cm, com o objetivo de assegurar adequação de umidade necessária à fermentação. Esse processo deve durar de 24 a 48 horas. Após esse processo fermentativo, o produto já pode ser fornecido aos animais ou ser submetido a uma secagem (10% a 15% de umidade) e estocá-lo para uso posterior, por períodos de até 6 meses (THIAGO; VIEIRA, 2002). Com essa formulação, os principais resultados obtidos de proteína bruta e verdadeira (microbiana) e a porcentagem de matéria seca são apresentados na Tabela 1. Além desses resultados obtidos no ICA em Cuba, por Elias et al. (1990), constam também na Tabela 1 resultados de diferentes autores, obtidos em diferentes regiões do Brasil conforme Resende e Inácio Neto (2001).

Tabela 1. Valores obtidos de proteína bruta (PB), microbiana (PV) e porcentagem de matéria seca.

Parâmetro

Resultado obtido
em Cuba(1)

Resultado médio obtido
no Brasil(2)

Matéria seca (%)

87 a 89

87

PB (%)

11 a 16

14,2

PV (%)

8,9 a 13,9

3,5

(PV/PB).100(%)

80,9 a 86,9

24,6

(1) Elias (1990).

(2) Almeida (1997), Carvalho (1995), Inácio Neto (1999), Oliveira (1998), Pereira (1995) e Reis (1996).

2.2.3. Resultados obtidos em Pernambuco – sacharina da cana-de-açúcar

A primeira experiência realizada em Pernambuco com relação à obtenção da sacharina foi em 1989. Nessa ocasião, foram utilizados como matéria-prima para o produto final enriquecido colmos da variedade de cana-de-açúcar CB-15-3 e também da variedade de sorgo sacarino IPA 467-4-2 (ENRIQUECIMENTO..., 1992). Visando atender o processo fermentativo, a mistura mineral foi modificada a partir da formulação original de conformidade com Elias et al. (1990). Além disso, a mencionada mistura mineral foi adaptada para atender também a produção da sacharina a partir do sorgo sacarino, que foi uma iniciativa tecnológica do IPA. Para cada tonelada de colmos, foi adicionada a mistura mineral (Tabela 2), 48 horas após a colheita.

Tabela 2. Mistura mineral utilizada na sacharina do sorgo sacarino e da cana-de-açúcar (1991).

Ingrediente

Kg/t de colmo

(%)

Ureia(1)

15

1,5

Sulfato de magnésio(2)

2

0,2

Cloreto de sódio(3)

2

0,2

Fonte de fósforo + microelementos(4)

3

0,3

(1) Ureia pecuária ou fertilizante.

(2) Fertilizante.

(3) Sal de cozinha, fino.

(4) Produto comercial (suplemento mineral com 130 g de P2O5/kg + macro e micronutrientes).

Fonte: Tabosa (2009).

A biomassa vegetal do sorgo sacarino e da cana-de-açúcar, caracterizada antes do processo de fermentação, apresentou 31% de matéria seca (pré-secagem), proteína bruta de 2,5% a 3,0%, e o brix do caldo em torno de 18% a 20%. Após o processo de fermentação, ficou sinalizado que a fermentação desejável ocorreu, promovendo incremento na proteína microbiana (Tabela 3).

Tabela 3. Valores de proteína bruta (PB) e proteína microbiana (PV) após fermentação.

Material

Proteína bruta(3)

(%)

Proteína microbiana(3)

(%)

PV/PB

(%)

Sorgo sacarino(1)

11,6 ± 1,17

5,1 ± 0,73

44

Cana-de-açúcar(2)

11,9 ± 1,17

5,8 ± 0,73

49

(1) Var. IPA 467-4-2.

(2) CB 45-3.

(3) Não significativo (P < 0,05), pelo teste t.

Fonte: Enriquecimento... (1992).

A relação proteína microbiana-proteína bruta, com valores entre 44% e 49%, para o sorgo sacarino e a cana-de-açúcar respectivamente, não está de acordo com os resultados obtidos por Elias et al. (1990).

2.2.4. Sacharina (rústica) da cana-de-açúcar em Pernambuco – formulação modificada

O principal objetivo que se busca em fermentar a cana-de-açúcar é a obtenção de um produto que seja contemplado com elevados níveis e qualidade de proteína. É importante frisar que, nesse processo, a formulação da proteína microbiana se dá mediante os microrganismos que se desenvolvem a partir da microflora epifítica, presente na biomassa da cana-de-açúcar. Por conseguinte, essa microflora é alimentada dos açúcares presentes, além de necessitar de pequenas quantidades de uma mistura mineral, contendo basicamente ureia e fósforo. Todo esse processo tecnológico é fundamentado e sustentado na literatura científica em várias regiões do mundo (BACKES et al., 2007; ELIAS et al., 1990; INÁCIO NETO, 2003; RESENDE; INÁCIO NETO, 2001; RICARDO; SANCHES, 2007; THIAGO; VIEIRA, 2002; VIVAS; CARVAJAL, 2004; ZANETTI et al., 1993).

No sentido de atualizar e tornar mais eficiente a tecnologia de produção da sacharina da cana-de-açúcar, foi realizada pelo IPA uma avaliação de 15 diferentes formulações a partir da formulação mineral original. Consta, na Tabela 4, a nova formulação selecionada em comparação à original, em que ocorreram modificações de ordem qualitativa e quantitativa. O critério de seleção dessa nova formulação foi promover reflexos na elevação da proteína microbiana de forma e intensidade de maior magnitude quando comparada às demais formulações. (TABOSA, 2009).

Tabela 4. Mistura mineral utilizada na elaboração da sacharina da cana-de-açúcar.

Componente

Formulação (kg/t biomassa)

Original

Modificada

Ureia(1)

15

8

Suplemento mineral

3

8

Sulfato de magnésio(2)

2

2

Cloreto de sódio

2

2

MAP(3)

-

7

Suplemento mineral – Suprafós 130 ou Guyo sal 900 ou Fosbovi 30.

(1) Pecuária ou fertilizante.

(2) Fertilizante.

(3) Fosfato monoamônico fertilizante.

Fonte: Tabosa (2009).

Novos resultados foram obtidos com essa nova formulação, em que foi adicionado o MAP, na proporção de 7 kg/t de biomassa e reduzida a ureia de 15 para 8 kg/t de biomassa, mostrando o total da mistura inalterado, em 22 kg/t de biomassa. Vale frisar que na composição do MAP há 48% de P2O5 e 11% de nitrogênio. Por sua vez o MAP possivelmente forneceu maior quantitativo de fósforo, o que favoreceu um maior desenvolvimento dos microrganismos e da proteína microbiana. Os resultados obtidos com essa formulação são mostrados na Tabela 5, para proteína bruta e microbiana.

Tabela 5. Teores de proteína bruta (PB), proteína verdadeira (PV) e PV/PB, em diferentes amostras de sacharina de cana sob formulação modificada.

Amostra(1)

Matéria seca

(%)

PB

(%)

PV

(%)

PV/PB

(%)

015-A1

91

16,9

8,8

52

016-A2

92

15,5

9,7

62

012-A3

95

16,8

6,7

39

001-A4

96

15,9

5,1

32

921-A5

91

19,4

7,5

39

Cana in natura

90

2,6

1,0

38

(1) Lotes de 0,5 t a 1,0 t de sacharina rústica, analisados no laboratório de Análise de Plantas e Rações – Lapra/IPA. Amostras de conformidade com as remessas nº 003/08, 004/08, 01/08 e 37/07 dos respectivos boletins de análise.

Fonte: Tabosa (2009).

Considerando que os resultados obtidos (Tabela 7) para proteína microbiana foram oriundos de lotes de magnitude comercial (0,5 t a 1,0 t), vale salientar que são adequados ao patamar esperado, de conformidade com Elias et al. (1990), bem como a relação proteína microbiana-proteína bruta, em que ocorreram percentuais acima de 50%. Ademais, Vivas e Carvajal (2004) relatam que a formulação equivalente a 15 kg de ureia + 5 kg de sais minerais + 2 kg de sulfato de cálcio ou sódio + 3 kg de Magnesita por tonelada de cana resultou em um teor de 13,0% de proteína bruta e de 82% de carboidratos solúveis. Com relação à sacharina produzida mediante inoculação conforme relatado por Pereira (1995), em comparação à confecção da sacharina tradicional, foi concluído que havia um aumento da proteína microbiana e também da proteína bruta quando foi adicionado o inóculo (levedura de panificação). Contudo, foi concluído que a sacharina tradicional (sem inoculação) parece ser a mais adequada pelo fato de ser mais facilmente obtida e apresentar menor custo.

3. Sacharina do sorgo sacarino – primeiros resultados obtidos envolvendo tamanho de partículas e tempo de fermentação

O sorgo sacarino (em muitas regiões utilizado como forrageiro) poderá apresentar adequação técnica para a confecção da sacharina. Esse fato poderá ser observado em face do seu alto potencial de produção de biomassa e principalmente por apresentar elevado teor de açúcares (brix de 15% a 20%). Os primeiros resultados de produção de sacharina do sorgo sacarino foram realizados em Pernambuco, no IPA, a partir da variedade IPA 467-4-2. É uma cultivar desenvolvida pelo IPA, recomendada para a região semiárida. Apresenta ciclo total de 130 dias do plantio à colheita, potencial de produção de biomassa da ordem de 40 t/ha a 60 t/ha (TABOSA et al., 1996, 2007).

Na Tabela 6, constam os resultados obtidos para sacharina do sorgo sacarino envolvendo tempo de fermentação em presença do tamanho de partículas.

Tabela 6. Avaliação do tamanho de partículas sob tempo de fermentação no processo de obtenção da sacharina de sorgo sacarino. Resultados de PB e de PV (%). IPA, Recife, 1998.

Tempo de fermentação (h)

Tamanho de partículas

4 cm

6 cm

8 cm

PB

PV

PB

PV

PB

PV

6

17,8a

1,2b

15,9b

1,6b

18,9a

1,6b

12

16,3a

2,1b

15,2b

3,5ab

16,4a

2,8b

18

17,1a

6,2a

18,3a

6,7a

18,4a

2,9b

24

17,9a

7,5a

20,6a

6,3a

20,3a

6,8a

PB – Proteína bruta; PV – proteína verdadeira ou microbiana/médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (P < 0,05).

Fonte: Araújo et al. (1996) e Tabosa et al. (2006).

Os resultados obtidos de proteína microbiana no processo de produção da sacharina sinalizam que o tamanho das partículas de 4 cm a 6 cm apresentaram-se mais favoráveis quando comparados com os resultados obtidos quando a partícula era de 8 cm, considerando o tempo de fermentação entre 18 e 24 horas. Além disso, a análise de regressão da proteína microbiana para tempo de fermentação revelou significância (P < 0,01) para efeito linear, em que a equação encontrada foi y = 0,5503 + 0,322509X, com r2 = 98,69%. Esses resultados de 15% a 20 % de PB provavelmente refletem os efeitos do nitrogênio adicionado via ureia. Elevados valores de PB não indicam necessariamente que ocorreu fermentação desejável, como aquela que eleva o teor de proteína microbiana. A mistura mineral utilizada na confecção da sacharina rústica a partir do sorgo sacarino foi a mesma utilizada para a elaboração da sacharina da cana-de-açúcar, conforme descrita na Tabela 2.

4. A importância da palma forrageira para a pecuária regional

A palma forrageira variedade gigante, redonda e clone 20 do IPA (Opuntia fícus-indica Mill) bem como a palma da variedade miúda ou doce, variedade Alagoas ou Sertânia (Nopalea cochenillifera Sal.Dick) poderão apresentar adequação técnica na confecção do farelo enriquecido, face o elevado potencial de produção de biomassa e, principalmente, por apresentar elevado teor de carboidratos solúveis. De acordo com Flores Valdez e Gallegos Vasquez (1993) e Santos et al. (2006), o teor de carboidratos das variedades gigante e redonda (Opuntia) e miúda ou doce (Nopalea) são 30% e 60%, respectivamente. Na região Nordeste do Brasil, há registro de cerca de mais de 600 mil hectares cultivados, predominantemente nos estados de Pernambuco, Alagoas e Paraíba (CHAGAS, 1992; SANTOS et al., 2006; SOARES et al., 2004; TABOSA et al., 2004). No caso particular do Estado de Alagoas, onde a cana-de-açúcar ocupa uma área de cerca de 400 mil hectares, a palma forrageira corresponde a segunda cultura, perdendo só para a cana-de-açúcar (ARAÚJO FILHO, 2008). Segundo relato de Arruda Filho e Arruda (2006), Bravo (1978) e Domingues (1963), essas espécies botânicas, que são nativas do México, foram introduzidas no Brasil ainda no período imperial, no início do século 19, objetivando assim a produção do corante natural (carmim) a partir da cochonilha de mesmo nome (Dactilopius cacti L.). Com relação à introdução da palma no Nordeste do Brasil, é importante evidenciar os seguintes registros:

a) No início do século passado, dois dos maiores empresários da indústria têxtil regional (Delmiro Goulveia e Hermann Lundgren) a importaram do México visando à produção do corante natural (carmim). O objetivo principal era o emprego do carmim no processo de tingimento industrial. A partir daí a palma foi identificada na região, possivelmente como alternativa forrageira, pelo fato de resistir à falta de água (SUASSUNA, 2004).

b) Há registros de que a palma forrageira foi disseminada no Nordeste brasileiro por ordem do governo, após a seca de 1932, passando assim a ser reconhecida como um dos principais recursos de subsistência da pecuária no Semiárido (DUQUE, 1973).

A palma pertence ao grupo de plantas cujo metabolismo é denominado de CAM – metabolismo ácido das crassuláceas –, cuja característica fundamental é a sua suculência. Essa se manifesta das seguintes formas: em nível de suas raquetes; em nível anatômico, pela dimensão elevada dos vacúolos completamente tomados por água. Outro aspecto da palma forrageira é a sua elevada eficiência em uso de água, que pode variar de 50 kg H2O por kg a 150 kg H2O por kg de matéria seca produzida (FARIAS et al., 1984). Nesse aspecto, o sorgo para produzir a mesma quantidade de matéria seca demandaria 250 kg H2O por kg de MS (TABOSA et al., 1986). Com relação ao seu valor nutricional, a palma apresenta 85% do valor do milho, considerado como de até 75% de Nutrientes Digestivos Totais (NDT) (FARIAS et al., 1984; TABOSA et al., 2004). O IPA vem desenvolvendo ações de pesquisa com essa cactácea desde 1958 em parceria com outros órgãos locais. Nesse ínterim foram avaliados diferentes aspectos da espécie, principalmente no âmbito do valor nutricional e na avaliação de consumo por ruminantes. Foram relatados níveis de produtividade de 300 t/ha a 400 t/ha, sendo a cultura devidamente atendida em todos os seus tratos culturais.

4.1. O farelo não enriquecido – um precedente para o enriquecimento proteico

Estudos envolvendo o farelo da palma forrageira sem a utilização da tecnologia da fermentação em estado sólido foram realizados em Pernambuco na Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). Pelos resultados alcançados, há uma sinalização do potencial de uso do farelo da palma que, na condição de enriquecimento protéico, poderá ser apresentado como de elevado valor nutricional para ruminantes e também para não ruminantes. Nesse contexto, Véras et al. (2002) avaliaram o farelo in natura da palma forrageira em substituição ao milho na proporção de até 75% por meio do consumo e da digestibilidade aparente em cordeiros. Os resultados evidenciaram que, com a inclusão do farelo in natura, o coeficiente de digestibilidade da matéria seca, matéria orgânica, fibra em detergente neutro, carboidratos totais, extrato etéreo e proteína bruta não foi influenciado. Todavia, para a fibra em detergente ácido foi verificado um aumento linear. Ainda Véras et al. (2005a), estudando outros níveis (0,33%, 67% e 100%) de substituição do milho pelo farelo de palma in natura no desempenho de ovinos em crescimento, relataram que os consumos de matéria seca, proteína bruta, matéria orgânica, carboidratos totais e o rendimento da carcaça não foram influenciados quando o milho foi substituído pelo farelo de palma. Além disso, em ovinos em crescimento, na avaliação do consumo e da digestibilidade, foi verificado que os coeficientes de digestibilidade aparente da matéria seca e matéria orgânica diminuíram linearmente enquanto os coeficientes da proteína bruta e FDN não foram influenciados. Não houve efeito da substituição do milho pelo farelo de palma in natura sobre os consumos de matéria seca e proteína bruta, porém o consumo de NDT diminuiu linearmente (VÉRAS et al., 2005b).

Com relação ao uso do farelo in natura da palma forrageira na formulação de rações para monogástricos, no caso da galinha caipira, Ludke et al. (2005) relatam que existe potencial para o uso do farelo da palma forrageira in natura na alimentação de galináceos em face dos coeficientes de metabolismo e dos valores de energia metabolizável calculados (973 kcal/kg a 997 kcal/kg).

Avaliando níveis de substituição da raspa de mandioca por farelo de palma forrageira in natura em ovinos, em que foi medido o consumo de nutrientes, Araújo et al. (2006) relataram que o farelo da palma forrageira substitui a raspa da mandioca possibilitando um maior consumo; todavia, os níveis nutricionais das dietas não foram significantes para atender as demandas totais de nutrientes. Em face do exposto, sobre o valor nutricional do farelo não enriquecido da palma forrageira e a sua respectiva utilização na alimentação animal, evidenciam-se os seguintes pontos: a) pode ser recomendado tanto para ruminantes como para não ruminantes; no entanto, pode ser considerado deficiente em alguns pontos, por exemplo, interferir na redução do NDT e da conversão alimentar; b) o valor obtido para energia metabolizável pode ser considerado baixo (970 kcal/kg – 1.100 kcal/kg) se comparado com os valores obtidos para sorgo ou milho.

Assim, procurando adequar o valor nutricional do referido farelo para um alimento rico, foi utilizada a tecnologia da fermentação em estado sólido no sentido de proceder o enriquecimento proteico, via proteína microbiana. Com isso, presume-se que o farelo enriquecido provavelmente irá suprir as deficiências alimentares detectadas quando da ingestão pelos animais do farelo in natura.

4.2. O farelo enriquecido da palma forrageira (FEP)

No âmbito da fermentação em estado sólido (FES), as atuais linhas de pesquisa em todo o mundo são voltadas para o enriquecimento proteico de resíduos agroindustriais (PANDEY, 2003; RAIMBAULT, 1998). Com isso, os microrganismos existentes no processo elevaram o teor proteico do produto, que por sua vez poderá ser utilizado como alimento animal. Trata-se, portanto, de uma tecnologia definida e que também poderá ser estendida a outros produtos in natura não residuais, como cana-de-açúcar, sorgo sacarino (ambos ricos em açúcares) e palma forrageira (rica em carboidratos). De acordo com Pinto et al. (2005), na fermentação em estado sólido a água presente na biomassa vegetal interage com dois parâmetros: a umidade, que corresponde ao percentual de água na massa total do meio, e a atividade de água (aw) que corresponde a um parâmetro termodinâmico interligado ao potencial químico da água, ou seja, à quantidade de moléculas de água disponíveis nas proximidades (adjacências) das partículas do substrato. No contexto da fermentação em estado sólido, a aw é mais importante do que a umidade, pois afeta diretamente o crescimento microbiano. Nesse contexto, de acordo com Pandey (2003), a biomassa homogênea, composta por hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas, atende como fonte de carbono e energia de suporte para o crescimento da microbiota que se encontra presente na própria biomassa.

No enriquecimento proteico da palma forrageira por meio da fermentação semissólida, a atividade da água (aw) se constitui em uma das variáveis que mais afetam o processo fermentativo. Nesse contexto, Araújo et al. (2005) realizaram trabalho com o objetivo de obter isotermas de dessorção da biomassa nas temperaturas usuais de fermentação (30 °C, 35 °C e 40 °C) correlacionando a aw e a umidade. Os resultados sinalizam que, para iniciar o processo de fermentação para o enriquecimento, a umidade da biomassa da palma deverá partir de 90%, e a aw acima de 0,9.

Utilizando a tecnologia de inoculação de microrganismos, na biomassa da palma forrageira, visando à elevação da proteína bruta, Araújo et al. (2005, 2008) relatam que, nas concentrações de 5%, 10% e 15% da levedura Saccharomyces cerevisiae, foram obtidos valores de 14,4%, 22% e 26%, respectivamente. Os autores não mencionam resultados de proteína microbiana. Outro resultado relatado por Lima et al. (2004) evidencia que o produto resultante da fermentação, com ou sem levedura, poderá ser usado na alimentação de ruminantes. Foram relatados valores de 26,52% de proteína bruta.

4.2.1. Mistura mineral utilizada no farelo enriquecido da palma forrageira (FEP)

No processo de bioconversão da palma forrageira, foi utilizada a fermentação em estado sólido. Nesse processo biotecnológico não foi utilizado inoculação de leveduras ou nenhum outro microrganismo. A fermentação foi completada a partir da flora epifítica existente na biomassa da palma forrageira. Para que o crescimento microbiano fosse realizado e completado no transcurso de um período de 24 horas, houve uma adição à biomassa de uma mistura mineral. Desse modo, nesse processo fermentativo, a ação de microrganismos em presença da mistura provoca, por sua vez, uma elevação e multiplicação da proteína microbiana. Os quantitativos dos componentes da mistura mineral para cada tonelada de biomassa da palma forrageira podem ser vistos na Tabela 7.

Tabela 7. Quantitativo da mistura mineral utilizada na biomassa da palma forrageira para obtenção do farelo enriquecido.

Componente da mistura

Kg/t de palma in natura

Ureia(1)

8,0

Suplemento mineral(2)

3,0

Sulfato de magnésio(3)

2,0

Cloreto de sódio

2,0

MAP (Fosfato monoamônico)(3)

8,0

(1) Fertilizante ou ureia pecuária.

(2) Suprafós 130 ou Guyio Sal 900 ou Fosbovi 30.

(3) Fertilizante.

Fonte: Tabosa (2009).

O processo metodológico de obtenção obedece aos seguintes passos: 1) selecionar os cladódios (raquetes), retirando os mais velhos e fibrosos; 2) triturar o material em máquina forrageira apropriada, de forma que o material fique bem uniforme; 3) espalhar o material triturado em piso de cimento, chão batido ou em lona, de modo que fique com uma camada de aproximadamente 10 cm de altura; 4) adicionar a este material a mistura mineral, revolvendo e tornando a espalhar o mesmo, formando novamente uma camada de 10 cm de altura; 5) repetir a operação de revolvimento a cada 6 horas; nessa fase, o material deverá permanecer à sombra e em ambiente arejado, por um período de 24 horas. Após esse período o material pode ser oferecido aos animais. No caso de armazenamento (15% de umidade), sua validade é de 6 meses a 1 ano.

4.2.2. Valor nutritivo e consumo voluntário do farelo enriquecido da palma forrageira

Foi realizada, em 2004, na Universidade Federal Rural de Pernambuco – Departamento de Zootecnia, sob a supervisão do Prof. Edvaldo Correia de Araújo, uma ação de pesquisa com animais, objetivando avaliar o valor nutritivo do farelo enriquecido da palma forrageira, por meio de um ensaio de digestibilidade in vivo e mensurar o seu consumo voluntário quando fornecido à vontade aos animais. Para obtenção do farelo enriquecido, utilizou-se a palma forrageira Miúda, predominante em Alagoas, oriunda do Município de Batalha. O processo utilizado foi o mesmo empregado na obtenção da sacharina da cana-de-açúcar. Foram utilizados quatro ovinos machos com peso médio inicial de 30 kg, em gaiolas metabólicas por um período de 28 dias. Os coeficientes de digestibilidade dos componentes químicos da palma enriquecida (MS – matéria seca, PB – proteína bruta, FDN – fibra em detergente neutro, FDA – fibra em detergente ácido, CND – carboidratos não estruturais, EE – extrato etéreo, MO – matéria orgânica, cinzas, e NDT – nutrientes digestivos totais) foram calculados. Os dados são apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. Coeficientes de digestibilidade dos componentes químicos e nutrientes digestivos totais (NDT) da palma enriquecida calculados com base na matéria seca (105 °C).

Componente químico (%)

MS

PB

FDN

FDA

CND

EE

MO

CINZAS

NDT

80,61

76,94

72,18

70,27

92,40

15,19

85,10

49,32

75,60

O consumo voluntário de matéria seca expresso em porcentagem do peso vivo foi de 2,0%. A energia metabolizável (EM Bovino) e o NDT calculados a partir do ensaio de digestibilidade foi de 2.721 kcal/kg e 75%, respectivamente. Vale frisar que, na palma forrageira in natura, os valores encontrados para NDT são de 63% (MELO et al., 2003; PESSOA et al., 2004). Os resultados preliminares obtidos pela pesquisa para a caracterização do produto (farelo da palma enriquecido) depois da fermentação são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9. Valores de proteína bruta e verdadeira ou microbiana no farelo enriquecido.

Produto

Matéria seca

(%)

Proteína bruta

(%)

Proteína verdadeira

(%)

FEP 1 Batalha – AL

90

18–26

8,0–19,0

FEP 4 SBU – PE

88

15–26

7,0–12

Palma in natura

90

2,9–5,2

1,4–2,0

FEP 1 e 4 – após processo fermentativo. Palma in natura – biomassa original e sem fermentação. Proteína verdadeira – originária do N microbiano.

4.2.3. Farelo enriquecido da palma forrageira – novos resultados obtidos

Novos resultados foram obtidos para proteína bruta, proteína microbiana, FDN (fibra em detergente neutro) e FDA (fibra em detergente ácido) no Laboratório de Enzimologia Aplicada e Bromatologia da Ufal conforme consta na Tabela 10.

Tabela 10. Resultados obtidos de proteína bruta, microbiana, FDN (fibra em detergente neutro) e FDA (fibra em detergente ácido).

Amostra

Matéria seca (%)

PB

(%)

PV

(%)

PV/PB

(%)

FDA

(%)

FDN

(%)

MI-C

94

4,1

2,5

60

13,3

63,1

MI-01

94

12,5

9,7

80

12,9

67,2

MI-02

94

21,0

16,7

79

14,6

35,1

SI-C

93

4,5

2,1

56

6,3

61,1

SI-01

92

18,9

10,8

57

19,6

56,4

SI-02

93

17,9

10,6

62

18,3

62,9

MI-C – amostra do farelo de palma forrageira in natura oriunda da localidade de Major Izidoro, AL. SI-C – amostra do farelo in natura oriunda da localidade de Santana do Ipanema, AL. MI-01 e MI-02 – amostras do farelo de palma enriquecido oriundas do Município de Major Izidoro, AL. SI-01 e SI-02 – amostras de farelo de palma enriquecido oriundas do Município de Santana do Ipanema, AL.

5. Uso da bioconversão no enriquecimento de resíduos vegetais por fermentação em estado sólido – uma experiência em Pernambuco com frutas e hortaliças

Um dos maiores problemas dos grandes centros urbanos é a geração de resíduos e de subprodutos sem destinação. Face aos princípios da preservação ambiental, torna-se necessário e imperioso equilibrar a produção de bens, principalmente de alimentos, no âmbito do maior desempenho da economia de mercado, levando em consideração os aspectos de equilíbrio social e de sustentabilidade ambiental (PINTO et al., 2005). Backes et al. (2007) relatam que existem, no Brasil, cerca de 44 milhões e, no mundo, 1 bilhão de seres humanos que não têm acesso ao direito básico de comer, enquanto que em certos lugares como no Centro de Abastecimento Alimentar de Pernambuco (Ceasa – PE), em feiras e mercados são desperdiçadas dezenas de toneladas de alimento diariamente, sendo que essa quantidade seria suficiente para alimentar milhares de famílias. Vale ressaltar que grande parte desses resíduos possui elevado potencial de reaproveitamento, e, portanto, torna-se interessante a busca de outros destinos que não o do aterro sanitário. Para isso existem várias alternativas que podem ser adotadas no sentido de melhorar a utilização desses resíduos, tais como: a) uso de partes nobres como frutas, legumes e hortaliças em bom estado de conservação para alimentação humana; b) partes menos nobres podem ser utilizadas na alimentação animal. Trabalhos desenvolvidos por Andrade (2000) e Klafke (2002) relatam sobre o assunto.

5.1. A tecnologia utilizada

A proposta se fundamenta na experiência realizada pelo IPA, cujo resultado foi a obtenção da sacharina da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino. Essa mesma tecnologia pode ser utilizada para o aproveitamento de resíduos vegetais (frutas hortaliças e tuberosas) da Ceasa. O produto final consistiu no enriquecimento proteico pela fermentação aeróbica de produtos sólidos. Com isso, foi obtido um produto enriquecido proteicamente e com possibilidades de utilização na alimentação animal, como é o caso da sacharina da cana-de-açúcar.

O princípio do enriquecimento proteico fundamenta-se na ação microbiana, em condições aeróbicas, em meio seco, com elevado teor de umidade, com disponibilidade de minerais essenciais (incorporados) da digestão de carboidratos (açúcares e celulose) pelos microrganismos presentes, naturalmente, na massa de tecidos vegetais disponíveis. Os carboidratos agem como combustível, e os minerais como catalisadores. Em pouco tempo toda a massa vegetal primitiva resulta numa massa disforme, de odor agradável, composta de microrganismos mortos. O produto resultante tem predominância de proteína no lugar dos carboidratos.

5.2. Resíduos vegetais na Ceasa – Recife (a matéria-prima)

Fundamentado na tecnologia descrita acima, procurou-se adaptá-la experimentalmente ao aproveitamento de resíduos vegetais da Ceasa, que recolhe mensalmente entre 600 e 700 toneladas de resíduos de frutas, hortaliças folhosas, raízes, tubérculos e outras. Basicamente, tudo isso é levado aos lixões, onde ocorrem problemas diversos. Desse quantitativo, ressalta-se que aproximadamente 80% (entre 480 e 560 toneladas) são de origem orgânica.

5.3. Avaliação preliminar no processamento dos resíduos

Em trabalho prévio realizado pelo IPA, já foi possível classificar os resíduos em quatro grandes grupos, conforme descritos a seguir: Grupo 1 – frutas; Grupo 2 – tubérculos e raízes; Grupo 3 – hortaliças folhosas; Grupo 4 – hortaliças não folhosas. Foi utilizada, na biomassa de resíduos, a mesma mistura mineral recomendada na obtenção do farelo enriquecido da palma (22 kg da mistura/t de resíduos). Os resultados preliminares de proteína microbiana e bruta são apresentados na Tabela 11.

Tabela 11. Resultados obtidos via fermentação em estado sólido – resíduos vegetais da Ceasa.

Nº da amostra

Material utilizado

Teor de proteína (%)

Microbiana

Bruta

929

Cenoura

6,5

31,7

930

Batata doce

4,1

13,8

931

Batata inglesa

7,4

23,5

932

Beterraba

9,6

33,6

933

Jerimum

21,3

34,3

934

Chuchu

17,5

41,3

022

Maracujá

8,5

23,6

024

Repolho

17,0

24,9

Da Tabela 11, evidenciam-se os seguintes aspectos: a) o valor muito elevado de proteína bruta, sem uma correspondente elevação da proteína microbiana, indica que não ocorreu fermentação adequada, fato não verificado nessa ação; b) mesmo um valor de 4,18% de proteína verdadeira para batata doce é considerado um resultado elevado, haja vista os valores encontrados na literatura no material in natura; c) os produtos que se mostraram bem desidratados, bem apresentáveis e com cheiro agradável foram: batata doce, batata inglesa, maracujá e beterraba que secaram totalmente com 72 horas, ao sol; d) o jerimum, repolho e chuchu apresentaram-se com elevados resultados de PB e PV; e) no geral, os resultados obtidos nessa primeira instância foram considerados promissores, indicando viabilidade do processo em escala. Além desses resultados, há relato de que o melhor método de processamento de resíduo sólido orgânico é a trituração e posterior secagem ao sol (BACKES et al., 2007). Ademais, Lousada Júnior et al. (2006) relatam que os teores de carboidratos não fibrosos (CNF), de 13% na goiaba e de 23% no maracujá, mostraram que esses resíduos podem ser utilizados como fontes de CNF.

6. Considerações finais

A bioconversão via fermentação em estado sólido pode ser utilizada na confecção do farelo enriquecido de açúcares ou carboidratos, como é o caso da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e da palma forrageira, visando à obtenção de um produto para a alimentação animal. Nesse processo, há um desenvolvimento da flora epifítica mediante a adição de uma mistura mineral, favorecendo o crescimento da proteína microbiana. Na Figura 1, consta a identificação da matéria-prima utilizada no mencionado processo.

O produto final obtido da sacharina da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino e do farelo enriquecido da palma forrageira podem apresentar valores médios de proteína microbiana da ordem de 8% a 20%. Outro aumento significativo é do teor de fósforo, de até 0,26%. Esse produto pode ser utilizado pelos animais logo após o processo ou ser armazenado por um período de seis meses a um ano. Na Figura 2, consta um registro do produto obtido, a partir da cana-de-açúcar e da palma forrageira.

Figura 1. Materiais vegetais avaliados na obtenção do farelo enriquecido via fermentação em estado sólido. (1) cana-de-açúcar variedade industrial; (2) palma forrageira Nopalea variedade Alagoas ou IPA Sertânia; (3) sorgo sacarino variedade IPA 2502.
Fotos: José Nildo Tabosa

Figura 2. Processamento do farelo enriquecido. (1) Cana-de-açúcar e sorgo sacarino na fase de secagem a céu aberto; (2) Farelo enriquecido da palma forrageira antes da secagem; (3) farelo enriquecido da palma forrageira após secagem.
Fotos: José Nildo Tabosa

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Capítulo 5
Metodologia analítica para produtos naturais

Arminda Saconi Messias
Ed Paschoal Carrazzoni

1. Introdução

A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de espécies distintas de plantas, animais e microrganismos. O Brasil dispõe da maior diversidade vegetal do mundo, cerca de 550 mil espécies, com apenas 10% catalogadas. As florestas tropicais da América do Sul, África e Ásia totalizam a megadiversidade global, mas são as florestas tropicais do Equador, da Colômbia e do Peru que guardam a maior riqueza do planeta, cerca de 300 espécies diferentes por hectare, apenas 2% da superfície da Terra. O interesse econômico de uma planta encontra suporte das indústrias químicas e farmacêuticas, que empregam matérias-primas vegetais na formulação de seus produtos; por isso, há demandas por novas tecnologias para assegurar suas necessidades, levando-se em consideração a importância do uso responsável e sustentável dos recursos naturais. O uso de componentes das plantas na área farmacêutica tem gradualmente aumentado no Brasil. As substâncias naturais, produzidas pelas espécies vegetais, têm atraído pesquisadores de diversas áreas. Nos países em desenvolvimento, cerca de dois terços da população utilizam-se de plantas como fonte de fármacos sem nenhum embasamento científico, prática essa que pode dar origem a intoxicações agudas ou crônicas (HARVEY, 2000).

No Brasil isso também é uma realidade, acrescida de um agravante, em virtude de se ter, em abundância, espécies vegetais desconhecidas tanto química quanto taxonomicamente. Portanto, estudos que possibilitem traçar o perfil químico, toxicológico e farmacológico dessa riqueza biológica são cada vez mais necessários (BALANDRIN et al., 1985). Óleos essenciais de plantas geralmente são agentes que apresentam atividade antimicrobiana contra um grande número de microrganismos, incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos (SOARES; CURY, 2001). A composição química de óleos essenciais depende do clima, da estação do ano, condições geográficas, período de colheita e a técnica de destilação (SIMÕES et al., 2004). Eles podem apresentar ação tanto contra bactérias Gram positivas quanto Gram negativas e ainda leveduras e fungos filamentosos.

O Brasil é muito rico em dados etnobotânicos, o que facilita a busca de novos ativos de origem vegetal, os quais compreendem amplo espectro de atividades biológicas. Assim, o caminho para o uso racional de produtos naturais de origem vegetal necessariamente passa pelos laboratórios, pois só diante de uma avaliação fitoquímica e de modelos experimentais é possível uma avaliação do potencial farmacológico e/ou fitocosmetológico. Isso viabiliza apontar o grau de segurança e eficácia, uma vez que a diversidade de substâncias químicas contidas em uma mesma planta nos alerta para questão do risco x benefício. Ou seja, até que ponto o fitocomplexo (micromoléculas biologicamente ativas) apresenta efeitos desejáveis, pois as reações colaterais, desencadeadas por intolerância e toxicidades, também estão presentes em produtos naturais, seja por meio de um fitoterápico ou fitocosmético (LIMA, 2008).

2. Procedimento experimental

Existem dezenas de roteiros utilizados para a separação dos constituintes de uma mistura em que se desconhece a natureza das substâncias. O importante a ser observado é que a separação seja feita de maneira sistematizada.

Quando há necessidade de extrair os constituintes de uma mistura, é importante que se consiga, pelo menos, separar as diversas substâncias agrupando-as em uma mesma função orgânica; e é baseado nesse princípio que se utiliza a marcha química. O material previamente seco e moído é extraído, normalmente, com três tipos de solventes: extração com benzeno, clorofórmio e etanol, trabalhando-se, portanto, com três extratos, independentemente.

A palavra extrato está sendo utilizada para indicar o produto de uma extração com um determinado solvente e cujo solvente foi evaporado, trata-se, portanto, de um resíduo (geralmente pastoso) que não mais contém o solvente que foi utilizado para a extração. Quando se faz referência, por exemplo, a um extrato benzênico, tratase de um material que foi extraído com benzeno, mas que não contém benzeno. Quando se trabalha com misturas que não são solúveis em solventes orgânicos não se deve utilizar o termo extrato, e sim, solução.

A metodologia a seguir descrita pode ser aplicada a qualquer tipo de extrato.

2.1. Tratamento com solução de ácido clorídrico – HCl a 3%

O extrato benzênico, alcoólico ou um outro extrato qualquer, é tratado, em funil de decantação, com uma solução de ácido clorídrico a 3%.

Como o tratamento com HCl é aquoso, a solução dessa mistura deve, obrigatoriamente, ser tratada com um solvente imiscível em água, a fim de que se possa separar as duas fases em funil de decantação.

Neutraliza-se a fase aquosa com hidróxido de amônio (ou uma outra base), a fim de liberar a base livre, extraindo-se esta, a seguir, com um solvente imiscível em água (clorofórmio, por exemplo).

Método 2.1

Colocar o extrato em funil de decantação. Adicionar cerca de 10% do volume do extrato e uma solução de ácido clorídrico a 3%. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de hidróxido de sódio a 3% (ou hidróxido de amônio), sempre agitando, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.

Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução clorofórmica até secura, sempre observando se ocorre uma cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar, continuar a evaporação, a fim de se obter um resíduo contendo as bases.

2.2. Tratamento com bicarbonato de sódio – NaHCO3

O bicarbonato de sódio, que é uma base fraca, solubiliza os ácidos carboxílicos fortes e fenóis fortes.

De idêntica maneira como se procedeu na extração anterior, é necessário neutralizar o meio a fim de liberar os ácidos carboxílicos e fenóis de seus sais. Nesse caso, a neutralização se fará com ácido clorídrico diluído. O restante do esquema de tratamento é idêntico àquele da extração das bases.

Método 2.2

Colocar o extrato do método 2.1 em funil de decantação. Adicionar cerca de 10% do volume do extrato e 20,0 mL de uma solução concentrada de bicarbonato de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor. Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar, continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma mistura de ácidos fortes e fenóis fortes.

2.3. Tratamento com carbonato de sódio – Na2CO3

Como já foram extraídos os ácidos carboxílicos e fenóis fortes, nesta etapa serão extraídos os compostos da mesma função, mas de acidez média.

Método 2.3

Colocar o extrato do método 2.2 em funil de decantação. Adicionar cerca de 10% do volume do extrato e 20,0 mL de uma solução concentrada de carbonato de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.

Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar, continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma mistura de ácidos carboxílicos e fenóis.

2.4. Tratamento com hidróxido de sódio – NaOH

Geralmente utilizam-se soluções aquosas entre 3% e 5%. Como já foram extraídos os ácidos fortes, ácidos carboxílicos de acidez média, fenóis fortes e médios, restam, para serem extraídos, os ácidos carboxílicos fracos e lactonas.

Método 2.4

Colocar o extrato do método 2.3 em funil de decantação. Adicionar cerca de 10% do volume do extrato e 10,0 mL de uma solução de hidróxido de sódio a 3%. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.

Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica. Na solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar, continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma mistura de ácidos carboxílicos fracos e lactonas.

2.5. Extração de compostos carbonílicos

As substâncias carbonílicas (aldeídicas e cetônicas) podem ser extraídas transformando-as em substâncias solúveis em água, ou transformando-as em substâncias que possam ser separadas por processos físicos.

No caso da marcha química dessa sequência, utiliza-se a reação de Bertagnini, isto é, tratamento com uma solução saturada de bissulfito de sódio.

Quando se adiciona a solução saturada de bissulfito de sódio ao extrato ou a uma solução, duas coisas podem ocorrer:

a) Quando existe uma boa quantidade do composto carbonílico, ocorre a precipitação do bissulfito do aldeído ou da cetona. Nesse caso, separa-se o precipitado por filtração, tratando-se, a seguir, o resíduo, com uma solução de ácido clorídrico diluído para liberar o composto carbonílico.

Nessa hipótese, duas novas alternativas podem ocorrer: o composto carbonílico precipita em virtude de sua insolubilidade em água, e, nesse caso, o composto é separado por filtração; ou o composto é solúvel em água, necessitando, pois, extrair com um solvente imiscível (clorofórmio) em funil de decantação. Evapora-se o solvente à secura, obtendo-se como resíduo o composto carbonílico puro ou uma mistura de compostos carbonílicos aldeídicos e cetônicos.

b) Quando existe uma pequena quantidade do composto carbonílico, ele fica dissolvido na solução aquosa, sendo necessário extrair com clorofórmio ou um outro solvente imiscível, em funil de decantação. Separadas as duas fases, evapora-se a fase orgânica (clorofórmica, se for o caso) à secura, obtendo-se como resíduo o(s) composto(s) carbonílico(s).

Método 2.5

Colocar o extrato do método 2.4 em funil de decantação. Adicionar cerca de 10% do volume do extrato e 10,0 mL de uma solução concentrada de bissulfito de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.

Nesta etapa, há 2 alternativas:

Alternativa 1 – Ocorrendo a formação de cristais, filtrar e desprezar o filtrado. Tratar o resíduo com uma solução de ácido clorídrico a 3% (o mínimo necessário para cobrir o resíduo), agitar e extrair com clorofórmio. Desprezar a solução aquosa. Evaporar a solução clorofórmica à secura, a fim de obter uma mistura de aldeídos e cetonas.

Alternativa 2 – Extrair com clorofórmio, obtendo-se duas camadas: camada aquosa (desprezar) e camada clorofórmica. Evaporar a solução clorofórmica à secura ou cristalizar, a fim de obter os aldeídos e cetonas.

São utilizados também os reagentes de Girard e Sandulesco. Embora sejam reagentes mais sensíveis e, portanto, com melhor capacidade de reação, são pouco utilizados em virtude de seu alto custo, quando comparados com o custo do bissulfito de sódio.

A grande vantagem do uso desses reativos é que formam hidrazonas a frio, solúveis em água acidulada, permitindo, portanto, retirar da fase orgânica todos os componentes carbonílicos.

Reagente T (trimetilamônioacetilhidrazida)

(CH3)3N+-CH2-CONHNH2

Dos compostos dessa série, o reagente T é o menos utilizado por ser o mais higroscópico.

Reagente de Girard P (piridilacetilhidrazida)

Reagente de Sandulesco (dimetilaminoacetilhidrazida)

(CH3)2N-CH2-CONHNH2

São compostos facilmente sintetizados.

Seus derivados são solúveis em água porque seus produtos são sais de amônio.

Além desses reagentes, é bastante utilizado o 2,4-dinitrofenilhidrazina por ser, dentre as hidrazinas, a mais reativa e de mais baixo custo. O seu emprego usual é na caracterização dos compostos carbonílicos e não como reagente para extração. Na verdade, é um dos reativos de maior valia para a extração de compostos carbonílicos de baixo peso molecular (líquido) porque seus derivados são sólidos e, portanto, de mais fácil manipulação.

2.6. Extração de álcoois

A extração pode ser feita seletivamente com o emprego do anidrido ftálico permitindo não somente a extração dos álcoois em geral, mas, dentre eles, separando os álcoois primários, secundários e terciários.

Originalmente a reação era utilizada para separar os álcoois (reação de Schotten-Bauer) e não para caracterização.

O processo consiste em adicionar o anidrido ftálico e a piridina, à temperatura ambiente, ou o anidrido ftálico e benzeno, e fazer o refluxo. O primeiro sistema é preferível porque a reação se processa a frio.

Os álcoois secundários reagem mais lentamente do que os álcoois primários, enquanto os álcoois terciários não reagem com o anidrido ftálico.

Se for conveniente, os álcoois terciários podem ser extraídos por reação com o anidrido tetracloroftálico.

Um método pouco usado é o da boratização: todos os álcoois formam boratos com o ácido bórico. Os produtos são pouco voláteis, razão pela qual o processo somente deve ser empregado quando o resto do extrato é volátil (por exemplo, óleos essenciais).

Método 2.6

1) Colocar o extrato do método 2.5 em funil de decantação. Podem ser utilizadas várias alternativas e, dentre elas:

Alternativa 1 – Adiciona-se uma mistura (1:1) de anidrido ftálico e piridina. Neste caso a reação se processa a frio, mas tem o inconveniente da piridina ser mais cara.

Alternativa 2 – Adiciona-se anidrido ftálico e benzeno. Refluxar de 3 a 5 horas. O tempo variará dependendo dos tipos de álcoois.

Nesta etapa há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica (extrato). Evaporar ou cristalizar a solução clorofórmica, obtendo-se um resíduo que deve ser tratado com uma solução de hidróxido de sódio a 3%, a quente. Esfriar, extrair com clorofórmio e evaporar à secura, obtendo-se os álcoois.

2.7. Extração de hidrocarbonetos

Os hidrocarbonetos aromáticos podem ser extraídos por complexação com ácido pícrico. Na realidade, não se forma ligação química entre o ácido pícrico e os hidrocarbonetos aromáticos. O núcleo pobre em elétrons do ácido pícrico superpõe-se ao composto aromático rico em elétrons. Os complexos de adição se separam simplesmente pela adição de solventes adequados.

Os hidrocarbonetos alifáticos podem ser separados por formação de produtos de inclusão com a ureia.

A análise pelos raios X mostra que a ureia possui um canal cilíndrico que é preenchido por hidrocarbonetos alifáticos normais. O complexo pode ser obtido por simples agitação do hidrocarboneto líquido com a ureia em pó, finamente dividida. O hidrocarboneto pode ser retirado dissolvendo-se o complexo em água, ou por um solvente que dissolva o hidrocarboneto deixando a ureia como resíduo.

A proporção molar da ureia no complexo aumenta com o comprimento da cadeia do hidrocarboneto. Assim, n-C7H16 combina com 6 moles de ureia; n-C10H22 com 8,3 moles; n-C16H34 com 12 moles e n-C28H58 com 21 moles.

A lacuna na ureia tem um diâmetro de 5,3 Å que é a medida justa para acomodar um ziguezague normal da molécula do hidrocarboneto alifático, mas não uma estrutura que possua qualquer ramificação na molécula.

A presença de um grupo funcional terminal não altera o espaço, razão pela qual a ureia forma, também, compostos de inclusão com álcoois primários, aldeídos, ácidos carboxílicos e aminas primárias, desde que suas cadeias não possuam ramificações.

A estabilidade da rede cristalina é o resultado da ligação entre o hidrogênio e a ureia e as forças de Wan der Waals, e, ainda, entre as moléculas da ureia e do hidrocarboneto.

Os hidrocarbonetos alifáticos ramificados podem ser separados com a tioureia, que forma canais com diâmetro de 6,5 Å.

Apesar de afirmado que a ureia não extraia hidrocarbonetos ramificados, a extração poderá ser feita, caso se considere, por exemplo, a estrutura do hidrocarboneto aromático representado a seguir.

Embora a ureia não incorpore o radical fenil, todo o restante da cadeia será ocluída, razão pela qual o composto será extraído, desde que o hidrocarboneto possua mais de seis átomos de carbono na cadeia principal.

Método 2.7

Colocar o extrato do método 2.6, alternativa 2, em funil de decantação. Adicionar 5,0 g de ureia e 20,0 mL de água deionizada. Separar em funil de decantação, obtendo-se camada aquosa e extrato.

Camada aquosa – Destilar, obtendo-se os hidrocarbonetos alifáticos não ramificados ou com substituintes aromáticos em um dos carbonos primários.

Extrato – Reservar e adicionar tioureia. Adicionar água deionizada. Separar em funil de decantação, obtendo-se duas camadas: a camada aquosa é destilada, obtendo-se os hidrocarbonetos ramificados.

3. SCREEN

Ao contrário da marcha química, em que se pode trabalhar com maiores quantidades, nesse processo analisa-se a amostra do ponto de vista qualitativo, com pequenas quantidades.

Dividir a amostra, devidamente moída, em 2 partes (com 10,00 g e com 300,00 g).

Amostra com 10,00 g – Colocar em um Erlenmeyer de 250,0 mL com tampa. Adicionar 50,0 mL de água deionizada e 1,00 mL de solução de ácido sulfúrico 1 N. Prender a tampa em uma fita de papel embebida com picrato de sódio, sem deixar tocar no líquido. Aquecer 2 horas, entre 50 ºC e 60 ºC. O desenvolvimento de cor indicará a presença de heterosídeos cianogênicos.

Amostra com 300,00 g – Colocar em um Soxhlet de 250,0 mL. Adicionar uma solução aquosa de etanol a 30%. Extrair até esgotamento, obtendo-se uma solução hidroalcoólica. Diluir a solução hidroalcoólica obtida com água deionizada na proporção de 1:3. Dividir em 8 partes:

Tubo 1 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroalcoólica – Adicionar 3 gotas de solução de cloreto férrico a 5%. Agitar. Observar variação de cor ou formação de um precipitado, comparando com um teste em branco. Coloração variável entre azul e vermelha indica a presença de fenóis (precipitado azul-escuro indica taninos pirogálicos, e precipitado verde indica taninos catéquicos).

Tubos 2, 3 e 4 contendo, cada um, 5,0 mL da solução hidroalcoólica – Adicionar ao tubo 2 uma solução de ácido clorídrico a 3% até pH 3. Adicionar ao tubo 3 uma solução de hidróxido de sódio a 3% até pH 8,5. Adicionar ao tubo 4 uma solução de hidróxido de sódio a 3% até pH 11.

Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 1.

Tabela 1. Resultados obtidos pelo método screen.

pH = 3

pH = 8,5

pH = 11

Antocianinas

Antocianidinas

Vermelha

Lilás

Azul-púrpura

Flavonas

Flavonóis

Xantonas

-

-

Amarela

Chalconas

Auronas

Vermelha

Vermelho-púrpura

Tubo 5 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroalcoólica – Adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3% até pH entre 1 e 3. Aquecer em lâmpada de álcool durante 2 a 3 minutos. O desenvolvimento de cor vermelha indica a presença de leucoantocianidinas. O desenvolvimento de cor pardo-amarelada indica a presença de catequinas.

Tubo 6 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroalcoólica – Adicionar uma solução de hidróxido de sódio a 3% até pH = 11. Aquecer em lâmpada de álcool durante 2 a 3 minutos. O desenvolvimento de cor vermelho-alaranjada indica a presença de flavanonas.

Tubo 7 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroalcoólica – Adicionar ao tubo de ensaio alguns decigramas de magnésio granulado ou em aparas. Adicionar 0,5 mL de uma solução de ácido clorídrico a 3%. Aguardar o término da reação (fim da efervescência). Comparar o aparecimento de cor com o tubo 5; se a reação for positiva, indica a presença de flavanóis e/ou flavononas e/ou flavanonóis e/ou xantonas.

Tubo 8 – Umedecer bem a madeira de um palito de fósforo na solução hidroalcoólica. Evaporar o solvente. Umedecer uma face do palito com uma solução de ácido clorídrico concentrado, com o auxílio de um bastão de vidro. Aquecer o palito de 2 a 3 minutos em chama de álcool, evitando que ele fique tostado. Observar se houve o aparecimento de coloração no lado acidulado do palito: cor vermelha ou pardo-amarelada indica a presença de catequinas.

Béquer 1 – Tarar o béquer e colocar 10,0 mL da solução hidroalcoólica. Evaporar à secura e colocar no dessecador. Calcular o rendimento em relação ao material seco. Observar se houve a formação de cristais. O resíduo deve conter açúcares, hexitóis, KCl, entre outros.

Béquer 2 – Colocar 10,0 mL da solução hidroalcoólica e evaporar até secura. Extrair com clorofórmio (2 a 3 vezes), triturando com o bastão todo o resíduo. Filtrar para funil fechado contendo bolinhas de algodão coberto com alguns cristais de sulfato de sódio anidro. Separar as duas frações (filtrado e resíduo).

No filtrado, adicionar 1,0 mL de anidrido acético e agitar suavemente. Adicionar 3 gotas de uma solução de ácido sulfúrico a 10% e observar se há rápido desenvolvimento de cor. O desenvolvimento de coloração azul evanescente seguida para verde permanente indica a presença de esteroides livres; o desenvolvimento de cor parda até vermelha indica a presença de triterpenos pentacíclicos.

No resíduo, adicionar 10,0 mL de água deionizada e filtrar para tubo de ensaio, descartando o novo resíduo. Agitar o filtrado durante 2 minutos. Uma espuma consistente e abundante indica a presença de saponinas. Adicionar 2,0 mL de ácido clorídrico concentrado e deixar esfriar. Neutralizar com uma solução de hidróxido de sódio a 10% e agitar. A formação de um precipitado e não formação de espuma confirma a presença de saponinas. O tratamento hidrolisa as saponinas, precipitando as agliconas, que podem ser extraídas com clorofórmio e submetidas ao teste de Liebermann-Buchardt.

4. Extração de aminoácidos livres e aqueles resultantes da hidrólise das proteínas, carboidratos e ácidos orgânicos

Amostra com 160,0 g

• Homogeneizar com 600,0 mL de água deionizada. Prensar. Obtêm-se duas fases:

• Resíduo 1.

• Camada aquosa.

• Centrifugar a camada aquosa (1).

• Adicionar 2,5 vezes o volume de acetona.

• Colocar na geladeira durante, pelo menos, 1 hora.

• Centrifugar.

• Evaporar à secura.

• Dissolver e completar a 5,0 mL com água deionizada.

• Colocar em uma coluna de Dowex 50.

• Passar 500,0 mL de água deionizada.

• Nesta etapa, há uma coluna de Dowex (1) e uma solução aquosa (2).

• Passar na coluna Dowex 250,00 mL de solução de hidróxido de amônio 5N.

• Evaporar a solução obtida à secura.

• Dissolver e completar o volume a 2,0 mL com solução de isopropanol a 10%.

• Desenvolver a cromatografia em sílica gel a fim de se obter os aminoácidos livres.

• A solução aquosa (2) é colocada em uma coluna de amberlite IR-45 e tratada com 500,0 mL de água deionizada.

• Evaporar à secura a solução aquosa (2) e fazer a cromatografia.

• Passar na coluna de amberlite (3) 250,00 mL de uma solução de ácido clorídrico 2N.

• A solução obtida (4) é evaporada à secura.

• Dissolver o resíduo em 2,0 mL de uma solução de i-propanol a 10%.

• Fazer a cromatografia (sílica gel).

• Serão isolados os ácidos orgânicos.

• Regenerar a coluna de amberlite.

Resíduo 1

Dividir o resíduo 1 em duas partes (resíduo 2 e resíduo 3).

Resíduo 2

• Pesar 2,50 g.

• Colocar em equipamento para fazer um refluxo.

• Adicionar uma mistura de 12,0 mL de solução de ácido clorídrico 6N + 12,0 mL de solução de ácido fórmico a 85%.

• Fazer o refluxo durante 20 horas.

• Filtrar.

• Evaporar o filtrado à secura.

• Dissolver o resíduo na menor quantidade possível com água deionizada.

• Evaporar à secura, novamente.

• Dissolver e completar 5,0 mL com água deionizada.

• Passar numa coluna de Dowex 50.

• Passar 250,0 mL de solução de hidróxido de amônio 5N, e separar a coluna de amberlite para regeneração.

• A solução aquosa obtida é evaporada à secura.

• Dissolver o resíduo com 2,0 mL de uma solução de i-propanol a 10%.

• Cromatografar (em sílica gel), a fim de obter os aminoácidos resultantes da hidrólise das proteínas.

5. Regeneração das colunas

5.1. Dowex

Lavar com água deionizada até pH 7. Passar 250,0 mL de solução de hidróxido de amônio a 10% (ou hidróxido de sódio a 3%); água deionizada até pH 7; 250,0 mL de uma solução de ácido clorídrico 2N; água deionizada até pH 7.

5.2. Amberlite IR 45

Passar água deionizada até pH 7; 250,0 mL de solução de hidróxido de amônio 5 N; água deionizada até pH 7.

5.3. Cromatografia monodimensional para aminoácidos

Existem várias alternativas, e, dentre elas:

Alternativa 1 – Preparar uma solução tampão de pH = 12 (50,00 mL de solução de Na2HPOH 0,067 M + 50,00 mL de solução de NaOH 0,067 M). Solvente: fenol saturado com a solução tampão. Tempo: 24 horas. Método: ascendente.

Alternativa 2 – Preparar uma solução tampão (50,00 mL de solução de H3BO3 0,067 M + 8,55 mL de solução de NaOH 0,067 M). Solvente: m-cresol saturado com a solução tampão. Tempo: 24 horas. Método: ascendente.

Alternativa 3 – Preparar uma solução de n-butanol 5N, na proporção de 8:2. Método: descendente. Tempo: 72 horas.

Alternativa 4 – Preparar uma solução de n-propanol e hidróxido do ácido a 8%, na proporção de 8:2. Método: descendente. Tempo: 60 horas. Repetir o mesmo sistema com 120 horas. Repetir o mesmo sistema durante 8 dias.

Os aminoácidos resultantes de cada uma das quatro alternativas encontram-se na Tabela 2.

Tabela 2. Aminoácidos resultantes das quatro alternativas.

Aminoácido

Alternativa

1

2

3

4

Ácido aspártico

x

Ácido glutâmico

x

Alanina

x

x

x

Arginina

x

Asparagina

Cisteína

Cistina

Fenilalanina

x

Glicina

x

Hidroxiprolina

x

Histamina

x

Histidina

x

Isoleucina

x

Leucina

x

Metionina

x

x

Prolina

x

Serina

x

Tirosina

x

x

Treonina

x

x

Valina

x

x

6. Referências

BALANDRIN, M. F.; KLOCKE, J. A.; WURTELE, E. S.; BOLLINGER, W. H. Natural plant chemicals sources of industrial and medicinal materials. Science, Washington, DC, v. 228, p. 1154, 1985.

HARVEY, A. Strategies for discovering drugs from previously unexplored natural products. Drug Discovery Today, Amsterdam, NL, v. 5, p. 294, 2000.

LIMA, G. S. F. Biodiversidade vegetal e a busca de produtos naturais. São Paulo: Fatec-Oswaldo Cruz, 2008. Texto das disciplinas de Fitocosméticos e Controle de Qualidade em Fitocosméticos - Tecnologia em Cosméticos.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5. ed. rev. ampl. Porto Alegre: UFSC, 2004. 1102 p.

SOARES, M. M. S. R.; CURY, A. E. In vitro activity of antifungal and antiseptic agents against dermatophyte isolates from patients with tinea pedis. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 130-134, 2001.

Capítulo 6
Caracterização da quitosana e sua aplicação na nanotecnologia

Thatiana Montenegro Stamford Arnaud

Thayza Christina Montenegro Stamford

1. Introdução

Quitosana é um heteropolímero natural, composto por unidades β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos de N-acetilglucosamina, podendo ser encontrado na natureza, na parede celular de alguns fungos, principalmente da classe Zygomycetes e em alguns moluscos (CHATTERJEE et al., 2005; SILVA et al., 2006; STAMFORD et al., 2007). A quitosana é obtida na indústria pela hidrólise química da quitina (AMORIM et al., 2006; FRANCO et al., 2005; OKAWA et al., 2003; POCHANAVANICH; SUNTORNSUK, 2002). Quitina é um polímero natural, insolúvel, linear que apresenta o mesmo tipo de unidade monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina, e, com exceção da celulose, é o polissacarídeo mais abundante e largamente distribuído na natureza (CANELLA; GARCIA, 2001). A quitina é encontrada no exoesqueleto dos crustáceos, insetos, artrópodes e na parede celular de fungos (CAMPOS-TAKAKI, 2005; STAMFORD et al., 2008).

Existem vários derivados da quitosana, os quais podem se diferenciar pelo grau de desacetilação, disposição dos grupos N-acetil residuais na cadeia do polímero e pela reação específica do grupo -NH2 no carbono 2 (C2) ou inespecífica com o grupo -OH nos carbonos de posição 3 ou 6 (C3 ou C6) da quitosana com outros grupos funcionais, gerando derivados tais como: O- ou N- carboximetilquitosana, quitosana-6-O-Sulfato, trimetilquitosana amonio, entre outros. Essas reações causam diferenças na quitosana quanto a sua solubilidade, estabilidade térmica, reatividade com outras substâncias, especificidade quanto ao sítio de ligação, proporcionando diversas aplicações biológicas da quitosana (RINAUDO, 2006; STAMFORD et al., 2007).

A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades específicas que revelam seu potencial para inúmeras aplicações em vários produtos comerciais. As principais propriedades desse polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade, reatividade do grupo amino deacetilado, permeabilidade seletiva, ação polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e capacidade adsortiva (SYNOWIECKI; AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN; KITTUR, 2003).

2. Aplicações da quitosana

No pH biológico, a quitosana apresenta-se como um policátion. Em meio ácido, os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio, resultando uma carga global positiva ao polímero, o que permite a sua interação com moléculas carregadas negativamente, tais como gorduras, tecidos animais ou vegetais, membrana celular, entre outras formas (HÖRNER et al., 1997; PAWTLOWSKA, 1997). As possibilidades de aplicações são ainda ampliadas pelo fato de que a quitosana pode ser preparada em diferentes formas, como soluções de viscosidade controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA FILHO et al., 2007; JAYAKUMAR et al., 2007; SEZER et al., 2007; WONGPANIT et al., 2007).

A quitosana vem sendo extensivamente estudada em razão das suas propriedades peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, por exemplo, carreador de fármacos de liberação controlada e DNA (KIM et al., 2004; PARK et al., 2004), regeneração de tecidos epiteliais (CHO et al., 1999; MAIA et al., 2006; ÖLMEZ et al., 2007), confecção de membranas artificiais (COSTA et al., 2006), promotor de osteogênese (MURUGAN; RAMAKRISHNA, 2004), antibacteriano (CAO; SUN, 2008; CHUNG et al., 2004; IKINCI et al., 2002; YADAV; BHISE, 2004), coadjuvante da higiene oral (SANO et al., 2002, 2003), absorção de gordura e redução do colesterol sérico (GADES; STERN, 2005), componente de cosméticos (KOHEI; MAKI, 2006), remoção e recuperação de diferentes resíduos (VIVEK; TORRES, 2000), biotransformação e detecção de pesticidas (DU et al., 2007; YOSHIZUKA et al., 2000), recobrimento de sementes na agricultura (VELÁSQUEZ, 2003), degradação de corantes, aminoácidos e proteínas (BORDERÍAS et al., 2005), agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (SYNOWIECKI; AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN; KITTUR, 2003).

Embora a aplicação da quitosana já esteja bem estabelecida, as pesquisas em novas aplicações têm aumentado exponencialmente em diversas áreas, como na agricultura, indústria de alimentos e meio ambiente (STAMFORD et al., 2008). Contudo, a aplicabilidade da quitosana está diretamente relacionada com suas características físicas e químicas, uma vez que fontes de obtenção distintas, processos diferentes de extração e purificação causam alterações no grau de desacetilação, peso molecular, estabilidade térmica e grau de cristalinidade.

3. Caracterização da quitosana

Diversas técnicas são realizadas para caracterizar a quitosana. A caracterização estrutural desse polímero pode ser realizada por espectroscopia vibracional na região do infravermelho, e o grau de umidade e a análise térmica são determinados por termogravimetria (TGA) e calorimetria diferencial exploratória (DSC), respectivamente. A cristalinidade da amostra pode ser obtida pela difração de raio-X; no entanto, as propriedades físico-químicas da quitosana estão relacionadas principalmente ao seu grau de desacetilação e a massa molar média.

O grau de desacetilação da quitosana deve ser determinado por diferentes técnicas: espectroscopia vibracional na região do infravermelho, ressonância magnética nuclear (RMN 1H), análise elementar e titulação condutimétrica. A determinação da massa molar média de polímeros pode ser realizada por cromatografia de permeação em gel (GPC) ou por medidas de viscosidades (STAMFORD, 2008).

3.1. Características estruturais: espectroscopia vibracional na região do infravermelho

O espectro no infravermelho é obtido em espectrofotômetro na região entre 4.000 cm-1 e 400 cm-1. Aproximadamente 1,5 mg de quitosana é seca em estufa a vácuo durante 15 horas a 60 °C. Em seguida, é adicionado 100 mg de KBr e a mistura homogeneizada em almofariz de ágata. A pastilha é preparada e deixada na estufa a vácuo a 110 °C durante 20 horas. Por tanto, o espectro do pó da quitosana é obtido utilizando pastilha de KBr como suporte.

A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e classificar algumas bandas relativas a vibrações características dos grupos funcionais presentes na estrutura da quitosana como pode ser observado na Tabela 1.

Tabela 1. Atribuição das bandas do infravermelho para a quitosana.

Número de onda (cm-1)

Tentativa de atribuições

800 a 1.200

Anéis piranosídicos

1.374

(-CH2 – OH) νC-O

1.428

(amida) νC-N

1.607

(amida II) δNH

1.655

(amida I) νC = O

2.888

ν C-H

3.450

ν O-H

3.450

(amina) δNH

O espectro da quitosana mostra um pico largo em torno de 3.450 cm-1, na região correspondente ao estiramento OH, o qual pode aparecer sobreposto à banda de deformação axial NH do grupo amina. O pico próximo a 2.888 cm-1 representa o estiramento C-H alifático, e o pico em torno de 1.655 cm-1 corresponde à banda de deformação axial C = O do grupo amida I da quitina, indicando que a amostra não está totalmente desacetilada. O modo vibracional da deformação angular da ligação N-H (amida II) deve aparecer como um ombro próximo a 1.607 cm-1. O pico em 1.374 cm-1 representa o estiramento C-O do grupo alcoólico primário (-CH2 – OH). A deformação axial de C-N da amida aparece em torno de 1.428 cm-1. E a banda intensa entre 800 cm-1 e 1.200 cm-1 está relacionada aos anéis piranosídicos. Podem ser observadas pequenas oscilações nos espectros de diferentes tipos de quitosanas, em virtude das diversas fontes de obtenção desse polímero e das variações dos graus de desacetilação.

3.2. Grau de desacetilação

O grau de desacetilação é considerado um dos principais parâmetros na caracterização da quitina e da quitosana. Ele é definido como sendo o número de grupos amina em relação ao número de grupos amida da cadeia polimérica.

Vários métodos já foram propostos para a sua determinação: espectroscopia no infravermelho, RMN 1H, análise elementar e titulações condutimétricas. Entretanto, existe certa discrepância entre os valores encontrados pelas diferentes técnicas, por isso até hoje ainda busca-se o método mais adequado para sua determinação.

3.2.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho

A espectroscopia no infravermelho é uma técnica que, além de caracterizar a estrutura do polímero, também é utilizada para determinar o grau de desacetilação da quitosana por meio da relação entre as absorbâncias nos números de ondas de 1.655 cm-1 e 3.450 cm-1. Para medir a absorbância em um espectro de transmitância versus número de onda é preciso: 1) traçar as linhas de base; 2) calcular a diferença de transmitância; 3) converter os valores de transmitância para absorbância (A = logT1/T2); e 4) aplicar os valores nas equações propostas por Domszy e Roberts (1985) (equação 1) e/ou por Baxter et al. (1992) (equação 2) que utilizam linhas de base diferentes para calcular a absorbância no número de onda 1.655 cm-1. No entanto, as duas equações apresentam um mesmo objetivo: calcular o grau de desacetilação da quitosana relacionando os picos característicos do grupo amina e acetamida do heteropolímero.

em que

A1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtida utilizando a linha de base (a) proposta por Domszy e Roberts (1985). Essa banda de absorção é característica da vibração entre os átomos de carbono e oxigênio (VC = O) do grupo amida I da quitina residual presente na quitosana. A 3.450 é a banda de absorção no número de onda 3.450 cm-1 correspondente ao estiramento OH e a deformação axial NH do grupo amina presente na quitosana. O número 1,33 equivale ao valor de A1.655/A3.450 encontrado na quitina pura. Pode-se visualizar nas Figuras 1 e 2 o traçado das diferentes linhas de base.

Figura 1. Traçado da linha de base (a) em um espectro da quitosana no infravermelho.

em que

A 1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtido utilizando a linha de base (b) proposta por Baxter et al. (1992), e A 3.450 é a absorbância medida no número de onda 3.450 cm-1 empregando a mesma linha de base usada por Domszy e Roberts (1985). O valor de (A 1.655/A 3.450) para a quitina pura encontrado por Baxter et al. (1992) quando traçada a linha de base (b) é aproximadamente 0,87. Para introduzir esse número na sua equação em vez de multiplicar (A1.655/A3.450) por 100 e dividir por 0,87, os autores decidiram simplificar a fórmula multiplicando (A1.655/A3.450) por 115.

Figura 2. Traçado da linha de base (b) em um espectro da quitosana no infravermelho.

3.2.2. Ressonância magnética nuclear

O espectro de RMN 1H é obtido a partir de um procedimento descrito por Signini et al. (2000). A solução de quitosana é preparada pela dissolução de 10 mg de quitosana em 1 mL de solução de HCl/D2O 1% (v/v), durante 24 horas, formando uma solução viscosa. Uma alíquota dessa solução é colocada em tubo de 5 mm de diâmetro para a análise a 50 °C, com tempo de relaxação de 6 segundos e pulso de 90º.

A ressonância magnética nuclear de 1H é uma técnica que permite a quantificação de alto grau de desacetilação. A preparação da amostra é simples por diversos motivos, como: não há necessidade de preparar curva analítica; utiliza uma pequena quantidade de substância (mg) e não precisa purificá-la (caso os picos de impurezas não tenham o mesmo deslocamento químico dos picos relevantes da quitosana).

Segundo Lavertu et al. (2003), a determinação do grau de desacetilação por RMN 1H é feita utilizando uma relação entre os picos referentes aos prótons do grupo acetoamido da quitina e os outros prótons, exceto o próton do carbono anomérico (C1) da quitosana/quitina (Figura 3).

Figura 3. Esquema da quitina/quitosana com a numeração dos prótons que aparecem no RMN 1H.
Fonte: Anjos (2005).

Nessa técnica a amostra de quitosana é dissolvida em solução de ácido clorídrico deuterado (solução viscosa). É necessário que a medida seja realizada a 50 ºC para impedir interações intermoleculares e intramoleculares. Essas interações modificam o tempo de relaxação responsável pela integração dos picos influenciando o valor do grau de desacetilação. Também é necessário que as medidas sejam realizadas rapidamente, de modo a minimizar problemas causados pela hidrólise da quitosana, ou seja, a quebra das ligações glicosídicas que formam o biopolímero.

A Figura 4 mostra os picos referentes a cada próton característicos da estrutura da quitosana. Os picos podem variar de acordo com os diferentes tipos de quitosana.

Figura 4. Espectro de RMN 1H de uma quitosana comercial.

O grau de desacetilação é calculado pela equação 3 proposta por Hirai et al. (1991), que utiliza os sinais dos prótons H2, H3, H4, H5, H6, H6’ (H2-6) de ambos os monômeros e o pico referente aos núcleos do hidrogênio do grupo acetoamido (Hac).

O grau de desacetilação também é calculado pela equação 4 proposta por Signini et al. (2000), que utiliza a área do pico na região de 2 ppm atribuído aos núcleos de hidrogênio do grupo acetoamido (Hac) e a área do pico em 3,4 ppm referente ao núcleo de hidrogênio na posição 2 do anel glicopiranosídico (H2).

A equação 4 só leva em conta os picos do grupo acetoamido (Hac) e dos hidrogênios do carbono na posição 2 do anel glicopiranosídico (H2). A escolha desses dois picos se deve ao fato de que as áreas relativas a núcleos dos grupos metila presentes no grupo acetoamido e ao núcleo na posição 2 do anel glicopiranosídico estão relativamente livres das influências do pico de HOD.

A espectroscopia de RMN e a vibracional no IV estão relacionadas respectivamente com o envolvimento de núcleos e elétrons no processo de absorção de energia, o que torna essas técnicas capazes de fornecer informações precisas. Contudo, é preciso saber usá-las corretamente a fim de se obter os dados desejados. Por isso, devem-se usar duas equações de cada técnica para determinar o GD da quitosana e, posteriormente, poder verificar a mais adequada para a amostra estudada. Como a substância analisada é um polímero, vale salientar que a RMN é uma técnica bastante utilizada para analisar polímeros e determinar a pureza de amostras, o que a torna um método confiável.

3.2.3. Análise elementar

A análise elementar é outra ferramenta que pode ser utilizada para a determinação do grau de desacetilação da quitosana. Apesar de ser um método preciso, deve ser usado com muita cautela em virtude dos diferentes teores de hidratação, que variam de acordo com as condições de armazenamento e tratamento prévio da amostra. A equação 5 é proposta por Kassai et al. (2000) para determinar o grau de desacetilação da quitosana tendo em vista a relação entre carbono e nitrogênio a qual pode ser obtida pela análise elementar.

em que

C/N é a razão de carbono/nitrogênio. Essa razão, de acordo com Kassai et al. (2000), varia de 5,145 em quitosana completamente desacetilada (monômero da quitosana) a 6,816 em quitina inteiramente acetilada (monômero da quitina).

Esse método só apresenta resultados precisos para a quitosana que não tem resíduos de proteínas; caso contrário, é necessário purificar o respectivo polímero.

3.2.4. Titulação condutimétrica

A determinação do grau de desacetilação da quitosana por titulação condutimétrica é um método indireto bastante utilizado nas indústrias por ser uma técnica simples e de baixo custo.

Para preparar a solução de quitosana é preciso dissolver 102 mg do polímero em 20 mL de ácido clorídrico 0,05 M sob agitação constante por 24 horas. Paralelamente deve ser feita a padronização da solução de hidróxido de sódio, visto que essa base, tanto no estado sólido como em solução, absorve rapidamente CO2 da atmosfera produzindo carbonato de sódio. A solução padrão de NaOH 0,17 M é preparada a partir do ácido biftalato de potássio por ser a substância primária frequentemente utilizada na aferição de soluções básicas.

A solução de quitosana é titulada com NaOH, e a condutância é medida em µS/cm a cada volume de base acrescentada. Dessa forma, é traçada a curva de titulação condutimétrica do polímero (condutividade versus volume de NaOH). O primeiro ramo da curva representa a neutralização do ácido presente, o segundo corresponde à neutralização de prótons dos grupos amino da quitosana, e o terceiro conjunto de pontos refere-se ao excesso de base, após o ponto de equivalência.

Para estimar o grau de desacetilação da quitosana por meio da titulação condutimétrica deve-se usar a seguinte equação.

em que

GD é o grau médio de desacetilação; V1 é o volume de base usado para a neutralização de HCl em excesso (mL); V2 – V1 é o volume de base usado para a neutralização dos grupos ácidos de quitosana (mL); [base] é a concentração da base usada; e m é a massa da amostra de quitosana.

3.3. Grau de umidade e análise térmica

3.3.1. Análise termogravimétrica (TGA)

A análise térmica é realizada para verificar as perdas de massa com o aumento da temperatura. Essa técnica é utilizada para caracterizar a estabilidade térmica do material. A medida termogravimétrica é efetuada usando suporte de platina e uma massa de aproximadamente 9 mg de quitosana. A taxa de aquecimento é de 10 ºC/min, dentro da faixa de 30 ºC a 400 ºC, sob fluxo de nitrogênio de 50 mL/min.

Os polissacarídeos geralmente têm forte afinidade por água, e no estado sólido essas macromoléculas têm uma estrutura desordenada que é facilmente hidratada. Assim, a análise termogravimétrica (TGA) da quitosana apresenta uma primeira perda de massa em torno de 90 ºC referente à desidratação da quitosana e uma segunda perda de massa que começa em aproximadamente 260 ºC, que é referente ao início da termodecomposição do polímero, com a geração de um resíduo carbonizado.

3.3.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

O experimento de calorimetria exploratória diferencial (DSC) é realizado para identificar os eventos endotérmicos e exotérmicos que ocorrem durante o aquecimento da amostra, ocorrendo ou não perda de massa. A medida de DSC é efetuada usando uma massa de aproximadamente 9 mg de quitosana e uma taxa de aquecimento é de 10 ºC/min, dentro da faixa de 30 ºC a 400 ºC, sob fluxo de nitrogênio de 50 mL/min.

A curva da calorimetria exploratória diferencial da quitosana deve apresentar dois picos: o primeiro é um evento térmico característico de um pico largo endotérmico entre 25 ºC e 175 ºC, correspondente à perda de água de hidratação, e o segundo evento térmico representa um pico exotérmico aproximadamente entre 260 ºC e 325 ºC, que é relacionado à decomposição da quitosana. Os dois processos devem ser coerentes com os eventos observados nas curvas TGA. Os valores desses eventos térmicos podem apresentar pequenas variações dependendo da quitosana analisada.

3.4. Cristalinidade

3.4.1. Difração de raio X

A difração de raio X é uma técnica usada para conhecer o interior dos sólidos no que diz respeito ao arranjo dos átomos, ao comprimento e ângulo de ligações. Na técnica de difração de pó, um feixe de raio X monocromático de Cu-Kα é direcionado para a amostra (λ = 1,5406 Aº), espalhada em um suporte, e a intensidade de difração é medida quando o detector é movido em diferentes ângulos (faixa de varredura entre 3º e 80º com taxa de 0,02º/min). A equação central para analisar os resultados de um experimento de difração de raio X é a equação 7 de Bragg

que relaciona o ângulo (θ) no qual a interferência construtiva ocorre com o espaçamento (d) das camadas de átomos na amostra para o raio X de determinado número de onda (λ). Observa-se interferência construtiva principalmente em 2θ = 9º e 20º que correspondem a dois picos característicos da quitosana.

O índice de cristalinidade, ou grau de ordenamento, da quitosana é calculado pela equação proposta por Focher et al. (1990) descrita a seguir.

em que

ICR é o índice de cristalinidade, e IC e IA são as intensidades de difrações relativas às regiões cristalinas (2θ≈20º) e amorfas (2θ≈9º), respectivamente.

Jaworska et al. (2003) verificaram, por difração de raio X, a cristalinidade de diversas quitosanas e observaram que o índice de cristalinidade sofre alteração dependendo do tipo de quitosana e do método empregado para a sua obtenção. Esses pesquisadores encontraram para alguns desses métodos a seguinte ordem crescente do índice de cristalinidade: fungo < molusco < crustáceo, e para outros métodos de obtenção da quitosana a ordem foi: fungo < crustáceo < molusco. Esses resultados também demonstram que a cristalinidade apresenta uma relação com o grau de desacetilação da quitosana.

De uma maneira geral, verifica-se que a quitosana possui menor grau de cristalinidade do que a quitina, e, conforme aumenta o grau de desacetilação, diminui o grau de cristalinidade. A diminuição do grau de cristalinidade durante a desacetilação da quitina não está associada apenas à remoção dos grupos acetil na quitosana, mas também às drásticas condições de processamento da quitina e da quitosana (MONTEIRO JÚNIOR, 1999; ORNUM, 1992). Portanto, o resultado esperado para a cristalinidade do biopolímero estudado deve ser coerente com os demais resultados obtidos para o grau de desacetilação, visto que o grau de ordenamento da quitosana deve ser característico de um material amorfo.

3.5. Massa molar média

As propriedades físico-químicas da quitosana dependem não somente do grau de desacetilação, mas também da sua massa molar média. As determinações da massa molar média de polímeros podem ser realizadas por cromatografia de permeação em gel (GPC) ou por medidas de viscosidades.

A cromatografia de permeação em gel é o método mais utilizado para a determinação da distribuição da massa molar de polímeros (STEVENS, 1999). Uma coluna cromatográfica separa as frações cujas massas molares apresentam pequena variação, mas no caso da quitosana tem sido discutido o efeito da natureza química dos padrões de calibração sobre a determinação de massa molar por GPC. Alguns trabalhos mostram melhores resultados por meio de padrões de calibração da própria quitosana (TSAIH; CHEN, 1999); todavia, a maior dificuldade é a inexistência de amostras comerciais.

3.5.1. Medidas de viscosidade

O peso molecular da quitosana pode ser determinado por viscosidade, segundo a metodologia proposta por Santos et al. (2003). A medida de viscosidade é realizada utilizando um capilar de vidro tipo Cannon-Fenske termostatizado a 25 ºC ± 0,01 ºC. Para determinar a viscosidade intrínseca [η], é necessário preparar cinco soluções de quitosana, com concentrações diferentes, utilizando o tampão de ácido acético como solvente para obter os respectivos tempos de escoamento. Devem-se realizar quatro ou cinco medidas de cada amostra e em seguida calcular a média.

A viscosidade de soluções poliméricas é a medida do volume hidrodinâmico (tamanho ou extensão no espaço) do polímero em solução. A viscosidade de soluções poliméricas diluídas é consideravelmente maior que a do solvente puro, ou de soluções diluídas de pequenas moléculas. Isso se deve à grande diferença de tamanho entre as moléculas do polímero e a do solvente. A viscosidade aumenta à medida que as dimensões das moléculas poliméricas em solução aumentam. Assim, a viscosidade polimérica é o resultado da comparação entre o tempo de escoamento do solvente em um capilar e o tempo de escoamento da solução polimérica a determinada concentração e temperatura. Embora seja um método não absoluto, a medida de viscosidade pode ser utilizada para estimar/determinar a massa molar média de polímeros.

A razão do tempo de escoamento da solução do polímero pelo tempo de escoamento da solução do solvente é chamada de viscosidade relativa. A viscosidade específica é o aumento fracionário em viscosidade e é calculada aplicando a média dos tempos de escoamento na equação abaixo.

em que

ηesp = viscosidade específica da amostra; t = tempo de escoamento da solução no viscosímetro; to = tempo de escoamento do solvente puro no viscosímetro.

Viscosidade reduzida é a viscosidade específica dividida pela concentração e tem como dimensão o inverso da concentração.

em que

ηred = viscosidade reduzida da amostra; C = concentração em gramas de polímero em 100 mL de solução.

A viscosidade intrínseca é encontrada pela extrapolação do gráfico de viscosidade reduzida versus concentração à diluição infinita, com base na equação 11 de Huggins (1942) mostrada abaixo.

A viscosidade intrínseca de uma solução polimérica está relacionada com a massa molar viscosimétrica média por meio da equação de Mark-Houving (equação 12). O valor das constantes K e a depende do polímero, do solvente e da temperatura. Os valores propostos por Rinaudo et al. (1993) quando o polímero é a quitosana e o solvente é o ácido acético (na temperatura ambiente) é de 0,076 e 0,76 para K e a, respectivamente.

A massa molar média da quitosana está entre 1 x 104 g/mol a 5 x 105 g/mol dependendo do meio de obtenção do biopolímero (ANJOS, 2005; SANTOS et al., 2003).

4. Aplicação da quitosana na nanotecnologia

Partículas maiores que 1 µm são denominadas micropartículas. A nanotecnologia estende a ciência de materiais para o domínio de partículas e interfaces com dimensões extremamente pequenas, menores que 1 µm. As nanopartículas apresentam uma grande área superficial e, com grande freqüência, exibem propriedades mecânicas, ópticas, magnéticas ou químicas distintas de partículas e superfícies macroscópicas. O aproveitamento dessas propriedades em aplicações tecnológicas forma a base da nanotecnologia de materiais (QUINA, 2004).

A ciência moderna vem demonstrando grande interesse em pesquisas com materiais nanoestruturados, uma vez que possuem alto potencial de aplicabilidade em várias áreas científicas e tecnológicas, como computação e tecnologia da informação, biotecnologia, agricultura, meio ambiente, ciências da saúde, medicina, materiais manufaturados, indústrias farmacêutica e química (AZEVEDO, 2002; MONTEIRO et al., 1999; PUSZTAY et al., 2002).

Quando aplicada nas ciências da vida, a nanotecnologia passa a ser denominada de nanobiotecnologia. A nanobiotecnologia envolve aspectos multidisciplinares de biologia, medicina, física, química e engenharia. Apresenta aplicações em várias linhas de pesquisas, como a genômica, robótica, descoberta de novas drogas e processos químicos (AZEVEDO et al., 2003; LACAVA; MORAIS, 2004).

Dentro da nanobiotecnologia há um corrente interesse na preparação de materiais nanoestruturados para serem utilizados em sistemas de liberação controlada de fármacos, frequentemente descritos como drug delivery systems. Tais sistemas representam novas estratégias para veiculação de ingredientes ativos, os quais incluem aplicações importantes na ciência de polímeros e em soluções de surfactantes, no preparo de espécies coloidais, administração de vacinas, além da utilização de técnicas transdérmicas (JAIN et al., 2002; YANO et al., 2002).

4.1. Liberação controlada de fármacos

A tecnologia de liberação controlada de fármacos representa um desenvolvimento relativamente novo. Esse sistema oferece inúmeras vantagens quando comparado aos sistemas convencionais de administração de fármacos, como maior eficácia, com liberação progressiva e controlada da substância ativa, a partir da degradação da matriz; diminuição da toxicidade e maior tempo de permanência na circulação; natureza e composição variadas dos veículos; administração segura e conveniente; direcionamento a alvos específicos, sem imobilização significativa das espécies bioativas; podem incorporar substâncias hidrofílicas ou lipofilicas (AZEVEDO, 2002; DUMITRIU, 2002; KAYSER et al., 2005).

Os sistemas de liberação controlada de fármacos usando nanotecnologia têm sido desenvolvidos visando a inúmeras aplicações terapêuticas, sendo planejados, principalmente, para administração parenteral, oral ou oftálmica. Uma das áreas mais promissoras na utilização das nanopartículas é a vetorização de fármacos anticancerígenos e de antibióticos, principalmente pela administração parenteral, almejando uma distribuição mais seletiva dos mesmos e, assim, um aumento do índice terapêutico (BENITA, 1998; PINTO-ALPHANDARY et al., 2000; SCHAFFAZICK et al., 2003).

Com relação à administração oral de nanopartículas, as pesquisas visam especialmente à diminuição dos efeitos colaterais de fármacos degradáveis no trato gastrintestinal e à proteção da mucosa do trato gastrintestinal (BECK et al., 2004; GUTERRES et al., 2001; RAFFIN et al., 2003). Outro grande interesse nas nanopartículas é a sua administração oftálmica, visando ao controle da liberação, ao aumento da biodisponibilidade ocular e/ou à diminuição dos efeitos colaterais em razão da absorção sistêmica de certos fármacos (ALLÉMANN et al., 1993; JUNG et al., 2000; MIYAZAKI et al., 2003).

O termo nanopartículas quando aplicado à liberação controlada de fármacos é amplo e refere-se a dois tipos de estruturas diferentes: nanoesferas e nanocápsulas. Denominam-se esferas aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica (sistema monolítico). Nanocápsula constitui sistemas em que é possível se identificar um núcleo diferenciado, que pode ser sólido ou líquido (sistema reservatório). Ambos os métodos de obtenção são semelhantes, com diferenças no mecanismo de polimerização (AZEVEDO, 2002; MELO; PIMENTA, 2004).

Os métodos de preparação de nanopartículas mais destacados e utilizados são os mecânicos e os físico-químicos. Independente do método de formulação, as nanopartículas devem ser biodegradavéis e biocompatíveis, o que contribui para diminuição dos efeitos colaterais (AZEVEDO, 2002; OLIVEIRA et al., 2004; SOPPIMATH et al., 2001).

4.2. Sistema de liberação de fármaco polimérico

Os sistemas de liberação controlada do tipo polimérico são largamente utilizados, pois permitem uma liberação lenta e gradual do ingrediente ativo, assim como podem possibilitar o direcionamento a alvos específicos do organismo, como sítios de inflamação ou tumor. Esse sistema utiliza polímeros naturais como colágeno, celulose e quitosana ou sintéticos: polietileno, poliacrilamidas, entre outros (MIDDLETON; TIPTON, 1998).

O sistema de liberação polimérico é classificado de acordo com o controle da liberação do princípio ativo em dois tipos: controlado por difusão e controlado quimicamente. Os sistemas controlados por difusão são os mais comuns e são conhecidos dois tipos. No primeiro, o agente bioativo (fármaco) forma uma partícula interna (caroço) envolvida por uma barreira de difusão inerte. Esses sistemas incluem membranas, cápsulas, nanocápsulas, lipossomas e fibras ocas. O segundo tipo é um sólido monolítico no qual o agente ativo é disperso ou dissolvido em um polímero inerte, e a difusão do fármaco é a etapa limitante, sendo a taxa de liberação dependente da escolha do polímero (AZEVEDO, 2002; PEPPES, 1987).

Os sistemas controlados quimicamente fazem uso da bioerosão de polímeros, resultando na absorção dos resíduos pelo organismo. A droga também pode estar ligada covalentemente ao polímero e ser liberada por cisão da ligação por ação da água ou de enzimas. Nos sistemas controlados por solvente, o agente ativo está dissolvido ou disperso na matriz polimérica e não se difunde pela matriz. Para que ocorra a difusão, o polímero deve se intumescer, abaixando a temperatura de transição vítrea (Tg) e tornando o material mais plástico. Desse modo, o fármaco contido na matriz pode se difundir para o meio externo (BRANNON-PEPPAS; BLANCHETTE, 2004).

4.3. Nanopartículas de quitosana

Várias pesquisas vêm sendo realizadas com nanopartículas de polímeros sintéticos biodegradáveis, como o poli-e-copralactoneo (PCL), polilactideo (PLA) e seus copolímeros, sendo biocompatíveis e biodegradáveis. Contudo essas nanopartículas não são aplicáveis para drogas hidrofílicas, em razão da sua alta hidrofobicidade. Para suprir essa limitação, nanopartículas hidrofílicas têm sido formuladas a partir do poliéster modificado, polietileno glicol (PEG), que apresenta como desvantagem a utilização de solventes orgânicos e surfactantes para sua preparação (HU et al., 2002). Nanopartículas hidrofílicas têm recebido muita atenção como liberador terapêutico de peptídeos, proteínas, antígenos, oligonicleotídeos e genes, por administração via oral, intravenosa e mucosa (JANES et al., 2001).

A quitosana foi selecionada para ser utilizada na preparação de nanopartículas por sua propriedade hidrofílica, por ser bioadesiva, por sua habilidade em aumentar a penetração de grandes moléculas por superfícies mucosas (HUANG et al., 2005a, 2005b; ILIUM, 1998), ser biodegradável, biocompatível (ASPDEN et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2001) e por possibilitar a utilização de métodos alternativos de formulação que não requerem a utilização de solventes orgânicos e de surfactantes (HU et al., 2002).

Nanopartículas produzidas com quitosana vêm sendo estudadas para preparação, modificação e propriedades de carregamento de várias drogas. As características fisiológicas de nanopartículas de quitosana ligadas a PLGA e PEO-PPO, insulina, DNA e drogas anticâncer, também estão sendo investigadas (LUBBEN et al., 2001; ROY et al., 1999).

Alguns fatores podem afetar as propriedades dos fármacos, como parâmetros moleculares da quitosana: peso molecular e grau de desacetilação. Com relação a sistemas de liberação de proteínas, alguns estudos têm demonstrado que quitosana com peso molecular entre 210 kDa e 115 kDa e grau de desacetilação entre 85% e 92% apresentam melhores resultados (XU; DU, 2003).

5. Considerações finais

Este capítulo mostra que, para trabalhar com o polímero do século – a quitosana –, é imprescindível saber caracterizá-la. Isso se deve ao princípio básico da ciência de qualquer material que se baseia no conhecimento da estrutura implicando diretamente nas suas propriedades e consequentemente nas suas aplicações. Portanto, é fundamental conhecer detalhadamente as técnicas de caracterização desse biopolímero de tal forma que o pesquisador consiga saber qual informação pode ser adquirida por cada técnica; por exemplo, com a espectroscopia vibracional na região do infravermelho, pode-se confirmar a estrutura da quitosana e fornecer seu grau de desacetilação. Sabe-se também que mesmo um material com estrutura química definida pode alterar suas propriedades ópticas, mecânicas, magnéticas ou químicas quando reduz o tamanho das suas partículas para a escala nano, e o mesmo acontece com a quitosana. Por exemplo, a regeneração de tecidos epiteliais é uma aplicação da quitosana com superfície macroscópica; já como nanopartículas, pode ser usada como biomarcador em diagnóstico de câncer. O aproveitamento dessas novas propriedades tecnológicas forma a base da nanotecnologia de materiais.

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Notas

Parte 3

Capítulo 1

1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

2 http://rdp.cme.msu.edu

3 Disponível em: <http://www.operon.com/products/stock_oligos/OperonsRAPD10merSequences.xls>

Capítulo 2

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast>.

2 Disponível em: <http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/Blast/index.cgi>.

3 Disponível em: <http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast>.

4 Disponível em: <http://inismor.ucd.ie/~talign/index.html)>.

Capítulo 3

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.

2 Disponível em: <http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php>.

3 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>

4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>.

5 Disponível em: <http://www.bioinformatics.nl/tools/haplosnper/>.

6 Disponível em: <http://frodo.wi.mit.edu/>.

Capítulo 4

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html>.

2 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>

3 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>

4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/ V15N2/ BLView.html>.

5 Disponível em: <http://conseq.bioinfo.tau.ac.il/>.

Capítulo 5

1 Disponível em:<http://www-gsd.lbl.gov/vista>.

2 Disponível em:<http://bio.cse.psu.edu/pipmaker>.

3 Disponível em: <http://www.plantgdb.org>.

4 Disponível em: <http://www.1000genomes.org/>.

Capítulo 6

1 Disponível em: <http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/TGI/gimain.pl?gudb = s officinarum>.

2 Disponível em: <http://sucestfun.Org>.

Capítulo 7

1 Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/>.

2 Disponível em: <www.ebi.ac.uk/embl/>.

3 Disponível em: <www.ddbj.nig.ac.jp>.

4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html>.

5 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>.

6 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>.

Parte 4 

Capítulo 1

1 Acesso a coleções de cultura no mundo. Disponível em: <http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html>.

Capítulo 1

1 Entende-se por revegetação a recuperação da vegetação (da flora), o mais próximo do estado original.

2 Entende-se por recomposição ambiental além da revegetação o retorno da funcionalidade do ecossistema.