DSpace Coleção: Tese/dissertação (CNPAE)Tese/dissertação (CNPAE)https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/item/3992024-03-29T09:18:40Z2024-03-29T09:18:40ZRespostas moleculares e fisiológicas de Pichia pastoris a componentes de hidrolisado lignocelulósico.PAES, B. G.https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/11373512021-12-09T02:09:16Z2021-01-01T00:00:00ZTítulo: Respostas moleculares e fisiológicas de Pichia pastoris a componentes de hidrolisado lignocelulósico.
Autoria: PAES, B. G.
Conteúdo: Resumo: Komagataella phaffii, anteriormente conhecida como Pichia pastoris, é um organismo modelo comummente usado na pesquisa e na indústria. Tem sido considerada para a produção de produtos de alto valor agregado, especialmente proteínas. Suas aplicações biotecnológicas envolvem principalmente a utilização de fontes clássicas de carbono como glicose, glicerol, sorbitol e metanol, embora muitos outros substratos também tenham sido pesquisados. As biomassas lignocelulósicas são ricas em açúcares fermentáveis, como a xilose, o segundo açúcar mais abundante na natureza, que pode ser usado para a produção de produtos químicos renováveis. No entanto, a utilização microbiana da xilose depende da capacidade inata de utilização desta pelo microrganismo, e de sua tolerância aos compostos inibidores presentes nos hidrolisados lignocelulósicos. Atualmente, entende-se que P. pastoris não é capaz de utilizar xilose como fonte de carbono a menos que seja modificada para isso, e sua sensibilidade a tais inibidores é pouco compreendida. Neste estudo, apresentamos as respostas moleculares e fisiológicas de P. pastoris aos principais componentes do hidrolisado lignocelulósico: inibidores derivados da lignocelulose, e a xilose. A análise fisiológica e transcricional de P. pastoris X33 para ácido acético, furaldeídos e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar mostrou que eles afetam o metabolismo celular de forma dose-dependente, e se correlacionam positivamente com a quantidade de genes diferencialmente expressos. Ao contrário de outras leveduras industriais como Saccharomyces cerevisiae, P. pastoris pode consumir concomitantemente ácido acético com glicose como fonte de carbono, possivelmente ajudando a reduzir sua toxicidade para as células. A tolerância ao inibidor, e a capacidade de utilização da xilose de 25 isolados diferentes naturais e um de laboratório de Komagataella, de seis espécies diferentes, também foram avaliadas. Nenhum isolado com tolerância aos inibidores distintamente maior foi identificado, entretanto linhagens capazes de crescer em xilose foram. Três linhagens de melhor crescimento foram selecionadas e submetidas à engenharia adaptativa de laboratório (ALE) para otimização do consumo de xilose. A caracterização detalhada da assimilação da xilose pela via de oxirredução foi confirmada por ensaios utilizando marcação com isótopos de carbono 13C, apesar de precisar de mais de dez dias para duplicar. Por fim, uma estratégia de engenharia genética foi empregada para melhorar a tolerância de P. pastoris X33 ao ácido acético. Para isso, o gene homólogo HAA1, previamente descrito em S. cerevisiae como fator de transcrição envolvido na resposta ao estresse com ácido acético, foi identificado e superexpresso em P. pastoris X33. Isso melhorou o crescimento da levedura na presença de 2g.L-1 4,9 vezes após 24 h de cultivo. Juntos, os resultados apresentados aqui abrem caminho para a compreensão do metabolismo de P. pastoris na presença de hidrolisados lignocelulósicos, ácido acético, furaldeídos e xilose. Abstract: Komagataella phaffii, previously known as Pichia pastoris, is a common model organism used in research and industry. It has been considered for the production of high value-added products, especially proteins. Its biotechnological applications mostly involve the utilization of classical carbon sources like glucose, glycerol, sorbitol, and methanol, although many other substrates have also been researched. Lignocellulosic biomasses are rich in fermentable sugars, like xylose, the second most abundant sugar in nature, which can be used for the production of renewable chemicals. The microbial utilization of xylose is dependent on the innate utilization capacity by the microorganism, and its tolerance to inhibitory compounds present in lignocellulosic hydrolysates. The current understanding is that P. pastoris is not capable of utilizing xylose as a carbon source unless engineered towards it, and its sensitivity to such inhibitors is poorly understood. In this study, we present the molecular and physiological responses of P. pastoris to the major lignocellulosic hydrolysate components: lignocellulose-derived inhibitors, and xylose. The physiological and transcriptional analysis of P. pastoris X33 to acetic acid, furaldehydes, and sugarcane bagasse hydrolysate showed they affect cell metabolism in a dose-dependent way, and it positively correlates with the amount of differentially expressed genes. Unlike other industrial yeasts like Saccharomyces cerevisiae, P. pastoris can co-consume acetic acid with glucose as carbon source, possibly helping it reduce its toxicity to the cells. The inhibitor tolerance and xylose utilization capacity of 25 different natural and one laboratory Komagataella isolates of six different species was also evaluated. No isolates with higher tolerance towards inhibitors were identified, however, strains capable of growing on xylose were. The three best growing strains were selected and underwent adaptative laboratory evolution (ALE) for xylose consumption optimization. Detailed characterization of xylose assimilation via the oxidoreductase pathway was confirmed using carbon isotope 13C labeling, despite it needing more than ten days to duplicate. Finally, a genetic engineering strategy was employed to improve P. pastoris X33 tolerance towards acetic acid. For this, the homologous HAA1 gene previously described in S. cerevisiae as a transcriptional factor involved in acetic acid stress response was identified and overexpressed in P. pastoris X33. These improved yeast?s growth in the presence of 2g.L-1 4.9-fold after 24 h of cultivation. Altogether the results presented here paves the way to understanding P. pastoris metabolism in presence of lignocellulosic hydrolysates, acetic acid, furaldehydes, and xylose.2021-01-01T00:00:00ZCaracterização fisiológica e comparação de leveduras Saccharomyces e não-Saccharomyces na presença de diferentes inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.SOARES, C. E. V. F.https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/11373442021-12-09T02:09:00Z2021-01-01T00:00:00ZTítulo: Caracterização fisiológica e comparação de leveduras Saccharomyces e não-Saccharomyces na presença de diferentes inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.
Autoria: SOARES, C. E. V. F.
Conteúdo: Resumo: Várias espécies de leveduras tem sido avaliadas para a produção de combustíveis e produtos químicos a partir de açúcares presentes na biomassa lignocelulósica. O hidrolisado lignocelulósico contém açúcares e também compostos que inibem o metabolismo microbiano, como ácidos orgânicos, furaldeídos e compostos fenólicos. Compreender a resposta de leveduras a esses compostos inibitórios é importante para o desenvolvimento de bioprocessos. Nesse contexto, o objetivo geral desse trabalho foi identificar novas linhagens de leveduras capazes de metabolizar xilose e caracterizar a resposta fisiológica de diferentes espécies em termos de tolerância a inibidores presentes em hidrolisados lignocelulósicos. Inicialmente, as linhagens de leveduras JA1 e JA9, previamente isoladas de madeira em decomposição, foram identificadas pela análise de dados de sequência de DNA das regiões D1/D2 e região ITS 5.8S. Em seguida, o potencial de assimilação de xilose e produção de xilitol dessas linhagens foi avaliado em meio contendo xilose, mistura de xilose-glicose e em hidrolisado lignocelulósico. As linhagens foram identificadas como Spathaspora sp. JA1 e Meyerozyma caribbica JA9, e ambas se destacaram pela capacidade de produção de xilitol em meio sintético e em hidrolisado de biomassa de cana de açúcar. De fato, Spathaspora sp. JA1 produziu 22,62 g/L de xilitol, com rendimento de 0,58 g/g em hidrolisado. Em um segundo momento, a tolerância e a resposta fisiológica de 7 leveduras industriais de Saccharomyces cerevisiae e 7 leveduras não-Saccharomyces em relação a inibidores selecionados de hidrolisados lignocelulósicos foram avaliadas. Comparou-se o perfil de crescimento das 14 leveduras na presença de três concentrações diferentes de furaldeídos (furfural e 5-hidroximetil- furfural - HMF), ácidos orgânicos (ácido acético e ácido fórmico) e compostos fenólicos (vanilina, seringaldeido, ácidos ferúlico e ácido cumárico). Baseado no perfil de crescimento das leveduras, 7 delas foram selecionadas para análise do perfil fermentativo na presença de ácido acético, HMF e vanilina, os compostos inibidores mais tóxicos nas condições testadas. Candida tropicalis JA2, Meyerozyma caribbica JA9, Wickerhamomyces anomalus 740, S. cerevisiae JP1, B1.1 e G06 foram selecionadas porque se mostraram mais tolerantes aos compostos testados, enquanto Spathaspora sp. JA1 foi selecionada por seu bom desempenho no consumo de xilose e produção de xilitol. Os resultados obtidos mostraram uma resposta dose-dependente das leveduras em relação aos oito inibidores avaliados. Entre as leveduras comparadas, as linhagens de S. cerevisiae apresentaram maior tolerância aos compostos fenólicos e furaldeídos, 3 delas com maior tolerância que as demais. Com relação às leveduras não-Saccharomyces, C. tropicalis JA2 e W. anomalus 740 apareceram como as mais tolerantes, enquanto as cepas de Spathaspora foram as mais sensíveis aos diferentes inibidores. Esses resultados demonstram a importância da caracterização fisiológica de diferentes linhagens e espécies de leveduras Saccharomyces e não-Saccharomyces. Abstract: Several yeast species were evaluated for the production of fuels and chemicals from sugars present in lignocellulosic biomass. The lignocellulosic hydrolysate also contains compounds that inhibit microbial metabolism, such as organic acids, furaldehydes and phenolic compounds. Understanding the response of yeasts to these inhibitory compounds is important for the development of different bioprocesses. The general objective of this work was to identify new yeast strains capable of metabolizing xylose and to characterize the physiological response of different species in terms of tolerance to inhibitors present in lignocellulosic hydrolysates. Initially, the yeast strains JA1 and JA9, previously isolated from decomposing wood, were identified by analyzing DNA sequence data from D1/D2 regions and ITS 5.8S region. Then, the potential for assimilation of xylose and production of xylitol from these strains was evaluated in a medium containing xylose, a mixture of xylose-glucose and in lignocellulosic hydrolysate. The strains were identified as Spathaspora sp. JA1 and Meyerozyma caribbica JA9, and both stood out for their capacity to produce xylitol in synthetic medium and in sugarcane biomass hydrolysate. In fact, Spathaspora sp. JA1 produced 22.62 g/L of xylitol, with yield of 0.58 g/g in hydrolysate. In a second step, the tolerance and physiological response of 7 industrial yeasts of Saccharomyces cerevisiae and 7 non-Saccharomyces yeasts in relation to selected inhibitors of lignocellulosic hydrolysates were evaluated. The growth profile of the 14 yeasts was compared in the presence of three different concentrations of furaldehydes (furfural and 5-hydroxymethyl-furfural - HMF), organic acids (acetic acid and formic acid) and phenolic compounds (vanillin, syringaldehyde, ferulic acids and coumaric acid). Based on the yeast growth profile, 7 yeasts were selected for analysis of the fermentative profile in the presence of acetic acid, HMF and vanillin, the most toxic inhibitory compounds under the conditions tested. Candida tropicalis JA2, M. caribbica JA9,Wickerhamomyces anomalus 740, S. cerevisiae JP1, B1.1 and G06 were selected because they were more tolerant to the compounds tested, while Spathaspora sp. JA1 was selected for its good performance in the consumption of xylose. The results obtained showed a dose-dependent response of yeasts in relation to the eight inhibitors evaluated. Among the yeasts compared, the strains of S. cerevisiae showed greater tolerance to phenolic and furaldehydes compounds, 3 of them with greater tolerance than the others. Regarding non-Saccharomyces yeasts, C.tropicalis JA2 and W. anomalus 740 appeared as the most tolerant, while the strains of Spathaspora were the most sensitive to different inhibitors. These results demonstrate the importance of the physiological characterization of different Saccharomyces and non- Saccharomyces yeasts and species.2021-01-01T00:00:00ZLipases microbianas: prospecção, produção e aplicação.MARTINS, P. A.https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/11370062021-12-02T19:01:00Z2021-01-01T00:00:00ZTítulo: Lipases microbianas: prospecção, produção e aplicação.
Autoria: MARTINS, P. A.
Conteúdo: Resumo: Este trabalho teve como objetivo a produção de lipases por fermentação em estado sólido com microrganismos isolados de dendezeiro (Elaeis guineenses Jacq.). Após prospecção dos microrganismos isolados, destacaram-se pela alta atividade lipolítica o fungo filamentoso Aspergillus sp. (BDA-FI-7) e a bactéria Burkholderia gladioli BRM58833. Os parâmetros para o cultivo por fermentação em estado sólido foram otimizados, sendo as maiores atividades lipolíticas obtidas de 68,5 ± 5,4 e 1096,7 ± 39,3 U.gss-1 (unidades de atividade lipolítica por grama de sólido seco) para o fungo e a bactéria, respectivamente, quando avaliadas pela hidrólise de palmitato de p-nitrofenila. Quando utilizada trioleína como substrato, as maiores atividade lipolíticas encontradas foram de 7,7 ± 0,7 e 374,2 ± 20,4 U.gss-1 para o fungo e a bactéria, respectivamente. Como as atividades obtidas para a lipase bacteriana foram mais promissoras que as do fungo, o restante do estudo foi focado na lipase bacteriana. A análise proteômica do extrato produzido pela bactéria revelou que, para as condições otimizadas de cultivo, são secretadas duas esterases e três lipases verdadeiras. Quando purificada, a lipase BGL mostrou preferência por substratos de cadeia longa sendo a maior atividade lipolítica observada a 50 °C e pH 9. Além disso, a lipase foi resistente a solventes e exibiu uma termoestabilidade expressiva quando comparada a outras lipases, revelando o potencial desta enzima em reações de hidrólise e síntese de ésteres. A síntese de biodiesel foi estudada com o uso dos sólidos fermentados obtidos do cultivo da bactéria. Os maiores teores de ésteres etílicos foram de 67,3 ± 1,7 e 74,7 ± 3,8% em 120 h para as reações em óleo de soja refinado e óleo de palma bruto, respectivamente. Adicionalmente, BGL foi imobilizada e estabilizada por diferentes técnicas e abordagens, resultando em derivados 263,8 e 70,1 vezes mais estáveis à inativação a 60 °C e pH 10, respectivamente. Resultados preliminares na hidrólise de óleo de peixe demonstraram o potencial da técnica de revestimento com polímeros bifuncionais para obtenção de um derivado estável e com maior capacidade catalítica para produção de PUFAs ômega-3, atingindo uma atividade de hidrólise de 0,207 ± 0,002 U.mg-1 . Por fim, BGL foi clonada em Escherichia coli encontrando- se uma atividade lipolítica extracelular de 71,3 ± 1,8 U.mg-1 para as melhores condições de cultivo. Abstract: The goal of this work was to produce lipases by solid state fermentation with microorganisms isolated from the oil palm tree (Elaeis guineenses Jacq.). After evaluation of the isolated microorganisms, the filamentous fungus Aspergillus sp. (BDA-FI-7) and the bacterium Burkholderia gladioli BRM58833 stood out for their high lipolytic activity. The parameters for cultivation by solid state fermentation were optimized, obtaining lipolytic activities of 68.5 ± 5.4 and 1096.7 ± 39.3 U.gds-1 (units of lipolytic activity per gram of dry solid ) for the fungus and bacterium, respectively, when evaluated by the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate. When using triolein as substrate, lipolytic activities were 7.7 ± 0.7 and 374.2 ± 20.4 U.gds-1 for the fungus and bacterium, respectively. As the activities obtained for the bacterial lipase were more promising than those for the fungus, the rest of the study was focused on the bacterial lipase. Proteomic analysis of the extract produced by the bacterium revealed that, for optimized culture conditions, two esterases and three true lipases are secreted. When purified, BGL lipase preferred long-chain substrates with the highest lipolytic activity observed at 50 °C and pH 9. In addition, BGL was resistant to solvents and exhibited an expressive thermostability when compared to other lipases, revealing the potential of this enzyme in reactions of hydrolysis and synthesis of esters. The synthesis of biodiesel was studied with use of the fermented solids obtained from the cultivation of the bacterium. The highest levels of ethyl esters were 67.3 ± 1.7 and 74.7 ± 3.8% in 120 h for the reactions in refined soybean oil and crude palm oil, respectively. Additionally, BGL was immobilized and stabilized by different techniques and approaches, resulting in derivatives 263.8 and 70.1 times more stable to inactivation at 60 °C and pH 10, respectively. Preliminary results in the hydrolysis of fish oil demonstrated the potential of the coating with bifunctional polymers to obtain a stable derivative with greater catalytic properties for the production of omega-3 PUFAs, reaching an hydrolysis activity of 0.207 ± 0.002 U.mg-1 . Finally, BGL was cloned in Escherichia coli with an extracellular lipolytic activity of 71.3 ± 1.8 U.mg-1 for the best culture conditions.2021-01-01T00:00:00ZFungo como agentes destoxificadores de tortas de algodão (Gossypium) e pinhão-manso (Jatropha Curcas L.)SOUZA, M. de J.https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/11204492020-02-20T18:09:05Z2019-01-01T00:00:00ZTítulo: Fungo como agentes destoxificadores de tortas de algodão (Gossypium) e pinhão-manso (Jatropha Curcas L.)
Autoria: SOUZA, M. de J.
Conteúdo: Na busca de fontes renováveis de energia destaca-se a produção de biodiesel, bicombustível obtido pelo processo de transesterificação realizada mediante a mistura de óleo vegetal ou gordura animal em metanol ou etanol, na presença de um catalisador. Um dos principais resíduos gerados pela produção de óleos para obtenção de biodiesel é torta, e que apresenta alto potencial para complementação da alimentação animal. Entretanto algumas tortas apresentam compostos tóxicos naturais em sua composição o que limita seu uso. Entre estas tortas temos a de caroço de algodão, que possui em sua formulação gossipol livre e a torta de semente de pinhão-manso que apresenta ésteres de forbol em sua composição que é tóxico para animais e humanos. Diante da limitação para o uso destas tortas devido á presença de compostos tóxicos, o presente estudo tem como objetivo promover a destoxificação de torta de semente de pinhão-manso (TSPM) e de caroço de algodão (TCA) pelo processo de fermentação em estado sólido usando os fungos filamentosos do filo dos ascomicetos (MB 2.1, MB 2.7 e MB 2.13B) e basidiomicetos (EF 41, EF 71 e EF 79). Os fungos filamentosos que apresentaram maior potencial de redução do gossipol livre foram EF 79, com redução do gossipol livre em 86,67%, e MB 2.7 com redução do gossipol livre em 72,80%. O teor de gossipol livre presente na torta in natura era de 8,43 mgg-1, após o processo de fermentação o teor foi reduzido para 1,12mgg-1 com EF 79 e 2,29 mgg-1 com MB 2.7. Dos fungos utilizados no processo de fermentação para a torta de semente de pinhão-manso, após 15 dias de fermentação EF 71 e MB 2.13B reduziram em meia 90% dos ésteres de forbol. O EF 71 promoveu à redução dos 92,02% dos ésteres de forbol e MB 2.13B a redução de 90,46%. O teor dos ésteres na torta in natura era de 1,15 mgg-1, após a fermentação com o fungo EF 71 o teor observado foi de 0,09 mgg-1 e, com o fungo MB2.13B foi de 0,11mgg-1. Após o processo cultivo microbiano foi possível a redução dos compostos tóxicos na torta, como também melhorar sua qualidade nutricional, observado por meio dos resultados de análises bromatológicas. Dessa forma o processo de cultivo estado sólido usando os fungos apresentou-se como uma alternativa viável para agregar valor aos resíduos agroindustriais destinados á alimentação animal, que poderão ser confirmados quando dos ensaios in vivo com adição de tortas pré-tratadas biologicamente pelos fungos insumos para composição de ração de animais (monogástricos ou poligástricos).2019-01-01T00:00:00Z